Summary
Het huidige protocol beschrijft een chirurgische procedure om oplopende aortabanding te verwijderen in een rattenmodel van pulmonale hypertensie als gevolg van linkerhartaandoeningen. Deze techniek bestudeert endogene mechanismen van omgekeerde remodellering in de pulmonale circulatie en het rechterhart, waardoor strategieën worden geïnformeerd om pulmonale hypertensie en / of rechterventrikeldisfunctie om te keren.
Abstract
Pulmonale hypertensie als gevolg van linker hart-en vaatziekten (PH-LHD) is de meest voorkomende vorm van PH, maar de pathofysiologie is slecht gekarakteriseerd dan pulmonale arteriële hypertensie (PAH). Als gevolg hiervan ontbreken goedgekeurde therapeutische interventies voor de behandeling of preventie van PH-LHD. Medicijnen die worden gebruikt voor de behandeling van PH bij PAH-patiënten worden niet aanbevolen voor de behandeling van PH-LHD, omdat verminderde pulmonale vasculaire weerstand (PVR) en verhoogde pulmonale bloedstroom in aanwezigheid van verhoogde linkszijdige vuldrukken decompensatie van het linkerhart en longoedeem kunnen veroorzaken. Er moeten nieuwe strategieën worden ontwikkeld om PH bij LHD-patiënten om te keren. In tegenstelling tot PAH ontwikkelt PH-LHD zich als gevolg van verhoogde mechanische belasting veroorzaakt door congestie van bloed in de longcirculatie tijdens links hartfalen. Klinisch normaliseert mechanische ontlading van de linker ventrikel (LV) door aortaklepvervanging bij aortastenosepatiënten of door implantatie van LV-hulpmiddelen bij patiënten met eindstadium hartfalen niet alleen pulmonale arteriële en rechterventrikel (RV) drukken, maar ook PVR, waardoor indirect bewijs wordt geleverd voor omgekeerde remodellering in de pulmonale vasculatuur. Met behulp van een gevestigd rattenmodel van PH-LHD als gevolg van linkerhartfalen veroorzaakt door drukoverbelasting met daaropvolgende ontwikkeling van PH, wordt een model ontwikkeld om de moleculaire en cellulaire mechanismen van dit fysiologische omgekeerde remodelleringsproces te bestuderen. In het bijzonder werd een aorta-ontbandingsoperatie uitgevoerd, wat resulteerde in omgekeerde remodellering van het LV-myocardium en het lossen ervan. Tegelijkertijd was volledige normalisatie van RV-systolische druk en significante maar onvolledige omkering van RV-hypertrofie detecteerbaar. Dit model kan een waardevol hulpmiddel zijn om de mechanismen van fysiologische omgekeerde remodellering in de longcirculatie en de RV te bestuderen, met als doel therapeutische strategieën te ontwikkelen voor de behandeling van PH-LHD en andere vormen van PH.
Introduction
Hartfalen is de belangrijkste doodsoorzaak in ontwikkelde landen en zal naar verwachting de komende tien jaar met 25% toenemen. Pulmonale hypertensie (PH) - een pathologische verhoging van de bloeddruk in de pulmonale circulatie - treft ongeveer 70% van de patiënten met hartfalen in het eindstadium; de Wereldgezondheidsorganisatie classificeert PH als pulmonale hypertensie als gevolg van linker hart-en vaatziekten (PH-LHD)1. PH-LHD wordt geïnitieerd door een verminderde systolische en/of diastolische linkerventrikel (LV) functie die resulteert in verhoogde vuldruk en passieve congestie van bloed in de pulmonale circulatie2. Hoewel aanvankelijk omkeerbaar, wordt PH-LHD geleidelijk gefixeerd als gevolg van actieve pulmonale vasculaire remodellering in alle compartimenten van de pulmonale circulatie, d.w.z. slagaders, haarvaten en aderen 3,4. Zowel omkeerbare als vaste PH verhogen de RV-nabelasting, waardoor aanvankelijk adaptieve myocardiale hypertrofie wordt veroorzaakt, maar uiteindelijk RV-dilatatie, hypokinese, fibrose en decompensatie wordt veroorzaakt die geleidelijk leiden tot RV-falen 1,2,5,6. Als zodanig versnelt PH de progressie van de ziekte bij patiënten met hartfalen en verhoogt het de mortaliteit, met name bij patiënten die een chirurgische behandeling ondergaan door implantatie van linkerventrikelhulpapparaten (LVAD) en / of harttransplantatie 7,8,9. Momenteel bestaan er geen curatieve therapieën die het proces van pulmonale vasculaire remodellering kunnen omkeren, dus fundamenteel mechanistisch onderzoek in geschikte modelsystemen is nodig.
Belangrijk is dat klinische studies aantonen dat PH-LHD als een frequente complicatie bij patiënten met aortastenose snel kan verbeteren in de vroege postoperatieve periode na aortaklepvervanging10. Analoog werd hoge (>3 Wood Units) preoperatieve pulmonale vasculaire weerstand (PVR) die echter omkeerbaar was op nitroprusside duurzaam genormaliseerd na harttransplantatie in een 5-jarige follow-up studie11. Evenzo kon een adequate vermindering van zowel reversibele als vaste PVR en verbetering van de RV-functie bij LHD-patiënten binnen enkele maanden worden gerealiseerd door de linker ventrikel te lossen met behulp van implanteerbare pulsatiele en niet-pulsatiele ventriculaire hulpmiddelen 12,13,14. Momenteel zijn de cellulaire en moleculaire mechanismen die omgekeerde remodellering in de longcirculatie en RV-myocard veroorzaken onduidelijk. Toch kan hun begrip belangrijk inzicht geven in fysiologische routes die therapeutisch kunnen worden benut om long vasculaire en RV-remodellering in PH-LHD en andere vormen van PH om te keren.
