Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt einen chirurgischen Eingriff zur Entfernung von aufsteigender Aortenbande in einem Rattenmodell der pulmonalen Hypertonie aufgrund einer Erkrankung des linken Herzens. Diese Technik untersucht endogene Mechanismen des umgekehrten Remodells im Lungenkreislauf und im rechten Herzen und informiert so über Strategien zur Umkehrung der pulmonalen Hypertonie und / oder der rechtsventrikulären Dysfunktion.
Abstract
Pulmonale Hypertonie aufgrund von Linksherzerkrankungen (PH-LHD) ist die häufigste Form von PH, aber ihre Pathophysiologie ist schlecht charakterisiert als die pulmonale arterielle Hypertonie (PAH). Dadurch fehlen zugelassene therapeutische Interventionen zur Behandlung oder Prävention von PH-LHD. Medikamente zur Behandlung von PH bei PAH-Patienten werden für die Behandlung von PH-LHD nicht empfohlen, da ein verminderter pulmonaler Gefäßwiderstand (PVR) und ein erhöhter pulmonaler Blutfluss bei erhöhtem linksseitigen Fülldruck zu einer Dekompensation des linken Herzens und einem Lungenödem führen können. Neue Strategien müssen entwickelt werden, um die PH bei LHD-Patienten umzukehren. Im Gegensatz zu PAH entwickelt sich die PH-LHD aufgrund einer erhöhten mechanischen Belastung, die durch die Verstopfung des Blutes in den Lungenkreislauf während der Linksherzinsuffizienz verursacht wird. Klinisch normalisiert die mechanische Entlastung des linken Ventrikels (LV) durch Aortenklappenersatz bei Patienten mit Aortenstenose oder durch Implantation von LV-Hilfsmitteln bei Patienten mit Herzinsuffizienz im Endstadium nicht nur den pulmonalen arteriellen und rechtsventrikulären (RV) Druck, sondern auch die PVR und liefert somit indirekte Hinweise auf einen umgekehrten Umbau im Lungengefäßsystem. Unter Verwendung eines etablierten Rattenmodells von PH-LHD aufgrund von Linksherzinsuffizienz, ausgelöst durch Drucküberlastung mit anschließender Entwicklung von PH, wird ein Modell entwickelt, um die molekularen und zellulären Mechanismen dieses physiologischen Reverse-Remodeling-Prozesses zu untersuchen. Insbesondere wurde eine Aortenentzündungsoperation durchgeführt, die zu einer umgekehrten Umgestaltung des LV-Myokards und seiner Entladung führte. Parallel dazu war eine vollständige Normalisierung des systolischen RV-Drucks und eine signifikante, aber unvollständige Umkehrung der RV-Hypertrophie nachweisbar. Dieses Modell könnte ein wertvolles Werkzeug darstellen, um die Mechanismen des physiologischen Reverse-Remodellings im Lungenkreislauf und im RV zu untersuchen, um therapeutische Strategien zur Behandlung von PH-LHD und anderen Formen von PH zu entwickeln.
Introduction
Herzinsuffizienz ist die häufigste Todesursache in den Industrieländern und wird in den nächsten zehn Jahren voraussichtlich um 25% zunehmen. Pulmonale Hypertonie (PH) - ein pathologischer Anstieg des Blutdrucks im Lungenkreislauf - betrifft etwa 70% der Patienten mit Herzinsuffizienz im Endstadium; Die Weltgesundheitsorganisation klassifiziert PH als pulmonale Hypertonie aufgrund einer Linksherzerkrankung (PH-LHD)1. PH-LHD wird durch eine beeinträchtigte systolische und/oder diastolische linksventrikuläre (LV) Funktion ausgelöst, die zu einem erhöhten Fülldruck und einer passiven Verstopfung des Blutes in den Lungenkreislauf führt2. Obwohl zunächst reversibel, wird PH-LHD aufgrund des aktiven pulmonalen Gefäßumbaus in allen Kompartimenten des Lungenkreislaufs, d.h. Arterien, Kapillaren und Venenallmählich fixiert 3,4. Sowohl der reversible als auch der feste pH-Wert erhöhen die RV-Nachlast, was zunächst zu einer adaptiven myokardialen Hypertrophie führt, aber letztendlich zu RV-Dilatation, Hypokinese, Fibrose und Dekompensation führt, die progressiv zum RV-Ausfallführen 1,2,5,6. Als solches beschleunigt PH das Fortschreiten der Erkrankung bei Patienten mit Herzinsuffizienz und erhöht die Mortalität, insbesondere bei Patienten, die sich einer chirurgischen Behandlung durch Implantation von linksventrikulären Unterstützungsgeräten (LVAD) und/oder Herztransplantation unterziehen 7,8,9. Derzeit gibt es keine kurativen Therapien, die den Prozess des pulmonalen Gefäßumbaus umkehren könnten, so dass grundlegende mechanistische Forschung in geeigneten Modellsystemen erforderlich ist.
