Summary
Wir präsentieren hier ein Protokoll zur Vorbereitung von Primärkulturen von Gliazellen, Astrozyten und Mikroglia aus Rattenkortices für die Zeitraffer-Videobildgebung von intrazellulärem Ca2+ für die Erforschung der Pathophysiologie der amyotrophen Lateralsklerose im hSOD1G93A-Rattenmodell .
Abstract
Dieses Protokoll zeigt, wie Primärkulturen von Gliazellen, Astrozyten und Mikroglia aus den Kortices von Sprague Dawley-Ratten hergestellt werden und wie diese Zellen zur Untersuchung der Pathophysiologie der amyotrophen Lateralsklerose (ALS) im hSOD1G93A-Modell der Ratte verwendet werden können. Zuerst zeigt das Protokoll, wie Astrozyten und Mikroglia aus postnatalen Rattenkortikern isoliert und kultiviert werden, und dann, wie diese Kulturen durch Immunzytochemie unter Verwendung des Gliafibrillär-sauren Proteins (GFAP) -Markers von Astrozyten und des ionisierten Calcium-bindenden Adaptermoleküls 1 (Iba1) Mikrogliamarkers charakterisiert und getestet werden. Im nächsten Schritt werden Methoden zur Farbstoffbeladung (calciumsensitives Fluo 4-AM) von kultivierten Zellen und die Aufzeichnung von Ca2+ Veränderungen in Videobildgebungsexperimenten an lebenden Zellen beschrieben.
Die Beispiele für Videoaufnahmen bestehen aus: (1) Fällen von Ca2+-Bildgebung von kultivierten Astrozyten, die akut Immunglobulin G (IgG) ausgesetzt waren, das von ALS-Patienten isoliert wurde und eine charakteristische und spezifische Reaktion im Vergleich zur Reaktion auf ATP zeigte, wie im selben Experiment gezeigt. Beispiele zeigen auch einen ausgeprägteren vorübergehenden Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentration, hervorgerufen durch ALS-IgG in hSOD1G93A-Astrozyten im Vergleich zu nicht-transgenen Kontrollen; (2) Ca 2+ Bildgebung von kultivierten Astrozyten während einer Erschöpfung der Calciumspeicher durch Thapsigargin (Thg), einem nicht-kompetitiven Inhibitor des endoplasmatischen Retikulums Ca 2+ ATPase, gefolgt von einem speicherbetriebenen Calciumeintritt, der durch die Zugabe von Calcium in der Aufnahmelösung hervorgerufen wird, was den Unterschied zwischen dem Ca 2+-Speicherbetrieb in hSOD1G93A und in nicht-transgenen Astrozyten zeigt; (3) Ca 2+-Bildgebung der kultivierten Mikroglia zeigte überwiegend eine mangelnde Reaktion auf ALS-IgG, während die ATP-Anwendung eine Ca2+-Veränderung hervorrief. Dieses Papier betont auch mögliche Vorbehalte und Vorsichtsmaßnahmen in Bezug auf kritische Zelldichte und Reinheit von Kulturen, indem die richtige Konzentration des Ca2+ Farbstoffs und der Farbstoffladetechniken gewählt wird.
Introduction
Zellkulturtechniken haben zu zahlreichen Fortschritten in verschiedenen Bereichen der zellulären Neurophysiologie in Gesundheit und Krankheit geführt. Insbesondere primäre Zellkulturen, frisch isoliert aus dem neuronalen Gewebe eines Labortieres, ermöglichen es dem Experimentator, das Verhalten verschiedener Zellen in verschiedenen biochemischen Medien und physiologischen Setups genau zu untersuchen. Die Verwendung verschiedener fluoreszierender physiologischer Indikatoren wie der Ca2+-sensitiven Farbstoffe in Kombination mit der Zeitraffer-Videomikroskopie ermöglicht einen besseren Einblick in die zellulären biophysikalischen und biochemischen Prozesse in Echtzeit.
ALS ist eine verheerende neurodegenerative Erkrankung, die obere und untere Motoneuronen betrifft1. Die Krankheit hat eine komplexe Pathogenese des familiären Typs, aber meist der sporadischen Form (90% der Fälle)2. Es ist bekannt, dass nicht-zellautonome Mechanismen zur ALS-Pathophysiologie beitragen, vor allem aufgrund der essentiellen Rolle von Gliazellen3. ALS ist auch gut als neuroinflammatorische Erkrankung mit Beteiligung von humoralen und zellulären Faktoren der Entzündung charakterisiert.
Immunglobulin G wird häufig als molekularer Marker bei ALS und anderen neurodegenerativen Erkrankungen verwendet. Die Untersuchung des Serumspiegels dieses Markers kann auf das Vorhandensein und Stadium der Neuroinflammation bei der Krankheit 4,5,6 hinweisen, während seine Anwesenheit in der Zerebrospinalflüssigkeit auf eine Verletzung der Blut-Hirn-Schranke 7 hinweisen kann. IgGs wurden auch als Ablagerungen in den Rückenmarks-Motoneuronen von ALS-Patienten identifiziert7. Dennoch hat dieser Ansatz einige Inkonsistenzen in der Korrelation des IgG-Spiegels mit dem Stadium und den Merkmalen der Krankheit gezeigt6.
Aus den Seren von ALS-Patienten isoliertes IgG (ALS-IgG) kann eine Kalziumreaktion in naiven Astrozyten8 und eine Glutamatfreisetzung in Neuronen induzieren, was auf eine exzitotoxische Wirkung hinweist - ein Kennzeichen der ALS-Pathologie9. Studien am HSOD1G93A ALS-Rattenmodell (das mehrere Kopien der menschlichen SOD1-Mutation10 enthielt) zeigten jedoch eine Reihe von Markern für oxidativen Stress in kultivierten Neurogliazellen11, Geweben 12,13,14 oder lebenden Tieren 13. Es ist bemerkenswert, dass die aus dem ALS-Rattenmodell gezüchteten Astrozyten anfälliger für oxidativen Stress waren, der durch Peroxid induziert wurde, als die Astroglia aus nicht-transgenen Wurfgeschwistern11.
Mikrogliazellen in Kultur sind weniger offensichtlich von ALS-IgG betroffen. Eine BV-2-Mikrogliazelllinie zeigte nämlich einen Anstieg des Signals von fluoreszierenden Markern für oxidativen Stress als Reaktion auf die Anwendung von nur 4/11 ALS-IgG-Patientenproben15. Es ist bekannt, dass Mikroglia an vielen neuroinflammatorischen Pathologien beteiligt sind, was zu oxidativem Stress und der späten Progressionsphase im nicht-zellautonomen Mechanismus von ALS16,17 beiträgt. Dennoch zeigten die Daten mit ALS-IgGs, dass diese Zellen möglicherweise nicht so reaktiv sind wie Astrozyten auf diese humoralen Faktoren der ALS-Entzündung. Mehrere Studien wurden mit primären Astrozyten aus ALS-Mausmodellen durchgeführt, nicht nur bei Welpen, sondern auch bei symptomatischen Tieren, entweder am Gehirn oder am Rückenmark 18,19,20,21. Dies gilt auch für mikrogliale Primärkulturen, wenn auch in geringerem Maße als Astrozyten und meist aus Hirnregionen im embryonalen Stadium22,23,24.
