Summary
Vi præsenterer her en protokol om, hvordan man forbereder primære kulturer af gliaceller, astrocytter og microglia fra rottekortika til time-lapse videobilleddannelse af intracellulær Ca2+ til forskning i patofysiologi af amyotrofisk lateral sklerose i hSOD1G93A rottemodellen.
Abstract
Denne protokol demonstrerer, hvordan man forbereder primære kulturer af gliaceller, astrocytter og microglia fra cortices af Sprague Dawley rotter, og hvordan man bruger disse celler med det formål at studere patofysiologien af amyotrofisk lateral sklerose (ALS) i rotte hSOD1G93A modellen. For det første viser protokollen, hvordan man isolerer og dyrker astrocytter og microglia fra postnatale rottekortika, og derefter hvordan man karakteriserer og tester disse kulturer for renhed ved immuncytokemi ved hjælp af glialfibrillary acidic protein (GFAP) markør for astrocytter og den ioniserede calciumbindende adaptermolekyle 1 (Iba1) mikroglial markør. I næste fase beskrives metoder til farvestofbelastning (calciumfølsom Fluo 4-AM) af dyrkede celler og optagelser af Ca2+ ændringer i videobilleddannelseseksperimenter på levende celler.
Eksemplerne på videooptagelser består af: (1) tilfælde af Ca2+ billeddannelse af dyrkede astrocytter, der er akut eksponeret for immunoglobulin G (IgG) isoleret fra ALS-patienter, hvilket viser et karakteristisk og specifikt respons sammenlignet med responsen på ATP som vist i samme eksperiment. Eksempler viser også en mere udtalt forbigående stigning i intracellulær calciumkoncentration fremkaldt af ALS IgG i hSOD1G93A astrocytter sammenlignet med ikke-transgene kontroller; (2) Ca 2+ billeddannelse af dyrkede astrocytter under en udtømning af calciumlagre af thapsigargin (Thg), en ikke-konkurrencedygtig hæmmer af det endoplasmatiske retikulum Ca 2+ ATPase, efterfulgt af lagerdrevet calciumindgang fremkaldt af tilsætning af calcium i registreringsopløsningen, hvilket viser forskellen mellem Ca2+ butiksdrift i hSOD1G93A og i ikke-transgene astrocytter; (3) Ca 2+-billeddannelse af den dyrkede microglia, der overvejende viser manglende respons på ALS IgG, mens ATP-applikationen fremkaldte en Ca2+-ændring. Dette papir understreger også mulige forbehold og advarsler vedrørende kritisk celletæthed og renhed af kulturer ved at vælge den korrekte koncentration af Ca2+ farvestof og farvestofbelastningsteknikker.
Introduction
Cellekulturteknikker har givet anledning til adskillige fremskridt inden for forskellige områder af cellulær neurofysiologi inden for sundhed og sygdom. Især primære cellekulturer, der er frisk isoleret fra et laboratoriedyrs neuronale væv, giver eksperimentatoren mulighed for nøje at studere forskellige cellers adfærd i forskellige biokemiske medier og fysiologiske opsætninger. Brug af forskellige fluorescerende fysiologiske indikatorer såsom Ca2+-følsomme farvestoffer i kombination med time-lapse videomikroskopi giver bedre indsigt i de cellulære biofysiske og biokemiske processer i realtid.
ALS er en ødelæggende neurodegenerativ sygdom, der påvirker øvre og nedre motorneuroner1. Sygdommen har en kompleks patogenese af den familiære type, men for det meste af den sporadiske form (90% af tilfældene)2. Det er velkendt, at ikke-celle autonome mekanismer bidrager til ALS patofysiologi, primært på grund af gliaceller3. ALS er også godt karakteriseret som en neuroinflammatorisk sygdom med involvering af humorale og cellulære faktorer af inflammation.
Immunoglobulin G anvendes i vid udstrækning som en molekylær markør i ALS og andre neurodegenerative sygdomme. At studere serumniveauet af denne markør kan indikere tilstedeværelsen og stadiet af neuroinflammation i sygdommen 4,5,6, mens dets tilstedeværelse i cerebrospinalvæsken kan indikere et brud på blodhjernebarrieren7. IgG'er blev også identificeret som aflejringer i rygmarvsmotorneuronerne hos ALS-patienter7. Ikke desto mindre har denne tilgang vist nogle uoverensstemmelser i sammenhængen mellem niveauet af IgG'er og sygdommens stadium og egenskaber6.
IgG isoleret fra sera af ALS-patienter (ALS IgG) kan inducere et calciumrespons i naive astrocytter8 og glutamatfrigivelse i neuroner, hvilket peger på en excitotoksisk virkning - et kendetegn ved ALS-patologi9. Undersøgelser af hSOD1G93A ALS-rottemodellen (indeholdende flere kopier af den humane SOD1-mutation10) viste imidlertid en række markører for oxidativ stress i dyrkede neuroglialceller11, væv 12,13,14 eller levende dyr 13. Det er bemærkelsesværdigt, at astrocytterne dyrket fra ALS-rottemodellen var mere tilbøjelige til oxidativ stress induceret af peroxid end astroglia fra ikke-transgene kuldkammerater11.
Mikroglialceller i kultur påvirkes af ALS IgG på en mindre tilsyneladende måde. En BV-2 mikroglialcellelinje viste nemlig en stigning i signalet fra fluorescerende markører for oxidativ stress som reaktion på anvendelsen af kun 4/11 ALS IgG-patientprøver15. Det er velkendt, at microglia deltager i mange neuroinflammatoriske patologier, hvilket øger oxidativ stress og sen progressionsfase i den ikke-celle autonome mekanisme af ALS16,17. Ikke desto mindre viste dataene med ALS IgG'er, at disse celler muligvis ikke er så reaktive som astrocytter til disse humorale faktorer af ALS-inflammation. Flere undersøgelser er blevet udført med primære astrocytter fra ALS murine modeller, ikke kun hos hvalpe, men også i symptomatiske dyr, enten på hjernen eller på rygmarven 18,19,20,21. Dette gælder også for mikroglial primære kulturer, men i mindre grad end astrocytter og for det meste fra hjerneområder på fosterstadiet22,23,24.
