Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Модель грызунов, индуцированная TNBS, для изучения патогенной роли механического стресса при болезни Крона

Published: March 1, 2022 doi: 10.3791/63499
Automatic Translation
*1, *1, *1, 2, 1
1Department of Internal Medicine, the University of Texas Medical Branch, 2Department of Pathology, the University of Texas Medical Branch
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Настоящий протокол описывает развитие модели колита, подобной модели колита Крона, у грызунов. Трансмуральное воспаление приводит к стенозу в месте инстилляции ТНБС, а механическое увеличение наблюдается в сегменте, близком к стенозу. Эти изменения позволяют изучать механические нагрузки при колите.

Abstract

Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК), такие как болезнь Крона (БК), являются хроническими воспалительными заболеваниями желудочно-кишечного тракта, затрагивающими примерно 20 на 1 000 000 в Европе и США. CD характеризуется трансмуральным воспалением, фиброзом кишечника и люминальным стенозом. Хотя противовоспалительные методы лечения могут помочь контролировать воспаление, они не эффективны при фиброзе и стенозе при БК. Патогенез БК не совсем понятен. Текущие исследования сосредоточены в основном на описании механизмов дисрегулируемого иммунного ответа кишечника. В то время как CD-ассоциированное трансмуральное воспаление, фиброз кишечника и люминальный стеноз представляют собой механическое напряжение для стенки кишечника, роль механического напряжения при CD четко не определена. Чтобы определить, играет ли механическое напряжение независимую патогенную роль в БК, был разработан протокол модели CD-подобного колита, вызванной TNBS, у грызунов. Эта модель трансмурального воспаления и фиброза, вызванная TNBS, напоминает патологические признаки CD в толстой кишке. Он индуцируется интраколонической инстилляцией TNBS в дистальную толстую кишку взрослых крыс Sprague-Dawley. В этой модели трансмуральное воспаление приводит к стенозу в месте инстилляции TNBS (сайт I). Механическое растяжение наблюдается в участке, расположенном ближе к месту инстилляции (участок Р), представляя собой механическое напряжение, но не видимое воспаление. Кишечная часть дистальнее воспаления (участок D) не представляет ни воспаления, ни механического напряжения. Наблюдались отличительные изменения экспрессии генов, иммунного ответа, фиброза и роста гладких мышц на разных участках (P, I и D), что подчеркивает глубокое воздействие механического напряжения. Таким образом, эта модель CD-подобного колита поможет нам лучше понять патогенные механизмы CD, в частности, роль механического стресса и механической экспрессии генов, вызванной стрессом, в иммунной дисрегуляции, кишечном фиброзе и ремоделировании тканей в CD.

Introduction

Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК), включая язвенный колит (UC) и болезнь Крона (CD), характеризуются хроническим воспалением в желудочно-кишечном тракте (GI). Он затрагивает ~1-2 миллиона американцев1. Предполагаемые ежегодные расходы на лечение ВЗК в США составляют 11,8 миллиарда долларов. В отличие от UC, CD характеризуется трансмуральным воспалением и стриктурным образованием 2,3. Стриктурное образование (стеноз) встречается у 70% больных БК3 и может быть вызвано трансмуральным воспалением (воспалительный стеноз) или фиброзом кишечника (фиброзным стенозом)4,5. Фиброз кишечника характеризуется чрезмерным отложением коллагена и других внеклеточных матриц (ECM) с гладкомышечными клетками (SMC) как одним из основных типов мезенхимальных клеток, участвующих в процессе 3,4. Гиперплазия гладкой мускулатуры, связанная с гипертрофией, является еще одним значительным гистологическим изменением фиброзного стеноза в CD6. Хотя образование стриктуры при БК связано с хроническим воспалением, никакое противовоспалительное лечение не является эффективным, за исключением хирургического лечения 2,6. Однако послеоперационные рецидивы составляют почти 100%, при наличии достаточного времени 2,7. Как воспалительная реакция, фиброз и гиперплазия SMC могут также развиваться при невоспалительных состояниях (т.е. непроходимости кишечника) в кишечнике 8,9; считается, что в формировании стриктуры участвуют как воспаление зависимые, так и независимые механизмы 3,4. Учитывая, что обширные исследования воспалительных механизмов не привели к какой-либо эффективной терапии образования стриктур, необходимы исследования возможной роли независимых от воспаления механизмов в кишечном фиброзе.

