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Immunology and Infection

प्रोटीनुरिया का विश्लेषण, ल्यूकोसाइट्स की गुर्दे की घुसपैठ, और ल्यूपस-प्रवण एमआरएल / एलपीआर चूहों में प्रोटीन का गुर्दे का जमाव

Published: June 8, 2022 doi: 10.3791/63506
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biomedical Sciences and Pathobiology, Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine, Virginia Polytechnic Institute and State University

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल चूहों में ल्यूपस प्रगति को ट्रैक करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है। गुर्दे में कोशिका घुसपैठ और प्रोटीन जमाव के आधार पर ल्यूपस नेफ्राइटिस को चिह्नित करने के लिए दो अतिरिक्त प्रक्रियाएं प्रस्तुत की जाती हैं।

Abstract

प्रणालीगत ल्यूपस एरिथेमेटोसस (एसएलई) एक ऑटोइम्यून विकार है जिसका कोई ज्ञात इलाज नहीं है और गुर्दे सहित कई अंगों में लगातार सूजन की विशेषता है। ऐसी परिस्थितियों में, गुर्दा रक्त से अपशिष्ट को साफ करने और नमक और द्रव सांद्रता को विनियमित करने की अपनी क्षमता खो देता है, अंततः गुर्दे की विफलता का कारण बनता है। महिलाओं, विशेष रूप से प्रसव उम्र की महिलाओं को पुरुषों की तुलना में नौ गुना अधिक बार निदान किया जाता है। गुर्दे की बीमारी एसएलई रोगियों में मृत्यु दर का प्रमुख कारण है। वर्तमान प्रोटोकॉल एकत्र मूत्र में उत्सर्जित प्रोटीन के स्तर को मापने के लिए एक त्वरित और सरल विधि का वर्णन करता है, समय के साथ ल्यूपस प्रगति को ट्रैक करता है। इसके अलावा, ल्यूकोसाइट्स के गुर्दे की घुसपैठ की जांच के लिए आकार और घनत्व चयन के आधार पर गुर्दे की मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक दृष्टिकोण प्रदान किया जाता है। इसके अलावा, एक इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विधि को ग्लोमेरुली में प्रोटीन जमाव और ट्यूबुलोइंटरस्टिशियल स्पेस में ल्यूकोसाइट घुसपैठ को चिह्नित करने के लिए विकसित किया गया है। साथ में, ये विधियां ल्यूपस-प्रवण एमआरएल / एलपीआर चूहों के गुर्दे से जुड़ी पुरानी सूजन की प्रगति की जांच करने में मदद कर सकती हैं।

Introduction

गुर्दे का प्राथमिक कार्य पानी और लवण के होमोस्टैसिस को बनाए रखते हुए मूत्र के माध्यम से विषाक्त पदार्थों का उन्मूलन है1. प्रणालीगत ल्यूपस एरिथेमेटोसस (एसएलई) वाले रोगियों में इस कार्य को खतरा है, जिससे तथाकथित ल्यूपस नेफ्रैटिस (एलएन) होता है। एलएन गुर्दे पर हमला करने वाली प्रतिरक्षा प्रणाली का एक परिणाम है, जिससे लगातार गुर्दे की सूजन होती है, इसलिए रक्त से अपशिष्ट को साफ करने और नमक और द्रव सांद्रता को विनियमित करने की अपनी क्षमता खो देता है। यह अंततः गुर्दे की विफलता का कारण बनेगा, जो घातक हो सकता है। नेफ्रिटिक प्रक्रिया के दौरान, परिसंचारी बी कोशिकाओं, टी कोशिकाओं और मोनोसाइट्स को गुर्दे में भर्ती किया जाता है, जो केमोकिन्स, साइटोकिन्स और प्रतिरक्षा जटिल बनाने वाले ऑटोएंटिबॉडी को स्रावित करता है। यह अंततः एंडोथेलियल सेल क्षति, झिल्लीदार चोटों, गुर्दे ट्यूबलर शोष और फाइब्रोसिस2 में परिणाम देता है।

एमआरएल /एमपी-फासएलपीआर (एमआरएल /एलपीआर) ल्यूपस-प्रवण चूहों एक शास्त्रीय माउस मॉडल है जो ल्यूपस जैसे नैदानिक संकेतों का प्रदर्शन करता है जो मानव एसएलई3 जैसा दिखता है। यह मॉडल एसएलई रोगियों, ल्यूपस नेफ्रैटिस (एलएन) 4 में मृत्यु दर के प्रमुख कारणों में से एक को समझने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है। मानव और माउस एसएलई दोनों में, एलएन को प्रतिरक्षा परिसरों के गुर्दे के जमाव से ट्रिगर होने वाली क्रमिक सूजन की विशेषता है, इसके बाद पूरक सक्रियण, भड़काऊ कोशिकाओं की भर्ती और गुर्दे के कार्य का नुकसान5. प्रतिरक्षा जटिल जमाव आंतरिक गुर्दे की कोशिकाओं द्वारा केमोकाइन और साइटोकिन उत्पादन को प्रेरित करने के लिए पहला कदम है, जो प्रतिरक्षा कोशिकाओं की भर्ती करके भड़काऊ प्रतिक्रिया का विस्तार करताहै 6. वर्तमान प्रोटोकॉल गुर्दे की बीमारी की प्रगति का पालन करने के लिए कई तकनीकों को प्रस्तुत करता है जो सेल घुसपैठ और प्रतिरक्षा जटिल बयान का विश्लेषण करते हैं।