Vi bruger time-lapse videobilleddannelse af Ca2+ på celler i kultur primært som et middel til at følge intracellulære transienter af denne ion som en fysiologisk markør for excitotoksicitet. Ved biofysisk karakterisering af disse transienter (amplitude, areal under forbigående, stigningstid, frekvens) kan forskeren således opnå eksperimentelle diagnostiske parametre fra forskellige cellulære modeller af neurodegeneration. Denne teknik giver således en fordel ved en kvantitativ fysiologisk vurdering af IgG'er som sygdomsbiomarkører. Der er en stor mængde litteratur om IgGs og Ca2+ rolle i induktionen af ALS. De fleste af disse undersøgelser blev udført ved at inducere ALS ved at injicere patient IgG'er i forsøgsdyr 25,26,27,28,29, som derefter viste intracellulær Ca 2+ elevation og IgG depositioner. En række undersøgelser undersøgte effekten af ALS IgGs på motorsynapsen in vitro30,31,32. I ovenstående sammenhæng sætter teknikken, der præsenteres her, fokus på gliaceller som vigtige aktører i ALS's ikke-celleautonome mekanisme og kvantificerer deres potentielle excitotoksiske respons på IgG'er som humorale faktorer for neuroinflammation. Denne tilgang kan have en bredere anvendelse til test af andre humorale faktorer såsom hele sera, CSF eller cytokiner i forskellige cellekultursystemer og i cellulære modeller af generel inflammation.
Dette papir beskriver, hvordan man forbereder primære kulturer af gliaceller, astrocytter og microglia fra cortices af Sprague Dawley rotter, og hvordan man yderligere kan bruge disse celler til at studere ALS patofysiologi med patient sera-afledt IgG. Protokoller er detaljerede for farvelægning af dyrkede celler (figur 1) og optagelser af Ca2+ ændringer i time-lapse videobilleddannelseseksperimenter. Eksempler på videooptagelser vil vise, hvordan gliaceller reagerer på ALS IgG sammenlignet med ATP, hvor sidstnævnte aktiverer purinerge membranreceptorer. Vist for første gang er et eksempel på, hvordan astrocytter isoleret fra hSOD1G93A ALS rottehjerne reagerer med et mere udtalt Ca 2+ respons på ALS IgG sammenlignet med ikke-transgene kontroller, og hvordan man relaterer denne proces til forskellene i Ca2+ butiksdrift. Også vist er et eksempel på calciumbilleddannelse i mikroglialceller, der er akut udfordret med ALS IgG, med kun et beskedent respons af intracellulært calcium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøg blev udført i overensstemmelse med EU's direktiver om beskyttelse af dyr til videnskabelige formål og med tilladelse fra den etiske kommission ved Det Biologiske Fakultet, Beograd Universitet (godkendelsesnummer EK-BF-2016/08). Med hensyn til patientmateriale (sera for IgG'er) blev det indsamlet til rutinemæssig klinisk undersøgelse med informeret patients samtykke i overensstemmelse med Verdenslægeforeningens etiske kodeks (Helsinki-erklæringen) for forsøg, der involverede mennesker. Protokollen blev godkendt af den etiske komité i Serbiens kliniske center (nr. 850/6).
1. Forberedelse af primær cellekultur
- Isolering af hjernevæv
BEMÆRK: Isolering skal udføres på is ved hjælp af iskolde opløsninger.- Brug nyfødte hvalpe 1-3 dage gamle til primær neonatal cellekultur33.
BEMÆRK: Til den undersøgelse, der præsenteres her, blev Sprague Dawley hSOD1G93A og ikke-transgene rotter anvendt. Til genotypning blev rottehaler brugt til senere DNA-ekstraktion og PCR. - Drys hvalpens hoved med 70% ethanol og halshug det straks hurtigt ved hjælp af en saks.
- Skær huden op ved hjælp af en lille vinklet saks for at afsløre kraniet. Åbn kraniet ved at lave et snit fra foramen magnum mod banerne. Lav derefter et vinkelret midterlinjesnit. Fjern hjernen fra kraniet og læg den i en petriskål indeholdende fosfatbufferet saltvand (PBS).
BEMÆRK: Rengør værktøjerne mellem hvalpe for at forhindre krydskontaminering mellem transgene og ikke-transgene hvalpe. Isolering af cortices fra resten af hjernen skal ske under et stereomikroskop. - Brug spidsen af tangen til at rive forbindelserne mellem begge halvkugler. Adskil derefter halvkuglerne med buede tang ved forsigtigt at skubbe en halvkugle fra midten til siden.
- Fjern meninges ved forsigtigt at rive dem med lige og buede tang.
- Fjern hippocampus ved at klemme den med en buet tang. Kassér hippocampus eller brug det til et andet cellekulturpræparat.
BEMÆRK: Yderligere trin skal udføres under den laminære strømningshætte for at sikre sterile forhold.
- Brug nyfødte hvalpe 1-3 dage gamle til primær neonatal cellekultur33.
- Vævshomogenisering og dissociation
- Overfør en cortex til et 15 ml rør fyldt med 3 ml kold PBS. Pift ophænget op og ned med en 1 ml spids, og fuldfør 10-15 slag, indtil suspensionen bliver homogen.
BEMÆRK: Vær meget forsigtig med ikke at producere bobler i denne proces. - Centrifuge ved 500 × g i 5 min. Supernatanten fjernes, og pelleten genoptages i 3 ml kold PBS ved at pipettere den op og ned med en 1 ml spids. Gentag centrifugeringstrinnet.
BEMÆRK: Alle opløsninger, der anvendes fra dette punkt, skal forvarmes til 37 °C. - Kassér supernatanten og suspender pelleten i 2 ml komplet Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og antibiotika (penicillin og streptomycin). Overfør homogenatet til et 2 ml rør.
- Før homogenatet gennem 21 G og 23 G nåle (tre gange hver) for at lave en suspension af enkeltceller.
BEMÆRK: Vær meget forsigtig med ikke at producere bobler i denne proces.
- Overfør en cortex til et 15 ml rør fyldt med 3 ml kold PBS. Pift ophænget op og ned med en 1 ml spids, og fuldfør 10-15 slag, indtil suspensionen bliver homogen.
- Cellesuspensionen fremstillet fra en cortex hældes i en petriskål med en diameter på 60 mm eller en T25-kolbe (med overfladen forbehandlet med en polypeptidbelægning til vækst af klæbende celler) indeholdende 3 ml komplet DMEM. Ryst petriskålen let, så suspensionen fordeles ensartet.
- Cellerne i inkubatoren dyrkes i en befugtet atmosfære med 5% CO2/95% luft ved 37 °C.
- Skift mediet 48 timer efter isolering, og udskift mediet hver 3. dag.
- For at fremme astrocytvækst, når cellerne når 70% -80% sammenløb, skal du vaske dem med forvarmet PBS for at fjerne de løst vedhæftede gliaceller og spor af FBS i mediet.