Een geschikt preklinisch model dat de pathofysiologische en moleculaire kenmerken van PH-LHD adequaat repliceert, kan worden gebruikt voor translationele studies bij drukoverbelasting-geïnduceerd congestief hartfalen als gevolg van chirurgische aortabanding (AoB) bij ratten 4,15,16. In vergelijking met vergelijkbaar hartfalen als gevolg van drukoverbelasting in het muizenmodel van transversale aortavernauwing (TAC)17, veroorzaakt bandering van de opgaande aorta boven de aortawortel bij AoB-ratten geen hypertensie in de linker halsslagader, omdat de bandeologieplaats proximaal is van de uitstroom van de linker halsslagader uit de aorta. Als gevolg hiervan veroorzaakt AoB geen linkszijdig neuronaal letsel in de cortex, zoals kenmerkend is voor TAC18, en dat de onderzoeksresultaten kan beïnvloeden. In vergelijking met andere knaagdiermodellen van chirurgisch geïnduceerde PH-LHD, blijken rattenmodellen in het algemeen, en AoB in het bijzonder, robuuster en reproduceerbaarder te zijn en repliceren ze de remodellering van de pulmonale circulatie die kenmerkend is voor PH-LHD-patiënten. Tegelijkertijd is de perioperatieve letaliteit laag19. Verhoogde LV-drukken en LV-disfunctie bij AoB-ratten induceren PH-LHD-ontwikkeling, wat resulteert in verhoogde RV-drukken en RV-remodellering. Als zodanig is het AoB-rattenmodel uiterst nuttig gebleken in een reeks eerdere studies door onafhankelijke groepen, waaronder wijzelf, om pathhomemechanismen van pulmonale vasculaire remodellering te identificeren en potentiële behandelingsstrategieën voor PH-LHD 4,15,20,21,22,23,24,25 te testen.
In de huidige studie werd het AoB-rattenmodel gebruikt om een chirurgische procedure van aorta-debanding vast te stellen om mechanismen van omgekeerde remodellering in de pulmonale vasculatuur en de RV te bestuderen. Eerder zijn myocardiale omgekeerde remodelleringsmodellen zoals aorta-debanding bij muizen26 en ratten27 ontwikkeld om de cellulaire en moleculaire mechanismen te onderzoeken die de regressie van linkerventrikelhypertrofie reguleren en potentiële therapeutische opties te testen om myocardiale terugwinning. Bovendien heeft een beperkt aantal eerdere studies de effecten van aorta-debanding op PH-LHD bij ratten onderzocht en aangetoond dat aorta-debanding mediale hypertrofie bij pulmonale arteriolen kan omkeren, de expressie van pre-pro-endotheline 1 kan normaliseren en de pulmonale hemodynamiek kan verbeteren27,28, wat bewijs levert voor de reversibiliteit van PH bij ratten met hartfalen. Hier worden de technische procedures van de ontbandingsoperatie geoptimaliseerd en gestandaardiseerd, bijvoorbeeld door een tracheotomie toe te passen in plaats van endotracheale intubatie of door titanium clips met een gedefinieerde binnendiameter te gebruiken voor aortabanding in plaats van polypropyleen hechtingen met een stompe naald26,27, waardoor een betere controle van de chirurgische procedures, verhoogde reproduceerbaarheid van het model en een verbeterde overlevingskans mogelijk is.
Vanuit een wetenschappelijk perspectief ligt de betekenis van het PH-LHD-debandingmodel niet alleen in het aantonen van de reversibiliteit van het cardiovasculaire en pulmonale fenotype bij hartfalen, maar nog belangrijker, in de identificatie van moleculaire drivers die omgekeerde remodellering in longslagaders activeren en / of ondersteunen als veelbelovende kandidaten voor toekomstige therapeutische targeting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures werden uitgevoerd volgens de "Guide for the Care and Use of Laboratory Animals" (Institute of Laboratory Animal Resources, 8e editie 2011) en goedgekeurd door de lokale overheidscommissie voor dierenverzorging en -gebruik van het Duitse staatsbureau voor gezondheid en sociale zaken (Landesamt für Gesundheit und Soziales (LaGeSO), Berlijn; protocol nr. G0030/18). Ten eerste werd congestief hartfalen chirurgisch geïnduceerd bij juveniele Sprague-Dawley-ratten ~ 100 g lichaamsgewicht (zie Materiaaltabel) door een titanium clip met een binnendiameter van 0,8 mm op de oplopende aorta (aortabanding, AoB) te plaatsen, zoals eerder beschreven29,30. In week 3 na AoB (figuur 1) werd een debandingsoperatie (Deb) uitgevoerd om de clip uit de aorta te verwijderen. De uitgevoerde chirurgische procedures en validatie van PH-omkering bij AoB-ratten zijn schematisch weergegeven in figuur 1.
1. Chirurgische voorbereidingen
- Steriliseer de vereiste chirurgische instrumenten (figuur 2) door autoclaveren.
- Injecteer de rat met carprofen (5 mg/kg lichaamsgewicht) (zie materiaaltabel) intraperitoneaal (i.p.) gedurende analgesie 30 min voorafgaand aan de operatie.
- Anesthetie rat door i.p. injectie van ketamine (87 mg/kg lichaamsgewicht) en xylazine (13 mg/kg lichaamsgewicht).
- Verwijder het haar van de halslijn en borst van het dier met behulp van een elektrisch scheerapparaat.
- Breng een druppel oogzalf aan om de ogen tijdens de operatie te beschermen.
- Plaats de rat in rugligging op een gesteriliseerde operatietafel. Bevestig de buik en ledematen van het dier zorgvuldig met plakband.
OPMERKING: Om de lichaamstemperatuur te handhaven, plaatst u een verwarmingsmat van 37 °C onder de operatietafel. Vermijd verwarming van het hoofdgebied om uitdroging van de ogen te voorkomen. - Desinfecteer de huid van dieren met povidon-jodium/jodophore oplossing. Noteer littekens en hechtingen van de primaire AoB-operatie en drapeer het chirurgische veld.
- Zorg voor voldoende diepte van de anesthesie door teen te knijpen.
OPMERKING: De diepte van de anesthesie moet regelmatig worden gecontroleerd tijdens de operatie.