Wichtig ist, dass klinische Studien zeigen, dass sich PH-LHD als häufige Komplikation bei Patienten mit Aortenstenose in der frühen postoperativen Phase nach dem Aortenklappenersatzschnell verbessern kann 10. Analog dazu wurde der hohe (>3 Wood Units) präoperative pulmonale Gefäßwiderstand (PVR), der jedoch auf Nitroprussid reversibel war, nach einer Herztransplantation in einer 5-jährigen Follow-up-Studie nachhaltig normalisiert11. In ähnlicher Weise konnte eine adäquate Reduzierung sowohl der reversiblen als auch der stationären PVR und eine Verbesserung der RV-Funktion bei LHD-Patienten innerhalb weniger Monate erreicht werden, indem der linke Ventrikel mit implantierbaren pulsierenden und nicht-pulsierenden ventrikulären Unterstützungsgerätenentladen wurde 12,13,14. Derzeit sind die zellulären und molekularen Mechanismen, die den umgekehrten Umbau im Lungenkreislauf und im RV-Myokard vorantreiben, unklar. Ihr Verständnis kann jedoch wichtige Einblicke in physiologische Signalwege liefern, die therapeutisch genutzt werden können, um den Lungengefäß- und RV-Remodeling bei PH-LHD und anderen Formen von PH umzukehren.
Ein geeignetes präklinisches Modell, das die pathophysiologischen und molekularen Merkmale von PH-LHD adäquat repliziert, kann für translationale Studien bei drucküberlastinduzierter kongestiver Herzinsuffizienz aufgrund von chirurgischem Aortenbanding (AoB) bei Rattenverwendet werden 4,15,16. Im Vergleich zu einer ähnlichen Herzinsuffizienz aufgrund von Drucküberlastung im murinen Modell der transversalen Aortenverengung (TAC)17 führt die Bandenbildung der aufsteigenden Aorta über der Aortenwurzel bei AoB-Ratten nicht zu Bluthochdruck in der linken Halsschlagader, da die Bandingstelle proximal des Abflusses der linken Halsschlagader aus der Aorta ist. Infolgedessen verursacht AoB keine linksseitige neuronale Verletzung im Kortex, wie es für TAC18 charakteristisch ist und die das Studienergebnis beeinflussen kann. Im Vergleich zu anderen Nagetiermodellen von chirurgisch induziertem PH-LHD erweisen sich Rattenmodelle im Allgemeinen und AoB im Besonderen als robuster, reproduzierbarer und replizieren den für PH-LHD-Patienten charakteristischen Umbau des Lungenkreislaufs. Gleichzeitig ist die perioperative Letalität niedrig19. Erhöhte LV-Drücke und LV-Dysfunktion bei AoB-Ratten induzieren die PH-LHD-Entwicklung, was zu erhöhten RV-Drücken und RV-Umbau führt. Daher hat sich das AoB-Rattenmodell in einer Reihe früherer Studien unabhängiger Gruppen, einschließlich uns, als äußerst nützlich erwiesen, um Pathomechanismen des pulmonalen vaskulären Remodells zu identifizieren und mögliche Behandlungsstrategien für PH-LHD 4,15,20,21,22,23,24,25 zu testen.
In der vorliegenden Studie wurde das AoB-Rattenmodell verwendet, um ein chirurgisches Verfahren der Aortendebandierung zu etablieren, um Mechanismen des umgekehrten Remodells in der Lungenvaskulatur und im RV zu untersuchen. Zuvor wurden myokardiale Reverse-Remodeling-Modelle wie die Aortendebandierung bei Mäusen26 und Ratten27 entwickelt, um die zellulären und molekularen Mechanismen zu untersuchen, die die Regression der linksventrikulären Hypertrophie regulieren, und mögliche therapeutische Optionen zur Förderung der myokardialen Hypertrophie zu testen. Genesung. Darüber hinaus hat eine begrenzte Anzahl früherer Studien die Auswirkungen der Aortendebandierung auf PH-LHD bei Ratten untersucht und gezeigt, dass die Aortendebandierung die mediale Hypertrophie in pulmonalen Arteriolen umkehren, die Expression von Prä-Pro-Endothelin 1 normalisieren und die pulmonale Hämodynamik verbessernkann 27,28, was Hinweise auf die Reversibilität von PH bei Ratten mit Herzinsuffizienz liefert. Hier werden die technischen Abläufe der Banderolierchirurgie optimiert und standardisiert, z.B. durch Anwendung einer Tracheotomie anstelle einer Endotrachealintubation oder durch die Verwendung von Titanclips eines definierten Innendurchmessers für die Aortenbandage anstelle von Polypropylennähten mit einer stumpfen Nadel26,27 und sorgen so für eine bessere Kontrolle der chirurgischen Eingriffe, eine erhöhte Reproduzierbarkeit des Modells und eine verbesserte Überlebensrate.
Aus wissenschaftlicher Sicht liegt die Bedeutung des PH-LHD-Debandierungsmodells nicht nur in der Demonstration der Reversibilität des kardiovaskulären und pulmonalen Phänotyps bei Herzinsuffizienz, sondern vor allem in der Identifizierung molekularer Treiber, die einen umgekehrten Remodeling in Lungenarterien auslösen und/oder aufrechterhalten, als vielversprechende Kandidaten für zukünftiges therapeutisches Targeting.
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Protocol
Alle Verfahren wurden nach dem "Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren" (Institut für Versuchstierressourcen, 8. Auflage 2011) durchgeführt und vom Landesamt für Gesundheit und Soziales (LaGeSO), Berlin; Protokoll-Nr. G0030/18). Erstens wurde eine kongestive Herzinsuffizienz bei juvenilen Sprague-Dawley-Ratten ~100 g Körpergewicht (KG) (siehe Materialtabelle) chirurgisch induziert, indem ein Titanclip mit einem Innendurchmesser von 0,8 mm auf die aufsteigende Aorta (Aortenbandbildung, AoB) gelegt wurde, wie zuvorbeschrieben 29,30. In Woche 3 nach AoB (Abbildung 1) wurde eine Debandierungsoperation (Deb) durchgeführt, um den Clip von der Aorta zu entfernen. Die chirurgischen Eingriffe und die Validierung der PH-Umkehrung bei AoB-Ratten sind in Abbildung 1 schematisch dargestellt.