Как невоспалительный фактор, механическое напряжение (РС), связанное с отеком, воспалительной инфильтрацией клеток, деформацией тканей, фиброзом и стенозом 10,11,12,13, обычно встречается при ВЗК, особенно БК, который характеризуется трансмуральным воспалением. Механическое напряжение наиболее примечательно при стенозивном БК, где стеноз (воспалительный или фиброзный) в месте воспаления представляет собой механическое напряжение в местной ткани и приводит к растяжению просвета в сегменте, близком к местуобструкции 10,14. Предыдущие исследования in vitro показали, что механическое напряжение изменяет экспрессию генов специфических медиаторов воспаления (например, ЦОГ-2, IL-6)8,14,15 и факторов роста (т.е. TGF-β) в тканях желудочно-кишечного тракта, особенно в гладкомышечных клетках кишечника (SMC)16. Недавние исследования также показали, что экспрессия специфических профиброзных медиаторов, таких как фактор роста соединительной ткани (CTGF), очень чувствительна к механическому напряжению17,18. Было выдвинуто предположение, что механическое напряжение может играть независимую патогенную роль в CD-ассоциированном воспалении, фиброзе и ремоделировании тканей. Тем не менее, патогенное значение механического стресса при воспалении кишечника, фиброзе и гиперплазии гладких мышц при БК остается в значительной степени неисследованным. Это может быть отчасти потому, что воспаление является более заметным и лучше изученным процессом, чем механическое воздействие. Что еще более важно, не было четко определенной животной модели ВЗК, чтобы отличить эффект механического стресса от эффекта воспаления.

В настоящей работе описана грызуновая модель кроноваподобного колита, индуцированного интраколонизацией гаптен-реагента 2,4,6-тринитробензоловой сульфоновой кислоты (TNBS)19,20, который может служить целью изучения роли механического напряжения в CD. Установлено, что инстилляция ТНБС индуцировала локализованное (~2 см в длину) трансмуральное воспаление с сужением просвета (стенозом) в дистальной части толстой кишки. Стеноз приводит к выраженному растяжению кишечника (механическому напряжению)14,15, но не видимому воспалению в сегменте толстой кишки, близком к месту инстилляции. Напротив, сегмент толстой кишки дистальнее места стеноза не представляет ни воспаления, ни механического напряжения. Значительные сайт-специфические изменения в экспрессии генов, воспаление, фиброз и гиперплазия SMC наблюдались в трех разных участках. Результаты показывают, что механическое напряжение, особенно механическая экспрессия генов, вызванная стрессом, может играть решающую роль в развитии фиброза и гиперплазии при колите Крона.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Медицинского отделения Техасского университета (#0907051C). Для исследования использовались самцы или самки крыс Sprague-Dawley, ~ 8-9 недель.

1. Подготовка животных

  1. Быстрые крысы в течение 24 ч и обрабатывают их слабительным (очищающим средством для кишечника, см. Таблицу материалов) на ночь.
  2. На следующий день обезболивают крыс с помощью анестезиологической системы (см. Таблицу материалов), подвергая их воздействию 2% изофлурана вместе с 1 л/мин кислорода во время введения TNBS. Проверьте наличие рефлексов или защемления пальцев ног, чтобы подтвердить анестезию.
  3. Приготовьте свежий раствор TNBS в соответствии с массой тела.
    ПРИМЕЧАНИЕ: TNBS - 65 мг/кг массы тела в 250 мкл 40% этанола.
  4. Поставьте крыс в лежачее положение на столе для анестезии. Чтобы вызвать колит, вставьте через анус медицинский полиуретановый катетер открытого класса на ~ 7-8 см от анальной грани и осторожно закапывают TNBS (подготовленный на этапе 1.3) в толстую кишку19. Вводите фиктивным контрольным крысам только с 250 мкл физиологического раствора.
  5. После закапывания TNBS или физиологического раствора держите крыс в лежачем и слегка опущенном положении (~ 30 °), с закрытым анусом в течение 2 минут, чтобы помочь распределению TNBS и избежать разливов.
  6. Обеспечьте крыс пищей и водой ad libitum в течение 7 дней и ежедневно наблюдайте за массой тела, потреблением пищи, калом и общим состоянием здоровья.