2. Tracheotomie en mechanische ventilatie
OPMERKING: Wissel tijdens de operatie handschoenen na het hanteren van niet-steriele apparatuur.
- Maak met een fijne schaar (figuur 2A) een 7-10 mm lange cervicale middellijnincisie (figuur 3A).
- Ontleed met behulp van een stompe tang (figuur 2B') het cervicale zachte weefsel om de infrahyoïde spieren bloot te leggen. Splits spieren in de middellijn om de luchtpijp te visualiseren. Snijd en verwijder de hechting van de primaire AoB-operatie.
- Maak ~2 mm luchtpijpincisie tussen twee kraakbeenachtige ringen met behulp van een schuine Noyes-veerschaar (figuur 2C,3B). Steek de tracheale canule met een buitendiameter van 2 mm (figuur 2D) in de luchtpijp en bevestig deze met een zijdeverbinding van 4-0 (figuur 2E,3C).
- Sluit de tracheale canule aan op een mechanische ventilator (zie materiaaltabel) en beperk de dode ruimte tot een minimum (figuur 3D-E). Houd perioperatieve longventilatie bij een ademhalingsfrequentie van 90 ademhalingen/min bij een getijdenvolume (Vt) van 8,5 ml/kg lichaamsgewicht.
3. Aorta ontbinden
- Maak een ~20 mm lange huidincisie tussen de tweede en derde rib met een fijne schaar (figuur 3F).
- Met behulp van een kleinere chirurgische schaar (figuur 2F), spreid spieren zorgvuldig en knip ze laag voor laag (figuur 3G). Maak een laterale incisie van 10 mm langs de intercostale ruimte tussen de tweede en derde rib.
OPMERKING: De middelste lijn moet zorgvuldig worden benaderd om bloedingen te voorkomen. - Gebruik een ribspreider (figuur 2G) om de intercostale ruimte tussen de tweede en derde rib uit te breiden om een chirurgisch venster te creëren (figuur 3H).
- Met behulp van een stompe tang (figuur 2B, B') scheidt u de thymus zorgvuldig van het hart en de leidingslagaders om de aorta met de clip te visualiseren (figuur 4A).
- Houd de clip vast met behulp van de tang en verwijder voorzichtig het bindweefsel rond de clip om het bloot te leggen.
OPMERKING: Vermijd het vasthouden of optillen van de aorta met de tang, omdat deze de aorta kan verwonden, wat kan leiden tot bloedingen en een dodelijke afloop. - Open met behulp van een naaldhouder (figuur 2H) de clip (figuur 4B) en verwijder deze uit de thoracale holte.
- Voordat u de borst sluit, opent u de longatlektase, zorgt u voor adequate longrekrutering zonder overdistentie, gaat u door met mechanische ventilatie met een Vt van 9,5 ml / kg lichaamsgewicht gedurende nog eens 10 minuten en keert u terug naar een Vt van 8,5 ml / kg lichaamsgewicht om de longen te rekruteren en een mogelijke pneumothorax op te lossen.
- Sluit de diepe spieren door een eenvoudige onderbroken hechting met 4-0 zijde. Verbind vervolgens de bovenste spieren en de huid met een eenvoudige continue hechting (figuur 5A,B).
4. Tracheale extubatie
- Koppel de tracheale canule los van de ventilatiemachine. Observeer de rat aandachtig totdat de spontane ademhaling is hersteld. Als het dier niet spontaan ademt bij het loskoppelen, sluit u de ventilator opnieuw aan en blijft u nog eens 5 minuten ventileren. Herhaal vervolgens de procedure.
- Nadat de spontane ademhaling is hersteld, verwijdert u de canule uit de luchtpijp en reinigt u de vloeistof rond de luchtpijp met sponspunten (figuur 2I) (zie materiaaltabel).
- Sluit de luchtpijp met een eenvoudige hechting met 6-0 prolene (figuur 2E' en figuur 5C). Sluit vervolgens infrahyoïde spieren in een eenvoudige onderbroken hechting met behulp van 4-0 zijde (figuur 5D) en verbind de huid in een eenvoudige continue hechting (figuur 5E). Reinig en desinfecteer de spieren en de huid tijdens het proces met povidon-jodium / joodforoplossing.
5. Postoperatieve zorg
- Na het voltooien van de chirurgische procedure, verplaats het dier voorzichtig naar een herstelkooi met aanvullende zuurstof en een infraroodlamp om dieren warm en voldoende zuurstofrijk te houden tijdens de herstelfase. Plaats het zuurstofmasker dicht bij de snuit van de rat. Houd slechts één dier per herstelkooi op elk moment.
- Nadat het dier wakker is geworden, verplaats je het voorzichtig naar een gewone kooi die wordt voorzien van water en voedsel. Controleer gedurende de volgende 12 uur de gezondheidsstatus van het geopereerde dier met tussenpozen van 2 uur.
- Breng na het voltooien van de chirurgische ingreep dagelijks analgesie aan door i.p. injectie van carprofen (5 mg / kg lichaamsgewicht) gedurende één week.