Wir verwenden Zeitraffer-Videoaufnahmen von Ca2+ auf Zellen in Kultur hauptsächlich als Mittel, um intrazelluläre Transienten dieses Ions als physiologischen Marker für Exzitotoxizität zu verfolgen. So kann der Forscher durch biophysikalische Charakterisierung dieser Transienten (Amplitude, Fläche unter Transienten, Anstiegszeit, Frequenz) experimentelle diagnostische Parameter aus verschiedenen zellulären Modellen der Neurodegeneration erhalten. Diese Technik bietet somit den Vorteil einer quantitativen physiologischen Bewertung von IgGs als Krankheitsbiomarker. Es gibt eine große Menge an Literatur über die Rolle von IgGs und Ca2+ bei der Induktion von ALS. Die meisten dieser Studien wurden durchgeführt, indem ALS induziert wurde, indem Patienten-IgGs in Versuchstiere injiziert wurden 25,26,27,28,29, die dann intrazelluläre Ca 2+-Erhöhung und IgG-Ablagerungen zeigten. Eine Reihe von Studien untersuchte die Wirkung von ALS-IgGs auf die motorische Synapse in vitro30,31,32. Im obigen Kontext legt die hier vorgestellte Technik den Fokus auf die Gliazellen als wichtige Akteure im nicht-zellautonomen Mechanismus der ALS und quantifiziert ihre mögliche exzitotoxische Reaktion auf IgGs als humorale Faktoren der Neuroinflammation. Dieser Ansatz kann eine breitere Anwendung beim Testen anderer humoraler Faktoren wie ganze Seren, Liquor oder Zytokine in verschiedenen Zellkultursystemen und in zellulären Modellen allgemeiner Entzündungen haben.
Dieser Artikel beschreibt, wie Primärkulturen von Gliazellen, Astrozyten und Mikroglia aus den Kortices von Sprague Dawley-Ratten hergestellt werden können und wie diese Zellen weiter verwendet werden können, um die ALS-Pathophysiologie mit Patienten-Seren-abgeleitetem IgG zu untersuchen. Protokolle sind detailliert für die Farbstoffbeladung von kultivierten Zellen (Abbildung 1) und die Aufzeichnungen von Ca2+ Änderungen in Zeitraffer-Video-Imaging-Experimenten. Beispiele für Videoaufnahmen zeigen, wie Gliazellen auf ALS-IgG im Vergleich zu ATP reagieren, wobei letzteres purinerge Membranrezeptoren aktiviert. Zum ersten Mal wird ein Beispiel gezeigt, wie aus dem HSOD1G93A ALS-Rattengehirn isolierte Astrozyten im Vergleich zu nicht-transgenen Kontrollen mit einer ausgeprägteren Ca 2+-Reaktion auf ALS-IgG reagieren und wie dieser Prozess mit den Unterschieden im Ca2+-Speicherbetrieb in Beziehung gesetzt werden kann. Ebenfalls gezeigt wird ein Beispiel für die Kalziumbildgebung in Mikrogliazellen, die akut mit ALS IgG herausgefordert wurden, mit nur einer bescheidenen Reaktion von intrazellulärem Kalzium.
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Protocol
Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den EU-Richtlinien zum Schutz von Tieren für wissenschaftliche Zwecke und mit Genehmigung der Ethikkommission der Fakultät für Biologie der Universität Belgrad (Zulassungsnummer EK-BF-2016/08) durchgeführt. Das Patientenmaterial (Seren für IgGs) wurde für die routinemäßige klinische Untersuchung mit informierter Zustimmung des Patienten gemäß dem Ethikkodex des Weltärztebundes (Deklaration von Helsinki) für Experimente am Menschen gesammelt. Das Protokoll wurde von der Ethikkommission des Klinischen Zentrums Serbiens genehmigt (Nr. 850/6).
1. Vorbereitung der primären Zellkultur
- Isolierung von Hirngewebe
HINWEIS: Die Isolierung sollte auf Eis mit eiskalten Lösungen durchgeführt werden.- Verwenden Sie neugeborene Welpen im Alter von 1-3 Tagen für die primäre neonatale Zellkultur33.
HINWEIS: Für die hier vorgestellte Studie wurden Sprague Dawley hSOD1G93A und nicht-transgene Ratten verwendet. Für die Genotypisierung wurden Rattenschwänze für die spätere DNA-Extraktion und PCR verwendet. - Bestreuen Sie den Kopf des Welpen mit 70% Ethanol und enthaupten Sie ihn sofort schnell mit einer Schere.
- Schneiden Sie die Haut mit einer kleinen Schere auf, um den Schädel freizulegen. Öffnen Sie den Schädel, indem Sie einen Schnitt vom Foramen magnum in Richtung der Orbita machen. Als nächstes machen Sie einen senkrechten Mittellinienschnitt. Entfernen Sie das Gehirn aus dem Schädel und legen Sie es in eine Petrischale, die phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) enthält.
HINWEIS: Reinigen Sie die Werkzeuge zwischen den Welpen, um eine Kreuzkontamination zwischen transgenen und nicht-transgenen Welpen zu vermeiden. Die Isolierung der Kortices vom Rest des Gehirns sollte unter einem Stereomikroskop erfolgen. - Reißen Sie mit der Spitze der Pinzette die Verbindungen zwischen beiden Hemisphären. Trennen Sie dann die Hemisphären mit einer gekrümmten Pinzette, indem Sie eine Halbkugel vorsichtig von der Mitte zur Seite schieben.
- Entfernen Sie die Hirnhäute, indem Sie sie vorsichtig mit geraden und gebogenen Pinzetten zerreißen.
- Entfernen Sie den Hippocampus, indem Sie ihn mit einer gebogenen Pinzette kneifen. Verwerfen Sie den Hippocampus oder verwenden Sie ihn für ein anderes Zellkulturpräparat.
HINWEIS: Weitere Schritte sollten unter der Laminar-Flow-Haube durchgeführt werden, um sterile Bedingungen zu gewährleisten.
- Verwenden Sie neugeborene Welpen im Alter von 1-3 Tagen für die primäre neonatale Zellkultur33.
- Gewebehomogenisierung und Dissoziation
- Übertragen Sie einen Kortex in eine 15-ml-Röhre, die mit 3 ml kaltem PBS gefüllt ist. Pipeten Sie die Aufhängung mit einer 1-ml-Spitze auf und ab und absolvieren Sie 10-15 Hübe, bis die Aufhängung homogen wird.
HINWEIS: Seien Sie sehr vorsichtig, um in diesem Prozess keine Blasen zu erzeugen. - Bei 500 × g 5 min zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 3 ml kaltem PBS, indem Sie es mit einer 1-ml-Spitze auf und ab pipettieren. Wiederholen Sie den Zentrifugationsschritt.
HINWEIS: Alle ab diesem Zeitpunkt verwendeten Lösungen sollten auf 37 °C vorgewärmt werden. - Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 2 ml komplettem Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) und Antibiotika (Penicillin und Streptomycin). Das Homogenat in ein 2 mL Röhrchen überführen.
- Führen Sie das Homogenat durch 21 G und 23 G Nadeln (jeweils dreimal), um eine Suspension aus einzelnen Zellen herzustellen.
HINWEIS: Seien Sie sehr vorsichtig, um in diesem Prozess keine Blasen zu erzeugen.
- Übertragen Sie einen Kortex in eine 15-ml-Röhre, die mit 3 ml kaltem PBS gefüllt ist. Pipeten Sie die Aufhängung mit einer 1-ml-Spitze auf und ab und absolvieren Sie 10-15 Hübe, bis die Aufhängung homogen wird.
- Gießen Sie die aus einem Kortex hergestellte Zellsuspension in eine Petrischale mit einem Durchmesser von 60 mm oder einen T25-Kolben (wobei die Oberfläche mit einer Polypeptidbeschichtung für das Wachstum adhärenter Zellen vorbehandelt ist), die 3 ml vollständiges DMEM enthält. Die Petrischale leicht schütteln, damit die Suspension gleichmäßig verteilt ist.
