Summary
No presente protocolo, um modelo de transplante cardíaco em camundongos é utilizado para investigar o mecanismo de rejeição do enxerto cardíaco. Neste modelo heterotópico de transplante cardíaco, a eficiência da operação é melhorada, e a sobrevida dos enxertos cardíacos é garantida por uma anastomose cervical término-terminal do implante cardíaco usando uma técnica de Cuff modificada.
Abstract
A rejeição do enxerto cardíaco limita a sobrevida em longo prazo dos pacientes após o transplante cardíaco. Um modelo de transplante cardíaco em camundongos é ideal para investigar o mecanismo de rejeição do aloenxerto cardíaco em estudos pré-clínicos devido à sua alta homologia com genes humanos. Esse entendimento ajudaria a desenvolver abordagens únicas para melhorar a sobrevida em longo prazo dos pacientes tratados com aloenxertos cardíacos. Em um modelo de camundongo, o implante de coração de doador abdominal é comumente realizado com anastomose término-terminal à aorta e veia cava inferior do receptor por meio de pontos. Nesse modelo, o coração do doador é implantado por anastomose término-terminal com a artéria carótida e veia jugular do receptor pela técnica de Cuff modificado. A cirurgia de transplante é realizada sem costura e, assim, pode aumentar a sobrevida do receptor, uma vez que não há interferência no suprimento sanguíneo e refluxo venoso da parte inferior do corpo. Este modelo murino ajudaria a investigar os mecanismos subjacentes à rejeição imunológica e patológica (aguda/crônica) de aloenxertos cardíacos.
Introduction
O transplante cardíaco tornou-se o tratamento padrão para a insuficiência cardíaca terminal. Mais de 5.500 transplantes cardíacos por ano são realizados nas organizações registradas na Sociedade Internacional de Transplante de Coração e Pulmão. Entre os receptores de transplante cardíaco alogênico, a taxa de rejeição em 1 ano ainda é de >10%, enquanto a taxa de rejeição em 3 anos aumentou para 36%1,2. No entanto, faltam tratamentos profiláticos efetivos para pacientes com rejeição do enxerto cardíaco. Portanto, estudos em modelos animais são necessários para elucidar os mecanismos fisiológicos subjacentes à rejeição imunológica e patológica de aloenxertos cardíacos. Tais estudos contribuiriam para a investigação de novos alvos necessários para o desenvolvimento de drogas eficazes, o que ajudaria a prevenir a rejeição do aloenxerto cardíaco e melhoraria as taxas de sobrevida nessas populações de pacientes.
Alguns potenciais mecanismos imunológicos e fisiopatológicos de rejeição do enxerto cardíaco têm sido propostos recentemente em modelos murinos de transplante cardíaco heterotópico3,4,5. Consequentemente, o transplante cardíaco heterotópico de camundongos tornou-se um modelo pré-clínico ideal para investigar os mecanismos de rejeição imune e lesão patológica que ocorrem em aloenxertos cardíacos após o transplante cardíaco devido à sua alta homologia com genes humanos. O conceito prevalente é a realização de transplante heterotópico em modelo murino por anastomose abdominal término-terminal na aorta receptora e veia cava inferior com pontos, semelhante à anatomia humana normal. Entretanto, esse procedimento pode interferir no suprimento sanguíneo do receptor e no refluxo venoso da parte inferior do corpo6. Portanto, um procedimento de transplante cardíaco heterotópico modificado em um modelo de camundongo é proposto aqui.
O coração do doador é implantado com a artéria carótida e veia jugular do receptor por meio de anastomose cervical término-terminal com a técnica de Cuff modificada. Esse procedimento modificado facilitou a viabilidade operatória e garantiu a sobrevida do enxerto cardíaco sem interferir no suprimento sanguíneo e no refluxo venoso da parte inferior do corpo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com o Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, Eight Edition, National Research Council (US) 2011. Os procedimentos envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Hospital do Câncer da Universidade de Chongqing, Chongqing, China. Camundongos BALB/c e C57BL/6 machos, pesando 20-30 g, obtidos de fontes comerciais (ver Tabela de Materiais), foram usados para o estudo do transplante cardíaco alogênico. Os camundongos C57BL/6 foram utilizados como doadores e receptores singênicos, enquanto os camundongos BALB/c serviram como receptores alogênicos. Um esquema do protocolo é mostrado na Figura 1.