- Om bacteriële infectie te voorkomen, dient u amoxicilline (500 mg / L) gedurende één week postoperatief in het drinkwater toe.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ten eerste werd succesvolle aorta-debanding bevestigd door transthoracale echocardiografie uitgevoerd voor en na de ontbindingsprocedure bij AoB-dieren (figuur 6). Hiertoe werd de aortaboog beoordeeld in parasternale lange as (PLAX) B-modus weergave. De positie van de clip op de opgaande aorta bij AoB-dieren en de afwezigheid ervan na de Deb-operatie werd gevisualiseerd (figuur 6A,B). Vervolgens werd de aortabloedstroom geëvalueerd door middel van dopplerbeeldvorming met gepulseerde golven (figuur 6C-F). De piekbloedstroomsnelheid bij AoB-dieren gemeten voor en na de clip was respectievelijk 733,24 ± 17,39 mm/s en 5215,08 ± 48,05 mm/s (n = 8 dieren) (figuur 6C,E), wat een steile gradiënt over de AoB-locatie aantoont. Na verwijdering van de clip bedroeg de piekbloedstroomsnelheid respectievelijk 1093,79 ± 28,97 mm/s en 2578,73 ± 42,27 mm/s op overeenkomstige aortalocaties, wat een duidelijke verzwakking van de gradiënt in overeenstemming met functionele ontkoppeling laat zien (figuur 6D, F). Om te onderzoeken op omkering van linkerhartfalen door aorta-debanding, werden de expressieniveaus van hersennatriuretisch peptide (BNP), een klinische routineparameter voor het beoordelen vanhartaandoeningen 31, benaderd in het LV-myocardium. In week 3 en 5 na aortabanding vertoonden AoB-dieren een significant verhoogde productie van BNP in vergelijking met schijncontroles. Deb-ratten daarentegen drukten BNP in week 5 uit op niveaus die vergelijkbaar zijn met schijndieren, wat wijst op de omkering van LV-falen door aorta-debanding (figuur 7A-C). Tegelijkertijd onthulde evaluatie van de LV-functie door transthoracale echocardiografie een verhoogde LV-ejectiefractie en LV-volume bij Deb-dieren in vergelijking met AoB-ratten (figuur 7D-E). Terwijl LV-ejectiefractie bij Deb-dieren vergelijkbaar was met schijnratten, slaagde het LV-volume er bij Deb-ratten niet in om volledig te normaliseren naar waarden die in de schijngroep werden gezien, wat aangeeft dat de omkering van de LV-functie onvolledig is.
Om te onderzoeken of Deb-dieren kunnen dienen als een preklinisch model om omgekeerde pulmonale vasculaire en rechterventrikel (RV) remodellering in PH-LHD te bestuderen, werd de linkerventrikel systolische druk (LVSP) en de rechterventrikel systolische druk (RVSP) beoordeeld met behulp van een microtip Millar-katheter. Kortom, ratten werden opnieuw verdoofd met ketamine (87 mg/kg lichaamsgewicht) en xylazine (13 mg/kg lichaamsgewicht), tracheotomiseerd en geventileerd zoals hierboven beschreven. Hartkatheterisatie werd uitgevoerd na mediane thoracotomie32 door de top van (eerst) respectievelijk de linker en (tweede) de rechter ventrikel, omdat directe katheterisatie van de linker ventrikel via de vasculaire route wordt voorkomen door de aortaband bij AoB-dieren. Na euthanasie door een overdosis ketamine/xylazine werd het hart weggesneden en werd ventriculaire hypertrofie beoordeeld als het gewicht van de linker ventrikel inclusief septum (LV +S) of de rechter ventrikel (RV) genormaliseerd naar lichaamsgewicht (BW). In overeenstemming met AoB-ratten als een vastgesteld model voor PH-LHD, vertoonden AoB-dieren een significant verhoogde LVSP en RVSP en LV- en RV-hypertrofie in vergelijking met schijnbediende dieren 3 weken na de operatie (figuur 8A-F). Debanding (Deb) chirurgie uitgevoerd in week 3 na AoB resulteerde in een significante vermindering van zowel LVSP- als LV-hypertrofie in vergelijking met AoB-dieren zonder Deb in week 3 en week 5 na AoB, wat aantoont dat normalisatie van LV-hemodynamiek na clipverwijdering uit de aorta LV-remodellering omkeerde (figuur 8C, D). Vergeleken met AoB-ratten in week 3 en week 5 vertoonden Deb-dieren ook een significante vermindering van RVSP en RV /BW, wat een succesvolle omkering van PH-LHD aantoont (figuur 8E, F). Met name RVSP bij Deb-ratten was vergelijkbaar met waarden gemeten bij schijndieren, wat wijst op een volledige normalisatie van RV-hemodynamiek. Daarentegen was RV-hypertrofie bij Deb-dieren slechts gedeeltelijk omgekeerd met RV / BW, waardoor het significant verhoogd bleef in vergelijking met schijncontroles (figuur 8E, F).
Figuur 1: Schematische weergave van de chirurgische procedures en validatie van PH-omkering bij AoB-ratten. Het schema geeft een beeld van de verschillende experimentele groepen die in de huidige studie worden gebruikt om te testen of debanding-chirurgie PH-LHD omkeert. Schijn, schijnbediening; AoB, aortabanding; Deb, ontbinden. Driehoeken markeren het tijdstip van chirurgische ingrepen: primaire operatie (sham of AoB; rood) in week 0 en secundaire operatie (Deb; groen) in week 3. Cirkels markeren de eindpuntanalyses waarbij PH-LHD werd beoordeeld door respectievelijk LV- en RV-drukken en hypertrofiemetingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Chirurgische instrumenten. (A) Fijne schaar Wolfraamcarbide. (B) Moria Iris tang en (B') Gekartelde Graefe tang. De uiteinden van de tang worden vergroot weergegeven. (C) Noyes veerschaar. (D) Tracheale canule. (E, E') respectievelijk 4-0 en 6-0 hechtingen. (F) Fijne schaar Wolfraamcarbide. (G) Ribstrooier. (H) Mathieu naaldhouder. (I) Sponspunten weefsel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Tracheotomie en thoracotomie. Afbeeldingen illustreren de chirurgische stappen voor de tracheotomie. (A) Cervicale middellijnincisie. (B) Insnijding van de luchtpijp tussen twee kraakbeenringen. (C) Tracheale canule ingebracht in de luchtpijp en vastgezet met een hechtdraad. (D) De tracheale canule is aangesloten op een mechanische ventilator. (E) Afbeeldingen illustreren de chirurgische stappen voor de thoracotomie. (F) Huidincisie tussen de tweede en derde rib. (G) Snijden van spieren. (H) Creatie van een thoracale chirurgische venster door het spreiden van de tweede en de derde rib. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Visualisatie van de aorta-vernauwende clip in vivo en ex vivo. (A) De afbeelding toont de thoracale holte van een AoB-rat met een titanium clip geplaatst op de opgaande aorta. (B) De afbeelding toont gesloten en geopende clip ex vivo. Asterisk markeert het deel van de clip dat de naaldhouder in vivo samendrukt om de clip te openen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Wondsluiting. Afbeeldingen illustreren het sluiten van de bovenste thoracale spieren (A) en de huid (B) met een eenvoudige continue hechting. De luchtpijp (C) en de infrahyoïde spieren (D) worden gesloten door een eenvoudige hechting en de huid in de nek (E) door een eenvoudige continue hechting. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Aortabloedstroom voor en na debandingsoperatie. (A-B) Visualisatie van de opgaande aorta bij een rat met aortabanding (AoB, links) en een rat na ontbandingsoperatie (Deb, rechts) door transthoracale echocardiografie. De pijl toont de titanium clip op de aorta in (A) afwezig in (B). (C,D) Doppler-echocardiografische beelden met gepulseerde golf tonen de bloedstroom vóór de clip bij een AoB-rat (C) en de bloedstroom in het overeenkomstige aortasegment bij een Deb-rat (D) die respectievelijk een dag vóór en één dag na de aorta-debandingsoperatie zijn genomen. (E,F) Analoog tonen beelden de bloedstroom in het aortasegment na de clip bij een AoB-rat (E) en in het overeenkomstige aortasegment bij een Deb-rat (F) die respectievelijk een dag vóór en één dag na de aorta-ontbindingsoperatie zijn genomen. Turquois verticale lijnen illustreren metingen van de piek aortastroomsnelheid. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Normalisatie van de linkerventrikelfunctie door aorta-debanding. (A) Representatieve Western blots tonen eiwitniveaus van BNP en met GAPDH als belastingscontrole in linker ventrikels (LV) van AoB-ratten in week 3 na aortabanding (n = 5) en in overeenkomstige schijncontroles (n = 5). (B) Representatieve Western blots tonen BNP en GAPDH in linker ventrikels (LV) van AoB-ratten in week 5 na aortabanding (n = 4), bij Deb-ratten in week 5 (n = 5) en in schijncontroles op het overeenkomstige tijdstip na primaire chirurgie (n = 4). (C) Box- en whiskerplots tonen kwantificering van BNP-expressie genormaliseerd tot GAPDH en schijncontrole op het overeenkomstige tijdstip na de primaire operatie. Vakken tonen respectievelijk mediaan, 25 en 75 percentielen; snorharen geven de minimum- en maximumwaarden aan. Voor statistische analyses werd student's t-test33 gebruikt. *p-waarde < 0,05. (D) Staafdiagrammen (gemiddelde ± standaarddeviatie) tonen LV-ejectiefractie en volume in sham (n = 4), AoB (n = 9) en Deb (n = 7) dieren in week 5, zoals gemeten aan de hand van echocardiografie van M- en B-modusbeelden. (E) Representatieve M-modus echocardiografische beelden tonen veranderingen in LV fractionele verkorting in sham-, AoB- en Deb-dieren in week 5. Voor statistische analyses werd Mann-Whitney U test33 gebruikt. *p-waarde < 0,05. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: Ventriculaire hemodynamiek wordt genormaliseerd en cardiale hypertrofie wordt omgekeerd door aorta-debanding. (A) Representatieve metingen van de linkerventrikel (LV) en rechterventrikel (RV) bloeddruk bij een rat 3 weken na aortabanding (AoB) in vergelijking met overeenkomstige schijncontrole. (B) Representatieve beelden tonen cardiale hypertrofie bij een AoB-rat 3 weken na aortabanding in vergelijking met schijncontrole. (C-F) Box- en snorharen tonen linkerventrikel systolische druk (LVSP; C), LV-hypertrofie ([LV+S]/BW; D), rechterventrikel systolische druk (RVSP; E), en RV-hypertrofie (RV/BW; F) bij sham- en AoB-dieren 3 en 5 weken na de operatie, en genormaliseerde parameters (in vergelijking met 3- en 5-weekse AoB-groepen) bij Deb-ratten. Vakken tonen respectievelijk mediaan, 25 en 75 percentielen; snorharen geven de minimum- en maximumwaarden aan. n = 9-12 dieren werden geanalyseerd voor hemodynamische metingen en het hartgewicht werd gemeten in n = 7-12 ratten per groep. Voor statistische analyses werd de Mann-Whitney U-test gebruikt. *p-waarde < 0,05. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier wordt een gedetailleerde chirurgische techniek voor aorta-debanding in een rat AoB-model gerapporteerd die kan worden gebruikt om de omkeerbaarheid van PH-LHD en de cellulaire en moleculaire mechanismen die omgekeerde remodellering in de pulmonale vasculatuur en de RV stimuleren, te onderzoeken. Drie weken aortavernauwing bij juveniele ratten resulteert in PH-LHD die duidelijk zichtbaar is als verhoogde LV-druk, LV-hypertrofie en gelijktijdig verhoogde RV-druk en RV-hypertrofie. Aorta-debanding in week 3 na AoB was in staat om de LV te lossen en LV-hypertrofie volledig om te keren binnen twee weken na Deb. Tegelijkertijd veroorzaakte aorta-debanding ook een volledige normalisatie van RV-drukken en een gedeeltelijke omkering van RV-hypertrofie.