2. Тканевые препараты

  1. В день эвтаназии усыпляют крыс с помощью ингаляцииСО2 и подтверждают эвтаназию с вывихом шейки матки.
  2. Откройте брюшко крысы с помощью хирургических ножниц и щипцов.
  3. Осторожно удалите всю толстую кишку (над анальным каналом) и немедленно перенесите толстую кишку в ледяной буфер HBSS 1x.
  4. Выпрямите двоеточие в буфере и измерьте длину двоеточия с помощью линейки. Возьмите нейлоновую нить и обведите вокруг толстой кишки, чтобы измерить внешнюю окружность сегментов толстой кишки в контроле и крысах, обработанных TNBS. Возьмите ткани полной толщины для гистологии.
  5. Разрежьте толстую кишку вдоль брыжеечной доски и хорошо очистите толстую кишку буфером HBSS. Оцените оценку толстой кишки для макроскопического воспаления на основе критериев, какописано ранее 19 с минимальными изменениями.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 0 = нормальная слизистая оболочка; 1 = локализованная гиперемия, но без эрозий или язв; 2 = язва и стеноз (пораженный участок < 5 мм); 3 = тяжелая язва, рубец и стеноз (пораженный участок > 5 мм).
  6. Соберите образцы ткани толстой кишки из участка P (часть 2-3 см до орального края участка воспаления), участка I (место воспаления, обычно в 4-6 см от конца толстой кишки, куда закапывается TNBS) и участка D (часть 1-2 см дистальнее аборального края участка воспаления), соответственно у крыс, обработанных TNBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ткань толстой кишки ~1-2 см длиной была взята из каждого сегмента. Кроме того, ткани толстой кишки длиной 2 см (~ 4-6 см от конца толстой кишки) крыс, обработанных физиологическим раствором, были взяты в качестве фиктивного контроля (S) (Рисунок 1).
  7. Берут образцы тканей с каждого участка для подготовки полной толщины, а при желании – слои слизистой оболочки/подслизистой и мускулистой наружной оболочки соответственно, а также21,22.
  8. Сначала заморозьте образцы тканей в жидком азоте, прежде чем хранить их при -80 °C для хранения до одного года и для будущих целей (т.е. препаратов РНК).

3. Гистопатологическая оценка воспаления кишечника и фиброза

  1. Зафиксируют ткани толстой кишки полной толщины в 10% формалине в течение 48 ч, затем переводят на 70% этанол в течение 24-48 ч.
  2. Используйте микротом для вырезания парафиновых срезов толщиной 5 мкм для гематоксилина и эозина (H&E) и трихромовых пятен Массона 6,19,23 (см. Таблицу материалов) соответственно.
  3. Получайте и просматривайте изображения с помощью вертикального микроскопа, оснащенного камерой высокого разрешения с совместимым программным обеспечением (см. Таблицу материалов).
  4. Оценка индексов воспаления и фиброза двумя независимыми исследователями, включая желудочно-кишечного хирургического патологоанатома в соответствии с критериями, описанными ранее 6,23 с изменениями. Оценки см. в дополнительном файле 1.
  5. Измерьте толщину и количество ячеек круговых и продольных мышечных слоев на поперечное сечение в четырех видах каждого окрашенного H&E образца и возьмите среднее значение четырех измерений для каждого образца.

4. Экстракция РНК и количественная ОТ-ПЦР

  1. Гомогенизировать иссеченные ткани толстой кишки, полученные из фиктивного контроля и трех участков (P, I, D) крыс с колитом TNBS в экстракционном реагенте набора для экстракции РНК (см. Таблицу материалов).
  2. Изолируйте РНК из каждого образца, используя набор. Элюируют гранулы РНК в 30 мкл рпазной воды.
  3. Количественная оценка концентрации РНК и проверка чистоты с помощью микрообъемного спектрофотометра UV-Vis (см. Таблицу материалов).
  4. Используйте 1 мкг общей РНК для синтеза кДНК21,22 с использованием набора синтеза РНК (см. Таблицу материалов).
  5. Анализируйте и количественно оценивайте уровни экспрессии генов, выполняя ПЦР в режиме реального времени с 50 нг кДНК в качестве шаблона, зондами IL-6 и CTGF с использованием коммерческого набора ПЦР для системы ПЦР в реальном времени (см. Таблицу материалов).
  6. Используйте контрольную рРНК гена 18S для нормализации образцов и количественной оценки относительной экспрессии генов, используя полученные значения Cq.

5. Статистический анализ

  1. Используйте программное обеспечение для статистического анализа (см. Таблицу материалов) для сравнения фиктивного контроля и крыс с колитом TNBS.
  2. Считать значение p < 0,05 статистически значимым15,19.
  3. Чтобы проверить различия между двумя группами, используйте t-тестовый анализ Student и выполните тест ANOVA, если сравнения более двух групп15,19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Макроскопический взгляд на подобный колит Крона, индуцированный внутриколонной инстилляцией ТНБС
Как показано на рисунке 1, интраколоническая инстилляция ТНБС у крыс вызывала локализованное трансмуральное воспаление (~2 см в длину) с утолщенной стенкой кишечника и суженным просветом (стенозом) в месте закапывания в дистальной части толстой кишки (Рисунок 1А). Сайт инстилляции ТНБС называется сайтом I. В результате трансмурального воспаления и стеноза в месте I присутствуют как воспаление, так и механическое напряжение. Стеноз в месте I приводил к выраженному растяжению просвета в сегменте, близком к месту инстилляции ТНБС (участок Р) (рисунок 1). Окружность толстой кишки была значительно увеличена в участках P и I по сравнению с фиктивной контрольной толстой кишкой (p < 0,05 по сравнению с контролем) (рисунок 1B). Несмотря на механическое растяжение, участок P не показывал видимого воспаления. Напротив, сегмент толстой кишки дистальнее места инстилляции TNBS является участком D и не представляет ни воспаления, ни механического растяжения (рисунок 1A,B).