1. Chirurgische Präparate
- Sterilisieren Sie die erforderlichen chirurgischen Instrumente (Abbildung 2) durch Autoklavieren.
- Injizieren Sie der Ratte Carprofen (5 mg/kg KG) (siehe Materialtabelle) intraperitoneal (i.p.) zur Analgesie 30 Minuten vor der Operation.
- Betäubung der Ratte durch i.p. Injektion von Ketamin (87 mg/kg KG) und Xylazin (13 mg/kg KG).
- Entfernen Sie die Haare mit einem elektrischen Rasierer vom Ausschnitt und der Brust des Tieres.
- Tragen Sie einen Tropfen Augensalbe auf, um die Augen während der Operation zu schützen.
- Stellen Sie die Ratte in Rückenlage auf einen sterilisierten Operationstisch. Befestigen Sie vorsichtig den Bauch und die Gliedmaßen des Tieres mit Klebeband.
HINWEIS: Um die Körpertemperatur zu halten, legen Sie eine 37 °C heiße Heizmatte unter den OP-Tisch. Vermeiden Sie die Erwärmung der Kopfregion, um ein Austrocknen der Augen zu verhindern. - Desinfizieren Sie die Tierhaut mit Povidon-Jod/Jodphör-Lösung. Beachten Sie Narben und Nähte aus der primären AoB-Operation und drapieren Sie das Operationsfeld.
- Stellen Sie eine ausreichende Tiefe der Anästhesie durch Zehenkneifen sicher.
HINWEIS: Die Tiefe der Anästhesie muss während der Operation regelmäßig kontrolliert werden.
2. Tracheotomie und mechanische Beatmung
HINWEIS: Wechseln Sie während der gesamten Operation die Handschuhe nach dem Umgang mit nicht sterilen Geräten.
- Machen Sie mit einer feinen Schere (Abbildung 2A) einen 7-10 mm langen zervikalen Mittellinienschnitt (Abbildung 3A).
- Sezieren Sie mit Hilfe einer stumpfen Pinzette (Abbildung 2B') das zervikale Weichgewebe, um die infrahyoidalen Muskeln freizulegen. Spalten Sie die Muskeln in der Mittellinie, um die Luftröhre zu visualisieren. Schneiden und entfernen Sie die Naht aus der primären AoB-Operation.
- Machen Sie ~ 2 mm Luftröhrenschnitt zwischen zwei Knorpelringen mit abgewinkelten Noyes-Federscheren (Abbildung 2C, 3B). Führen Sie die Trachealkanüle mit einem Außendurchmesser von 2 mm (Abbildung 2D) in die Luftröhre ein und befestigen Sie sie mit einer 4:0-Seidennaht (Abbildung 2E,3C).
- Schließen Sie die Trachealkanüle an ein mechanisches Beatmungsgerät an (siehe Materialtabelle), während der Totraum auf ein Minimum reduziert wird (Abbildung 3D-E). Halten Sie die perioperative Lungenbeatmung bei einer Atemfrequenz von 90 Atemzügen/min bei einem Tidalvolumen (Vt) von 8,5 ml/kg KG aufrecht.
3. Aortenauflösung
- Machen Sie einen ~ 20 mm langen Hautschnitt zwischen der zweiten und dritten Rippe mit einer feinen Schere (Abbildung 3F).
- Mit Hilfe einer kleineren chirurgischen Schere (Abbildung 2F) die Muskeln vorsichtig verteilen und Schicht für Schicht schneiden (Abbildung 3G). Machen Sie einen 10 mm seitlichen Schnitt entlang des Interkostalraums zwischen der zweiten und dritten Rippe.
HINWEIS: Die Mittelsternallinie muss vorsichtig angegangen werden, um Blutungen zu vermeiden. - Verwenden Sie einen Rippenspreizer (Abbildung 2G), um den Interkostalraum zwischen der zweiten und dritten Rippe zu erweitern und ein chirurgisches Fenster zu erstellen (Abbildung 3H).
- Trennen Sie mit Hilfe einer stumpfen Pinzette (Abbildung 2B,B') den Thymus vorsichtig von den Herz- und Rohrarterien, um die Aorta mit dem Clip sichtbar zu machen (Abbildung 4A).
- Halten Sie den Clip mit Hilfe der Pinzette fest und entfernen Sie vorsichtig das Bindegewebe um den Clip, um ihn freizulegen.
HINWEIS: Vermeiden Sie es, die Aorta mit der Pinzette zu halten oder anzuheben, da dies die Aorta verletzen kann, was zu Blutungen und einem tödlichen Ausgang führen kann. - Öffnen Sie mit Hilfe eines Nadelhalters (Abbildung 2H) den Clip (Abbildung 4B) und entfernen Sie ihn aus der Brusthöhle.
- Bevor Sie die Brust schließen, öffnen Sie die Lungenatlektase, sorgen Sie für eine ausreichende Lungenrekrutierung ohne Überdehnung, setzen Sie die mechanische Beatmung mit einem Vt von 9,5 ml / kg KG für weitere 10 Minuten fort und kehren Sie zu einem Vt von 8,5 ml / kg KG zurück, um die Lunge zu rekrutieren und einen möglichen Pneumothorax aufzulösen.
- Schließen Sie die tiefen Muskeln durch eine einfache unterbrochene Naht mit 4-0-Seide. Verbinden Sie dann die oberen Muskeln und die Haut mit einer einfachen kontinuierlichen Naht (Abbildung 5A, B).