- Trypsiniser det underliggende lag af astrocytter ved at tilsætte 1 ml forvarmet trypsinopløsning (0,25% trypsin, 0,02% EDTA i PBS, sterilfiltreret).
- Læg fadet i inkubatoren ved 37 °C i 2-5 min.
- Kontroller cellerne under mikroskopet. Når de begynder at løsne sig, skal du tilføje 4 ml komplet DMEM.
- Saml cellesuspensionen og overfør den til et 15 ml rør. Centrifuge ved 500 × g i 5 min.
- Kassér supernatanten og suspender pelleten i 1 ml komplet medium. Tæl cellerne ved hjælp af et hæmocytometer.
- Replate cellerne med en tæthed på 104 celler / cm2 i 5 ml frisk komplet DMEM.
- Skift mediet hver 3. dag. For at minimere tilstedeværelsen af andre gliacelletyper, efter at astrocytter når 50% sammenløb og før hver medieudskiftning, vaskes cellerne med komplet DMEM.
- Aspirer supernatantmediet med en 1 ml pipette og dispenser det forsigtigt på cellelaget flere gange. Sørg for, at hele overfladen af cellelaget er dækket under dette vasketrin.
- Når cellerne når 80% sammenløb (normalt efter 14 dage), gentages trypsiniseringen og samlingen af astrocytter som beskrevet i trin 1.6.
- Frø 5 × 103 af astrocytter på en 7 mm cirkulær glasdæksel belagt med poly-L-lysin (50 μg/ml). Brug dem i eksperimenter efter 48 timer.
- For at fremme microglia, efter trin 1.7, lad gliaceller nå et sammenflydende lag34. Når mikroglialceller vises oven på astrocytlaget (efter 10-15 dage, genkendt af deres mindre, mere ovale kroppe og kortere processer), rystes petriskålen på en orbital shaker i 2 timer ved 220 o / min.
- Dispergering og såning af mikroglialceller
- Vask let de løsrevne og løst fastgjorte celler ved at aspirere supernatantmediet med en 1 ml pipettespids og dispenser det forsigtigt på cellelaget flere gange. Sørg for at dække hele overfladen af cellelaget under dette vasketrin, saml mediet med de løsrevne celler, og overfør det til et 15 ml rør.
- Centrifuge ved 500 × g i 5 min. Kassér supernatanten og suspender pelleten i 1 ml medium.
- Før cellesuspensionen gennem en 21 G nål for at opnå en enkeltcellesuspension.
BEMÆRK: De fleste offentliggjorte metoder bruger trypsin eller papain til at adskille vævet; 21 G nåle har dog den fordel, at de forhindrer overfordøjelse af celler, hvilket giver mulighed for en blidere dissociation. - Tæl cellerne ved hjælp af et hæmocytometer. Frø 5 × 103 mikroglialceller på en 7 mm cirkulær glasdæksel belagt med poly-L-lysin (50 μg/ml). Brug dem i eksperimenter efter 48 timer.
BEMÆRK: Det er vanskeligt at opnå en ren mikroglialkultur ved at ryste, da oligodendrocytforløbercellerne og astrocytterne stadig kan være til stede i et variabelt tal afhængigt af eksperimentatorens erfaring. Den immuncytokemiske protokol, der anvendes til at estimere tilstedeværelsen af forskellige cellepopulationer i gliakulturer, er beskrevet andetsteds35.
2. Immuncytokemi
- Skyl cellerne belagt på dæksler i PBS, 2 x 1 min.
- Fix cellerne i 4% paraformaldehyd i 20 minutter ved stuetemperatur (RT).
- Vask i PBS 3 x 5 min.
- Inkuberes i en blokerende opløsning indeholdende 10% normalt æselserum (NDS)/1% bovin serumalbumin (BSA)/0,1% Triton X-100 i 45 minutter ved RT.
- Der tilsættes 50 μL blokeringsopløsning pr. dækslip med en diameter på 10 mm.
- Forbered primære antistoffer i 1% NDS / 1% BSA / 0,1% TritonX-100 i følgende fortyndinger: mus anti-GFAP 1:300, ged anti-Iba1 1:500. Inkubere cellerne med primære antistoffer natten over ved +4 °C.
- Skyl i PBS, 3 x 10 min.
- Inkuberes med de sekundære antistoffer konjugeret med en fluorophore: æsel anti-mus (excitation 488 nm [1:200)) eller æsel anti-ged (ophidset ved 647 nm [1:200)). Inkuber cellerne i 2 timer ved RT i mørke.
- Vask i PBS, 7 x 5 min.
- Inkubere cellerne med 4',6-diamidino-2-phenylindol (DAPI, 1:4,000) i 10 minutter ved RT.
- Vask i PBS 5 x 5 min.
- Monter dækslikkerne på mikroskopglas ved hjælp af en monteringsløsning; Brug en dråbe af det pr. Coverslip.
BEMÆRK: Antistoffortyndinger kan variere afhængigt af producenten. Brugere skal bestemme optimale fortyndinger til deres eksperimenter.
3. Time-lapse videobilleddannelse
BEMÆRK: Opløsninger, der indeholder det fluorescerende farvestof, skal beskyttes mod direkte lys. Før du starter billeddannelseseksperimentet, skal du sørge for, at glasdækslet ikke bevæger sig, når du tænder for perfusionen.
- Fremstilling af opløsninger og celler
- Forbered ekstracellulær opløsning (ECS) til billeddannelse: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCal 2, 2 mM MgCl2, 10 mM D-glucose og 10 mM HEPES. Juster pH-værdien til 7,4. Sørg for, at osmolariteten er 280-300 mOsm / kg, og tilbered ECS uden Ca2+: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM MgCl2, 10 mM D-glucose, 10 mM HEPES og 0,1 mM EGTA.
- Testopløsningerne forberedes: 100 μM ATP opløst i ECS, 1 μM Thg i ECS uden Ca2+ og 0,1 mg / ml ALS IgG i ECS8.
- Overfør en dæksel til en skål med ECS for at vaske hele DMEM ud. Farvestofpåfyldningsopløsningen fremstilles ved at fortynde 1 mM stamopløsning af Fluo-4 AM med ECS til den endelige koncentration på 5 μM Fluo-4 AM.
- Anbring dækslikket med celler i farvestofbelastningsopløsningen i 30 minutter ved RT i mørke. Vask cellerne i ECS i 20 min.