Het huidige model bootst dus kritische aspecten van het klinische scenario na waarbij het mechanisch lossen van de LV door een implanteerbare niet-pulsatiele LVAD met continue stroomeigenschappen eerder PH bleek om te keren bij patiënten met hartfalen34,35. In een retrospectieve analyse werd aangetoond dat LVAD-ondersteuning de pulmonale slagaderdruk in vergelijkbare mate verlaagt bij patiënten met hartfalen met reversibele of vaste PH, met vaste PH gedefinieerd als gemiddelde pulmonale arteriële druk >25 mm Hg, pulmonale vasculaire weerstand >2,5 Wood Unit en een gemiddelde druk transpulmonale gradiënt >12 mm Hg ondanks farmacologische behandeling35. Belangrijk is dat deze bevindingen34,35 indirect bewijs leveren dat het lossen van linkerventrikels niet alleen passieve pulmonale congestie en secundaire veranderingen in de vasculaire tonus van de long vermindert, maar ook omgekeerde remodellering van de pulmonale vasculatuur veroorzaakt door "fysiologische" mechanismen, d.w.z. door aanpassing aan veranderde hemodynamiek. Diepgaande, multi-omics analyses van de cellulaire en moleculaire processen die omgekeerde remodellering in de pulmonale vasculatuur stimuleren, kunnen nieuwe wegen openen voor het identificeren van nieuwe therapeutische opties voor de behandeling van PH bij patiënten met hartfalen en mogelijk ook bij andere vormen van PH, waaronder PAH. Het huidige model van debanding bij AoB-ratten biedt een unieke mogelijkheid voor dergelijke analyses, aangezien volledige normalisatie van RVSP een effectieve omkering van PH bevestigt, waardoor mechanistische studies routes kunnen identificeren met het vermogen om homeostatische processen in de zieke pulmonale vasculatuur te herstellen.
Met een vergelijkbare redenering kan het huidige model verder worden gebruikt om intra- en intercellulaire processen te bestuderen die omgekeerde remodellering van de RV stimuleren. RV-functie is onlangs erkend als een belangrijke voorspeller van de prognose voor morbiditeit en mortaliteit bij hart- en vaatziekten. Toch zijn er geen therapieën klinisch goedgekeurd om rv-functie te verbeteren36. Als zodanig biedt de mogelijkheid om omgekeerde remodelleringsprocessen in het RV-myocardium in een diermodel te bestuderen een unieke kans om een aanzienlijke kenniskloof en een kritieke medische behoefte aan te pakken.
Het succes van de technisch uitdagende aorta-ontbandingsprocedure bij AoB-ratten hangt af van chirurgische vaardigheden en nauwkeurige perioperatieve strategieën. Hieronder worden kritieke chirurgische procedurestappen beschreven die perioperatieve letaliteit kunnen veroorzaken door overmatig bloeden (1-5) of onvoldoende ademhaling (6) en aanbevelingen om deze complicaties te voorkomen.
(1) Tijdens een thoracotomie moet de middelste lijn zorgvuldig worden benaderd met een schaar om letsel aan de inwendige borstslagader te voorkomen. (2) Om het hart en de leidingen te visualiseren, moet de thymus worden gemobiliseerd en zorgvuldig in de schedelrichting worden verplaatst. Bij de ontbandingsoperatie is het thymusweefsel vaak verbonden met het hart en de slagaders via postoperatieve verklevingen van de oorspronkelijke AoB-operatie. Deze verklevingen moeten zorgvuldig worden gescheiden met een paar stompe tangen om letsel aan de cardiovasculaire structuren te voorkomen. (3) Bij de ontbandingsoperatie is de aorta met de clip vaak ingebed in bindweefsel. Dit bindweefsel moet voorzichtig worden ontleed met een stompe tang om de clip te visualiseren. Hier is de transthoracale echocardiografie die vóór de operatie wordt uitgevoerd een nuttige voorbereidingsstap, waardoor kan worden vastgesteld of de clip zich dicht bij de aortawortel, in het midden van de opgaande aorta of dicht bij de brachiocephalische slagader bevindt. Deze kennis bespaart kostbare tijd voor cliptoewijzing tijdens de operatie. (4) De oriëntatie van de clip is een kritieke stap die zorgvuldig moet worden overwogen tijdens de eerste aortabandoperatie. Om een optimale beoordeling en snelle opening van de clip tijdens het ontbinden van de aorta mogelijk te maken, moet het deel dat door de naaldhouder moet worden samengedrukt (figuur 4B) ventraal worden georiënteerd. Clip heroriëntatie tijdens debandingsoperatie is haalbaar, hoewel met het risico op letsel aan de aorta. Voor clipheroriëntatie moeten clips door een tang worden vastgehouden terwijl het omliggende bindweefsel zorgvuldig wordt verwijderd, waarna de clip moet worden gemobiliseerd en gedraaid. Het vasthouden van de aorta met de tang moet worden vermeden. (5) Voor het ontbinden moet de clip met één hand door een tang worden vastgehouden en met de andere hand met een naaldhouder worden geopend. De aorta hoeft niet ventraal te worden opgetild. (6) Na het voltooien van de ontbindingsprocedure lopen geëxtubeerde PH-LHD-ratten een aanzienlijk risico op respiratoire insufficiëntie, waarbij dieren gewoonlijk binnen 10-20 minuten na de operatie sterven terwijl ze nog onder de anesthesie zijn. Atelectase van de linkerlong is de meest voorkomende doodsoorzaak in deze periode, en langdurige mechanische beademing vóór borstsluiting helpt de long te rekruteren en voldoende ademhaling na de operatie te rechtvaardigen.
We suggereren ook dat in vergelijking met endotracheale intubatie zoals uitgevoerd in eerdere studies26,27, tracheostomie een betere controle biedt van geschikte beademing tijdens chirurgische procedures, wat specifiek relevant is tijdens aorta-debanding. Dit idee is gebaseerd op de volgende redenering: (1) Tracheostomie, routinematig uitgevoerd in ons laboratorium voor perioperatieve longventilatie, is een eenvoudige en veilige techniek zonder perioperatieve of postoperatieve complicaties. (2) Tracheostomie elimineert het risico op slokdarmperubatie of tracheale verwonding; het maakt nauwkeurige positionering en fixatie van de tracheale canule en constante visuele controle van de canule mogelijk tijdens alle stappen van de chirurgische ingreep. (3) Op het moment van aorta-ontbinding hebben AoB-dieren al hartfalen en zijn ze gevoeliger voor extra stress; als gevolg hiervan kunnen de potentiële risico's die gepaard gaan met endotracheale intubatie bijdragen aan een verhoogde letaliteit. (4) Ten slotte, wanneer het geopereerde dier van de beademingsmachine wordt gespeend maar geen spontane ademhaling ontwikkelt, maakt een tracheostoma snelle reïntubatie en herverbinding met de beademingsmachine mogelijk, waardoor mogelijk levens worden gered vanwege de mogelijkheid van langdurige postoperatieve ventilatie.