हर हफ्ते एकत्र मूत्र ल्यूपस की शुरुआत से पहले, दौरान और बाद में प्रोटीन्यूरिया के समय पाठ्यक्रम का पता लगाने और दृश्य की अनुमति देता है। बायोमार्कर के रूप में प्रोटीनुरिया एलएन की जैविक प्रगति को निर्धारित कर सकता है। इस तकनीक के अन्य फायदे यह हैं कि यह गैर-आक्रामक, लागत कुशल और लागू करने में आसानहै 7. जब गुर्दे पूरी तरह से काम कर रहे होते हैं, तो प्रोटीन्यूरिया का स्तर लगातार कम होता है; एलपीआर चूहों में, 8-9 सप्ताह की उम्र के बाद, प्रोटीनूरिया स्तर की क्रमिक वृद्धि, जो अंततः गुर्दे की विफलता8 का कारण बनने के लिए पर्याप्त है, मनाया जाता है। इस मुद्दे की निगरानी के लिए कई अभिकर्मक स्ट्रिप्स और वर्णमितीय अभिकर्मक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं। हालांकि, ब्रैडफोर्ड परख प्रोटीनूरिया की शुरुआत और ल्यूपस नेफ्राइटिस के पाठ्यक्रम को निर्धारित करने में सस्ता और बहुत सटीक है। यह परख त्वरित है, और अभिकर्मक सॉल्वैंट्स, बफर, कम करने वाले एजेंटों और धातु-चेलेटिंग एजेंटों की उपस्थिति से प्रभावित नहीं है जो आपके नमूने 9,10,11 में हो सकते हैं।

विचार करने के लिए एक महत्वपूर्ण पहलू गुर्दे में कोशिका घुसपैठ है। ये घुसपैठ सूजन को खराब करने के लिए साइटोकिन्स जैसे घुलनशील कारकों के स्राव को ट्रिगर करके रोगजनन को बढ़ावा देते हैं12. बेहतर ढंग से समझने के लिए कि घुसपैठ में कौन सी कोशिका आबादी मौजूद है, ल्यूकोसाइट्स13 को अलग करना एक उपयोगी तरीका है। यहां, बी कोशिकाओं के गुर्दे की घुसपैठ का पता लगाने का उपयोग एक उदाहरण के रूप में किया जाता है। प्रक्रिया डीऑक्सीराइबोन्यूक्लिज (डीएनए) और कोलेजनेज के साथ पाचन प्रक्रिया के साथ शुरू होती है, इसके बाद घनत्व ढाल पृथक्करण होता है जो मलबे, लाल रक्त कोशिकाओं और घने ग्रैनुलोसाइट्स को हटा देता है। बी कोशिकाओं (सीडी 19 +) और प्लाज्मा कोशिकाओं (सीडी 138 +) को अलग करने का कारण यह है कि ल्यूपस गुर्दे इन कोशिकाओंको 14 पर केंद्रित कर सकते हैं। यह सुझाव दिया जाता है कि गुर्दे में छोटे समुच्चय में बी कोशिकाओं की उपस्थिति क्लोनल विस्तार का संकेत दे सकती है और परिणामस्वरूप, इम्युनोग्लोबुलिन (आईजी) उत्पादन। प्लाज्मा कोशिकाओं को इन समुच्चयों में भी मौजूद होने के लिए जाना जाता है15. एक बार ल्यूकोसाइट्स को अलग करने के बाद, प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) का उपयोग विभिन्न प्रतिदीप्ति-संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ धुंधला होने पर ब्याज की कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है।

इम्यूनोफ्लोरेसेंस इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) का पता लगाने के तरीकों में से एक है जो 4 μm मोटी गुर्दे के ऊतकों के नमूनों में प्रोटीन के फ्लोरोसेंट विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है। अन्य आईएचसी का पता लगाने के तरीके विश्लेषण, बाध्यकारी रसायन विज्ञान और अन्य कारकों की प्रकृति पर निर्भर करतेहैं 16. इम्यूनोफ्लोरेसेंस एक तेजी से पहचान विधि है जो एंटीजन को एक विशिष्ट फ्लोरोक्रोम (या फ्लोरोसेंट डाई) के साथ लेबल किए गए अपने समकक्ष एंटीबॉडी को उजागर करती है। उत्तेजित होने पर, यह प्रकाश पैदा करता है जो एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का पता लगा सकता है। इस तकनीक का उपयोग पूरक सी 3 और आईजीजी 2 ए17 के जमाव का निरीक्षण करने के लिए किया जा सकता है। अत्यधिक पूरक कैस्केड सक्रियण एक अनियंत्रित प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और हानि-ऑफ-फ़ंक्शन18 से जुड़ा हो सकता है। गुर्दे में एंटी-डबल-फंसे डीएनए (एंटी-डीएसडीएनए) ऑटोएंटिबॉडी का प्रतिरक्षा जमाव एक प्रमुख चिंता का विषय है, जहां आईजीजी 2 ए आइसोटाइप वाले लोग एलएन20 से जुड़े हुए हैं। विशेष रूप से, एंटी-डीएसडीएनए एंटीबॉडी परमाणु सामग्रियों के लिए अधिक रोगजनकता और आत्मीयता प्रदर्शित करते हैं, जिससे प्रतिरक्षा परिसर21 बनते हैं। जब आईजीजी 2 ए मौजूद होता है, तो सी 3 सहित पूरक कैस्केड, प्रतिरक्षा परिसरों22 को साफ करने के लिए सक्रिय होता है। सी 3 और आईजीजी 2 ए मार्करों को व्यक्तिगत रूप से मात्रा निर्धारित की जा सकती है या उनके सहसंबंध को स्थापित करने के लिए मढ़ा जा सकता है।