- Hvis cellerne ikke er tilstrækkeligt belastede (dvs. hvis det basale fluorescensniveau er for lavt <5 % af kameraets dynamiske område med en eksponeringstid på over 400 ms), øges indlæsningstiden til op til 45 minutter til 1 time ved 37 °C. Alternativt blandes Fluo-4 AM-stamopløsningen med et tilsvarende volumen på 20% (w / v) vaskemiddel (pluronic) i DMSO, inden det fortyndes i ECS, hvilket gør den endelige Pluronic-koncentration ~ 0,02%.
BEMÆRK: De eksperimentelle eksempler på denne undersøgelse blev udført med human IgG isoleret fra ALS-patienters blodsera som beskrevet tidligere 4,5,11. Hvert eksperiment blev udført med IgG-prøver af en enkelt patient.
- Videooptagelse
BEMÆRK: I denne protokol blev Video Imaging System kombineret med en xenon kortbuelampe, et polychromatorsystem og et omvendt epifluorescensmikroskop udstyret med vand, glycerin og olienedsænkningsmål. Timelapse-billeddannelse blev udført ved hjælp af et digitalkamerasystem.- Tænd for komponenterne i billedopsætningen 15 minutter før eksperimentet, så systemet kan nå arbejdstemperaturen.
- Anbring dækslikket i optagekammeret med 1 ml arbejdsløsning (ECS eller ECS uden Ca2+).
- For at vælge den korrekte billedbehandlingsprotokol skal du åbne billedbehandlingssoftwaren og i optagelsespanelet vælge filterparrene til Fluo4-AM med en excitationsbølgelængde ved 480 nm, et dikroisk spejl ved 505 nm og en emissionsbølgelængde ved 535 nm.
- Vælg synsfeltet og sørg for at have et ensartet antal celler i hele eksperimentet. Juster eksponeringstiden og detektorforstærkningen korrekt på en sådan måde, at signalet ikke er mættet. Vælg pseudocolor-tilstanden til erhvervelse. For mere detaljerede instruktioner henvises til manualen fra producenten.
- Juster samplingshastigheden til 1 Hz (1 billede pr. Sekund).
- Start billeddannelsen ved at erhverve det basale fluorescensniveau i 3-5 minutter til baselinebestemmelsen (F0). Sørg for et konstant flow i arbejdsløsningen.
- Stop arbejdsløsningens flow, og skift til testløsningen i det ønskede tidsrum (se også tidslinjer i eksempler på figur 2 og figur 3). Mellem hver testopløsning vaskes cellerne med en konstant strøm af arbejdsløsningen i 3-5 minutter.
- Opløsningsvolumenet i optagekammeret holdes på ~1 ml ved at arrangere et konstant sug fra toppen af opløsningen (se figur 2E).
BEMÆRK: For at anvende behandlingen direkte på de afbildede celler blev et tilpasset leveringssystem lavet af en glaspipette (0,8 mm indvendig diameter) placeret ~ 350 μm væk og ~ 1 mm over cellerne i en vinkel på 45 ° kombineret med opløsningsudvekslingssystemet indeholdende klemventiler og en elektronisk ventilregulator (se figur 2E).
4. Dataanalyse
- Definer et interesseområde (ROI), der svarer til den enkelte celle.
- Vælg rammen med den højeste signalintensitet (dvs. fra anvendelsen af ATP), og omkranser en celle ved hjælp af applikationen Polygonal Tool. Gentag for alle cellerne i det erhvervede felt. Vælg fem investeringsafkast i baggrunden ved hjælp af cirkelværktøjet.
- Hvis du vil måle den gennemsnitlige signalintensitet for en enkelt celle og baggrunden for hver tidsramme, skal du vælge alle ROI'er og bruge kommandoen Multi Measure i ROI Manager i ImageJ eller en tilsvarende kommando i kommerciel software (se Materialetabellen).
- Eksportér de gennemsnitlige signalintensitetsværdier for investeringsafkastet som et regneark.
- Gennemsnit fem baggrunds-ROI'er og træk den gennemsnitlige baggrund for hver ramme fra den gennemsnitlige ROI-intensitet af den ramme, der er erhvervet på samme tid.
- For at normalisere de opnåede data til basissignalet skal du bruge ligning (1):
ΔF/F 0 = (F - F 0)/F0 (1)
hvor F er signalintensiteten for hver tidsramme efter baggrundssubtraktion, og F0 er basislinjen Fluo-4 fluorescens.
BEMÆRK: En specialfremstillet kode blev brugt i denne undersøgelse. - For at analysere calciumaktivitet bestemmes flere parametre4: amplituden af calciumtoppen (ΔF / F 0), den integrerede ændring (tidsintegral, overflade under responsoptagelsen) af calciumtransienten (ΔF / F 0 × s), tid-til-top-forløbet tid fra stimuleringens begyndelse til maksimum af calciumforbigående (r), stigningstid gået fra stimuleringens begyndelse til værdien af ΔF / F 0 der når 50% -80% af den maksimale amplitude (r), halv bredde-fuld bredde af en forbigående ved halvmaksimal amplitude (er), frekvens af svar, hvis de er gentagne (Hz).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Karakterisering af forskellige gliacelletyper i kultur
Det tager normalt 15-21 dage at producere astrocytter til eksperimenter, mens mikroglialceller tager 10-15 dage at vokse. Immunostaining blev udført for at vurdere kulturens cellerenhed. Figur 1 viser ekspressionen af dobbelt mærkning af den astrocytiske markør GFAP og mikroglialmarkøren Iba1 i respektive kulturer.
Calciumbilleddannelse er kendt for at afsløre forskellene i cellefysiologi hos sunde og syge astrocytter. Tidligere i vildtype astrocytter viste vi, at ALS IgG påvirker cellulær Ca2+ ved at mobilisere intra- og ekstracellulære puljer i cytosolen8. Følgende protokol fastslog, om der var forskelle mellem calciumtransienterne i hSOD1G93A og ikke-transgene dyrkede astrocytter, der akut blev udsat for ALS IgG-prøver fra patienter. Astrocytter fyldt med Fluo4-AM blev perfunderet med ECS i 3 minutter for at opnå en stabil baseline. Dernæst blev 100 μg/ml ALS IgG påført i badet i 5 min. Astrocytter blev vasket med ECS, og derefter blev 100 μM ATP anvendt i slutningen af hver optagelse for at teste hver celles sundhed og observere calciumresponset på en standardstimulans.