4. Trachealextubation
- Trennen Sie die Trachealkanüle von der Beatmungsmaschine. Beobachten Sie aufmerksam die Ratte, bis die Spontanatmung wiederhergestellt ist. Wenn das Tier beim Trennen nicht spontan atmet, schließen Sie das Beatmungsgerät wieder an und fahren Sie für weitere 5 Minuten fort. Wiederholen Sie dann den Vorgang.
- Nachdem die Spontanatmung wieder hergestellt ist, entfernen Sie die Kanüle aus der Luftröhre und reinigen Sie die Flüssigkeit um die Luftröhre mit Schwammpunkten (Abbildung 2I) (siehe Materialtabelle).
- Schließen Sie die Luftröhre mit einer einfachen Naht mit 6-0 Prolene (Abbildung 2E' und Abbildung 5C). Schließen Sie dann die Infrahyoidmuskeln in einer einfachen unterbrochenen Naht mit 4-0-Seide (Abbildung 5D) und verbinden Sie die Haut in einer einfachen kontinuierlichen Naht (Abbildung 5E). Reinigen und desinfizieren Sie die Muskeln und die Haut während des Prozesses mit Povidon-Jod / Jodphor Lösung.
5. Nachsorge
- Bringen Sie das Tier nach Abschluss des chirurgischen Eingriffs vorsichtig in einen Erholungskäfig mit zusätzlichem Sauerstoff und einer Infrarotlampe, um die Tiere während der Erholungsphase warm und ausreichend mit Sauerstoff zu versorgen. Legen Sie die Sauerstoffmaske nahe an die Schnauze der Ratte. Halten Sie zu jeder Zeit nur ein Tier pro Auffangkäfig.
- Nachdem das Tier aufgewacht ist, bringen Sie es vorsichtig in einen normalen Käfig, der mit Wasser und Nahrung versorgt wird. Für die nächsten 12 h den Gesundheitszustand des operierten Tieres in 2 h Intervallen kontrollieren.
- Nach Abschluss des chirurgischen Eingriffs eine Woche lang täglich Analgesie durch i.p. Injektion von Carprofen (5 mg/kg KG) anwenden.
- Um bakterielle Infektionen zu vermeiden, verabreichen Sie Amoxicillin (500 mg / L) postoperativ für eine Woche im Trinkwasser.
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Representative Results
Zunächst wurde eine erfolgreiche Aortendebandation durch eine transthorakale Echokardiographie bestätigt, die vor und nach dem Debandierungsverfahren bei AoB-Tieren durchgeführt wurde (Abbildung 6). Zu diesem Zweck wurde der Aortenbogen in der B-Mode-Ansicht der parasternalen Langachse (PLAX) bewertet. Die Position des Clips auf der aufsteigenden Aorta bei AoB-Tieren und ihre Abwesenheit nach der Deb-Operation wurde visualisiert (Abbildung 6A,B). Als nächstes wurde der Aortenblutfluss durch gepulste Wellen-Doppler-Bildgebung bewertet (Abbildung 6C-F). Die maximale Blutflussgeschwindigkeit bei AoB-Tieren, gemessen vor und nach dem Clip, betrug 733,24 ± 17,39 mm/s bzw. 5215,08 ± 48,05 mm/s (n = 8 Tiere) (Abbildung 6C,E), was eine starke Steigung über den AoB-Standort zeigt. Nach der Clipentfernung betrug die maximale Blutflussgeschwindigkeit 1093,79 ± 28,97 mm/s bzw. 2578,73 ± 42,27 mm/s an entsprechenden Aortenstellen, was eine deutliche Abschwächung des Gradienten im Einklang mit der funktionellen Defraktionierung zeigt (Abbildung 6D,F). Um die Umkehrung der Linksherzinsuffizienz durch Aortendebandation zu untersuchen, wurden die Expressionsniveaus des natriuretischen Peptids (BNP) des Gehirns, eines klinischen Routineparameters zur Beurteilung von Herzerkrankungen31, im LV-Myokard aufgerufen. In den Wochen 3 und 5 nach der Aortenbandung zeigten AoB-Tiere eine signifikant erhöhte Produktion von BNP im Vergleich zu scheinbetriebenen Kontrollen. Im Gegensatz dazu drückten Deb-Ratten in Woche 5 BNP auf einem Niveau aus, das mit Scheintieren vergleichbar ist, was auf die Umkehrung des LV-Versagens durch Aortendebandierung hinweist (Abbildung 7A-C). Parallel dazu ergab die Auswertung der LV-Funktion mittels transthorakaler Echokardiographie eine erhöhte LV-Ejektionsfraktion und LV-Volumen bei Deb-Tieren im Vergleich zu AoB-Ratten (Abbildung 7D-E). Während die LV-Ejektionsfraktion bei Deb-Tieren mit Scheinratten vergleichbar war, konnte sich das LV-Volumen bei Deb-Ratten nicht vollständig auf die Werte der Scheingruppe normalisieren, was darauf hindeutet, dass die Umkehrung der LV-Funktion unvollständig ist.