- Züchten Sie die Zellen im Inkubator in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO2/95% Luft bei 37 °C.
- Wechseln Sie das Medium 48 h nach der Isolierung und ersetzen Sie das Medium alle 3 Tage.
- Um das Wachstum von Astrozyten zu fördern, waschen Sie sie, wenn Zellen eine Konfluenz von 70% -80% erreichen, mit vorgewärmtem PBS, um die lose anhaftenden Gliazellen und Spuren von FBS im Medium zu entfernen.
- Trypsinisieren Sie die darunter liegende Schicht von Astrozyten durch Zugabe von 1 ml vorgewärmter Trypsinlösung (0,25% Trypsin, 0,02% EDTA in PBS, steril gefiltert).
- Die Schale bei 37 °C für 2-5 min in den Inkubator stellen.
- Überprüfen Sie die Zellen unter dem Mikroskop. Wenn sie sich zu lösen beginnen, fügen Sie 4 ml vollständiges DMEM hinzu.
- Sammeln Sie die Zellsuspension und geben Sie sie in ein 15-ml-Röhrchen. Bei 500 × g 5 min zentrifugieren.
- Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml vollständigem Medium. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.
- Replaten Sie die Zellen bei einer Dichte von 104 Zellen /cm2 in 5 ml frischem komplettem DMEM.
- Wechseln Sie das Medium alle 3 Tage. Um das Vorhandensein anderer Gliazelltypen zu minimieren, waschen Sie die Zellen nach Erreichen von 50% Konfluenz und vor jedem Medienaustausch mit vollständigem DMEM.
- Das überstehende Medium mit einer 1 ml Pipette absaugen und mehrmals vorsichtig auf die Zellschicht dosieren. Stellen Sie sicher, dass die gesamte Oberfläche der Zellschicht während dieses Waschschritts bedeckt ist.
- Sobald die Zellen einen Zusammenfluss von 80% erreicht haben (normalerweise nach 14 Tagen), wiederholen Sie die Trypsinisierung und die Entnahme von Astrozyten wie in Schritt 1.6 beschrieben.
- Samen 5 × 103 von Astrozyten auf einem 7 mm kreisförmigen Glasdeckglas, beschichtet mit Poly-L-Lysin (50 μg/ml). Verwenden Sie sie in Experimenten nach 48 h.
- Um Mikroglia zu fördern, lassen Sie nach Schritt 1.7 die Gliazellen eine konfluente Schicht34 erreichen. Wenn Mikrogliazellen auf der Astrozytenschicht erscheinen (nach 10-15 Tagen, erkennbar an ihren kleineren, ovaleren Körpern und kürzeren Prozessen), schütteln Sie die Petrischale auf einem Orbitalschüttler für 2 h bei 220 U / min.
- Dispergieren und Aussaaten von Mikrogliazellen
- Waschen Sie die abgelösten und lose anhaftenden Zellen leicht, indem Sie das überstehende Medium mit einer 1-ml-Pipettenspitze ansaugen und mehrmals vorsichtig auf die Zellschicht aufsaugen. Achten Sie darauf, während dieses Waschschritts die gesamte Oberfläche der Zellschicht zu bedecken, das Medium mit den abgelösten Zellen zu sammeln und in ein 15-ml-Röhrchen zu überführen.
- Bei 500 × g 5 min zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml Medium.
- Führen Sie die Zellsuspension durch eine 21-G-Nadel, um eine einzellige Suspension zu erhalten.
HINWEIS: Die meisten veröffentlichten Methoden verwenden Trypsin oder Papain, um das Gewebe zu dissoziieren; 21 G-Nadeln haben jedoch den Vorteil, dass sie die Überverdauung von Zellen verhindern und eine sanftere Dissoziation ermöglichen. - Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. Seed 5 × 103 Mikrogliazellen auf einem 7 mm großen kreisförmigen Glasdeckglas, beschichtet mit Poly-L-Lysin (50 μg/ml). Verwenden Sie sie in Experimenten nach 48 h.
HINWEIS: Es ist schwierig, eine reine Mikrogliakultur durch Schütteln zu erhalten, da die Oligodendrozyten-Vorläuferzellen und Astrozyten je nach Erfahrung des Experimentators noch in variabler Anzahl vorhanden sein können. Das immunzytochemische Protokoll, das zur Abschätzung des Vorhandenseins verschiedener Zellpopulationen in Gliakulturen verwendet wird, wurde an anderer Stelle beschrieben35.
2. Immunzytochemie
- Spülen Sie die auf Deckgläsern plattierten Zellen in PBS, 2 x 1 min.
- Fixieren Sie die Zellen in 4% Paraformaldehyd für 20 min bei Raumtemperatur (RT).
- Waschen in PBS 3 x 5 min.
- Inkubieren Sie in einer Blocklösung, die 10% normales Eselserum (NDS)/1% Rinderserumalbumin (BSA)/0,1% Triton X-100 für 45 min bei RT enthält.
- Fügen Sie 50 μL einer Blocklösung pro Deckglas mit einem Durchmesser von 10 mm hinzu.
- Primäre Antikörper in 1% NDS/1% BSA/0,1% TritonX-100 in den folgenden Verdünnungen herstellen: Maus-Anti-GFAP 1:300, Ziegen-Anti-Iba1 1:500. Inkubieren Sie die Zellen mit primären Antikörpern über Nacht bei +4 °C.
- Spülen in PBS, 3 x 10 Min.
- Inkubieren Sie mit den sekundären Antikörpern, die mit einem Fluorophor konjugiert sind: Esel-Anti-Maus (Anregung 488 nm [1:200])) oder Esel-Anti-Ziege (angeregt bei 647 nm [1:200)). Inkubieren Sie die Zellen für 2 h bei RT im Dunkeln.
- Waschen in PBS, 7 x 5 Min.
- Inkubieren Sie die Zellen mit 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI, 1:4.000) für 10 min bei RT.
- Waschen in PBS 5 x 5 min.
- Montieren Sie die Deckgläser mit einer Montagelösung auf Objektträgern; Verwenden Sie einen Tropfen davon pro Deckglas.
HINWEIS: Antikörperverdünnungen können je nach Hersteller variieren. Anwender müssen optimale Verdünnungen für ihre Experimente bestimmen.
3. Zeitraffer-Video-Imaging
HINWEIS: Lösungen, die den Fluoreszenzfarbstoff enthalten, sollten vor direktem Licht geschützt werden. Bevor Sie mit dem bildgebenden Experiment beginnen, stellen Sie sicher, dass sich das Glasdeckglas beim Einschalten der Perfusion nicht bewegt.
- Herstellung von Lösungen und Zellen
- Extrazelluläre Lösung (ECS) für die Bildgebung vorbereiten: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCal 2, 2 mM MgCl2, 10 mM D-Glucose und 10 mM HEPES. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein. Stellen Sie sicher, dass die Osmolarität 280-300 mOsm/kg beträgt und bereiten Sie ECS ohne Ca2+ vor: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM MgCl2, 10 mM D-Glucose, 10 mM HEPES und 0,1 mM EGTA.
- Bereiten Sie die Testlösungen vor: 100 μM ATP gelöst in ECS, 1 μM Thg in ECS ohne Ca2+ und 0,1 mg/ml ALS IgG in ECS8.
- Ein Deckglas mit ECS in eine Schale geben, um das komplette DMEM auszuwaschen. Die Farbstoffbeladungslösung wird hergestellt, indem 1 mM Stammlösung von Fluo-4 AM mit ECS auf die Endkonzentration von 5 μM Fluo-4 AM verdünnt wird.