Repræsentative spor i figur 2A,B viser, at hSOD1G93A astrocytter reagerer på ALS IgG med en større amplitude af calciumtransienten, en større samlet integreret ændring og en kortere time-to-peak end ikke-transgene astrocytter. Her skal man dog være forsigtig med at fortolke kvantitative data, når der anvendes enkeltbølgelængde Ca2+-sonder som Fluo4-AM (se diskussionsafsnittet). Derudover kan formen af responsen på ALS IgG skelnes fra responsen på ATP (bemærk en hurtigere forbigående med en større amplitude i sporene og cellesynkroniciteten i pseudofarvebilleder som svar på ATP, figur 2A, B).
Med det mål at undersøge oprindelsen af forskellene i calciumresponset på ALS IgG og ATP mellem hSOD1G93A og ikke-transgene astrocytter yderligere brugte vi en farmakologisk tilgang til at manipulere interne Ca 2+ -lagre under calciumbilleddannelse ved hjælp af 1 μM Thg. Thg er en ikke-selektiv hæmmer af det endoplasmatiske retikulum Ca2+ ATPase (SERCA), udtømning af de intracellulære Ca2+ lagre næsten øjeblikkeligt, hvilket afspejles i en calciumtransient, der varer over flere minutter. For at udelukke effekten af ekstern Ca 2+ i de observerede fænomener blev ECS frataget Ca2+ anvendt under eksperimentet. Efter registrering af fluorescensens basalniveau i 3 minutter blev 1 μM Thg påført i badet i 2 minutter. Efter Thg-induceret calciumudtømning blev astrocytterne perfunderet med ECS indeholdende Ca2+ for at inducere og overvåge genopfyldningen af lagrene. Repræsentative spor af det beskrevne eksperiment er vist i figur 2C,D. Som forventet havde hSOD1G93A astrocytter et højere niveau af Ca2+ i butikkerne, som afsløret ved butiksudtømning, hvilket indikerer en overbelastning af denne ion. En lignende mekanisme er blevet påvist i dyrkede astrocytter fra SOD1G93A transgene mus36.
Calciumbilleddannelse af mikroglialceller i kultur
Timelapse-billeddannelse af microglia mærket med Fluo-4 AM blev udført på samme måde som beskrevet for astrocytter (figur 3B). Mikroglialceller blev perfunderet med ECS med 2 mM Ca2+ i 3 minutter for at opnå en stabil baseline, efterfulgt af badpåføring af 100 μg / ml ALS IgG i 5 minutter, vask med ECS og stimulering med 100 μM ATP. Interessant nok, mens astrocytter let reagerer på ALS IgG, reagerede et stort flertal af mikroglialceller ikke på ALS IgG (som illustreret af kun en mikroglialcelle, der reagerede med en calciumtransient; rødt spor i eksemplet med figur 3A). De reagerede dog altid på ATP og på samme måde som astrocytter (figur 3A). Bemærk også et tilfælde af en spontan Ca2+ forbigående i cellesporet 2 (figur 3A), der ikke bør forveksles med et induceret respons.
Figur 1: Astrocytter og microglia i en primær kultur. Repræsentative konfokale billeder af astrocytter (venstre) i kultur mærket ved hjælp af GFAP (rød) og microglia (højre) i en kultur farvet med Iba1 (grøn). Dobbelt mærkning (GFAP/Iba1) blev brugt til at angive kulturrenhed. DAPI blev brugt til at mærke kerner (blå). Skalastænger = 50 μm. Forkortelser: GFAP = glialfibrillært surt protein; lba1 = ioniseret calciumbindende adaptermolekyle 1; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Et eksempel på anvendelse af calciumbilleddannelse i en undersøgelse af astrocytpatofysiologi. (A) Et repræsentativt eksempel på et calciumbilleddannelseseksperiment, hvor hSOD1G93A-astrocytter blev afbildet i 5 minutter for at indsamle baselinefluorescens ("baseline"), efterfulgt af en akut anvendelse af ALS IgG (0,1 mg / ml) i 5 minutter ('respons på ALS IgG') og en behandling med 100 μM ATP ('respons på ATP'). Toppanelet viser pseudofarvebilleder (fluorescensintensitet er farvekodet, hvor sort svarer til meget lav intensitet, mens hvid markerer pixels med højeste intensitet; farveintensitetsrelation er repræsenteret i en farvebjælke til højre i toppanelet af B, der svarer til fluorescensintensiteten af en individuel celle i hvert af eksperimentets segmenter ('baseline', 'svar på ALS IgG' og 'svar på ATP'). De grå stiplede linjer peger på pseudofarvebillederne af specifikke tidspunkter for det repræsentative calciumspor (i orange). Den grå boks midt i calciumsporet markerer 5 minutters påføring af ALS IgG. Sort bjælke under calciumsporet markerer anvendelsen af ATP. (B) Samme som i (A) bortset fra ikke-transgene astrocytter (spor i blåt). (C) Et repræsentativt calciumspor (orange) i hSOD1G93A astrocyt udfordret med 1 μg/ml thapsigargin (sort bjælke under sporet) i ECS uden calcium, efterfulgt af tilsætning af 2 mM Ca 2+ ('2 mM Ca2+', sort bjælke under sporet). (D) Samme som i (C) bortset fra den ikke-transgene astrocyt (sporet er i blåt). Amplitude skala = 100% ΔF / F0. Tidsskala = 200 s. Skalastænger = 50 μm. (E) Skema for den eksperimentelle opsætning, der viser den skræddersyede form for løsningsudveksling og placeringen af pipetten til anvendelse af biokemiske midler. Forkortelser: ALS = amyotrofisk lateral sklerose; IgG = immunoglobulin G; Thg = thapsigargin. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Et eksempel på calciumbilleddannelse af kultiveret mikroglia. (A) Til venstre: Brightfield billede af dyrket microglia. Da det er vanskeligt at opnå en ren mikroglialkultur, er astrocytter også til stede her (større flade polygonale celler, se eksempel angivet med pilespids). Både forgrenet (lille soma, fremtrædende processer) og amoeboid microglia (angivet med henholdsvis grønne og gule kasser) er til stede i kulturen. I midten: Forstørrede gule og cyankasser fra venstre. Røde, blå og violette linjer markerer ROI'erne, hvorfra den gennemsnitlige fluorescensintensitet over tid ekstraheres. Til højre: Calciumspor af tre celler i det midterste panel. Sporets farve svarer til farven på ROI'erne i midterpanelet. Efter billeddannelse af baseline calciumfluorescens ('baseline fluorescens') for 200 s blev cellerne udsat for en akut anvendelse af ALS IgG (0,1 mg / ml) i 5 minutter ('respons på ALS IgG') efterfulgt