NOTA: Todos os suprimentos utilizados durante a cirurgia, incluindo instrumentos e soluções cirúrgicas, são estéreis. O procedimento cirúrgico adere ao princípio da técnica de operação asséptica.
1. Procedimento do destinatário
- Induzir anestesia geral através da inalação de isoflurano a 5% através de uma câmara de indução de 15 x 10 x 10 cm conectada a um capuz (ver Tabela de Materiais).
- Fixe o mouse do destinatário na mesa de operação com uma almofada de aquecimento. Manter a anestesia com inalação contínua de isoflurano a 2% através de uma máscara facial sobre o nariz e a boca.
NOTA: A frequência e o ritmo respiratórios lentos, o desaparecimento do reflexo corneano e a ausência do reflexo pedal nos pododáctilos indicam a eficácia da anestesia. - Após raspar os cabelos, desinfetar a área cirúrgica com três rodadas alternadas de esfoliação iodopovidona, seguidas de álcool. Em seguida, incisar a pele 1,5-2 cm paralela à linha média cervical do ângulo mandibular direito até a extremidade caudal.
- Dissecção ~1 cm da veia jugular externa direita com eletrocoagulador e micropinça. Prender a veia na extremidade proximal com uma pinça microvascular atraumática e ligá-la na extremidade distal.
- Passe a extremidade distal da veia através de um manguito farpado de poliuretano 22 G (ver Tabela de Materiais) com uma extremidade chanfrada e sulcos superficiais. Fixe a veia com a alça do manguito usando uma pinça microvascular.
- Remover o 8-0 sutura de ligadura na extremidade distal, vire o lúmen sobre o manguito preso pela farpa superficial de dentro para fora e fixe com sutura cirúrgica 10-0 nos sulcos da superfície.
- Ressecção da glândula sublingual direita para formação de fossa para implante do enxerto cardíaco, reservando o lobo direito da glândula submaxilar e o esternocleidomastoideo direito.
- Dissecar a artéria carótida comum direita por ~1 cm usando micropinças e clipar a artéria com uma pinça microvascular atraumática na extremidade proximal. Na extremidade distal, ligadura e corta a artéria.
- Passe a extremidade distal da artéria através de um manguito farpado de poliuretano 26 G (ver Tabela de Materiais) com uma extremidade chanfrada e sulcos na superfície. Fixar a artéria com a alça do manguito usando uma pinça microvascular.
- Remova a sutura da ligadura na extremidade distal, vire a luz do avesso sobre o manguito e fixe com uma farpa superficial e sulcos com uma sutura cirúrgica 10-0.
- Após o preparo dos vasos do receptor, lançar 100 UI/mL de solução salina de heparina sobre os vasos para evitar trombose. Cobrir a incisão cervical com gaze salina úmida estéril para posterior implante.
2. Procedimento do doador
- Empregar o mesmo procedimento anestésico (passo 1.1) para o camundongo doador.
- Raspar os cabelos abdominais usando uma navalha elétrica e desinfetar a área cirúrgica com três rodadas alternadas de esfoliação com iodopovidona seguidas de álcool.
- Incise o abdome (2-3 cm) com uma tesoura ao longo da linha média, desde a sínfise púbica até o subxifóide, e expanda a área incisada com um afastador.
- Dissecar 1 cm da aorta abdominal e veia cava inferior com eletrocoagulador e micropinça e heparinizar injetando-se 1 mL de soro fisiológico suplementado com 250 UI/mL de heparina pela veia cava inferior. Depois disso, excisar a aorta abdominal e veia cava inferior.
- Excisar o tórax ao longo da linha axilar anterior em ambos os lados usando uma tesoura cirúrgica para separar a parede torácica. Ligate a veia cava superior com um 8-0 sutura cirúrgica.
- Inserir uma agulha de couro cabeludo na veia cava inferior supra-hepática. Em seguida, injetar soro fisiológico gelado suplementado com 100 UI/mL de heparina através da agulha do couro cabeludo da veia cava inferior supra-hepática para perfundir o coração do doador até que a cor do sangue desapareça.