Чтобы помочь отличить эффект механического напряжения от воспаления, мы следовали уникальному дизайну при сборе образцов тканей из толстой кишки в модели, описанной на этапе 2.6. Участок P является основным направлением исследования, так как эта часть механически растянута в модели CD. Участок D является самоконтролем, так как не представляет механического напряжения. Участки P и D не демонстрируют видимого воспаления (рисунок 1). Однако участок I испытывает воспаление и механическое напряжение (рисунок 1).

Сайт-специфические изменения показателя воспаления в участках P, I и D у крыс с колитом
Критерии были разработаны при классификации воспаления на основе макроскопической оценки живой ткани (0-3)19 и микроскопической оценки окрашенных образцов H&E (0-3)23 , как описано с модификациями. Результаты показали, что макроскопический показатель воспаления в месте I составил 2,70 ± 0,20 у крыс, получавших TNBS (через 7 дней после индукции воспаления), резко увеличился по сравнению с фиктивной контрольной группой (0,30 ± 0,22, p < 0,05) и у участков P (0,80 ± 0,26) и D (0,50 ± 0,22) крыс с колитом (рисунок 1C). Показатели воспаления в местах P и D значительно не увеличиваются по сравнению с фикцией (рисунок 1C). Микроскопическая визуализация показала вызванное лечением TNBS трансмуральное воспаление у крыс (рисунок 2A). Микроскопическая оценка воспаления в месте I составила 2,80 ± 0,27 у крыс, получавших TNBS, опять же значительно (p < 0,05, n = 5 в каждой группе) увеличилась по сравнению с контрольной группой (0,3 ± 0,2) и в местах P (1,0 ± 0,31) и D (0,80 ± 0,38) крыс с колитом. Показатели воспаления в местах P и D не были значительно увеличены по сравнению с фикцией (рисунок 2C).

Сайт-специфические изменения фиброза и гиперплазии гладких мышц и гипертрофии у участков P, I и D у крыс с колитом
Оценка фиброза была определена на основе трихромного пятна Мейсона (рисунок 2B) в разных участках (P, I, D) (рисунок 2A). Система классификации фиброза описана в дополнительном файле 1. Было установлено, что показатель фиброза значительно повышен не только у участка I (2,60 ± 0,25), но и у участка Р (1,60 ± 0,24) крыс колита, по сравнению с фиктивным контролем (0,40 ± 0,25. p < 0,05) (рисунок 2D). Толщина и количество клеток круглых и продольных гладко мускулистых слоев были измерены в разных местах в окрашенных образцах H&E (4 вида на образец). Толщина и количество клеток как круговых, так и продольных гладкомышечных слоев были значительно увеличены в участках I и P (рисунок 2E, F). Участок D у крыс с колитом не показывает какого-либо значительного увеличения показателя фиброза, количества гладкомышечных клеток или толщины мышц (рисунок 2).

Сайт-специфическая экспрессия механочувствительных генов в сайтах P, I и D у крыс с колитом
IL-6 играет решающую роль в воспалении кишечника, поскольку он способствует дифференцировке Т-клеток, повреждает барьерную функцию и влияет на нервно-мышечную функцию 8,24. CTGF является хорошо признанным профиброзным медиатором, так как его ингибирование может обратить вспять процесс фиброза17. Что еще более важно, недавние исследования показали, что экспрессия генов IL-6 и CTGF очень чувствительна к механическому стрессу 8,14,18. Сайт-специфическую экспрессию IL-6 и CTGF мРНК определяли в ткани полной толщины фиктивного контроля и крыс с колитом TNBS. Уровни экспрессии мРНК IL-6 и CTGF были значительно увеличены в месте воспаления (участке I) по сравнению с фиктивной контрольной группой. В месте P, где наблюдается механическое растяжение, но нет видимого воспаления, экспрессия мРНК IL-6 и CTGF также была резко увеличена по сравнению с контрольными крысами (рисунок 3A, B). Однако уровни мРНК IL-6 и CTGF в месте D крыс с колитом существенно не отличались от уровней в фиктивной контрольной группе (рисунок 3).