af 100 μM ATP ('respons på ATP'). Den grå boks midt i calciumsporet markerer 5 minutters påføring af ALS IgG. Den sorte bjælke under calciumsporet markerer anvendelsen af ATP. Bemærk, at kun celle 1 (rødt spor), der repræsenterer et stort mindretal af celler, reagerede på ALS IgG, mens alle celler reagerede på ATP. (B) Pseudofarvebilleder repræsenterer fluorescensintensiteten i hvert af segmenterne i optagelserne ("baseline", "response to ALS IgG" og "response to ATP"), hvor orange stiplede linjer peger på de specifikke tidspunkter i de repræsentative calciumspor (A, højre panel). Grønne og orange kasser markerer amoeboid microglia (samme som i A). Farveintensitetsrelationen er repræsenteret i en farvebjælke til højre. Amplitude skala = 100% ΔF / F0. Tidsskala = 100 s. Skalastænger = 50 μm. Forkortelser: ALS = amyotrofisk lateral sklerose; IgG = immunoglobulin G; ROI = interesseområde. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette papir præsenterer metoden til primær celledyrkning som et hurtigt og "på budgettet" værktøj til at studere forskellige aspekter af celle (pato) fysiologi såsom ALS i rotte hSOD1G93A-modellen . Teknikken er således velegnet til undersøgelser på enkeltcelleniveau, der kan ekstrapoleres og undersøges yderligere på et højere organisationsniveau (dvs. i vævsskiver eller i et levende dyr). Celledyrkning som teknik har dog et par forbehold. Det er mest kritisk at isolere hjernevævet og dissociere celler på is og udføre disse og efterfølgende stadier af isolering og forberedelse på kortest mulig tid. Forurening er en altid tilstedeværende forhindring, der kan overvindes ved at bruge godt steriliseret udstyr og være særlig omhyggelig med at udføre vævsdissociation i den laminære hætte37. Det er også afgørende at så den korrekte tæthed af celler. Hvis antallet af podede celler er mindre end det ønskede antal, understøtter dette ikke cellevækst og formering i skålen. Men hvis cellerne er for tætte, vil der være konkurrence mellem dem om næringsstofferne i vækstmediet og dermed mere celledød. Derfor er det tilrådeligt at tælle de dissocierede celler før såning, i det mindste før der opnås en vis erfaring med hensyn til det korrekte forhold mellem startvævet og dissociationsvolumenet.
GFAP er en meget anvendt astrocytmarkør og bruges ofte til at vurdere cellekulturens renhed38,39. Imidlertid er kun GFAP ikke tilstrækkelig, når man studerer astrocytreaktivitet. Det anbefales at kombinere det med en proliferationsmarkør såsom Ki67 eller andre astrocytmarkører (glutaminsyntetase, aldolase-C eller aldehyddehydrogenase-1)18,38. Selvom disse teknikker har tendens til at give rene gliacelle-type kulturer, skal man være forsigtig med at vurdere kulturcellerenhed. Dette er af særlig betydning for mikroglialcellekulturer, der normalt indeholder nogle oligodendrocytprækursorer eller astrocytter34. Specifikke markører for mikroglialceller tiltrækker stor interesse. Den mest anvendte markør er Iba1, men andre ofte anvendte markører, såsom differentieringsreceptorer (CD68, CD45) og fractalkinreceptor (CX3CR1), kan også detekteres i andre celler (for flere detaljer, se40). I øjeblikket er de mest specifikke markører for microglia TMEM119 og den purinerge receptor P2Y1241, selvom et nyligt papir har rejst bekymring vedrørende TMEM119 specificitet42.
Introduktion af timelapse live-cell imaging giver fordelen ved at overvåge cellulære processer, såsom Ca2+ signalering, i realtid. Derudover giver modulering af celleadfærd ved anvendelse af forskellige kemiske agenser (f.eks. Thg her) yderligere information til beskrivelse af veje og signalbudbringere, der aktiveres i en sund celle eller en cellulær sygdomsmodel (isoleret og dyrket her fra hSOD1G93A ALS rotte). Når man arbejder med cellemembranpermeable fluorescerende farvestoffer som Fluo-4 AM, er det vigtigt at finde den korrekte koncentration og inkubationstid for farvestoffet til at fylde det indre af cellen. Hvis det tager for lang tid, kan farvestofoptagelsen øges ved at holde cellerne i en inkubator ved 37 ° C. I mere alvorlige tilfælde kan et mildt vaskemiddel (f.eks. Pluronic F-127) anvendes i lasteopløsningen. Det anbefales heller ikke at opnå ovenstående ved at øge koncentrationen af farvestoffet over 10 μM. Faktisk kan farvestoffet ved højere koncentrationer fungere som en Ca 2+ buffer og dæmpe Ca2+ signalamplituden.
Det er også værd at nævne, at der ud over Fluo-4 og lignende enkeltbølgelængdefarvestoffer findes Ca 2+ -følsomme forholdsfølsomme farvestoffer (f.eks. Fura-2), der udsender ved en måling og ved en Ca2+ -ufølsom referencebølgelængde. Sådanne målinger er således ufølsomme over for den skævhed, der skyldes ujævn farvefordeling i cellen, og over for ændringer i den optiske vej. Ikke desto mindre er det tilrådeligt at bruge enkeltbølgelængdefarvestoffer, især med indikatorer med høj affinitet som Fluo-4, i tilfælde, hvor relative målinger foretages inden for samme prøve, eller hvor man primært følger dynamikken i processen og ikke reelle Ca2+ koncentrationsændringer43. Disse målinger kan dog ikke anvendes til kvantitative data i form af Ca2+-koncentration, og forsigtighed er nødvendig ved fortolkning af amplituder fra dataene som vist i figur 2.
Vi har her demonstreret, hvordan brug af denne billeddannelsesfacilitet på levende celler - astrocytter i kultur - kan afsløre subtile intracellulære mekanismer for patofysiologi, såsom genopfyldning af Ca 2+ -butikker og butiksdrevet Ca2+ -indgang, der forstyrres i ALS-modellen i overensstemmelse med tidligere resultater på murinceller36. Dette kan derefter forklare en højere følsomhed af hSOD1G93A astrocytter til ALS IgG som foreslået her, der kan forstærke patologiens progression. For at sammenligne målinger i sådanne eksperimenter er det tilrådeligt at have en lignende celletæthed i synsfeltet, og at de samme cellerum tages for ROI'er (f.eks. Soma vs processer).