विशेष रूप से, सीरम क्रिएटिनिन माप एक और विश्वसनीय तकनीक है जिसका उपयोग एलएन23 का निदान करने के लिए सूक्ष्म हेमट्यूरिया और गुर्दे की बायोप्सी के साथ किया जा सकता है। हालांकि, प्रोटीनमेह की उपस्थिति ग्लोमेरुलर क्षति का एक मजबूत संकेतक है। उस अर्थ में, ल्यूपस के दौरान प्रोटीनुरिया के स्तर की निगरानी करने से बीमारी की शुरुआत का पता लगाया जा सकता है और ल्यूपस के निदान के लिए अन्य तरीकों का पूरक हो सकता है। इसके अलावा, ग्लोमेरुली में जमा प्रतिरक्षा परिसर एक भड़काऊ प्रतिक्रिया को प्रेरित कर सकते हैं, पूरक प्रणाली को सक्रिय कर सकते हैं, और अधिक भड़काऊ कोशिकाओं की भर्ती कर सकते हैं। इस प्रोटोकॉल का एक और उल्लेखनीय बिंदु गुर्दे में बी सेल घुसपैठ है। यह, घुसपैठ टी कोशिकाओं के साथ, स्थानीय प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को बढ़ाता है जो अंग क्षति को ट्रिगर करते हैं। महत्वपूर्ण रूप से, एलएन का वर्गीकरण न केवल माइक्रोस्कोपी में देखे गए ग्लोमेरुलर मॉर्फोलॉजिकल परिवर्तनों पर आधारित है, बल्कि इम्यूनोफ्लोरेसेंस के साथ देखे गए प्रतिरक्षा जमा भी है। इसलिए, इस प्रोटोकॉल में, गुर्दे समारोह के विश्लेषण के लिए सटीक और लागत प्रभावी तरीके प्रयोगशाला सेटिंग्स में पेश किए जाते हैं।

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Protocol

वर्तमान प्रोटोकॉल वर्जीनिया टेक में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित है। चूंकि ल्यूपस रोग में महिलाओं में अधिक घटनाएं होती हैं, इसलिए केवल मादा एमआरएल / एलपीआर चूहों का उपयोग किया जाता था। नमूना संग्रह 4 सप्ताह की उम्र में शुरू किया गया था और 15 सप्ताह में समाप्त हुआ था। चूहों को वाणिज्यिक स्रोतों से प्राप्त किया गया था ( सामग्री की तालिका देखें) और संस्थागत दिशानिर्देशों का पालन करते हुए एक विशिष्ट रोगज़नक़ मुक्त वातावरण में नस्ल और रखरखाव किया गया था।

1. प्रोटीनमेह परीक्षण

  1. नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए मूत्र इकट्ठा करें।
    1. 70% इथेनॉल छिड़काव करके हुड को निष्फल करें। सतह पर एक बाँझ प्लास्टिक शीट रखें। युक्तियाँ, 1.5 एमएल ट्यूब, और तरल के बारे में 20 μL इकट्ठा करने के लिए एक विंदुक तैयार करें।
      नोट: युक्तियाँ और ट्यूब बाँझ और किसी भी पूर्व उपचार के बिना होना चाहिए।
    2. पिंजरे को लें और हुड के अंदर डालने से पहले 70% इथेनॉल स्प्रे करें।
    3. एक हाथ से माउस पकड़ो और धीरे से ऊपर से नीचे उदर क्षेत्र मालिश करने के लिए दूसरे हाथ का उपयोग करें।
    4. मूत्र को सीधे इकट्ठा करने के लिए 1.5 एमएल ट्यूब या पिपेट का उपयोग करें, या यदि नमूना गिरता है, तो इसे प्लास्टिक शीट से इकट्ठा करें। प्रत्येक नमूने के लिए ताजा दस्ताने, चादरें और युक्तियों का उपयोग करें।
      नोट: यदि यह काम नहीं करता है, तो माउस को अलग करने के लिए एक बाँझ बीकर का उपयोग करें, फिर माउस पेशाब के बाद बीकर से मूत्र एकत्र करें।
    5. माउस पिंजरे में वापस रखो। एक और माउस निकालें और चरण 1.1.3-1.1.4 दोहराएं।
      नोट: हमेशा प्रत्येक माउस के लिए नमूना इकट्ठा करने के बाद 70% इथेनॉल के साथ प्लास्टिक शीट और बीकर को साफ करें। सांख्यिकीय महत्व के लिए प्रति समूह कम से कम पांच चूहे आवश्यक हैं। मूत्र के नमूनों को 12 महीने तक उपयोग होने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. ब्रैडफोर्ड विधि24 द्वारा प्रोटीन की मात्रा निर्धारित करें।
    1. मूत्र के नमूने, एल्बुमिन मानक, और ब्रैडफोर्ड अभिकर्मक को 10-20 मिनट के लिए फ्रीजर के बाहर रखकर कमरे के तापमान (आरटी) पर आने की अनुमति दें।
      नोट: ब्रैडफोर्ड अभिकर्मक और एल्बुमिन मानक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट में शामिल हैं ( सामग्री की तालिका देखें)। एल्बुमिन मानक की शुरुआती एकाग्रता 2 मिलीग्राम / धारावाहिक कमजोर पड़ने (1: 2 छह बार) पानी के साथ किया जाना चाहिए।
    2. ब्रैडफोर्ड अभिकर्मक को 96-अच्छी तरह से प्लेट (200 μL / अच्छी तरह से) में जोड़ें, बिना पतला।
    3. पिपेट 5 अच्छी तरह से प्रति अनियंत्रित मूत्र नमूना के μL और ठीक से मिश्रण करने के लिए कई बार ऊपर और नीचे विंदुक करने के लिए टिप का उपयोग करें।
    4. डुप्लिकेट में मानकों (400, 200, 100, 50, 25, 12.5 मिलीग्राम / रिक्त स्थान के रूप में कुओं के एक जोड़े को छोड़ दें।
      नोट: नमूने और मानकों के अलावा जल्दी से किया जाना चाहिए।
    5. इसे आरटी पर 5-10 मिनट के लिए खड़े होने दें।
    6. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार एक प्लेट रीडर में 595 एनएम पर प्लेट पढ़ें ( सामग्री की तालिका देखें)।