Figure 1
Рисунок 1: Модель Грызунов CD-подобного колита, вызванного TNBS (7 дней). (A) Перспективный вид фиктивного контроля и обработанной TNBS толстой кишки (вверху) и макроскопический вид слизистой поверхности дистальной части толстой кишки (снизу). Желтые поля указывают на различные участки ткани толстой кишки. S, фиктивный контроль; I, место воспаления; P, растянутый участок толстой кишки проксимально к месту воспаления; D, нерастянутый участок дистальнее воспаления. (B) Окружность толстой кишки в фиктивном контроле и различные участки (P, I, D) толстой кишки, обработанной TNBS. (C) Оценка макроскопического воспаления фиктивной контрольной толстой кишки и различных участков толстой кишки, обработанной TNBS. n = 5, *p < 0,05 против фиктивных крыс группы. Полосы представляют SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Гистопатологическая оценка. Микроскопические изображения в H&E (A) и трихромных пятнах Массона (B), показывающие распределение коллагена в фиктивных и различных участках крыс колита. Количественный анализ показывает увеличение микроскопического индекса воспаления (C), фиброза (D) и мышечной толщины (гипертрофия) (E), а также числа гладкомышечных клеток (гиперплазия) (F) в участках I и P, но не D, у крыс, получавших TNBS. В (E) и (F) открытые стержни предназначены для круглого гладкомышечного слоя, а полосатые стержни - для продольного слоя гладких мышц. n = 5 в каждой группе, *p < 0,05 против. фиктивные крысы группы. Полосы на графиках представляют SEM. Бары в (A) и (B) = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Сайт-специфическая экспрессия механочувствительных генов (IL-6 и CTGF) при CD-подобном колите. (A) Экспрессия мРНК IL-6 в фиктивной контрольной толстой кишке и различных участках (P, I и D) обработанного TNBS колита толстой кишки. (B) Экспрессия мРНК CTGF в фиктивной контрольной толстой кишке и различных участках (P, I и D) толстой колита, обработанной TNBS. n = 4 или 5, *p < 0,05 против. S (фиктивный контроль). Полосы представляют SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный файл 1: Оценка воспаления и фиброза. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

TNBS-индуцированный колит был введен в 1989 году и с тех пор используется в качестве экспериментальной модели болезни Крона 19,20,23. Существенные особенности этой модели у грызунов включают развитие трансмурального воспаления, которое очень напоминает гистопатологические поражения, развившиеся при болезни Крона человека19,20. Предыдущие исследования модели были сосредоточены в основном на аберрантном иммунном ответе в слое слизистой оболочки в месте видимого воспаления (участок I)19,20,23. Мало внимания уделялось участкам кишечника проксимальным и дистальным к воспалению. Настоящее исследование участка воспаления, а также растянутого проксимального сегмента и нерастянутого дистального сегмента, выявляет очевидные сайт-специфические изменения в экспрессии генов, воспалительной реакции и гистопатологических особенностях. Модель была пересмотрена для рассмотрения потенциальной патогенной роли механического стресса при фиброзе и ремоделирования тканей при болезни Крона.

Установлено, что острое воспаление развивается сразу после воздействия TNBS на слизистую оболочку в этаноле и достигает пика на 319 день. Присутствует трансмуральное воспаление и воспалительный стеноз, что связано с растяжением просвета в месте Р у каждой крысы, получавшей ТНБС. К 7-му дню хроническое трансмуральное воспаление хорошо развито в месте I, как обнаружено в текущем исследовании и сообщено в другом месте20. Между тем, фиброзные изменения очевидны в этом месте, характеризующемся чрезмерным отложением коллагена, как видно из настоящего исследования и в других местах20. Закапывание ТНБС в этанол в дистальной части толстой кишки повреждает местную ткань слизистой оболочки23 и приводит к трансмуральному воспалению в локализованной области в толстой кишке. Трансмуральное воспаление с воспалительной инфильтрацией, отеком и деформацией тканей 10,12,13 в месте инстилляции присутствует воспаление и механическое напряжение 14 в локализованной области (участок I). Кроме того, трансмуральное воспаление также вызывает люминальный стеноз в месте I10. Установлено, что стеноз, частичная непроходимость кишечника, вызывает механическое растяжение в проксимальном сегменте (участок Р). Однако часть дистальности к месту инстилляции не растянута (участок D). Как обнаружено в макроскопических и гистологических системах оценки, в то время как сайт I представляет как воспаление, так и механическое напряжение, участки P и D не представляют воспаления. Кроме того, участок P показывает значительно увеличенную окружность (и, следовательно, механическое напряжение, согласно закону Лапласа14), но участок D этого не делает. Таким образом, исследование специфических для сайта изменений, особенно участка P, будет изучать патогенную важность механического напряжения в модели воспаления в кишечнике.