De huidige studie meldt een aorta-debandingstechniek die 3 weken na de eerste aortabanding bij ratten is uitgevoerd. Voor studies die gericht zijn op het vergelijken van omgekeerde remodellering van de pulmonale vasculatuur en de RV in verschillende PH-stadia, kunnen de beschreven procedures ook op latere tijdstippen na aortabanding worden uitgevoerd. Toch is voorzichtigheid geboden, omdat litteken- en bindweefsel rond de aorta waarschijnlijk met de tijd overvloediger zullen worden, waardoor de procedure verder wordt bemoeilijkt en extra probleemoplossing en verfijning nodig is. Tegelijkertijd gelden nog steeds de basisprincipes van het gerapporteerde protocol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden. Alle co-auteurs hebben de inhoud van het manuscript gezien en zijn het ermee eens.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd ondersteund door subsidies van het DZHK (Duits Centrum voor Cardiovasculair Onderzoek) aan CK en WMK, het BMBF (Duits Ministerie van Onderwijs en Onderzoek) aan CK in het kader van VasBio, en aan WMK in het kader van VasBio, SYMPATH en PROVID, en de Duitse Stichting voor Onderzoek (DFG) aan WMK (SFB-TR84 A2, SFB-TR84 C9, SFB 1449 B1, SFB 1470 A4, KU1218/9-1 en KU1218/11-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amoxicillin | Ratiopharm | PC: 04150075615985 | Antibiotic |
| Anti-BNP antibody | Abcam | ab239510 | Western Blotting |
| Aquasonic 100 Ultrasound gel | Parker Laboratories | BT-025-0037L | Echocardiography consumables |
| Bepanthen | Bayer | 6029009.00.00 | Eye ointment |
| Carprosol (Carprofen) | CP-Pharma | 401808.00.00 | Analgesic |
| Clip holder | Weck stainless USA | 523140S | Surgical instruments |
| Fine scissors Tungsten carbide | Fine Science Tools | 14568-12 | Surgical scissors |
| Fine scissors Tungsten carbide | Fine Science Tools | 14568-09 | Surgical scissors |
| High-resolution imaging system | FUJIFILM VisualSonics, Amsterdam, Netherlands | VeVo 3100 | Echocardiography machine. Images were acquired with pulse-wave Doppler mode, M-mode and B-mode |
| Isoflurane | CP-Pharma | 400806.00.00 | Anesthetic |
| Ketamine | CP-Pharma | 401650.00.00 | Anesthetic |
| Mathieu needle holder | Fine Science Tools | 12010-14 | Surgical instruments |
| Mechanical ventilator (Rodent ventilator) | UGO Basile S.R.L. | 7025 | Volume controlled respirator |
| Metal clip | Hemoclip | 523735 | Surgical consumables |
| Microscope | Leica | M651 | Manual surgical microscope for microsurgical procedures |
| Millar Mikro-Tip pressure catheters | ADInstruments | SPR-671 | Hemodynamics assessment |
| Moria Iris forceps | Fine Science Tools | 11373-12 | Surgical forceps |
| Noyes spring scissors | Fine Science Tools | 15013-12 | Surgical scissors |
| Povidone iodine/iodophor solution | B/Braun | 16332M01 | Disinfection |
| PowerLab | ADInstruments | 4_35 | Hemodynamics assessment |
| Prolene Suture, 4-0 | Ethicon | EH7830 | Surgical consumables |
| Rib spreader (Alm selfretaining retractor blunt, 70 mm, 2 3/4″) | Austos | AE-BV010R | Surgical instruments |
| Serrated Graefe forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | Surgical forceps |
| Silk Suture, 4-0 | Ethicon | K871 | Surgical consumables |
| Skin disinfiction solution (colored) | B/Braun | 19412M07 | Disinfection |
| Spectra 360 Elektrode gel | Parker Laboratories | TB-250-0241H | Echocardiography consumables |
| Sponge points tissue | Sugi | REF 30601 | Surgical consumables |
| Sprague-Dawley rat | Janvier Labs, Le Genest-Saint-Isle, France | Study animals | |
| Tracheal cannula | Outer diameter 2 mm | ||
| Xylazin | CP-Pharma | 401510.00.00 | Anesthetic |
References
- Rosenkranz, S., et al. Pulmonary hypertension due to left heart disease: Updated recommendations of the cologne consensus conference 2011. International Journal of Cardiology. 154, Suppl 1 34-44 (2011).
- Rosenkranz, S., et al. Left ventricular heart failure and pulmonary hypertension. European Heart Journal. 37 (12), 942-954 (2016).
- Fayyaz, A. U., et al. Global Pulmonary vascular remodeling in pulmonary hypertension associated with heart failure and preserved or reduced ejection fraction. Circulation. 137 (17), 1796-1810 (2018).
- Hunt, J. M., et al. Pulmonary veins in the normal lung and pulmonary hypertension due to left heart disease. The American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 305 (10), 725-736 (2013).
- Bursi, F., et al. Pulmonary pressures and death in heart failure: A community study. Journal of the American College of Cardiology. 59 (3), 222-231 (2012).
- Ryan, J. J., et al. Right ventricular adaptation and failure in pulmonary arterial hypertension. Canadian Journal of Cardiology. 31 (4), 391-406 (2015).
- Miller, W. L., Mahoney, D. W., Enriquez-Sarano, M. Quantitative Doppler-echocardiographic imaging and clinical outcomes with left ventricular systolic dysfunction: Independent effect of pulmonary hypertension. Circulation: Cardiovascular Imaging. 7 (2), 330-336 (2014).
- Kjaergaard, J., et al. Prognostic importance of pulmonary hypertension in patients with heart failure. The American Journal of Cardiology. 99 (8), 1146-1150 (2007).