- Reperfundir o coração do doador com 2-3 mL de solução gelada de histidina-triptofano-cetoglutarato (HTK) (ver Tabela de Materiais) usando uma agulha de couro cabeludo do arco aórtico para proteger o miocárdio do doador. O tempo médio de isquemia quente é de 5 min.
- Acoplar as veias cavas superior e inferior e a veia pulmonar com sutura cirúrgica 5-0. Dissecar e cortar a aorta doadora e a artéria pulmonar antes de sua ramificação. Em seguida, divida a veia cava superior e inferior e a veia pulmonar para retirar o coração do doador.
3. Implantação
- Implante o coração doador na bolsa cervical do camundongo receptor em posição invertida.
- Puxar o manguito com uma veia jugular receptora evertida para dentro da luz da artéria pulmonar doadora para realizar a anastomose término-terminal da artéria pulmonar doadora com a veia jugular externa receptora. Ligate o manguito usando os sulcos na superfície através de uma sutura cirúrgica 10-0 para fixar a anastomose.
- Empregar procedimento semelhante para anastomose término-terminal da aorta doadora com a artéria carótida receptora.
- Solte a pinça microvascular atraumática da veia jugular seguida da artéria carótida para reperfundir o coração do doador. O tempo médio de isquemia fria é de 15 min.
- Fixar o enxerto cardíaco e suturá-lo adequadamente para evitar a torção do enxerto.
- Fechar a incisão cervical com suturas contínuas com fio monofilamentar de poliamida 5-0 (ver Tabela de Materiais).
NOTA: Remova a sutura após a cicatrização completa da ferida. - Mantenha o rato receptor dentro de uma gaiola quente, seca e limpa até que se recupere da anestesia.
NOTA: Leva 5-10 minutos para recuperar. - Injetar buprenorfina (0,05 mg/kg) por via subcutânea no camundongo receptor a cada 6 h por 48 h para analgesia pós-operatória.
OBS: A dose de analgesia foi otimizada para este estudo. No entanto, o regime de analgesia pode ser estendido/modificado se houver qualquer sinal de dor, de acordo com as diretrizes institucionais de uso de animais.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Neste modelo de transplante cardíaco heterotópico cervical em camundongos, a taxa de sobrevivência dos camundongos receptores foi de aproximadamente 95,2% (20 dos 21 camundongos sobreviveram). A principal causa de óbito foi sangramento pós-operatório. O batimento cardíaco acelerado com ritmo regular serve como indicador da sobrevida do coração doador implantado.
Camundongos C57BL/6 e BALB/c foram do tipo MHC (H-2b) e MHC (H-2d) nesse modelo, respectivamente 7,8. Essas duas cepas diferem pelo H-2, que causa rejeição aguda mediada por células T9. De todos os aloenxertos cardíacos, 62,5% foram perdidos até 7 dias após o transplante, avaliados pela palpação dos batimentos cardíacos. Todos os aloenxertos cardíacos foram perdidos dentro de 8 dias após o transplante. Em contraste, todos os transplantes cardíacos isogênicos sobreviveram além de 4 semanas (Figura 2). Camundongos que sobreviveram além de 4 semanas foram eutanasiados por inalação de CO2.