Um zu untersuchen, ob Deb-Tiere als präklinisches Modell dienen können, um den reversen pulmonalen vaskulären und rechtsventrikulären (RV) Remodeling bei PH-LHD zu untersuchen, wurde der linksventrikuläre systolische Druck (LVSP) und der rechtsventrikuläre systolische Druck (RVSP) mit einem Mikrotip-Millar-Katheter bewertet. Kurz gesagt, die Ratten wurden erneut mit Ketamin (87 mg/kg KG) und Xylazin (13 mg/kg KG) betäubt, tracheotomisiert und wie oben beschrieben beatmet. Die Herzkatheteruntersuchung wurde nach medianer Thorakotomie32 durch die Spitze des (ersten) linken bzw. (zweiten) rechten Ventrikels durchgeführt, da eine direkte Katheterisierung des linken Ventrikels über den Gefäßweg durch das Aortenband bei AoB-Tieren verhindert wird. Nach der Euthanasie durch eine Überdosierung von Ketamin / Xylazin wurde das Herz herausgeschnitten und die ventrikuläre Hypertrophie wurde als Gewicht des linken Ventrikels einschließlich Septum (LV + S) oder des rechten Ventrikels (RV) auf Körpergewicht (BW) normalisiert. In Übereinstimmung mit AoB-Ratten als etabliertem Modell für PH-LHD zeigten AoB-Tiere eine signifikant erhöhte LVSP und RVSP sowie LV- und RV-Hypertrophie im Vergleich zu Scheintieren operierten Tieren in 3 Wochen nach der Operation (Abbildung 8A-F). Die Debandierungsoperation (Deb), die in Woche 3 nach AoB durchgeführt wurde, führte zu einer signifikanten Reduktion sowohl der LVSP- als auch der LV-Hypertrophie im Vergleich zu AoB-Tieren ohne Deb in Woche 3 und Woche 5 nach AoB, was zeigt, dass die Normalisierung der LV-Hämodynamik nach der Entfernung von Clips aus der Aorta den LV-Umbau umkehrte (Abbildung 8C, D). Im Vergleich zu AoB-Ratten in Woche 3 und Woche 5 zeigten Deb-Tiere auch eine signifikante Reduktion von RVSP und RV / BW, was eine erfolgreiche Umkehrung von PH-LHD zeigte (Abbildung 8E, F). Insbesondere war RVSP bei Deb-Ratten vergleichbar mit Werten, die bei Scheintieren gemessen wurden, was auf eine vollständige Normalisierung der RV-Hämodynamik hinweist. Im Gegensatz dazu wurde die RV-Hypertrophie bei Deb-Tieren mit RV/BW nur teilweise umgekehrt und blieb im Vergleich zu Scheinkontrollen signifikant erhöht (Abbildung 8E, F).
Abbildung 1: Schematische Darstellung der chirurgischen Eingriffe und Validierung der PH-Umkehrung bei AoB-Ratten. Das Schema zeigt die verschiedenen experimentellen Gruppen, die in der vorliegenden Studie verwendet wurden, um zu testen, ob die Debandierungsoperation PH-LHD umkehrt. Schein, Scheinsteuerungen; AoB, Aortenbanding; Deb, die sich auflöst. Dreiecke markieren den Zeitpunkt chirurgischer Eingriffe: Primäroperation (Schein oder AoB; rot) in Woche 0 und Sekundäroperation (Deb; grün) in Woche 3. Kreise markieren die Endpunktanalysen, bei denen PH-LHD durch LV- bzw. RV-Drücke bzw. Hypertrophiemessungen bewertet wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Chirurgische Instrumente. (A) Feine Schere Wolframcarbid. b) Muszette Moria Iris und (B') gezackte Graefe-Zange. Die Spitzen der Pinzette werden vergrößert dargestellt. (C) Noyes Federschere. (D) Trachealkanüle. (E, E') 4:0 bzw. 6:0. (F) Feine Schere Wolframcarbid. (G) Rippenstreuer. (H) Mathieu-Nadelhalter. (I) Schwammspitzengewebe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Tracheotomie und Thorakotomie. Bilder veranschaulichen die chirurgischen Schritte für die Tracheotomie. (A) Zervikaler Mittellinienschnitt. (B) Schnitt der Luftröhre zwischen zwei Knorpelringen. (C) Trachealkanüle, die in die Luftröhre eingeführt und mit einer Naht gesichert wird. (D) Die Trachealkanüle ist an ein mechanisches Beatmungsgerät angeschlossen. (E) Bilder veranschaulichen die chirurgischen Schritte für die Thorakotomie. (F) Hautschnitt zwischen der zweiten und dritten Rippe. (G) Schneiden von Muskeln. (H) Schaffung eines thorakalen chirurgischen Fensters durch Spreizung der zweiten und der dritten Rippe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Visualisierung des aortenverengenden Clips in vivo und ex vivo. (A) Das Bild zeigt die Brusthöhle einer AoB-Ratte mit einem Titanclip, der auf der aufsteigenden Aorta platziert ist. (B) Das Bild zeigt geschlossenen und geöffneten Clip ex vivo. Das Sternchen markiert den Teil des Clips, den der Nadelhalter in vivo komprimiert, um den Clip zu öffnen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Wundverschluss Bilder veranschaulichen das Schließen der oberen Brustmuskulatur (A) und der Haut (B) mit einer einfachen durchgehenden Naht. Die Luftröhre (C) und die Infrahyoidmuskulatur (D) werden durch eine einfache Naht