2. गुर्दे की कोशिकाओं का अलगाव

  1. गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के बाद एक कक्ष में सीओ2 (प्रवाह दर: 30% -70% मात्रा / मिनट, बेहोशी या मृत्यु प्राप्त करने के लिए) के साथ माउस को इच्छामृत्यु दें। दोनों गुर्दे इकट्ठा करने के लिए विच्छेदन के साथ आगे बढ़ें। बर्फ-ठंडे सी 10 माध्यम में डेढ़-गुर्दे रखें। दूसरे आधे गुर्दे को ओसीटी में रखें (चरण 3.1.1)।
    नोट: सी 10 आरपीएमआई 1640 के साथ 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 1 एमएम सोडियम पाइरूवेट, 100 एक्स एमईएम गैर-आवश्यक अमीनो एसिड का 1%, एचईपीईएस का 10 एमएम, 2-मर्कैप्टोएथेनॉल का 55 μM, और पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के 100 यू /
  2. गुर्दे को अनाज के आकार (1-2 मिमी3 टुकड़े) में काटें और 5 मिलीलीटर पाचन बफर में पचाएं जिसमें 1 मिलीग्राम / एमएल कोलेजनेज और 0.2 मिलीग्राम / एमएल डीएनएएसई आई ( सामग्री की तालिका देखें) आरपीएमआई 1640 माध्यम में 10 एमएमओएल / एल एचईपीईएस होता है जिसमें 37 डिग्री सेल्सियस पर निरंतर कोमल मिलाते हुए 1 घंटे के लिए एचईपीईएस होता है।
    नोट: एक बाँझ 2 एमएल ट्यूब में 1 एमएल पाचन बफर जोड़ें और गुर्दे को काटने के लिए बाँझ कैंची का उपयोग करें।
  3. 1एक्स बर्फ-ठंडे पीबीएस के 10 एमएल जोड़ें जिसमें 10 एमएम एथिलीनडियामाइनटेट्राएसेटिक एसिड (ईडीटीए) होता है और बर्फ पर 10 मिनट के लिए सेते हैं। फिर निलंबन को दो बार भंवर करें।
  4. एक 100 μM छलनी के माध्यम से सेल निलंबन फ़िल्टर और एचबीएसएस-पूर्ण के 10 मिलीलीटर के साथ धो लें।
    नोट: एचबीएसएस-फुल में ईडीटीए के 5 एमएम, 0.1% बीएसए और एचईपीईएस के 10 एमएम शामिल हैं।
  5. आरटी पर 10 मिनट के लिए 350 एक्स जी पर अपकेंद्रित्र।
  6. 30%, 37% और 70% स्टॉक आइसोटोनिक परकोल (एसआईपी) समाधान तैयार करें।
    नोट: एसआईपी तैयार करने के लिए 10x पीबीएस और परकोल के 9 भागों की मात्रा के 1 भाग की मात्रा मिलाएं ( सामग्री की तालिका देखें); एसआईपी को 30%, 37% और 70% एसआईपी तक पतला करने के लिए एचबीएसएस-फुल का उपयोग करें।
  7. 30% एसआईपी के 5 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और 5 एमएल (शीर्ष) के 37% और 5 एमएल (नीचे) के 70% लोड करें, एसआईपी ढाल बनाते हुए, धीरे-धीरे एक पेस्टर पिपेट के साथ।
  8. आरटी पर 30 मिनट के लिए 1000 एक्स जी पर अप 9 डाउन0 (या ब्रेक 0) के साथ अपकेंद्रित्र।
  9. 37% -70% इंटरफ़ेस से ल्यूकोसाइट्स इकट्ठा करें और उन्हें सी 10 के 5 एमएल में फिर से निलंबित करें।
  10. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 350 एक्स जी पर अपकेंद्रित्र।
  11. एफएसीएस बफर के 3 एमएल में सेल गोली को फिर से निलंबित करें। कोशिकाएं एफएसीएस धुंधला होने के लिए तैयार हैं।
    नोट: एफएसीएस बफर में 1 एक्स पीबीएस और 0.1% बोवाइन सीरम एल्बुमिन (बीएसए) शामिल हैं।
  12. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 350 एक्स जी पर अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला (एसएन) त्यागें, लगभग 50 μL छोड़ दें।
    नोट: सतह पर तैरनेवाला को हटाने के लिए, ध्यान से डालने या ठोस से दूर समाधान विंदुक या सतह पर तैरनेवाला आकांक्षा करने के लिए एक अर्धस्वचालित वैक्यूम का उपयोग करें।
  13. एफसीआर ब्लॉक के 50 μL जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें) प्रति ट्यूब (1x पीबीएस में 1/50 पूर्वनिर्धारित); मिश्रण और 10 मिनट के लिए अंधेरे में बर्फ पर सेते हैं।
  14. धोने के लिए एफएसीएस बफर के 2 एमएल जोड़ें।
  15. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 350 एक्स जी पर अपकेंद्रित्र और एसएन त्यागें, लगभग 50 μL छोड़ दें।
  16. उपयुक्त फ्लोरोसेंट डाई के 20 μL जोड़ें (1x पीबीएस के साथ 1/100 पतला, सामग्री की तालिका देखें) और इसे बर्फ पर 15-30 मिनट के लिए खड़े होने दें।
  17. एंटीबॉडी 15 मिश्रण प्रति ट्यूब के50 μL जोड़ें: सीडी 138-बीवी 711 (1x पीबीएस में 1/200) और सीडी 45-एएफ 700 (1x पीबीएस में 1/200) ( सामग्री की तालिका देखें)।
  18. 15-30 मिनट के लिए अंधेरे में बर्फ पर सेते हैं और एफएसीएस बफर के 3 एमएल जोड़ें।
  19. 4 डिग्री सेल्सियस और वैक्यूम एसएन पर 5 मिनट के लिए 350 एक्स जी पर अपकेंद्रित्र, लगभग 50 μL छोड़कर। यह अब प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा विश्लेषण करने के लिए तैयार है।

3. इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला होना

  1. नमूना संग्रह करें।
    1. इष्टतम काटने के तापमान (ओसीटी) यौगिक के साथ छोटे प्लास्टिक क्रायोमोल्ड में आधा गुर्दा एम्बेड करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    2. एक पॉलीस्टाइनिन फोम बॉक्स में सूखी बर्फ जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें), और ध्यान से सूखे बर्फ के शीर्ष पर क्रायोमोल्ड रखें। सुनिश्चित करें कि क्रायोमोल्ड्स को फ्लैट रखा गया है।
      नोट: ओसीटी यौगिक को जमने और सफेद होने में 3-4 मिनट लगते हैं।
    3. क्रायोमोल्ड को बाहर निकालें और इसे एल्यूमीनियम पन्नी में लपेटें। इसे आगे के उपयोग तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: यह कम से कम 1 वर्ष के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. सेक्शनिंग और नमूने की फिक्सिंग करें।
    1. नमूनों को 4 μm वर्गों में काटें, सूखने के लिए कम से कम 2-3 घंटे की प्रतीक्षा करें, और फिर 10 मिनट के लिए ठंडे एसीटोन (4 डिग्री सेल्सियस पर) के साथ ठीक करें।
      नोट: एसीटोन का उपयोग करते समय सावधान रहें, जिसके लिए एक विशेष रासायनिक हुड की आवश्यकता होती है।
    2. स्लाइड को ठीक करने के बाद, 0.5-1 घंटे के लिए हवा सूख जाती है और उन्हें -20 डिग्री सेल्सियस पर थोड़े समय के लिए, या -80 डिग्री सेल्सियस पर लंबे समय तक स्टोर करें।
  3. नमूनों को दाग दें।
    1. 5-10 मिनट के लिए ठंडे एसीटोन में स्लाइड्स को फिर से मिलाएं।
    2. अनुभागों को आरटी तक गर्म होने दें अनुभाग के चारों ओर एक पीएपी पेन ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करें और इसे सूखने दें।
      नोट: नाखून तामचीनी के रूप में अच्छी तरह से इस्तेमाल किया जा सकता है। यह कदम एंटीबॉडी कमजोर पड़ने को पूरी स्लाइड पर तैरने से रोकता है।
    3. 20 मिनट के लिए कोप्लिन जार ( सामग्री की तालिका देखें) में 1x ट्रिस-बफर खारा (टीबीएस) में स्लाइड रखें, जार को शेकर पर रखें, और धीरे से हिलाएं।
    4. 1 एक्स टीबीएस डालो और जार को 1 एक्स टीबीएस, 5% बीएसए और 0.1% ट्वीन 20 के साथ भरें। शेकर पर 20 मिनट के लिए सेते हैं, धीरे हिला।
    5. स्लाइड्स को बाहर निकालें और स्लाइड्स के निचले हिस्से को सूखा पोंछें। यदि आवश्यक हो, तो स्लाइड को सूखा हिलाएं। अनुभाग में संयुग्मित एंटीबॉडी25 सी 3-एफआईटीसी (1/100) और आईजीजी 2 ए-पीई (1/100) के 100 μL जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें)। 1 घंटे के लिए एक आर्द्र कक्ष में आरटी पर सेते हैं।
    6. शेकर पर 10 मिनट के लिए 1x टीबीएस, 5% बीएसए, और 0.1% ट्वीन 20 में अनुभाग को 3 बार धोएं।
    7. स्लाइड्स को हिलाएं और एक एंटीफेड अभिकर्मक के साथ अनुभाग को माउंट करें ( सामग्री की तालिका देखें) फिर एक कवरस्लिप।
    8. माइक्रोस्कोप (जैसे, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप या इमेजिंग सिस्टम माइक्रोस्कोप) के तहत देखने तक स्लाइड्स को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। क्षेत्रों के बीच प्रतिदीप्ति तीव्रता की तुलना करते समय सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके छवियों को मापें और पृष्ठभूमि संकेतों को घटाएं।
    9. इमेजजे सॉफ्टवेयर का उपयोग करके छवि विश्लेषण के लिए ( सामग्री की तालिका देखें), वांछित क्षेत्र की रूपरेखा तैयार करें।
    10. विश्लेषण पर क्लिक करके मानक पैरामीटर सेट करें, फिर परिणाम प्राप्त करने के लिए माप और माप क्षेत्र सेट करें।
    11. माप विंडो से प्राप्त डेटा को स्प्रेडशीट में स्थानांतरित करें।
      नोट: एक छोटे से क्षेत्र को पृष्ठभूमि के रूप में छवि से चुना जा सकता है; इसमें कोई प्रतिदीप्ति नहीं होनी चाहिए।
    12. एक बार हो जाने के बाद, क्षेत्र को मापने और डेटा को फिर से पिछले स्प्रेडशीट में स्थानांतरित करने के लिए विश्लेषण पर क्लिक करें।
    13. कई क्षेत्रों के लिए चरण 3.3.11-3.3.12 दोहराएँ।
    14. सही सेल प्रतिदीप्ति (सीसीएफ) = एकीकृत घनत्व के रूप में मतलब प्रतिदीप्ति की गणना - (चयनित सेल क्षेत्र एक्स मतलब पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति)।
    15. प्रत्येक क्षेत्र के लिए गणना करें और ग्राफिंग और सांख्यिकी सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण करें (सामग्री की तालिका देखें)।

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Representative Results

प्रोटोकॉल ल्यूपस नेफ्रैटिस के लिए एमआरएल / एलपीआर चूहों का आकलन करने के लिए कई तरीकों का उपयोग करता है। सबसे पहले, समय के साथ गुर्दे की शिथिलता के कारण प्रोटीनमेह के स्तर में वृद्धि का अध्ययन करने के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन किया गया है। जैसा कि चित्रा 1 में दिखाया गया है, मादा चूहों को नियंत्रण समूह के रूप में फॉस्फेट-बफर खारा (1 एक्स पीबीएस) के 200 μL के मौखिक गैवेज के साथ इलाज किया गया था और उपचार समूह के रूप में प्रोबायोटिक लैक्टोबैसिलस , सप्ताह में दो बार 109 सीएफयू / उपचार 3 सप्ताह की उम्र में शुरू हुआ और 15 सप्ताह की उम्र में समाप्त हुआ। रॉयटरी के साथ इलाज किए गए चूहों के समूह में नियंत्रण समूह की तुलना में अधिक आक्रामक प्रोटीनुरिया प्रगति थी।