Figura 1: Esquema do modelo de transplante cardíaco heterotópico cervical em camundongos. (A) Protocolo de preparo do receptor: após clipagem da artéria carótida comum e veia jugular externa na extremidade proximal, a luz vascular dos vasos é evertida e fixada após passar pelo manguito farpado com uma extremidade chanfrada e sulcos na superfície. O quadrado tracejado mostra a estrutura e o uso do manguito. (B) Ressecção do coração do doador: após a perfusão do coração doador com heparina e solução HTK da veia cava inferior e aorta, liga-se a veia cava superior e inferior e a veia pulmonar com suturas. O coração do doador é então ressecado incisando os vasos vasculares. (C) Implante do coração do doador. A artéria pulmonar e a aorta doadoras são anastomosadas à veia jugular externa do receptor, e a artéria carótida através do manguito com a vasculatura do receptor virada do avesso em um padrão término-terminal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Curva de sobrevida dos enxertos cardíacos. A curva de sobrevida dos enxertos cardíacos mostra que os transplantes cardíacos alogênicos são perdidos até 8 dias após o transplante, o que foi avaliado pela palpação dos batimentos cardíacos. Um total de 10 camundongos receptores foi submetido ao transplante cardíaco heterotópico cervical modificado em cada grupo. Todos os transplantes cardíacos isogênicos sobreviveram mais de 4 semanas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Rupert Oberhuber et al.10 | Xin Mao et al (presente trabalho) | |||
| Anestesia | xilazina e cetamina | isoflurano (Seguro, contínuo e estável) | ||
| Lobo direito da glândula submandibular | remoção | preservação (Reduzir o rodopio dos enxertos) | ||
| Esternocleidomastoideo direito | remoção | preservação (Reduzir o rodopio dos enxertos) | ||
| Perfusão cardíaca | Perfusão retrógrada com solução de HTK a 4 °C do arco aórtico | 1. Perfusão anterógrada com soro fisiológico gelado suplementado com 100 UI/mL de solução de heparina da veia cava supra-hepática. 2. Reperfusão retrógrada com solução gelada de HTK do arco aórtico (Reduzir a coagulação e aumentar a proteção miocárdica) | ||
| Algema | extremidade romba, com alça | extremidade chanfrada, com alça, farpa e ranhuras na superfície (Facilitar a eversão e fixação) | ||
Tabela 1: Comparação das técnicas de transplante cardíaco. A atual técnica de transplante cardíaco heterotópico cervical em camundongos é modificada de Oberhuber, R. et al.10 e possui vantagens adicionais na sobrevida do enxerto cardíaco.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
O modelo de transplante cardíaco em camundongos contribui para a investigação dos mecanismos de rejeição após o transplante cardíaco, contribuindo para o desenvolvimento de abordagens únicas para melhorar a sobrevida em longo prazo de receptores de aloenxerto cardíaco. Entretanto, o transplante cardíaco em camundongos é uma tarefa complexa e desafiadora, exigindo alto nível de técnicas de microcirurgia, principalmente em anastomosesvasculares11,12,13. O modelo de transplante cardíaco heterotópico abdominal de camundongos é realizado por meio de pontos por anastomose da aorta e artéria pulmonar doadoras com a aorta e veia cava inferior receptoras. A aorta e a veia cava inferior do receptor precisam ser bloqueadas nessa operação. Portanto, a isquemia da parte inferior do corpo e a trombose da veia cava inferior podem aumentar a incapacidade e a morte de camundongos receptores. Para reduzir as dificuldades da anastomose vascular durante o transplante, Matsuura e col. introduziram pela primeira vez um modelo de transplante cardíaco cervical em camundongos usando a técnica do manguito em 199114. Neste modelo, a anastomose everted dos vasos por ligadura com manguito aumentou a eficiência da anastomose. Em contraste com a anastomose de vasos com suturas em um modelo de transplante cardíaco abdominal em camundongos, reduziu a probabilidade de sangramento pós-procedimento. Portanto, a melhora da eficiência da anastomose reduziu o tempo de isquemia do músculo cardíaco e aumentou a sobrevida dos enxertos cardíacos. Além disso, o implante cervical do coração do doador não interrompe a circulação da aorta receptora e da veia cava inferior em comparação com o implante abdominal15; portanto, a sobrevivência dos camundongos receptores é aumentada.