Было замечено, что экспрессия механочувствительных генов IL-6 и CTGF была увеличена в месте I и в механически растянутом участке P, но не в соседнем участке D, где нет механического растяжения. Для изучения гипотезы о том, что механическое напряжение может способствовать развитию фиброза и гиперплазии гладкой мускулатуры, оценивали показатели фиброза и измеряли количество гладкомышечных клеток и толщину мышц в участках P, I и D. Установлено, что фиброз и гиперплазия SMC присутствуют в участках I и P. Однако фиброз и гиперплазия гладкой мускулатуры не обнаруживаются в месте D. Эти данные свидетельствуют о том, что механическое напряжение может играть независимую патогенную роль в синтезе коллагена и пролиферации клеток при воспалении кишечника. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы определить, может ли этот эффект быть опосредован механической стресс-индуцированной экспрессией профиброзных факторов и факторов роста, таких как CTGF в участках P и I.

Хотя описанная животная модель сама по себе может быть использована для устранения механического напряжения при стенозирующем CD-подобном колите, она имеет ограничения в долгосрочной перспективе, чтобы полностью определить патогенную роль механического стресса в воспалении. Например, эффекты механического напряжения и воспаления в месте I описываемой модели не могут быть дифференцированы. Хотя предполагается, что механическое напряжение присутствует в месте I из-за воспалительной инфильтрации, деформации тканей, стеноза и растяжения, насколько механическое напряжение способствует патологическим изменениям, определить невозможно. Могут потребоваться дальнейшие комплексные исследования с использованием подходов in vitro, in vivo и ex vivo. Например, предотвращение механического растяжения путем кормления животных с колитом исключительно прозрачной жидкой диетой25 может помочь создать статус потери механического растяжения в модели колита. С другой стороны, индукция чисто механического растяжения полосой обструкции15 может помочь создать модель усиления механических напряжений. Кроме того, модель механического растяжения in vitro в культивируемых клетках 14,15 помогает в количественном определении влияния механического напряжения на экспрессию и функцию генов, поскольку режим и степень механического напряжения могут точно контролироваться в условиях in vitro.

Для подготовки воспроизводимой модели трансмурального и стенотического воспаления при CD-подобном колите, как описано в исследовании, необходимо использовать TNBS при 65 мг/кг в 250 мкл 40% этанола. Модель тестировалась в основном на крысах, самцах или самках, в возрасте 8-9 недель. После инстилляции ТНБС в дозе постоянно развивается трансмуральное воспаление в месте местной инстилляции. Воспаление связано с инфильтрацией воспалительных клеток, отеком и утолщением стенки кишечника, что приводит к сужению просвета в месте инстилляции, напоминающему патологические характеристики болезни Крона20. Пилотные исследования в лаборатории показали, что TNBS в дозах ниже 50 мг / кг в том же объеме 40% этанола может вызвать воспаление кишечника, но не надежный стеноз в месте I. Таким образом, на участке Р не было бы явного механического растяжения. С другой стороны, TNBS в дозах более 80 мг / кг может вызвать сильное воспаление и смертельные исходы. Текущий протокол с использованием TNBS при 65 мг/кг в 250 мкл 40% этанола вряд ли приводит к смертельным исходам (1 из 16 крыс с колитом TNBS).

Было установлено, что очищение кишечника за день до закапывания ТНБС является важным шагом для обеспечения относительно чистой толстой кишки для надежной модели стенотического колита. Для этого крысы должны голодать в течение 24 ч и давать очищающее средство для кишечника на ночь перед лечением TNBS. Также важно держать крыс в лежачем и слегка опущенном головой положении с закрытым анусом в течение 2 мин после закапывания ТНБС. Это помогает обеспечить хорошее распределение TNBS внутри дистальной толстой кишки.