und die Haut am Hals (E) durch eine einfache durchgehende Naht geschlossen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: Aortenblutfluss vor und nach der Banditungsoperation . (A-B) Visualisierung der aufsteigenden Aorta bei einer Ratte mit Aortenbandbildung (AoB, links) und einer Ratte nach einer Banditenoperation (Deb, rechts) mittels transthorakaler Echokardiographie. Der Pfeil zeigt den Titanclip auf der Aorta in (A) fehlt in (B). (C,D) Echokardiographische Bilder des gepulsten Dopplers zeigen den Blutfluss vor dem Clip bei einer AoB-Ratte (C) und den Blutfluss im entsprechenden Aortensegment bei einer Deb-Ratte (D), die einen Tag vor bzw. einen Tag nach der Aortenbandoperation aufgenommen wurden. (E,F) Analog dazu zeigen Bilder den Blutfluss im Aortensegment nach dem Clip bei einer AoB-Ratte (E) und im entsprechenden Aortensegment bei einer Deb-Ratte (F), die einen Tag vor bzw. einen Tag nach der Aortenbandoperation aufgenommen wurden. Türkisfarbene vertikale Linien veranschaulichen Messungen der maximalen Aortenströmungsgeschwindigkeit. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 7: Normalisierung der linksventrikulären Funktion durch Aortendebandation. (A) Repräsentative Western Blots zeigen Proteinspiegel von BNP und mit GAPDH als Belastungskontrolle in linken Ventrikeln (LV) von AoB-Ratten in Woche 3 nach Aortenbanding (n = 5) und in entsprechenden Scheinkontrollen (n = 5). (B) Repräsentative Westernflecken zeigen BNP und GAPDH in den linken Ventrikeln (LV) von AoB-Ratten in Woche 5 nach Aortenbanding (n = 4), bei Deb-Ratten in Woche 5 (n = 5) und in Scheinkontrollen zum entsprechenden Zeitpunkt nach der primären Operation (n = 4). (C) Box- und Whisker-Diagramme zeigen die Quantifizierung der BNP-Expression, die zum entsprechenden Zeitpunkt nach der primären Operation auf GAPDH und Scheinkontrolle normiert ist. Kästchen zeigen Median, 25 bzw. 75 Perzentile; Schnurrhaare zeigen die Minimal- und Maximalwerte an. Für statistische Analysen wurde der t-Test33 von Student verwendet. *p-Wert < 0,05. (D) Balkendiagramme (Mittelwert ± Standardabweichung) zeigen LV-Ejektionsanteil und -volumen bei Scheintieren (n = 4), AoB (n = 9) und Deb (n = 7) in Woche 5, gemessen durch Echokardiographie aus M- und B-Modus-Bildern. (E) Repräsentative schallkardiographische M-Mode-Bilder zeigen Veränderungen der LV-fraktionierten Verkürzung bei Schein-, AoB- und Deb-Tieren in Woche 5. Für statistische Analysen wurde Mann-Whitney U Test33 verwendet. *p-Wert < 0,05. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 8: Die ventrikuläre Hämodynamik wird normalisiert, und die kardiale Hypertrophie wird durch Aortendebandierung umgekehrt . (A) Repräsentative Messungen des linksventrikulären (LV) und rechtsventrikulären (RV) Blutdrucks bei einer Ratte 3 Wochen nach Aortenbanding (AoB) im Vergleich zur entsprechenden Scheinkontrolle. (B) Repräsentative Bilder zeigen eine Herzhypertrophie bei einer AoB-Ratte 3 Wochen nach der Aortenbandage im Vergleich zur Scheinkontrolle. (C-F) Box- und Whisker-Diagramme zeigen den linksventrikulären systolischen Druck (LVSP; C), LV-Hypertrophie ([LV+S]/BW; D), rechtsventrikulärer systolischer Druck (RVSP; E) und RV-Hypertrophie (RV/BW; F) bei Schein- und AoB-Tieren in 3 und 5 Wochen nach der Operation und normalisierte Parameter (im Vergleich zu 3- und 5-wöchigen AoB-Gruppen) bei Deb-Ratten. Kästchen zeigen Median, 25 bzw. 75 Perzentile; Schnurrhaare zeigen die Minimal- und Maximalwerte an. n = 9-12 Tiere wurden für hämodynamische Messungen analysiert, und das Herzgewicht wurde in n = 7-12 Ratten pro Gruppe gemessen. Für statistische Analysen wurde der Mann-Whitney U-Test verwendet. *p-Wert < 0,05. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Hier wird eine detaillierte Operationstechnik zur Aortendebandation in einem Ratten-AoB-Modell berichtet, die verwendet werden kann, um die Reversibilität von PH-LHD und die zellulären und molekularen Mechanismen zu untersuchen, die den umgekehrten Umbau im Lungengefäßsystem und im RV vorantreiben. Drei Wochen Aortenverengung bei juvenilen Ratten führen zu PH-LHD, die sich als erhöhter LV-Druck, LV-Hypertrophie und gleichzeitig erhöhter RV-Drücke und RV-Hypertrophie zeigt. Die Aortendebandation in Woche 3 nach AoB war in der Lage, die LV innerhalb von zwei Wochen nach Deb vollständig zu entladen und die LV-Hypertrophie vollständig umzukehren. Parallel dazu verursachte die Aortendebandation auch eine vollständige Normalisierung der RV-Drücke und eine teilweise Umkehrung der RV-Hypertrophie.