- Legen Sie das Deckglas mit Zellen für 30 min bei RT im Dunkeln in die Farbstoffladelösung. Waschen Sie die Zellen 20 min in ECS.
- Wenn die Zellen nicht ausreichend belastet sind (d. h. wenn der basale Fluoreszenzpegel zu niedrig ist <5% des Dynamikumfangs der Kamera bei einer Belichtungszeit von mehr als 400 ms), erhöhen Sie die Ladezeit auf bis zu 45 min bis 1 h bei 37 °C. Alternativ kann die Fluo-4 AM-Stammlösung mit einem gleichen Volumen von 20% (w/v) Reinigungsmittel (Pluronic) in DMSO gemischt werden, bevor sie in ECS verdünnt wird, wobei die endgültige Pluronic-Konzentration ~0,02% beträgt.
HINWEIS: Die experimentellen Beispiele dieser Studie wurden mit humanem IgG durchgeführt, das aus Blutseren von ALS-Patienten isoliert wurde, wie zuvorbeschrieben 4,5,11. Jedes Experiment wurde mit IgG-Proben eines einzelnen Patienten durchgeführt.
- Video-Imaging
HINWEIS: In diesem Protokoll wurde das Video-Imaging-System mit einer Xenon-Kurzbogenlampe, einem Polychromatorsystem und einem inversen Epifluoreszenzmikroskop kombiniert, das mit Wasser-, Glycerin- und Ölimmersionsobjektiv ausgestattet ist. Die Zeitrafferaufnahmen wurden mit einem Digitalkamerasystem durchgeführt.- Schalten Sie die Komponenten des Bildgebungsaufbaus 15 Minuten vor dem Experiment ein, damit das System die Arbeitstemperatur erreichen kann.
- Legen Sie das Deckglas mit 1 mL Arbeitslösung (ECS oder ECS ohne Ca2+) in die Aufnahmekammer.
- Um das richtige Bildgebungsprotokoll auszuwählen, öffnen Sie die Bildgebungssoftware und wählen Sie im Erfassungsbereich die Filterpaare für Fluo4-AM mit einer Anregungswellenlänge bei 480 nm, einem dichroitischen Spiegel bei 505 nm und einer Emissionswellenlänge bei 535 nm aus.
- Wählen Sie das Sichtfeld und achten Sie darauf, dass während des gesamten Experiments eine konsistente Anzahl von Zellen vorhanden ist. Stellen Sie die Belichtungszeit und die Detektorverstärkung entsprechend ein, so dass das Signal nicht gesättigt wird. Wählen Sie den Pseudofarbmodus für die Erfassung. Ausführlichere Anweisungen finden Sie im Handbuch des Herstellers.
- Stellen Sie die Abtastrate auf 1 Hz (1 Bild pro Sekunde) ein.
- Beginnen Sie die Bildgebung, indem Sie den basalen Fluoreszenzspiegel für 3-5 min für die Baseline-Bestimmung (F0) erfassen. Stellen Sie einen konstanten Fluss der Arbeitslösung sicher.
- Stoppen Sie den Fluss der Arbeitslösung und wechseln Sie für die gewünschte Zeit zur Testlösung (siehe auch Zeitbalken in den Beispielen von Abbildung 2 und Abbildung 3). Zwischen den einzelnen Testlösungen die Zellen mit einem konstanten Fluss der Arbeitslösung für 3-5 min waschen.
- Halten Sie das Lösungsvolumen in der Aufnahmekammer bei ~1 ml, indem Sie eine konstante Absaugung von der Oberseite der Lösung veranlassen (siehe Abbildung 2E).
HINWEIS: Um die Behandlung direkt auf die abgebildeten Zellen anzuwenden, wurde ein kundenspezifisches Abgabesystem aus einer Glaspipette (0,8 mm Innendurchmesser) ~350 μm entfernt und ~1 mm über den Zellen in einem Winkel von 45° positioniert, kombiniert mit dem Lösungsaustauschsystem mit Quetschventilen und einer elektronischen Ventilsteuerung (siehe Abbildung 2E).
4. Datenanalyse
- Definieren Sie eine Region of Interest (ROI), die der einzelnen Zelle entspricht.
- Wählen Sie den Rahmen mit der höchsten Signalintensität (d. h. aus der Anwendung von ATP) und umgeben Sie eine Zelle mit dem Polygonal Tool. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle Zellen im erfassten Feld. Wählen Sie mit dem Kreiswerkzeug fünf ROIs im Hintergrund aus.
- Um die mittlere Signalintensität einer einzelnen Zelle und den Hintergrund für jeden Zeitraum zu messen, wählen Sie alle ROIs aus und verwenden Sie den Befehl Multi Measure im ROI Manager in ImageJ oder einen gleichwertigen Befehl in kommerzieller Software (siehe Materialtabelle).
- Exportieren Sie die mittleren Signalintensitätswerte der ROIs als Tabelle.
- Durchschnittlich fünf Hintergrund-ROIs und subtrahieren Sie den gemittelten Hintergrund jedes Frames von der mittleren ROI-Intensität des gleichzeitig erfassten Frames.
- Um die erhaltenen Daten auf das Basisliniensignal zu normalisieren, verwenden Sie Gleichung (1):
ΔF/F 0 = (F - F 0)/F0 (1)
wobei F die Signalintensität jedes Zeitrahmens nach Hintergrundsubtraktion und F0 die Basislinie Fluo-4-Fluoreszenz ist.
HINWEIS: In dieser Studie wurde ein benutzerdefinierter Code verwendet. - Um die Calciumaktivität zu analysieren, bestimmen Sie mehrere Parameter4: die Amplitude des Calciumpeaks (ΔF/F 0), die integrierte Änderung (Zeitintegral, Oberfläche unter der Antwortaufzeichnung) des Calciumtransienten (ΔF/F 0 × s), die Zeit bis zur Spitze vom Beginn der Stimulation bis zum Maximum des Kalziumtransienten (s), die Anstiegszeit vom Beginn der Stimulation bis zum Wert von ΔF/F 0 Das erreicht 50% -80% der maximalen Amplitude (s), halbe Breite voller Breite eines Transienten bei halbmaximaler Amplitude (s), Frequenz der Antworten, wenn sie sich wiederholen (Hz).
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Representative Results
Charakterisierung verschiedener Gliazelltypen in Kultur
Es dauert normalerweise 15-21 Tage, um Astrozyten für Experimente zu produzieren, während Mikrogliazellen 10-15 Tage brauchen, um zu wachsen. Eine Immunfärbung wurde durchgeführt, um die Zellreinheit der Kultur zu beurteilen. Abbildung 1 zeigt die Expression der Doppelmarkierung des astrozytären Markers GFAP und des Mikrogliamarkers Iba1 in jeweiligen Kulturen.
Es ist bekannt, dass die Kalziumbildgebung die Unterschiede in der Zellphysiologie gesunder und kranker Astrozyten aufdeckt. Zuvor haben wir in Wildtyp-Astrozyten gezeigt, dass ALS-IgG zelluläres Ca2+ beeinflusst, indem es intra- und extrazelluläre Pools in das Zytosol8 mobilisiert. Das folgende Protokoll bestimmte, ob es Unterschiede zwischen den Kalziumtransienten in hSOD1G93A und nicht-transgenen kultivierten Astrozyten gab, die akut ALS-IgG-Proben von Patienten ausgesetzt waren. Astrozyten, die mit Fluo4-AM beladen waren, wurden 3 Minuten lang mit ECS perfundiert, um eine stabile Basislinie zu erhalten. Als nächstes wurden 100 μg/ml ALS-IgG für 5 min in das Bad aufgetragen. Astrozyten wurden mit ECS gewaschen, und dann wurden am Ende jeder Aufnahme 100 μM ATP aufgetragen, um die Gesundheit jeder Zelle zu testen und die Kalziumreaktion auf einen Standardreiz zu beobachten.