Таким образом, было установлено, что внутриколонная инстилляция TNBS при 65 мг/кг в 250 мкл 40% этанола последовательно вызывала у крыс CD-подобный колит. Трансмуральное воспаление в модели связано со стенозом в месте инстилляции TNBS. Механическое растяжение, но не воспаление, наблюдается в сегменте, близком к стенозу. Ни воспаление, ни механическое напряжение не присутствуют в сегменте, дистальном к стенозу. С этими изменениями в различных участках толстой кишки у крысы с колитом можно различить механическое напряжение от воспаления при CD-подобном колите.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не сообщают о конфликте интересов и им нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа частично поддерживается грантами NIH (R01 DK124611 для XZS) и Министерства обороны США (W81XWH-20-1-0681 для XZS). Гистологические работы проводились с помощью Лаборатории хирургической патологии UTMB.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ACT-1 Control Software Ver2.63 Nikon DXM1200F
C1000 Touch Thermal Cycler with 96-Well Fast Reaction Module BIO-RAD 1851196
CFX96 Optical Reaction Module for Real-Time PCR Systems BIO-RAD 1845097
Dako Agilent Artisan Link Pro Special stainer Dako AR310
Dako-Agilent Masson's Trichrome Kit ref# AR173 Dako AR173
DXM1200 Digital Color HR Camera Nikon DXM1200
Eukaryotic 18S rRNA Endogenous Control ThermoFisher Scientific 4352930E
E-Z Anesthesia E-Z Systems Inc. EZ-155
GraphPad Prism 9 GraphPad 9.0.2 (161)
Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, white/clear BIO-RAD HSP9601
HBSS (Corning Hank's Balanced Salt Solution, 1x without calcium and magnesium) CORNING 21-021-CV
HM 325 Microtome Thermo Scientific 23-900-667
Isoflurane Piramal NDC 66794-017-10
LI-COR Odyssey Digital Imaging System LI-COR 9120
Mastercycler epGradient Thermal Cycler with Control Panel 5340 Thermal Cycler Eppendorf 5341
Medical grade open end polyurethane catheter Covidien 8890703013
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers Thermo Fisher Scientific ND2000CLAPTOP
Nikon Eclipse E800 Upright Microscope Nikon E800
Nitrocellulose/Filter Paper Sandwiches Pkg of 50, 0.45 μm, 7 x 8.5 cm BIO-RAD 1620215
Polyethylene Glycol 3350, Osmotic Laxative Miralax C8175 Dose: 17g in 226 mL of water
RNeasy Mini Kit (250)
250 RNeasy Mini Spin Columns, Collection Tubes (1.5 mL and 2 mL), RNase-free Reagents and Buffers		 QIAGEN 74106
SuperScript III First-Strand Synthesis System ThermoFisher Scientific 18080051
TaqMan Gene Expression Assays Rn00573960_g1 CTGF Probe ThermoFisher Scientific 4331182
TaqMan Gene Expression Assays Rn99999011_m1 IL6 Probe ThermoFisher Scientific 4331182
TaqMan Fast Advanced Master Mix ThermoFisher Scientific 4444557
Tissue-Tek Prisma H&E Stain Kit #1 Sakura 6190
Tissue-Tek Prisma Plus Automated Slide Stainer Sakura 6171
TNBS (Picrylsulfonic acid solution) SIGMA-ALDRICH 92822