Das vorliegende Modell ahmt somit kritische Aspekte des klinischen Szenarios nach, in dem zuvor festgestellt wurde, dass die mechanische Entladung des LV durch eine implantierbare, nicht pulsierende LVAD mit kontinuierlichen Fließeigenschaften den pH-Wert bei Patienten mit Herzinsuffizienzumkehrt 34,35. In einer retrospektiven Analyse wurde gezeigt, dass die LVAD-Unterstützung den Lungenarteriendruck bei Patienten mit reversiblem oder festem pH-Wert mit festem pH-Wert, definiert als mittlerer pulmonalarterieller Druck >25 mm Hg, pulmonalem Gefäßwiderstand >2,5 Wood Unit und einem mittleren transpulmonalen Gradienten von >12 mm Hg trotz pharmakologischer Behandlung35 reduziert. Wichtig ist, dass diese Ergebnisse34,35 indirekte Beweise dafür liefern, dass die linksventrikuläre Entladung nicht nur die passive Lungenstauung und sekundäre Veränderungen des Lungengefäßtonus verringert, sondern auch eine umgekehrte Umgestaltung des Lungengefäßsystems durch "physiologische" Mechanismen, d.h. durch Anpassung an veränderte Hämodynamik, auslöst. Eingehende Multi-Omics-Analysen der zellulären und molekularen Prozesse, die den umgekehrten Umbau im Lungengefäßsystem vorantreiben, könnten neue Wege eröffnen, um neue therapeutische Optionen für die Behandlung von PH bei Patienten mit Herzinsuffizienz und möglicherweise auch bei anderen Formen von PH einschließlich PAH zu identifizieren. Das vorliegende Modell der Debandierung bei AoB-Ratten bietet eine einzigartige Möglichkeit für Analysen, da die vollständige Normalisierung von RVSP eine effektive Umkehrung des PH-Werts bestätigt und somit mechanistische Studien ermöglicht, um Wege zu identifizieren, die homöostatische Prozesse im erkrankten Lungengefäßsystem wiederherstellen können.
Mit einer ähnlichen Begründung kann das vorliegende Modell weiter verwendet werden, um intra- und interzelluläre Prozesse zu untersuchen, die den umgekehrten Umbau des RV vorantreiben. RV-Funktion wurde kürzlich als signifikanter Prädiktor für die Prognose für Morbidität und Mortalität bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen anerkannt. Dennoch wurden keine Therapien klinisch zugelassen, um die RV-Funktionzu verbessern 36. Daher bietet die Möglichkeit, umgekehrte Umbauprozesse im RV-Myokard in einem Tiermodell zu untersuchen, eine einzigartige Gelegenheit, eine erhebliche Wissenslücke und einen kritischen medizinischen Bedarf zu schließen.
Der Erfolg des technisch anspruchsvollen Aortendebandierungsverfahrens bei AoB-Ratten hängt von chirurgischen Fähigkeiten und präzisen perioperativen Strategien ab. Im Folgenden werden kritische chirurgische Verfahrensschritte beschrieben, die durch übermäßige Blutungen (1-5) oder unzureichende Atmung (6) zu perioperativer Letalität führen können, sowie Empfehlungen zur Vermeidung dieser Komplikationen.
(1) Während einer Thorakotomie muss die Mittelsternallinie vorsichtig mit einer Schere angegangen werden, um eine Verletzung der inneren Brustarterie zu vermeiden. (2) Um das Herz und die Rohrarterien sichtbar zu machen, sollte der Thymus mobilisiert und vorsichtig in Schädelrichtung verlagert werden. Bei der Debandierungsoperation ist das Thymusgewebe oft über postoperative Adhäsionen aus der ursprünglichen AoB-Operation mit dem Herzen und den Arterien verbunden. Diese Verwachsungen sollten sorgfältig mit einer stumpfen Pinzette getrennt werden, um Verletzungen der kardiovaskulären Strukturen zu vermeiden. (3) Bei der Bandandoperation ist die Aorta mit dem Clip häufig in das Bindegewebe eingebettet. Dieses Bindegewebe muss schonend mit stumpfer Pinzette seziert werden, um den Clip sichtbar zu machen. Hier ist die vor der Operation durchgeführte transthorakale Echokardiographie ein hilfreicher Vorbereitungsschritt, mit dem festgestellt werden kann, ob sich der Clip in der Nähe der Aortenwurzel, in der Mitte der aufsteigenden Aorta oder in der Nähe der Arteria brachiocephalica befindet. Dieses Wissen spart wertvolle Zeit für die Clip-Zuweisung während der Operation. (4) Die Ausrichtung des Clips ist ein kritischer Schritt, der bei der ersten Aortenbanding-Operation sorgfältig abgewogen werden muss. Um eine optimale Beurteilung und ein schnelles Öffnen des Clips während der Aortendebandation zu ermöglichen, sollte der Teil, der durch den Nadelhalter komprimiert werden muss (Abbildung 4B), ventral ausgerichtet sein. Eine Neuorientierung des Clips während der Debandierungsoperation ist möglich, wenn auch mit dem Risiko einer Verletzung der Aorta. Für die Neuausrichtung des Clips müssen die Clips von einer Pinzette gehalten werden, während das umgebende Bindegewebe vorsichtig entfernt wird, dann sollte der Clip mobilisiert und gedreht werden. Das Halten der Aorta mit der Pinzette ist zu vermeiden. (5) Zum Debandieren sollte der Clip mit einer Hand von einer Pinzette gehalten und mit einem Nadelhalter mit der anderen Hand geöffnet werden. Die Aorta muss nicht ventral angehoben werden. (6) Nach Abschluss des Debandierungsverfahrens haben extubierte PH-LHD-Ratten ein erhebliches Risiko für Ateminsuffizienz, wobei die Tiere in der Regel innerhalb von 10-20 Minuten nach der Operation sterben, während sie noch unter Narkose sind. Atlekasis der linken Lunge ist die häufigste Todesursache in dieser Periode, und eine längere mechanische Beatmung vor dem Brustverschluss hilft, die Lunge zu rekrutieren und eine ausreichende Atmung nach der Operation zu gewährleisten.