Repräsentative Spuren in Abbildung 2A,B zeigen, dass hSOD1G93A-Astrozyten auf ALS-IgG mit einer größeren Amplitude des Kalziumtransienten, einer größeren integrierten Gesamtänderung und einer kürzeren Zeit bis zum Peak reagieren als nicht-transgene Astrozyten. Hier ist jedoch Vorsicht bei der Interpretation quantitativer Daten geboten, wenn einwellenige Ca2+-Sonden wie Fluo4-AM verwendet werden (siehe Diskussionsabschnitt). Darüber hinaus ist die Form der Reaktion auf ALS-IgG von der Antwort auf ATP unterscheidbar (beachten Sie einen schnelleren Transienten mit einer größeren Amplitude in den Spuren und Zellsynchronizität in Pseudofarbbildern als Reaktion auf ATP, Abbildung 2A, B).
Mit dem Ziel, den Ursprung der Unterschiede in der Calciumantwort auf ALS-IgG und ATP zwischen hSOD1G93A und nicht-transgenen Astrozyten weiter zu untersuchen, verwendeten wir einen pharmakologischen Ansatz, um interne Ca2+-Speicher während der Kalziumbildgebung unter Verwendung von 1 μM Thg zu manipulieren. Thg ist ein nicht-selektiver Inhibitor des endoplasmatischen Retikulums Ca2+ ATPase (SERCA), Abbau der intrazellulären Ca2+ Speicher fast sofort, was sich in einem Kalzium-Transienten widerspiegelt, der über mehrere Minuten anhält. Um die Wirkung von externem Ca 2+ in den beobachteten Phänomenen auszuschließen, wurde ECS ohne Ca2+ während des Experiments verwendet. Nach Aufnahme des Basalspiegels der Fluoreszenz für 3 min wurde 1 μM Thg für 2 min in das Bad aufgetragen. Nach Thg-induziertem Kalziummangel wurden die Astrozyten mit ECS perfundiert, das Ca2+ enthielt, um das Nachfüllen der Speicher zu induzieren und zu überwachen. Repräsentative Spuren des beschriebenen Experiments sind in Abbildung 2C,D dargestellt. Wie erwartet, hatten hSOD1G93A-Astrozyten ein höheres Niveau von Ca2+ in den Speichern, was durch Speichererschöpfung gezeigt wurde, was auf eine Überlastung dieses Ions hinweist. Ein ähnlicher Mechanismus wurde in kultivierten Astrozyten von SOD1G93A transgenen Mäusen36 nachgewiesen.
Calcium-Bildgebung von Mikrogliazellen in Kultur
Die Zeitraffer-Bildgebung von Mikroglia, die mit Fluo-4 AM markiert waren, wurde auf die gleiche Weise durchgeführt wie für Astrozyten beschrieben (Abbildung 3B). Mikrogliazellen wurden 3 min lang mit ECS mit 2 mM Ca2+ perfundiert, um eine stabile Ausgangsbasis zu erhalten, gefolgt von einer Badanwendung von 100 μg/ml ALS-IgG für 5 min, Waschen mit ECS und Stimulation mit 100 μM ATP. Interessanterweise reagierten Astrozyten zwar leicht auf ALS-IgG, eine große Mehrheit der Mikrogliazellen reagierte jedoch nicht auf ALS-IgG (wie nur eine Mikrogliazelle zeigt, die mit einem Kalzium-Transienten reagiert; rote Spur im Beispiel von Abbildung 3A). Sie reagierten jedoch immer auf ATP und ähnlich wie Astrozyten (Abbildung 3A). Beachten Sie auch einen Fall eines spontanen Ca2+ Transienten in der Zellspur 2 (Abbildung 3A), der nicht mit einer induzierten Reaktion verwechselt werden sollte.
Abbildung 1: Astrozyten und Mikroglia in einer Primärkultur. Repräsentative konfokale Bilder von Astrozyten (links) in Kultur, markiert mit GFAP (rot) und Mikroglia (rechts) in einer mit Iba1 (grün) gefärbten Kultur. Die doppelte Markierung (GFAP/Iba1) wurde verwendet, um die Reinheit der Kultur anzuzeigen. DAPI wurde verwendet, um Kerne (blau) zu markieren. Maßstabsbalken = 50 μm. Abkürzungen: GFAP = glial fibrillary acidic protein; LBA1 = ionisiertes Calcium-bindendes Adaptermolekül 1; DAPI = 4',6-Diamidino-2-phenylindol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Ein Beispiel für die Anwendung der Kalziumbildgebung in einer Studie zur Pathophysiologie von Astrozyten. (A) Ein repräsentatives Beispiel für ein Calcium-Imaging-Experiment, bei dem hSOD1G93A-Astrozyten 5 Minuten lang abgebildet wurden, um die Baseline-Fluoreszenz ("Baseline") zu sammeln, gefolgt von einer akuten Anwendung von ALS-IgG (0,1 mg/ml) für 5 min ("Ansprechen auf ALS-IgG") und einer Behandlung mit 100 μM ATP ("Ansprechen auf ATP"). Das obere Feld zeigt Pseudofarbbilder (die Intensität der Fluoreszenz ist farbcodiert, wobei Schwarz einer sehr geringen Intensität entspricht, während Weiß Pixel mit der höchsten Intensität markiert; die Farbintensitätsbeziehung wird in einem Farbbalken rechts im oberen Bereich von B dargestellt, der der Fluoreszenzintensität einer einzelnen Zelle in jedem der Segmente des Experiments entspricht ("Baseline", "Antwort auf ALS-IgG" und "Antwort auf ATP"). Die grauen gestrichelten Linien verweisen auf die Pseudofarbbilder bestimmter Zeitpunkte für die repräsentative Kalziumspur (in orange). Der graue Kasten in der Mitte der Kalziumspur markiert die 5-minütige Anwendung von ALS-IgG. Schwarzer Balken unter der Kalziumspur markiert die Anwendung von ATP. (B) Wie in (A), außer für nicht-transgene Astrozyten (Spur in blau). (C) Eine repräsentative Calciumspur (orange) in hSOD1G93A-Astrozyten, die mit 1 μg/ml Thapsigargin (schwarzer Balken unter der Spur) in ECS ohne Calcium herausgefordert wurde, gefolgt von der Zugabe von 2 mM Ca 2+ ("2 mM Ca2+", schwarzer Balken unter der Spur). (D) Wie in (C) mit Ausnahme des nicht-transgenen Astrozyten (Spur ist blau). Amplitudenskala = 100% ΔF/F0. Zeitskala = 200 s. Maßstabsbalken = 50 μm. (E) Schema des Versuchsaufbaus, das die maßgeschneiderte Art des Lösungsaustauschs und die Platzierung der Pipette für die Anwendung biochemischer Wirkstoffe darstellt. Abkürzungen: ALS = Amyotrophe Lateralsklerose; IgG = Immunglobulin G; Thg = Thapsigargin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Ein Beispiel für die Kalziumbildgebung kultivierter Mikroglia. (A) Links: Hellfeldaufnahme von kultivierten Mikroglia. Da es schwierig ist, eine reine Mikrogliakultur zu erhalten, sind auch hier Astrozyten vorhanden (größere flache polygonale Zellen, siehe Beispiel durch Pfeilspitze dargestellt). Sowohl verzweigte (kleines Soma, prominente Prozesse) als auch amöboide Mikroglia (gekennzeichnet mit grünen bzw. gelben Kästchen) sind in der Kultur vorhanden. Mitte: Vergrößerte gelbe und cyanfarbene Kästchen von links. Rote, blaue und violette Linien markieren die ROIs, aus denen die mittlere Fluoreszenzintensität im Zeitverlauf extrahiert wird. Rechts: Kalziumspuren von drei Zellen im mittleren Bild. Die Farbe der Spur entspricht der Farbe der ROIs im mittleren Bereich. Nach der Abbildung der Calciumfluoreszenz zu Studienbeginn ("Baseline-Fluoreszenz") für 200 s wurden die Zellen 5 min lang einer akuten Anwendung von ALS-IgG (0,1 mg/ml) ausgesetzt ("Response to ALS IgG"), gefolgt von 100 μM ATP ("response to ATP"). Der graue Kasten in der Mitte der Kalziumspur markiert die 5-minütige Anwendung von ALS-IgG. Der schwarze Balken unter der Kalziumspur markiert die Anwendung von ATP. Beachten Sie, dass nur Zelle 1 (rote Spur), die eine große Minderheit von Zellen repräsentiert, auf ALS-IgG reagierte, während alle Zellen auf ATP reagierten. (B) Pseudofarbbilder stellen die Fluoreszenzintensität in jedem der Segmente der Aufzeichnungen dar ("Baseline", "Reaktion auf ALS-IgG" und "Reaktion auf ATP"), wobei orange gestrichelte Linien auf die spezifischen Zeitpunkte in den repräsentativen Kalziumspuren hinweisen (A, rechtes Bild). Grüne und orangefarbene Kästchen markieren amöboide Mikroglia (wie in A). Die Farbintensitätsbeziehung wird in einem Farbbalken auf der rechten Seite dargestellt. Amplitudenskala = 100% ΔF/F0. Zeitskala = 100 s. Maßstabsbalken = 50 μm. Abkürzungen: ALS = Amyotrophe Lateralsklerose; IgG = Immunglobulin G; ROI = Region of Interest. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
In diesem Artikel wird die Methode der primären Zellkultivierung als schnelles und "budgetgerechtes" Werkzeug zur Untersuchung verschiedener Aspekte der Zell(patho)physiologie wie ALS im hSOD1G93A-Modell der Ratte vorgestellt. Die Technik eignet sich daher für Studien auf Einzelzellebene, die auf einer höheren Organisationsebene (d.h. in Gewebeschnitten oder in einem lebenden Tier) extrapoliert und weiter untersucht werden können. Die Zellkultivierung als Technik hat jedoch einige Vorbehalte. Es ist am wichtigsten, die Isolierung des Hirngewebes und die Dissoziation von Zellen auf Eis durchzuführen und diese und nachfolgende Phasen der Isolierung und Vorbereitung in kürzester Zeit durchzuführen. Die Kontamination ist eine allgegenwärtige Hürde, die durch die Verwendung gut sterilisierter Geräte und besondere Sorgfalt bei der Durchführung der Gewebedissoziation in der laminaren Haubeüberwunden werden kann 37. Es ist auch wichtig, die richtige Zelldichte zu säen. Wenn die Anzahl der ausgesäten Zellen geringer als die gewünschte Anzahl ist, wird dies das Zellwachstum und die Zellvermehrung in der Schale nicht unterstützen. Wenn die Zellen jedoch zu dicht sind, gibt es einen Wettbewerb zwischen ihnen um die Nährstoffe im Wachstumsmedium und damit mehr Zelltod. Aus diesem Grund ist es ratsam, die dissoziierten Zellen vor der Aussaat zu zählen, zumindest bevor einige Erfahrungen über das richtige Verhältnis von Ausgangsgewebe und Dissoziationsvolumen gesammelt werden.
GFAP ist ein weit verbreiteter Astrozytenmarker und wird häufig zur Beurteilung der Zellkulturreinheitverwendet 38,39. GFAP allein reicht jedoch nicht aus, um die Reaktivität von Astrozyten zu untersuchen. Es wird empfohlen, es mit einem Proliferationsmarker wie Ki67 oder anderen Astrozytenmarkern (Glutaminsynthetase, Aldolase-C oder Aldehyd-Dehydrogenase-1) zu kombinieren18,38. Obwohl diese Techniken dazu neigen, reine Gliazelltypkulturen zu liefern, muss bei der Beurteilung der Reinheit der Kulturzellen Vorsicht walten gelassen werden. Dies ist von besonderer Bedeutung für Mikrogliazellkulturen, die normalerweise einige Oligodendrozytenvorläufer oder Astrozyten enthalten34. Spezifische Marker für Mikrogliazellen stoßen auf großes Interesse. Der am häufigsten verwendete Marker ist Iba1, aber auch andere häufig verwendete Marker wie Differenzierungsrezeptoren (CD68, CD45) und Fractalkinrezeptoren (CX3CR1) können in anderen Zellen nachgewiesen werden (weitere Details siehe40). Derzeit sind die spezifischsten Marker für Mikroglia TMEM119 und der purinerge Rezeptor P2Y1241, obwohl ein kürzlich veröffentlichter Artikel Bedenken hinsichtlich der TMEM119-Spezifität42 geäußert hat.
Die Einführung der Timelapse-Live-Cell-Bildgebung bietet den Vorteil, zelluläre Prozesse wie die Ca2+-Signalgebung in Echtzeit zu überwachen. Darüber hinaus liefert die Modulation des Zellverhaltens durch Anwendung verschiedener chemischer Wirkstoffe (z.B. hier Thg) weitere Informationen für die Beschreibung der Signalwege und Signalbotenstoffe, die in einer gesunden Zelle oder einem zellulären Krankheitsmodell (hier isoliert und kultiviert aus der hSOD1G93A ALS-Ratte) aktiviert werden. Bei der Arbeit mit zellmembrandurchlässigen Fluoreszenzfarbstoffen wie Fluo-4 AM ist es wichtig, die richtige Konzentration und Inkubationszeit zu finden, damit der Farbstoff das Innere der Zelle füllt. Wenn es zu lange dauert, kann die Farbstoffaufnahme erhöht werden, indem die Zellen in einem Inkubator bei 37 °C gehalten werden. In schwereren Fällen kann ein mildes Reinigungsmittel (z. B. Pluronic F-127) in der Ladelösung verwendet werden. Es wird auch nicht empfohlen, dies zu erreichen, indem die Konzentration des Farbstoffs über 10 μM erhöht wird. Tatsächlich kann der Farbstoff bei höheren Konzentrationen als Ca 2+ Puffer wirken und die Ca2+ Signalamplitude dämpfen.
Es ist auch erwähnenswert, dass es neben Fluo-4 und ähnlichen einwellenlängenigen Farbstoffen Ca 2+ -sensitive ratiometrische Farbstoffe (z. B. Fura-2) gibt, die bei einer Messung und bei einer Ca2+ -unempfindlichen Referenzwellenlänge emittieren. Solche Messungen sind daher unempfindlich gegenüber der Verzerrung, die durch ungleichmäßige Farbstoffverteilung in der Zelle und gegen Veränderungen des optischen Weges verursacht wird. Dennoch ist die Verwendung von Einwellenlängenfarbstoffen, insbesondere mit hochaffinen Indikatoren wie Fluo-4, in Fällen ratsam, in denen relative Messungen innerhalb derselben Probe durchgeführt werden oder wenn man hauptsächlich der Dynamik des Prozesses folgt und nicht realen Ca2+-Konzentrationsänderungen43. Dennoch können diese Messungen nicht für quantitative Daten in Bezug auf die Ca2+-Konzentration verwendet werden, und bei der Interpretation der Amplituden aus den Daten ist Vorsicht geboten, wie in Abbildung 2 dargestellt.