- Shah, R., et al. Pulmonary hypertension after heart transplantation in patients bridged with the total artificial heart. ASAIO Journal. 62 (1), 69-73 (2016).
- Tracy, G. P., Proctor, M. S., Hizny, C. S. Reversibility of pulmonary artery hypertension in aortic stenosis after aortic valve replacement. The Annals of Thoracic Surgery. 50 (1), 89-93 (1990).
- Lindelow, B., Andersson, B., Waagstein, F., Bergh, C. H. High and low pulmonary vascular resistance in heart transplant candidates. A 5-year follow-up after heart transplantation shows continuous reduction in resistance and no difference in complication rate. European Heart Journal. 20 (2), 148-156 (1999).
- Martin, J., et al. Implantable left ventricular assist device for treatment of pulmonary hypertension in candidates for orthotopic heart transplantation-a preliminary study. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 25 (6), 971-977 (2004).
- Gallagher, R. C., et al. Univentricular support results in reduction of pulmonary resistance and improved right ventricular function. ASAIO Transactions. 37 (3), 287-288 (1991).
- Beyersdorf, F., Schlensak, C., Berchtold-Herz, M., Trummer, G. Regression of "fixed" pulmonary vascular resistance in heart transplant candidates after unloading with ventricular assist devices. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 140 (4), 747-749 (2010).
- Hoffmann, J., et al. Mast cells promote lung vascular remodelling in pulmonary hypertension. European Respiratory Journal. 37 (6), 1400-1410 (2011).
- Litwin, S. E., et al. Serial echocardiographic-Doppler assessment of left ventricular geometry and function in rats with pressure-overload hypertrophy. Chronic angiotensin-converting enzyme inhibition attenuates the transition to heart failure. Circulation. 91 (10), 2642-2654 (1995).
- Rockman, H. A., et al. Segregation of atrial-specific and inducible expression of an atrial natriuretic factor transgene in an in vivo murine model of cardiac hypertrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (18), 8277-8281 (1991).
- de Montgolfier, O., et al. High Systolic blood pressure induces cerebral microvascular endothelial dysfunction, neurovascular unit damage, and cognitive decline in mice. Hypertension. 73 (1), 217-228 (2019).
- Breitling, S., Ravindran, K., Goldenberg, N. M., Kuebler, W. M. The pathophysiology of pulmonary hypertension in left heart disease. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 309 (9), 924-941 (2015).
- Ranchoux, B., et al. Metabolic syndrome exacerbates pulmonary hypertension due to left heart disease. Circulation Research. 125 (4), 449-466 (2019).
- Zhang, H., Huang, W., Liu, H., Zheng, Y., Liao, L. Mechanical stretching of pulmonary vein stimulates matrix metalloproteinase-9 and transforming growth factor-beta1 through stretch-activated channel/MAPK pathways in pulmonary hypertension due to left heart disease model rats. PLoS One. 15, 0235824 (2020).
- Yin, J., et al. Sildenafil preserves lung endothelial function and prevents pulmonary vascular remodeling in a rat model of diastolic heart failure. Circulation: Heart Failure. 4 (2), 198-206 (2011).
- Yin, N., et al. Inhaled nitric oxide versus aerosolized iloprost for the treatment of pulmonary hypertension with left heart disease. Critical Care Medicine. 37 (3), 980-986 (2009).
- Breitling, S., et al. The mast cell-B cell axis in lung vascular remodeling and pulmonary hypertension. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 312 (5), 710-721 (2017).
- Kerem, A., et al. Lung endothelial dysfunction in congestive heart failure: Role of impaired Ca2+ signaling and cytoskeletal reorganization. Circulation Research. 106 (6), 1103-1116 (2010).
- Goncalves-Rodrigues, P., Miranda-Silva, D., Leite-Moreira, A. F., Falcao-Pires, I. Studying left ventricular reverse remodeling by aortic debanding in rodents. Journal of Visualized Experiments. (173), e60036 (2021).
- Miranda-Silva, D., et al. Characterization of biventricular alterations in myocardial (reverse) remodelling in aortic banding-induced chronic pressure overload. Scientific Reports. 9, 2956 (2019).
- Chou, S. H., et al. The effects of debanding on the lung expression of ET-1, eNOS, and cGMP in rats with left ventricular pressure overload. Experimental Biology and Medicine. 231 (6), 954-959 (2006).
- Hentschel, T., et al. Inhalation of the phosphodiesterase-3 inhibitor milrinone attenuates pulmonary hypertension in a rat model of congestive heart failure. Anesthesiology. 106 (1), 124-131 (2007).
- Gs, A. K., Raj, B., Santhosh, K. S., Sanjay, G., Kartha, C. C. Ascending aortic constriction in rats for creation of pressure overload cardiac hypertrophy model. Journal of Visualized Experiments. (88), e50983 (2014).
- Angermann, C. E., Ertl, G. Natriuretic peptides--new diagnostic markers in heart disease. Herz. 29 (6), 609-617 (2004).
- Ordodi, V. L., Paunescu, V., Mic, F. A. Optimal access to the rat heart by transverse bilateral thoracotomy with double ligature of the internal thoracic arteries. American Association for Laboratory Animal Science. 47 (5), 44-46 (2008).
- Fay, D. S., Gerow, K. A biologist's guide to statistical thinking and analysis. WormBook. , 1-54 (2013).
- Etz, C. D., et al. Medically refractory pulmonary hypertension: treatment with nonpulsatile left ventricular assist devices. The Annals of Thoracic Surgery. 83 (5), 1697-1705 (2007).
- Mikus, E., et al. Reversibility of fixed pulmonary hypertension in left ventricular assist device support recipients. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 40 (4), 971-977 (2011).
- Zelt, J. G. E., Chaudhary, K. R., Cadete, V. J., Mielniczuk, L. M., Stewart, D. J. Medical therapy for heart failure associated with pulmonary hypertension. Circulation Research. 124 (11), 1551-1567 (2019).