Um modelo experimental único de transplante cardíaco heterotópico em camundongos é descrito aqui, estabelecido por Rupert Oberhuber e cols.10. O procedimento envolve uma anastomose cervical término-terminal da aorta doadora e da artéria pulmonar com a artéria carótida e veia jugular receptora, seguindo a técnica de Cuff modificada. Nesse modelo, a circulação sistêmica dos camundongos receptores não interfere com10, e o coração do doador foi perfundido da veia cava inferior e aorta com soluções de heparina e HTK para melhor proteção miocárdica. Entretanto, o componente crítico desse modelo diferiu do de Oberhuber et al.10, que empregaram o manguito farpado modificado com extremidade chanfrada e sulcos semelhantes aos de Finsterer et al.16. A extremidade chanfrada facilita um evert oversleeve do lúmen vascular. Os sulcos na superfície facilitam a fixação das paredes evertidas dos vasos com um manguito usando suturas, e a farpa fora do manguito reduz o deslizamento das paredes dos vasos anastomosadas do manguito (Figura 1). Essas modificações diminuem o tempo cirúrgico em 20% e melhoram a eficiência e a sobrevida do implante dos enxertos cardíacos. Além disso, o manguito farpado modificado é produzido a partir do cateter de poliuretano mais comum usado para acupuntura no couro cabeludo, reduzindo significativamente o custo do procedimento. A comparação da técnica atual com a de Oberhuber et al.10 é mostrada na Tabela 1.
As características únicas deste modelo precisam ser observadas. Primeiro, o comprimento e o calibre do manguito são essenciais para o sucesso da anastomose. O comprimento adequado do manguito foi de ~3 mm com alça (1 mm) (Figura 1). O calibre adequado do manguito é de 26 G e 22 G para artéria e veias, respectivamente. O comprimento e o calibre inadequados do manguito resultariam em torção ou tensão excessiva dos vasos anastomosados. Em segundo lugar, os comprimentos adequados dos vasos do receptor são de 1,5 a 2 dobras do manguito. Terceiro, o coração do doador não é perfundido com pressão excessiva, potencialmente danificando o enxerto. Quarto, o enxerto cardíaco é fixado, e o manguito é anastomosado em posição adequada por sutura após o implante para evitar movimentação ou torção dos vasos ou enxertos anastomosados. Em quinto lugar, a preservação da glândula submaxilar e do esternocleidomastoideo contribui para reduzir o rodopio ou torção dos vasos anastomosados ou do enxerto ao ressaltar a glândula sublingual direita para produzir uma fossa para enxerto cardíaco. Em sexto lugar, para facilitar o oversleeve-like evert da luz vascular e reduzir a trombose após a cirurgia, solução de heparina (100 UI/mL) pode ser fornecida aos vasos anastomosados durante a realização da anastomose.
Esta técnica do manguito facilita a anastomose dos vasos doadores e receptores durante o implante; entretanto, a dureza do manguito pode, por sua vez, aumentar o risco de torção dos vasos anastomosados, resultando em aumento da trombose após o transplante. A otimização do material do manguito é necessária para reduzir complicações, aumentar a sobrevida do enxerto e aumentar a taxa de utilização dos modelos em experimentos subsequentes. Além disso, a cicatriz fibrosa do corte pode limitar o espaço para o enxerto cardíaco e afetar sua sobrevida a longo prazo. Além disso, a ejeção do enxerto cardíaco pode interferir no fluxo sanguíneo hemodinâmico normal dos camundongos receptores. Finalmente, esse modelo não é funcional e não pode ser usado para avaliar a função cardíaca dos enxertos. No entanto, este estudo fornece conhecimento sobre as funções imunológicas e patológicas do transplante cardíaco.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (81870304) para Jun Li.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-0 Polyamide Monofilament suture | B.Braun Medical Inc. | C3090954 | |
| 8-0 Polyamide Monofilament suture | B.Braun Medical Inc. | C2090880 | |
| 10-0 Polyamide Monofilament suture | B.Braun Medical Inc. | G0090781 | |
| 22 G polyurethane cuff | B.Braun Medical Inc. | 4251628-02 | |
| 26 G polyurethane cuff | Suzhou Linhua Medical Instrument Co., LTD | REF383713 | |
| Anesthesia induction chamber | RWD Life Science Co., LTD | V100 | |
| Atraumatic microvascular clamp | Beyotime | FS500 | |
| BALB/c and C57BL/6 mice (20–30 g) | Centre of Experimental Animals (Army Medical University, Chongqing, China) | ||
| Buprenorphine | US Biological life Sciences | 352004 | |
| Electrocoagulator | Guangzhou Runman Medical Instrument Co., LTD | ZJ1099 | |
| Gauze | Henan piaoan group Co., LTD | 10210402 | |
| Heating pad | Guangzhou Dewei Biological Technology Co., LTD | DK0032 | |
| Heparin | North China Pharmaceutical Co., LTD | 2101131-2 | |
| HTK solution | Shenzhen Changyi Pharmaceutical Co., LTD | YZB/Min8263-2013 | |
| Injection syringe (10 mL) | Shandong weigao group medical polymer Co., LTD | 20211001 | |
| Isoflurane | RWD Life Science Co., LTD | 21070201 | |
| Physiological saline | Southwest pharmaceutical Co., LTD | H50021610 | |
| Scalp needle | Hongyu Medical Group | 20183150210 | |
| Shaver | Beyotime | FS600 | |
| Small animal anesthesia machine | RWD Life Science Co., LTD | R500 | |
| Surgical operation microscope | Tiannuoxiang Scientific Instrument Co. , Ltd, Beijing, China | SZX-6745 | |
| Swab | Yubei Medical Materials Co., LTD | 21080274 |
References
- Khush, K. K., et al. The International thoracic organ transplant registry of the international society for heart and lung transplantation: Thirty-sixth adult heart transplantation report - 2019; focus theme: Donor and recipient size match. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 38 (10), 1056-1066 (2019).