Figure 1
चित्रा 1: समय के साथ एमआरएल/एलपीआर चूहों के मूत्र में प्रोटीन के स्तर का पता लगाना। आंकड़े सरल रैखिक प्रतिगमन परीक्षण के साथ किए गए थे। * पी < 0.05, ** पी < 0.01। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 2 पृथक गुर्दे ल्यूकोसाइट्स के एफएसीएस विश्लेषण को दर्शाता है। इस प्रयोग में चूहों को वैनकोमाइसिन (2 ग्राम / एल) या वैनकोमाइसिन प्लस ई कोलाई डीएसडीएनए (80 μg) के साथ इलाज किया गया था। वैनकोमाइसिन को समय की निर्धारित अवधि के दौरान पीने के पानी के साथ दिया गया था। बैक्टीरिया डीएनए के मौखिक गैवेज को 4, 5, 6 और 7 सप्ताह की उम्र में लगातार चार सप्ताह के लिए सप्ताह में एक बार वैनकोमाइसिन-उपचारित चूहों को प्रशासित किया गया था। ई कोलाई डीएसडीएनए से प्लाज्मा कोशिकाओं के गुर्दे की घुसपैठ को ट्रिगर करने की उम्मीद थी जिससे गुर्दे के कार्य से समझौता किया गया था, लेकिन कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं पाया गया।

Figure 2
चित्रा 2: पृथक गुर्दे ल्यूकोसाइट्स में प्लाज्मा कोशिकाओं का विश्लेषण (ए) अनुक्रमिक गेटिंग रणनीति: कुल कोशिकाएं, एकल कोशिकाएं, जीवित कोशिकाएं, सीडी 45+ कोशिकाएं, और अंत में सीडी 138+ कोशिकाएं। (बी) 3 सप्ताह के लिए वैन (वैनकोमाइसिन) या वैन + डीएनए (वैनकोमाइसिन + ई कोलाई डीएसडीएनए) के साथ उपचार के बाद प्लाज्मा कोशिकाओं का प्रतिशत (एन ≥ प्रति समूह 5 चूहे)। कोई सांख्यिकीय महत्व ('एनएस') नहीं देखा गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 3 महिला एमआरएल / एलपीआर गुर्दे वर्गों पर पूरक सी 3 और आईजीजी 2 ए के इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला दिखाता है। इस प्रयोग में, पर्यावरणीय कारकों के प्रभाव की तुलना सी 3 और आईजीजी 2 ए के गुर्दे के जमाव से संबंधित की गई थी। इन-हाउस चूहों को कई पीढ़ियों के लिए पशु सुविधा में पैदा किया गया था, और उनकी तुलना हाल ही में एक विक्रेता से खरीदे गए चूहों से की गई थी। इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषण ने विभिन्न सुविधाओं के बीच कोई अंतर नहीं दिखाया।

Figure 3
चित्रा 3: इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला के माध्यम से गुर्दे के वर्गों में पूरक सी 3 और आईजीजी 2 ए का पता लगाना( ए) एंटी-सी 3-एफआईटीसी (ग्रीन) और एंटी-आईजीजी 2 ए-पीई (लाल) के साथ दाग वाले गुर्दे वर्गों के प्रतिनिधि चित्र। (बी) दो समूहों के बीच सही सेल प्रतिदीप्ति (सीसीएफ) की तुलना (एन ≥ प्रति समूह 5 चूहों)। स्केल बार = 100 μM। कोई सांख्यिकीय महत्व ('एनएस') नहीं देखा गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

एलएन एसएलई रोगियों में मृत्यु दर का एक प्रमुख कारण है, और बीमारी को बढ़ाने वाले कारक स्पष्ट नहीं हैं। इस प्रोटोकॉल का अनुप्रयोग प्रोटीन्यूरिया के माप, पृथक गुर्दे ल्यूकोसाइट्स के एफएसीएस विश्लेषण, और जमे हुए गुर्दे वर्गों के इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला सहित कई तरीकों का उपयोग करके गुर्दे समारोह को चिह्नित करना है।

मूत्र एकत्र करते समय विचार करने के लिए एक महत्वपूर्ण बात यह है कि किसी को दिन के समय और मूत्र संग्रह के स्थान के अनुरूप होना चाहिए। चूहे निशाचर जानवर हैं, इसलिए चूहों के सक्रिय होने से पहले देर से दोपहर में सबसे सटीक नमूने एकत्र किए जाते हैं। इस समय को चुनने का एक और कारण यह है कि एमआरएल / एलपीआर चूहे रात में बहुत सारा पानी पीते हैं, जिससे पतला मूत्र होता है। इस प्रकार, गलत समय पर संग्रह मूत्र की एकाग्रता और / या मात्रा परिवर्तनशीलता को बढ़ा सकता है। सटीक परिणाम प्राप्त करने के लिए जितना संभव हो उतना मूत्र एकत्र करना भी महत्वपूर्ण है।

ब्रैडफोर्ड परख हमें अनुमान देता है कि कितना प्रोटीन मौजूद है। यह किसी भी एसएलई मार्कर प्रोटीन के लिए विशिष्ट नहीं है, लेकिन रोग प्रगति26 का विचार देने के लिए पर्याप्त है। इसके अलावा, यह विधि दूसरों की तुलना में लागत प्रभावी है। विशेष रूप से, ब्रैडफोर्ड परख समय-संवेदनशील है; इसलिए, इसे आधे घंटे के भीतर पूरा किया जाना चाहिए। नमूनों में मूल्यों में वृद्धि या उच्च झूठे परिणाम होते हैं यदि कोई बहुत लंबा इंतजार करता है। मूत्रालय के लिए वाणिज्यिक अभिकर्मक स्ट्रिप्स की तुलना में एक और लाभ यह है कि यह मूत्र के नमूने के भीतर एक सीमा के बजाय सटीक संख्या देता है। स्कोरिंग स्ट्रिप्स अस्पष्ट परिणाम दे सकते हैं, खासकर उच्च रेंज 9,10,24 में।