Et eksempel blev vist her, at mikroglialceller ikke reagerede på ALS IgG med samme kraft som astrocytter. Dette er i overensstemmelse med konstateringen af den knappe generation af peroxid i mikroglialcellelinjen ved ALS IgG-behandling15. Alt i alt peger denne tilgang på et cellespecifikt svar på IgG relateret til ALS, også en vigtig kendsgerning realiseret ved brug af rene cellekulturer af microglia versus astroglia. Brug af gliaceller fra modellerne for neuropatofysiologi eller afledt af patienters inducerbare pluripotente stamceller har fremtiden for fysiologisk biomærkning i alvorlige neurale sygdomme som ALS. Det ville derfor være vigtigt at forstå fin Ca2+ signalering som fingeraftryk af sygdommens særlige tilstand eller at skelne mellem forskellige excitotoksiske sygdomme. Til disse formål skal der udvikles en maskinlæringsprocedure og dataoptagelser kategoriseres. Derudover kan disse celler dyrkes i kultur og podes i en mikrofluidisk enhed, der skal bruges til diagnose eller til patientstratificering af neurodegenerativ sygdom ved at fremkalde et respons på forskellige humorale faktorer af neuroinflammation (f.eks. Sera, IgG, CSF).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Undervisningsministeriets kontrakt nr. 451-03-9/2021-14/ 200178, FENS - NENS Education and Training Cluster-projektet "Trilateral Course on Glia in Neuroinflammation" og EC H2020 MSCA RISE-bevilling #778405. Vi takker Marija Adžić og Mina Perić for at levere immunhistokemiske billeder og Danijela Bataveljić for hjælp til papirskrivning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL tube | Sarstedt, Germany | 62 554 502 | |
| 2 mL tube | Sarstedt, Germany | 72.691 | |
| 21 G needle | Nipro, Japan | HN-2138-ET | |
| 23 G needle | Nipro, Japan | HN-2338-ET | |
| 5 mL syringe | Nipro, Japan | SY3-5SC-EC | |
| 6 mm circular glass coverslip | Menzel Glasser, Germany | 630-2113 | |
| 60 mm Petri dish | ThermoFisher Sientific, USA | 130181 | |
| ATP | Sigma-Aldrich, Germany | A9062 | |
| AxioObserver A1 | Carl Zeiss, Germany | ||
| Bovine serum albumine | Sigma-Aldrich, Germany | B6917 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich, Germany | 2110 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | ||
| DAPI | Sigma-Aldrich, Germany | 10236276001 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich, Germany | 158968 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich, Germany | D5648 | |
| Donkey-anti goat AlexaFluor 647 IgG antibody | Invitrogen, USA | A-21447 | |
| Donkey-anti mouse AlexaFluor 488 IgG antibody | Invitrogen, USA | A-21202 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich, Germany | EDS-100G | |
| EGTA | Sigma-Aldrich, Germany | E4378 | |
| ”evolve”-EM 512 Digital Camera System | Photometrics, USA | ||
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 10500064 | |
| Fiji ImageJ Software | Open source under the GNU General Public Licence | ||
| FITC filter set | Chroma Technology Inc., USA | ||
| Fluo-4 AM | Molecular Probes, USA | F14201 | |
| Goat anti-Iba1 | Fujifilm Wako Chemicals, USA | 011-27991 | |
| HEPES | Biowest, France | P5455 | |
| HighSpeed Solution Exchange System | ALA Scientific Instruments, USA | ||
| Incubator | Memmert GmbH + Co. KG, Germany | ||
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich, Germany | M2393 | |
| Matlab software | Math Works, USA | ||
| Mouse anti-GFAP | Merck Millipore, USA | MAB360 | |
| Mowiol 40-88 | Sigma-Aldrich, Germany | 324590 | |
| Normal donkey serum | Sigma-Aldrich, Germany | D9663 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, Germany | 158127 | |
| Penicilin and Streptomycin | ThermoFisher Sientific, USA | 15140122 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich, Germany | P5899 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich, Germany | P5405 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Carlo Erba Reagents, Spain | 471686 | |
| Shaker DELFIA PlateShake | PerkinElmer Life Sciencies, USA | ||
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, Germany | S3817 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich, Germany | S5886 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Carl ROTH GmbH | X987.2 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich, Germany | P5280 | |
| Thapsigargine | Tocris Bioscience, UK | 1138 | |
| Triton X - 100 | Sigma-Aldrich, Germany | T8787 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich, Germany | T4799 | |
| Vapro Vapor Pressure Osmometer 5520 | Wescor, ELITechGroup Inc., USA | ||
| ViiFluor Imaging System | Visitron System Gmbh, Germany | ||
| VisiChrome Polychromator System | Visitron System Gmbh, Germany | ||
| VisiView high performance setup | Visitron System Gmbh, Germany | ||
| Xenon Short Arc lamp | Ushio, Japan |
References
- Kiernan, M. C., et al.
- Taylor, J. P., Brown, R. H. J., Cleveland, D. W. Decoding ALS: from genes to mechanism. Nature. 539 (7628), 197-206 (2016).
- Gleichman, A. J., Carmichael, S. T. Glia in neurodegeneration: Drivers of disease or along for the ride. Neurobiology of Disease. 142, 104957 (2022).
- Zhang, R., et al. Evidence for systemic immune system alterations in sporadic amyotrophic lateral sclerosis (sALS). Journal of Neuroimmunology. 159 (1-2), 215-224 (2005).
- Saleh, I. A., et al. Evaluation of humoral immune response in adaptive immunity in ALS patients during disease progression. Journal of Neuroimmunology. 215 (1-2), 6 (2009).
- Wang, M., et al. Evaluation of Peripheral Immune Activation in Amyotrophic Lateral Sclerosis. Frontiers in Neurology. 12, 628710 (2021).
- Li, J. -Y., et al. Blood-brain barrier dysfunction and myelin basic protein in survival of amyotrophic lateral sclerosis with or without frontotemporal dementia. Neurological Sciences. 43 (5), 3201-3210 (2022).
- Milošević, M., et al. Immunoglobulins G from patients with sporadic amyotrophic lateral sclerosis affects cytosolic Ca2+ homeostasis in cultured rat astrocytes. Cell Calcium. 54 (1), 17-25 (2013).
- Andjus, P. R., Stevic-Marinkovic, Z., Cherubini, E. Immunoglobulins from motoneurone disease patients enhance glutamate release from rat hippocampal neurones in culture. Journal of Physiology. 504, 103-112 (1997).
- Howland, D. S., et al. Focal loss of the glutamate transporter EAAT2 in a transgenic rat model of SOD1 mutant-mediated amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (3), 1604-1609 (2002).
- Dučić, T., Stamenković, S., Lai, B., Andjus, P., Lučić, V. Multimodal synchrotron radiation microscopy of intact astrocytes from the hSOD1 G93A rat model of amyotrophic lateral sclerosis. Analytical Chemistry. 91 (2), 1460-1471 (2019).