Wir haben hier gezeigt, wie die Verwendung dieser bildgebenden Einrichtung an lebenden Zellen - Astrozyten in Kultur - subtile intrazelluläre Mechanismen der Pathophysiologie wie die Auffüllung von Ca 2+ Speichern und den speicherbetriebenen Ca2+ Eintritt aufdecken kann, die im ALS-Modell gestört sind, in Übereinstimmung mit früheren Ergebnissen an Mauszellen36. Dies könnte dann eine höhere Empfindlichkeit von hSOD1G93A-Astrozyten gegenüber ALS-IgG erklären, wie hier vorgeschlagen, was das Fortschreiten der Pathologie potenzieren könnte. Um Messungen in solchen Experimenten zu vergleichen, ist es ratsam, eine ähnliche Zelldichte im Sichtfeld zu haben und dass die gleichen Zellkompartimente für ROIs genommen werden (z. B. Soma vs. Prozesse).
Ein Beispiel wurde hier gezeigt, dass Mikrogliazellen auf ALS-IgG nicht mit der gleichen Kraft reagierten wie Astrozyten. Dies steht im Einklang mit dem Befund der geringen Peroxidbildung in der Mikrogliazelllinie bei ALS-IgG-Behandlung15. Insgesamt deutet dieser Ansatz auf eine zellspezifische Reaktion auf IgG im Zusammenhang mit ALS hin, ebenfalls eine wichtige Tatsache, die durch die Verwendung von reinen Zellkulturen von Mikroglia gegenüber Astroglia realisiert wird. Die Verwendung von Gliazellen aus den Modellen der Neuropathie oder aus induzierbaren pluripotenten Stammzellen von Patienten hat die Zukunft der physiologischen Biomarkierung bei schweren neuronalen Erkrankungen wie ALS. Es wäre daher essentiell, die feineCa2+ -Signalisierung als Fingerabdruck des jeweiligen Krankheitszustandes zu verstehen oder zwischen verschiedenen exzitotoxischen Erkrankungen zu unterscheiden. Dazu muss ein maschinelles Lernverfahren entwickelt und Datenaufzeichnungen kategorisiert werden. Darüber hinaus können diese Zellen in Kultur gezüchtet und in einem mikrofluidischen Gerät ausgesät werden, um zur Diagnose oder zur Patientenstratifizierung neurodegenerativer Erkrankungen verwendet zu werden, indem eine Reaktion auf verschiedene humorale Faktoren der Neuroinflammation (z. B. Seren, IgG, Liquor) hervorgerufen wird.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom Ministerium für Bildung, Wissenschaft und technologische Entwicklung Republik Serbien Vertrag Nr. 451-03-9/2021-14/ 200178, dem FENS - NENS Education and Training Cluster-Projekt "Trilateral Course on Glia in Neuroinflammation" und dem EC H2020 MSCA RISE Grant #778405 unterstützt. Wir danken Marija Adžić und Mina Perić für die Bereitstellung der immunhistochemischen Bilder und Danijela Bataveljić für die Hilfe beim Schreiben von Papieren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL tube | Sarstedt, Germany | 62 554 502 | |
| 2 mL tube | Sarstedt, Germany | 72.691 | |
| 21 G needle | Nipro, Japan | HN-2138-ET | |
| 23 G needle | Nipro, Japan | HN-2338-ET | |
| 5 mL syringe | Nipro, Japan | SY3-5SC-EC | |
| 6 mm circular glass coverslip | Menzel Glasser, Germany | 630-2113 | |
| 60 mm Petri dish | ThermoFisher Sientific, USA | 130181 | |
| ATP | Sigma-Aldrich, Germany | A9062 | |
| AxioObserver A1 | Carl Zeiss, Germany | ||
| Bovine serum albumine | Sigma-Aldrich, Germany | B6917 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich, Germany | 2110 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | ||
| DAPI | Sigma-Aldrich, Germany | 10236276001 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich, Germany | 158968 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich, Germany | D5648 | |
| Donkey-anti goat AlexaFluor 647 IgG antibody | Invitrogen, USA | A-21447 | |
| Donkey-anti mouse AlexaFluor 488 IgG antibody | Invitrogen, USA | A-21202 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich, Germany | EDS-100G | |
| EGTA | Sigma-Aldrich, Germany | E4378 | |
| ”evolve”-EM 512 Digital Camera System | Photometrics, USA | ||
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 10500064 | |
| Fiji ImageJ Software | Open source under the GNU General Public Licence | ||
| FITC filter set | Chroma Technology Inc., USA | ||
| Fluo-4 AM | Molecular Probes, USA | F14201 | |
| Goat anti-Iba1 | Fujifilm Wako Chemicals, USA | 011-27991 | |
| HEPES | Biowest, France | P5455 | |
| HighSpeed Solution Exchange System | ALA Scientific Instruments, USA | ||
| Incubator | Memmert GmbH + Co. KG, Germany | ||
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich, Germany | M2393 | |
| Matlab software | Math Works, USA | ||
| Mouse anti-GFAP | Merck Millipore, USA | MAB360 | |
| Mowiol 40-88 | Sigma-Aldrich, Germany | 324590 | |
| Normal donkey serum | Sigma-Aldrich, Germany | D9663 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, Germany | 158127 | |
| Penicilin and Streptomycin | ThermoFisher Sientific, USA | 15140122 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich, Germany | P5899 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich, Germany | P5405 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Carlo Erba Reagents, Spain | 471686 | |
| Shaker DELFIA PlateShake | PerkinElmer Life Sciencies, USA | ||
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, Germany | S3817 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich, Germany | S5886 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Carl ROTH GmbH | X987.2 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich, Germany | P5280 | |
| Thapsigargine | Tocris Bioscience, UK | 1138 | |
| Triton X - 100 | Sigma-Aldrich, Germany | T8787 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich, Germany | T4799 | |
| Vapro Vapor Pressure Osmometer 5520 | Wescor, ELITechGroup Inc., USA | ||
| ViiFluor Imaging System | Visitron System Gmbh, Germany | ||
| VisiChrome Polychromator System | Visitron System Gmbh, Germany | ||
| VisiView high performance setup | Visitron System Gmbh, Germany | ||
| Xenon Short Arc lamp | Ushio, Japan |
References
- Kiernan, M. C., et al.
- Taylor, J. P., Brown, R. H. J., Cleveland, D. W. Decoding ALS: from genes to mechanism. Nature. 539 (7628), 197-206 (2016).
- Gleichman, A. J., Carmichael, S. T. Glia in neurodegeneration: Drivers of disease or along for the ride. Neurobiology of Disease. 142, 104957 (2022).
- Zhang, R., et al. Evidence for systemic immune system alterations in sporadic amyotrophic lateral sclerosis (sALS). Journal of Neuroimmunology. 159 (1-2), 215-224 (2005).
- Saleh, I. A., et al. Evaluation of humoral immune response in adaptive immunity in ALS patients during disease progression. Journal of Neuroimmunology. 215 (1-2), 6 (2009).
- Wang, M., et al. Evaluation of Peripheral Immune Activation in Amyotrophic Lateral Sclerosis. Frontiers in Neurology. 12, 628710 (2021).