गुर्दे ल्यूकोसाइट्स के अलगाव के लिए, पहला महत्वपूर्ण कदम जितनी जल्दी हो सके विच्छेदन करना है। गुर्दे की कोशिकाओं की व्यवहार्यता बाद के एफएसीएस विश्लेषण की सफलता को बहुत प्रभावित करती है। जब गुर्दे संसाधित किए जा रहे हैं, तो प्रत्येक चरण समय- और तापमान-संवेदनशील है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि डीएनए आई और कोलेजनेज सांद्रता और तापमान अधिकतम दक्षता के लिए महत्वपूर्ण हैं, क्योंकि वे डीएनए को खत्म करते हैं और अंग के विघटन की अनुमति देते हैं, क्रमशः27. दूसरा महत्वपूर्ण चरण कोशिकाओं को अलग करना है, जो दो महत्वपूर्ण प्रक्रियाओं में विभाजित है। पहला छलनी का उपयोग कर रहा है जो ऊतक मलबे को हटाने की अनुमति देता है; परकोल से जुड़ी दूसरी प्रक्रिया सबसे महत्वपूर्ण कदम है और इसके लिए ध्यान और धैर्य की आवश्यकता होती है। पेरकोल के साथ घनत्व ढाल करते समय, एसआईपी की विभिन्न सांद्रता के बीच स्पष्ट इंटरफेस बनाए रखना महत्वपूर्ण है। प्रवाह और दबाव मैन्युअल रूप से नियंत्रित किया जा सकता है के बाद से एक पाश्चर विंदुक का उपयोग करने की सिफारिश की है। अतिरिक्त चरणों को एसआईपी समाधान के धीमे वितरण के साथ बेहतर बनाया जा सकता है या यहां तक कि ड्रॉप बाय ड्रॉप भी किया जा सकता है। एक बार चरण स्थापित हो जाने के बाद, ट्यूब को धीरे-धीरे संभालने की आवश्यकता होती है; अन्यथा, चरण तुरंत मिश्रण करेंगे, और नमूने खो जाएंगे, क्योंकि चरणों को फिर से अलग करना असंभव है। इसके अलावा, ब्रेक के बिना ट्यूब को अपकेंद्रित करना महत्वपूर्ण है क्योंकि तोड़ना बहुत आक्रामक हो सकता है, जिससे अलग-अलग चरणों का नुकसान हो सकता है। ल्यूकोसाइट्स को तब 30% और 37% एसआईपी के बीच इंटरफेज़ से पुनर्प्राप्त किया जाता है। हमने इस उदाहरण में एक सेल आबादी का विश्लेषण किया, प्लाज्मा कोशिकाएं (सीडी 45+ और सीडी 138+)। हालांकि, यह तकनीक बी कोशिकाओं तक सीमित नहीं है; इसका उपयोग अन्य सेल प्रकारों और इंट्रासेल्युलर धुंधला28 के लिए किया जा सकता है।

तीसरी विधि दिए गए प्रोटीन बयानों के इंट्रासेल्युलर स्थानीयकरण की कल्पना करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। एक बार जब ऊतक एसीटोन के साथ तय हो जाते हैं, तो पर्याप्त धुलाई करना महत्वपूर्ण है, इसलिए एंटीबॉडी केवल लक्ष्य से जुड़ते हैं। अगला, बीएसए के साथ अवरुद्ध करना निरर्थक बाध्यकारी और झूठी सकारात्मकता को कम करता है। प्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस की आमतौर पर सिफारिश की जाती है, क्योंकि यह एक माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस की तुलना में तेज है, जो समय लेने वाला है, विशेष रूप से अतिरिक्त धोने और इनक्यूबेशन चरणों पर विचार करना। हालांकि, प्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस29 की तुलना में एंटीबॉडी चयन के लचीलेपन को प्रतिबंधित करता है। इसलिए, दोनों उद्देश्य के आधार पर मूल्यवान तरीके हो सकते हैं। इसके अलावा, यह उल्लेख किया जाना चाहिए कि आईएचसी के लिए धुंधला होने पर कमजोर पड़ने वाले कारक महत्वपूर्ण हैं। यदि कमजोर पड़ने अच्छी तरह से नहीं किया जाता है, तो बढ़ी हुई पृष्ठभूमि (पर्याप्त एंटीबॉडी कमजोर पड़ने नहीं) या कमजोर धुंधला (बहुत अधिक फैलाव) माइक्रोस्कोपी छवियों पर दिखाई देगा। बेहतर लक्ष्य-से-पृष्ठभूमि अनुपात के लिए एंटीबॉडी एकाग्रता को अनुकूलित करने के लिए एंटीबॉडी के धारावाहिक कमजोर पड़ने के साथ शुरू करना महत्वपूर्ण है। विचार करने के लिए एक और कदम एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेशन समय की मात्रा है। एंटीबॉडी नमूने के संपर्क में जितनी देर तक होती है, उतना ही निरर्थक बंधन बनाया जा सकता है।