Wir schlagen auch vor, dass die Tracheostomie im Vergleich zur Endotrachealintubation, wie sie in früheren Studien26,27 durchgeführt wurde, eine bessere Kontrolle der geeigneten Beatmung während chirurgischer Eingriffe bietet, was besonders während der Aortendebandage relevant ist. Dieser Begriff basiert auf der folgenden Begründung: (1) Die Tracheostomie, die routinemäßig in unserem Labor zur perioperativen Lungenbeatmung durchgeführt wird, ist eine einfache und sichere Technik ohne perioperative oder postoperative Komplikationen. (2) Die Tracheostomie beseitigt das Risiko einer Ösophagusintubation oder einer Trachealverletzung; Es ermöglicht eine präzise Positionierung und Fixierung der Trachealkanüle und eine ständige visuelle Kontrolle der Kanüle während aller Schritte des chirurgischen Eingriffs. (3) Zum Zeitpunkt der Aortendefraktionierung haben AoB-Tiere bereits eine Herzinsuffizienz und reagieren empfindlicher auf zusätzlichen Stress. Infolgedessen können die potenziellen Risiken, die mit der endotrachealen Intubation einhergehen, zu einer erhöhten Letalität beitragen. (4) Wenn das operierte Tier vom Beatmungsgerät entwöhnt wird, aber keine spontane Atmung entwickelt, ermöglicht eine Tracheostomie eine schnelle Reintubation und Wiederverbindung mit dem Beatmungsgerät, wodurch möglicherweise Leben gerettet werden, da eine längere postoperative Beatmung möglich ist.
Die vorliegende Studie berichtet von einer Aortendebandierungstechnik, die 3 Wochen nach der ersten Aortenbandbildung bei Ratten durchgeführt wurde. Für Studien, die darauf abzielen, den umgekehrten Umbau des Lungengefäßsystems und des RV in verschiedenen PH-Stadien zu vergleichen, können die beschriebenen Verfahren auch zu späteren Zeitpunkten nach dem Aortenband durchgeführt werden. Dennoch ist Vorsicht geboten, da Narben und Bindegewebe, die die Aorta umgeben, mit der Zeit wahrscheinlich häufiger werden, was das Verfahren weiter erschwert und zusätzliche Fehlerbehebung und Verfeinerung erfordert. Gleichzeitig gelten weiterhin die Grundprinzipien des gemeldeten Protokolls.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären. Alle Co-Autoren haben den Inhalt des Manuskripts gesehen und stimmen ihm zu.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde durch Zuschüsse des DZHK (Deutsches Zentrum für Herz-Kreislauf-Forschung) an CK und WMK, das BMBF (Bundesministerium für Bildung und Forschung) an CK im Rahmen von VasBio und an WMK im Rahmen von VasBio, SYMPATH und PROVID sowie der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) an WMK (SFB-TR84 A2, SFB-TR84 C9), SFB 1449 B1, SFB 1470 A4, KU1218/9-1 und KU1218/11-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amoxicillin | Ratiopharm | PC: 04150075615985 | Antibiotic |
| Anti-BNP antibody | Abcam | ab239510 | Western Blotting |
| Aquasonic 100 Ultrasound gel | Parker Laboratories | BT-025-0037L | Echocardiography consumables |
| Bepanthen | Bayer | 6029009.00.00 | Eye ointment |
| Carprosol (Carprofen) | CP-Pharma | 401808.00.00 | Analgesic |
| Clip holder | Weck stainless USA | 523140S | Surgical instruments |
| Fine scissors Tungsten carbide | Fine Science Tools | 14568-12 | Surgical scissors |
| Fine scissors Tungsten carbide | Fine Science Tools | 14568-09 | Surgical scissors |
| High-resolution imaging system | FUJIFILM VisualSonics, Amsterdam, Netherlands | VeVo 3100 | Echocardiography machine. Images were acquired with pulse-wave Doppler mode, M-mode and B-mode |
| Isoflurane | CP-Pharma | 400806.00.00 | Anesthetic |
| Ketamine | CP-Pharma | 401650.00.00 | Anesthetic |
| Mathieu needle holder | Fine Science Tools | 12010-14 | Surgical instruments |
| Mechanical ventilator (Rodent ventilator) | UGO Basile S.R.L. | 7025 | Volume controlled respirator |
| Metal clip | Hemoclip | 523735 | Surgical consumables |
| Microscope | Leica | M651 | Manual surgical microscope for microsurgical procedures |
| Millar Mikro-Tip pressure catheters | ADInstruments | SPR-671 | Hemodynamics assessment |
| Moria Iris forceps | Fine Science Tools | 11373-12 | Surgical forceps |
| Noyes spring scissors | Fine Science Tools | 15013-12 | Surgical scissors |
| Povidone iodine/iodophor solution | B/Braun | 16332M01 | Disinfection |
| PowerLab | ADInstruments | 4_35 | Hemodynamics assessment |
| Prolene Suture, 4-0 | Ethicon | EH7830 | Surgical consumables |
| Rib spreader (Alm selfretaining retractor blunt, 70 mm, 2 3/4″) | Austos | AE-BV010R | Surgical instruments |
| Serrated Graefe forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | Surgical forceps |
| Silk Suture, 4-0 | Ethicon | K871 | Surgical consumables |
| Skin disinfiction solution (colored) | B/Braun | 19412M07 | Disinfection |
| Spectra 360 Elektrode gel | Parker Laboratories | TB-250-0241H | Echocardiography consumables |
| Sponge points tissue | Sugi | REF 30601 | Surgical consumables |
| Sprague-Dawley rat | Janvier Labs, Le Genest-Saint-Isle, France | Study animals | |
| Tracheal cannula | Outer diameter 2 mm | ||
| Xylazin | CP-Pharma | 401510.00.00 | Anesthetic |
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