- Li, J. -Y., et al. Blood-brain barrier dysfunction and myelin basic protein in survival of amyotrophic lateral sclerosis with or without frontotemporal dementia. Neurological Sciences. 43 (5), 3201-3210 (2022).
- Milošević, M., et al. Immunoglobulins G from patients with sporadic amyotrophic lateral sclerosis affects cytosolic Ca2+ homeostasis in cultured rat astrocytes. Cell Calcium. 54 (1), 17-25 (2013).
- Andjus, P. R., Stevic-Marinkovic, Z., Cherubini, E. Immunoglobulins from motoneurone disease patients enhance glutamate release from rat hippocampal neurones in culture. Journal of Physiology. 504, 103-112 (1997).
- Howland, D. S., et al. Focal loss of the glutamate transporter EAAT2 in a transgenic rat model of SOD1 mutant-mediated amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (3), 1604-1609 (2002).
- Dučić, T., Stamenković, S., Lai, B., Andjus, P., Lučić, V. Multimodal synchrotron radiation microscopy of intact astrocytes from the hSOD1 G93A rat model of amyotrophic lateral sclerosis. Analytical Chemistry. 91 (2), 1460-1471 (2019).
- Popović-Bijelić, A., et al. Iron-sulfur cluster damage by the superoxide radical in neural tissues of the SOD1(G93A) ALS rat model. Free Radical Biology & Medicine. 96, 313-322 (2016).
- Stamenković, S., et al. In vivo EPR pharmacokinetic evaluation of the redox status and the blood brain barrier permeability in the SOD1(G93A) ALS rat model. Free Radical Biology & Medicine. 108, 258-269 (2017).
- Stamenković, S., Dučić, T., Stamenković, V., Kranz, A., Andjus, P. R. Imaging of glial cell morphology, SOD1 distribution and elemental composition in the brainstem and hippocampus of the ALS hSOD1(G93A) rat. Neuroscience. 357, 37-55 (2017).
- Milošević, M., et al. Immunoglobulins G from sera of amyotrophic lateral sclerosis patients induce oxidative stress and upregulation of antioxidative system in BV-2 microglial cell line. Frontiers in Immunology. 8, 1619 (2017).
- Boillée, S., Cleveland, D. W. Revisiting oxidative damage in ALS: microglia, Nox, and mutant SOD1. Journal of Clinical Investigation. 118 (2), 474-478 (2008).
- Boillée, S., et al. Onset and progression in inherited ALS determined by motor neurons and microglia. Science. 312 (5778), 1389-1392 (2006).
- Martínez-Palma, L., et al. Mitochondrial modulation by dichloroacetate reduces toxicity of aberrant glial cells and gliosis in the SOD1G93A rat model of amyotrophic lateral sclerosis. Journal of American Society for Experimental Neurotherapeutics. 16 (1), 203-215 (2019).
- Díaz-Amarilla, P., et al. Phenotypically aberrant astrocytes that promote motoneuron damage in a model of inherited amyotrophic lateral sclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (44), 18126-18131 (2011).
- Barbosa, M., et al. Recovery of depleted miR-146a in ALS cortical astrocytes reverts cell aberrancies and prevents paracrine pathogenicity on microglia and motor neurons. Frontiers in Cell Developmental Biology. 9, 634355 (2021).
- Gomes, C., et al. Astrocyte regional diversity in ALS includes distinct aberrant phenotypes with common and causal pathological processes. Experimental Cell Research. 395 (2), 112209 (2020).
- Kovacs, M., et al. CD34 identifies a subset of proliferating microglial cells associated with degenerating motor neurons in ALS. International Journal of Molecular Sciences. 20 (16), 3880 (2019).
- Komiya, H., et al. Ablation of interleukin-19 improves motor function in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Molecular Brain. 14 (1), 1-13 (2021).
- Trias, E., et al. Emergence of microglia bearing senescence markers during paralysis progression in a rat model of inherited ALS. Frontiers in Aging Neuroscience. 10, 1-14 (2019).
- Pullen, A. H., Demestre, M., Howard, R. S., Orrell, R. W. Passive transfer of purified IgG from patients with amyotrophic lateral sclerosis to mice results in degeneration of motor neurons accompanied by Ca2+ enhancement. Acta Neuropatholgica. 107 (1), 35-46 (2004).
- Obál, I., et al. Intraperitoneally administered IgG from patients with amyotrophic lateral sclerosis or from an immune-mediated goat model increase the levels of TNF-α, IL-10 in the spinal cord and serum of mice. Journal of Neuroinflammation. 13 (1), 121 (2016).
- Obál, I., et al. Experimental motor neuron disease induced in mice with long-term repeated intraperitoneal injections of serum from ALS patients. International Journal of Molecular Sciences. 20 (10), 2573 (2019).
- Mohamed, H. A., et al. Immunoglobulin Fc gamma receptor promotes immunoglobulin uptake, immunoglobulin-mediated calcium increase, and neurotransmitter release in motor neurons. Journal of Neuroscience Research. 69 (1), 110-116 (2002).
- Engelhardt, J. I., Siklos, L., Appel, S. H. Altered calcium homeostasis and ultrastructure in motoneurons of mice caused by passively transferred anti-motoneuronal IgG. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 56 (1), 21-39 (1997).
- Pagani, M. R., Reisin, R. C., Uchitel, O. D. Calcium signaling pathways mediating synaptic potentiation triggered by amyotrophic lateral sclerosis IgG in motor nerve terminals. Journal of Neuroscience. 26 (10), 2661-2672 (2006).
- Carter, J. R., Mynlieff, M. Amyotrophic lateral sclerosis patient IgG alters voltage dependence of Ca2+ channels in dissociated rat motoneurons. Neuroscience Letters. 353 (3), 221-225 (2003).
- Fratantoni, S. A., Weisz, G., Pardal, A. M., Reisin, R. C., Uchitel, O. D. Amyotrophic lateral sclerosis IgG-treated neuromuscular junctions develop sensitivity to L-type calcium channel blocker. Muscle & Nerve. 23 (4), 543-550 (2000).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).
- Vay, S. U., et al. The impact of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) and voltage-gated potassium KCNQ/Kv7 channels on primary microglia function. Journl of Neuroinflammation. 17 (1), 100 (2020).
- Bijelić, D. D., et al. Central nervous system-infiltrated immune cells induce calcium increase in astrocytes via astroglial purinergic signaling. Journal of Neuroscience Research. 98 (11), 2317-2332 (2020).
- Kawamata, H., et al. Abnormal intracellular calcium signaling and SNARE-dependent exocytosis contributes to SOD1G93A astrocyte-mediated toxicity in amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Neuroscience. 34 (6), 2331-2348 (2014).
- Nims, R. W., Price, P. J. Best practices for detecting and mitigating the risk of cell culture contaminants. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 53 (10), 872-879 (2017).
- Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of Visualized Experiments. (71), e50079 (2013).
- Adzic, M., et al. Extracellular ATP induces graded reactive response of astrocytes and strengthens their antioxidative defense in vitro. Journal of Neuroscience Research. 95 (4), 1053-1066 (2017).
- Jurga, A. M., Paleczna, M., Kuter, K. Z. Overview of general and discriminating markers of differential microglia phenotypes. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 198 (2020).
- Butovsky, O., et al. Identification of a unique TGF-β-dependent molecular and functional signature in microglia. Nature Neuroscince. 17 (1), 131-143 (2014).
- Vankriekelsvenne, E., et al. Transmembrane protein 119 is neither a specific nor a reliable marker for microglia. Glia. 70 (6), 1170-1190 (2022).
- Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D.