वर्तमान विधियों की सीमाएं इस प्रकार हैं। एलएन के लिए कुछ नैदानिक पैरामीटर, जैसे एल्ब्यूमिन / क्रिएटिनिन अनुपात, इन विधियों का उपयोग करके प्रकट नहीं किया जा सकता है। इसके अलावा, कुछ नमूनों में खराब एसिड घुलनशीलता हो सकती है जिससे मानक वक्र के ऊपर उच्च एकाग्रता पढ़ने के लिए अग्रणी हो सकता है। इसके लिए नमूनों के और कमजोर पड़ने या डाई30 को अवक्षेपित करने के लिए सर्फैक्टेंट के अलावा की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, यह प्रोटोकॉल उपयुक्त नहीं हो सकता है यदि गुर्दे ल्यूकोसाइट अलगाव के बाद कई कोशिकाओं की आवश्यकता होती है। वर्तमान गुर्दे सेल अलगाव प्रोटोकॉल में अन्य कोशिकाओं को हटाने को अधिकतम करने के लिए कई धोने के कदम, पाचन और अलगाव चरण शामिल हैं, इसलिए भले ही अंत में सेल शुद्धता अधिक हो, सेल संख्या आमतौर पर कम होती है। इसके अलावा, यह एक लंबी प्रक्रिया है, इसलिए सेल व्यवहार्यता से समझौता किया जा सकता है। अन्य तैयार-से-उपयोग परख नैदानिक उपयोग के लिए अधिक उपयुक्त हैं; हालाँकि, वर्तमान विधियाँ अनुसंधान प्रयोगशालाओं के लिए एक छोटे बजट के साथ सटीक परिणाम प्रदान कर सकती हैं।

संक्षेप में, एलएन प्रगति को चिह्नित करने के लिए इस प्रोटोकॉल में तीन अलग-अलग कुशल और सटीक तकनीकें प्रस्तुत की जाती हैं। प्रोटीनूरिया स्तर के लिए ब्रैडफोर्ड विधि का संयोजन, ल्यूकोसाइट्स के गुर्दे की घुसपैठ के लिए एफएसीएस विश्लेषण, और आईजीजी 2 ए और सी 3 के गुर्दे के जमाव के लिए आईएचसी विश्लेषण, मानव एलएन के मॉडल के रूप में महिला एमआरएल / एलपीआर चूहों में गुर्दे की शिथिलता की एक स्पष्ट तस्वीर सफलतापूर्वक स्थापित की गई है।

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Disclosures

लेखकों ने घोषणा की है कि हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

हम तकनीकी सहायता के लिए फ्लो साइटोमेट्री कोर सुविधा, हिस्टोपैथोलॉजी प्रयोगशाला, वर्जीनिया पॉलिटेक्निक इंस्टीट्यूट में फ्रालिन इमेजिंग सेंटर और स्टेट यूनिवर्सिटी को धन्यवाद देते हैं। यह काम विभिन्न एनआईएच और आंतरिक अनुदानों द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x Tris-Buffered Saline (TBS) Thermo Fisher Scientific J60764.K2
2-mercaptoethanol Thermo Fisher Scientific 21985-023
Anti-Human/Mouse C3 Cedarlane CL7632F
Anti-Mouse CD138 BV711 Biolegend 142519
Anti-Mouse CD45 AF700 Biolegend 103127
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A9418-100G
Collagenase D Sigma-Aldrich 11088882001
Confocal Microscope LSM 880 Zeiss LSM 880
Coplin jar Fisher Scientific 50-212-281
Cryomold Fisher Scientific NC9511236
Density gradient medium GE Healthcare 17-1440-02 Percoll
DEPC-Treated water Thermo Fisher Scientific AM9906
DNase I Sigma-Aldrich D4527
dsDNA-EC InvivoGen tlrl-ecdna
Ethylenediaminetetraacetic Acid Fisher Scientific S311-500 EDTA
EVOS M5000 Microscope imaging system Thermo Fisher Scientific AMF5000
FACS Fusion Cell sorter BD Biosciences FACS Fusion
Fetal Bovine Serum - Premium, Heat Inactivated R&D systems S11150H
Fisherbrand 96-Well Polystyrene Plates Fisher Scientific 12-565-501
Graphpad prism GraphPad N/A
Hank’s Balanced Salt Solution Thermo Fisher Scientific 14175-079
HEPES Thermo Fisher Scientific 15630-080
ImageJ software National Institutes of Health N/A
Lactobacillus reuteri Kandler et al. ATCC 23272
MEM non-essential amino acids Thermo Fisher Scientific 11140-050
MRL/MpJ-Fas lpr /J Mice (MRL/lpr) Jackson Lab 485
Nail enamel N/A N/A Any conventional store
O.C.T compound Tisse-Tek 4583
PAP pen Sigma-Aldrich Z377821
Peel-A-Way Disposable Embedding Molds Polysciences R-30
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140-122
Phosphate-buffered saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 70011069
Pierce 20x TBS Buffer Thermo Fisher Scientific 28358
Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay kit Thermo Fisher Scientific 23236 Albumin standard included
ProLon Gold Antifade Mountant ThermoFisher P36934
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 BD Biosciences 553141 FcR block
RPMI 1640 Thermo Fisher Scientific 11875-093
Sodium pyruvate Thermo Fisher Scientific 11360-070
SpectraMax M5 Molecular Devices N/A SoftMax Pro 6.1 software
Sterile cell Strainers 100 µM Fisher Scientific 22363549
Tween 20 Fisher Scientific BP337-500
Vancomycin Hydrochloride Goldbio V-200-1
Zombie Aqua Biolegend 423102 fluorescent dye for flow cytometry analysis

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 184 एसएलई ल्यूपस नेफ्राइटिस गुर्दे गुर्दे की घुसपैठ बेकार बी कोशिकाएं प्रोटीन जमाव
प्रोटीनुरिया का विश्लेषण, ल्यूकोसाइट्स की गुर्दे की घुसपैठ, और ल्यूपस-प्रवण एमआरएल / एलपीआर चूहों में प्रोटीन का गुर्दे का जमाव
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Cabana-Puig, X., Luo, X. M. Analyses … More

Cabana-Puig, X., Luo, X. M. Analyses of Proteinuria, Renal Infiltration of Leukocytes, and Renal Deposition of Proteins in Lupus-prone MRL/lpr Mice. J. Vis. Exp. (184), e63506, doi:10.3791/63506 (2022).

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