- Popović-Bijelić, A., et al. Iron-sulfur cluster damage by the superoxide radical in neural tissues of the SOD1(G93A) ALS rat model. Free Radical Biology & Medicine. 96, 313-322 (2016).
- Stamenković, S., et al. In vivo EPR pharmacokinetic evaluation of the redox status and the blood brain barrier permeability in the SOD1(G93A) ALS rat model. Free Radical Biology & Medicine. 108, 258-269 (2017).
- Stamenković, S., Dučić, T., Stamenković, V., Kranz, A., Andjus, P. R. Imaging of glial cell morphology, SOD1 distribution and elemental composition in the brainstem and hippocampus of the ALS hSOD1(G93A) rat. Neuroscience. 357, 37-55 (2017).
- Milošević, M., et al. Immunoglobulins G from sera of amyotrophic lateral sclerosis patients induce oxidative stress and upregulation of antioxidative system in BV-2 microglial cell line. Frontiers in Immunology. 8, 1619 (2017).
- Boillée, S., Cleveland, D. W. Revisiting oxidative damage in ALS: microglia, Nox, and mutant SOD1. Journal of Clinical Investigation. 118 (2), 474-478 (2008).
- Boillée, S., et al. Onset and progression in inherited ALS determined by motor neurons and microglia. Science. 312 (5778), 1389-1392 (2006).
- Martínez-Palma, L., et al. Mitochondrial modulation by dichloroacetate reduces toxicity of aberrant glial cells and gliosis in the SOD1G93A rat model of amyotrophic lateral sclerosis. Journal of American Society for Experimental Neurotherapeutics. 16 (1), 203-215 (2019).
- Díaz-Amarilla, P., et al. Phenotypically aberrant astrocytes that promote motoneuron damage in a model of inherited amyotrophic lateral sclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (44), 18126-18131 (2011).
- Barbosa, M., et al. Recovery of depleted miR-146a in ALS cortical astrocytes reverts cell aberrancies and prevents paracrine pathogenicity on microglia and motor neurons. Frontiers in Cell Developmental Biology. 9, 634355 (2021).
- Gomes, C., et al. Astrocyte regional diversity in ALS includes distinct aberrant phenotypes with common and causal pathological processes. Experimental Cell Research. 395 (2), 112209 (2020).
- Kovacs, M., et al. CD34 identifies a subset of proliferating microglial cells associated with degenerating motor neurons in ALS. International Journal of Molecular Sciences. 20 (16), 3880 (2019).
- Komiya, H., et al. Ablation of interleukin-19 improves motor function in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Molecular Brain. 14 (1), 1-13 (2021).
- Trias, E., et al. Emergence of microglia bearing senescence markers during paralysis progression in a rat model of inherited ALS. Frontiers in Aging Neuroscience. 10, 1-14 (2019).
- Pullen, A. H., Demestre, M., Howard, R. S., Orrell, R. W. Passive transfer of purified IgG from patients with amyotrophic lateral sclerosis to mice results in degeneration of motor neurons accompanied by Ca2+ enhancement. Acta Neuropatholgica. 107 (1), 35-46 (2004).
- Obál, I., et al. Intraperitoneally administered IgG from patients with amyotrophic lateral sclerosis or from an immune-mediated goat model increase the levels of TNF-α, IL-10 in the spinal cord and serum of mice. Journal of Neuroinflammation. 13 (1), 121 (2016).
- Obál, I., et al. Experimental motor neuron disease induced in mice with long-term repeated intraperitoneal injections of serum from ALS patients. International Journal of Molecular Sciences. 20 (10), 2573 (2019).
- Mohamed, H. A., et al. Immunoglobulin Fc gamma receptor promotes immunoglobulin uptake, immunoglobulin-mediated calcium increase, and neurotransmitter release in motor neurons. Journal of Neuroscience Research. 69 (1), 110-116 (2002).
- Engelhardt, J. I., Siklos, L., Appel, S. H. Altered calcium homeostasis and ultrastructure in motoneurons of mice caused by passively transferred anti-motoneuronal IgG. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 56 (1), 21-39 (1997).
- Pagani, M. R., Reisin, R. C., Uchitel, O. D. Calcium signaling pathways mediating synaptic potentiation triggered by amyotrophic lateral sclerosis IgG in motor nerve terminals. Journal of Neuroscience. 26 (10), 2661-2672 (2006).
- Carter, J. R., Mynlieff, M. Amyotrophic lateral sclerosis patient IgG alters voltage dependence of Ca2+ channels in dissociated rat motoneurons. Neuroscience Letters. 353 (3), 221-225 (2003).
- Fratantoni, S. A., Weisz, G., Pardal, A. M., Reisin, R. C., Uchitel, O. D. Amyotrophic lateral sclerosis IgG-treated neuromuscular junctions develop sensitivity to L-type calcium channel blocker. Muscle & Nerve. 23 (4), 543-550 (2000).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).
- Vay, S. U., et al. The impact of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) and voltage-gated potassium KCNQ/Kv7 channels on primary microglia function. Journl of Neuroinflammation. 17 (1), 100 (2020).
- Bijelić, D. D., et al. Central nervous system-infiltrated immune cells induce calcium increase in astrocytes via astroglial purinergic signaling. Journal of Neuroscience Research. 98 (11), 2317-2332 (2020).
- Kawamata, H., et al. Abnormal intracellular calcium signaling and SNARE-dependent exocytosis contributes to SOD1G93A astrocyte-mediated toxicity in amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Neuroscience. 34 (6), 2331-2348 (2014).
- Nims, R. W., Price, P. J. Best practices for detecting and mitigating the risk of cell culture contaminants. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 53 (10), 872-879 (2017).
- Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of Visualized Experiments. (71), e50079 (2013).
- Adzic, M., et al. Extracellular ATP induces graded reactive response of astrocytes and strengthens their antioxidative defense in vitro. Journal of Neuroscience Research. 95 (4), 1053-1066 (2017).
- Jurga, A. M., Paleczna, M., Kuter, K. Z. Overview of general and discriminating markers of differential microglia phenotypes. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 198 (2020).
- Butovsky, O., et al. Identification of a unique TGF-β-dependent molecular and functional signature in microglia. Nature Neuroscince. 17 (1), 131-143 (2014).
- Vankriekelsvenne, E., et al. Transmembrane protein 119 is neither a specific nor a reliable marker for microglia. Glia. 70 (6), 1170-1190 (2022).
- Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D.