- Stehlik, J., et al. The registry of the international society for heart and lung transplantation: 29th official adult heart transplant report--2012. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 31 (10), 1052-1064 (2012).
- Huang, H., et al. Combined intrathymic and intravenous injection of mesenchymal stem cells can prolong the survival of rat cardiac allograft associated with decrease in miR-155 expression. Journal of Surgical Research. 185 (2), 896-903 (2013).
- Eggenhofer, E., et al. Features of synergism between mesenchymal stem cells and immunosuppressive drugs in a murine heart transplantation model. Transplant Immunology. 25 (2-3), 141-147 (2011).
- Sula Karreci, E., et al. Brief treatment with a highly selective immunoproteasome inhibitor promotes long-term cardiac allograft acceptance in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (52), 8425-8432 (2016).
- Liu, F., Kang, S. M.
- Lin, C. M., Gill, R. G., Mehrad, B. The natural killer cell activating receptor, NKG2D, is critical to antibody-dependent chronic rejection in heart transplantation. American Journal of Transplantation. 21 (11), 3550-3560 (2021).
- Ito, H., Hamano, K., Fukumoto, T., Wood, K. J., Esato, K. Bidirectional blockade of CD4 and major histocompatibility complex class II molecules: An effective immunosuppressive treatment in the mouse heart transplantation model. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 17 (5), 460-469 (1998).
- Zhou, Y. X., et al. Acute rejection correlates with expression of major histocompatibility complex class I antigens on peripheral blood CD3(+)CD8(+) T-lymphocytes following skin transplantation in mice. Journal of International Medical Research. 39 (2), 480-487 (2011).
- Oberhuber, R., et al. Murine cervical heart transplantation model using a modified cuff technique. Journal of Visualized Experiments. (92), e50753 (2014).
- Cui, D., Tan, C., Liu, Z. An alternative technique of arterial anastomosis in mouse heart transplantation. Clinical Transplantation. 32 (6), 13264 (2018).
- Plenter, R. J., Zamora, M. R., Grazia, T. J. Four decades of vascularized heterotopic cardiac transplantation in the mouse. Journal of Investigative Surgery. 26 (4), 223-228 (2013).
- Fang, J., et al. A simplified two-stitch sleeve technique for arterial anastomosis of cervical heterotopic cardiac transplantation in mice. American Journal of Translational Research. 5 (5), 521-529 (2013).
- Matsuura, A., Abe, T., Yasuura, K. Simplified mouse cervical heart transplantation using a cuff technique. Transplantation. 51 (4), 896-898 (1991).
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Primarily vascularized allografts of hearts in mice. The role of H-2D, H-2K, and non-H-2 antigens in rejection. Transplantation. 16 (4), 343-350 (1973).
- Fensterer, T. F., Miller, C. J., Perez-Abadia, G., Maldonado, C. Novel cuff design to facilitate anastomosis of small vessels during cervical heterotopic heart transplantation in rats. Comparative Medicine. 64 (4), 293-299 (2014).