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kappelman, M. D., et al. The prevalence and geographic distribution of Crohn's disease and ulcerative colitis in the United States. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 5 (12), 1424-1429 (2007).
  2. Hwang, J. M., Varma, M. G. Surgery for inflammatory bowel disease. World Journal of Gastroenterology. 14 (17), 2678-2690 (2008).
  3. Latella, G., Rieder, F. Intestinal fibrosis: Ready to be reversed. Current Opinion in Gastroenterology. 33 (4), 239-245 (2017).
  4. Rieder, F., Fiocchi, C., Rogler, G. Mechanisms, management, and treatment of fibrosis in patients with inflammatory bowel diseases. Gastroenterology. 152 (2), 340-350 (2017).
  5. Bettenworth, D., et al. Assessment of Crohn's disease-associated small bowel strictures and fibrosis on cross-sectional imaging: A systematic review. Gut. 68 (6), 1115-1126 (2019).
  6. Chen, W., Lu, C., Hirota, C., Iacucci, M., Ghosh, S., Gui, X. Smooth muscle hyperplasia/hypertrophy is the most prominent histological change in Crohn's fibrostenosing bowel strictures: A semiquantitative analysis by using a novel histological grading scheme. Journal of Crohn's and Colitis. 11 (1), 92-104 (2017).
  7. Olaison, G., Smedh, K., Sjödahl, R. Natural course of Crohn's disease after ileocolic resection: Endoscopically visualised ileal ulcers preceding symptoms. Gut. 33 (3), 331-335 (1992).
  8. Lin, Y. M., Li, F., Shi, X. Z. Mechanical stress is a pro-inflammatory stimulus in the gut: In vitro, in vivo and ex vivo evidence. PLoS One. 9, 106242 (2014).
  9. Gabella, G., Yamey, A. Synthesis of collagen by smooth muscle in the hyertrophic intestine. Experimental Physiology. 62 (3), 257-264 (1977).
  10. Katsanos, K. H., Tsianos, V. E., Maliouki, M., Adamidi, M., Vagias, I., Tsianos, E. V. Obstruction and pseudo-obstruction in inflammatory bowel disease. Annals of Gastroenterology. 23 (4), 243-256 (2010).
  11. Johnson, L. A., et al. Matrix stiffness corresponding to strictured bowel induces a fibrogenic response in human colonic fibroblasts. Inflammatory Bowel Disease. 19 (5), 891-903 (2013).
  12. Gayer, C. P., Basson, M. D. The effects of mechanical forces on intestinal physiology and pathology. Cell Signalling. 21 (8), 1237-1244 (2009).
  13. Cox, C. S., et al. Hypertonic saline modulation of intestinal tissue stress and fluid balance. Shock. 29 (5), 598-602 (2008).
  14. Shi, X. Z. Mechanical regulation of gene expression in gut smooth muscle cells. Frontiers in Physiology. 8, 1000 (2017).
  15. Shi, X. Z., Lin, Y. M., Powell, D. W., Sarna, S. K. Pathophysiology of motility dysfunction in bowel obstruction: Role of stretch-induced COX-2. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 300 (1), 99-108 (2011).
  16. Gutierrez, J. A., Perr, H. A. Mechanical stretch modulates TGF-beta1 and alpha1(I) collagen expression in fetal human intestinal smooth muscle cells. American Journal of Physiology. 277 (5), 1074-1080 (1999).
  17. Lipson, K. E., Wong, C., Teng, Y., Spong, S. CTGF is a central mediator of tissue remodeling and fibrosis and its inhibition can reverse the process of fibrosis. Fibrogenesis Tissue Repair. 5, Supp 1 24 (2012).
  18. Chaqour, B., Goppelt-Struebe, M. Mechanical regulation of the Cyr61/CCN1 and CTGF/CCN2 proteins. The FEBS Journal. 273 (16), 3639-3649 (2006).
  19. Shi, X. Z., Winston, J. H., Sarna, S. K. Differential immune and genetic responses in rat models of Crohn's colitis and ulcerative colitis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 300 (1), 41-51 (2011).
  20. Antoniou, E., et al. The TNBS-induced colitis animal model: An overview. Annals of Medicine and Surgery (London). 11, 9-15 (2016).
  21. Shi, X. Z., Sarna, S. K. Gene therapy of Cav1.2 channel with VIP and VIP receptor agonists and antagonists: A novel approach to designing promotility and antimotility agents. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 295 (1), 187-196 (2008).
  22. Lin, Y. M., Sarna, S. K., Shi, X. Z. Prophylactic and therapeutic benefits of COX-2 inhibitor on motility dysfunction in bowel obstruction: Roles of PGE2 and EP receptors. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 302 (2), 267-275 (2012).
  23. Morris, G. P., Beck, P. L., Herridge, M. S., Depew, W. T., Szewczuk, M. R., Wallace, J. L. Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon. Gastroenterology. 96 (3), 795-803 (1989).
  24. Mudter, J., Neurath, M. F. Il-6 signaling in inflammatory bowel disease: Pathophysiological role and clinical relevance. Inflammatory Bowel Disease. 13 (8), 1016-1023 (2007).
  25. Geesala, R., Lin, Y. M., Zhang, K., Shi, X. Z. Targeting mechano-transcription process as therapeutic intervention in gastrointestinal disorders. Frontiers in Pharmacology. 12, 809350 (2021).

Tags

Иммунология и инфекции выпуск 181

Erratum

Formal Correction: Erratum: A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn's Disease
Posted by JoVE Editors on 05/20/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn's Disease. The Introduction and Protocol were updated.

The first sentence of the Introduction was updated from:

Inflammatory bowel diseases (IBD) such as Crohn's disease (CD) are chronic inflammatory disorders of the gastrointestinal tract affecting approximately 20 per 1,00,000 in Europe and USA. CD is characterized by transmural inflammation, intestinal fibrosis, and luminal stenosis.

to:

Inflammatory bowel diseases (IBD) such as Crohn's disease (CD) are chronic inflammatory disorders of the gastrointestinal tract affecting approximately 20 per 1,000,000 in Europe and USA. CD is characterized by transmural inflammation, intestinal fibrosis, and luminal stenosis.

Step 1.3 in the Protocol was updated from:

Prepare fresh TNBS solution according to body weights.
NOTE: TNBS - 65 mg/kg of body weight in 250 µL of 40% ethanol was used.

to:

Prepare fresh TNBS solution according to body weights.
NOTE: TNBS - 65 mg/kg of body weight in 250 µL of 40% ethanol/saline was used.

Модель грызунов, индуцированная TNBS, для изучения патогенной роли механического стресса при болезни Крона
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Geesala, R., Lin, Y. M., Zhang, K.,… More

Geesala, R., Lin, Y. M., Zhang, K., Qiu, S., Shi, X. Z. A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn's Disease. J. Vis. Exp. (181), e63499, doi:10.3791/63499 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter