Summary
يصف هذا البروتوكول طريقة لتتبع تطور مرض الذئبة في الفئران. يتم تقديم إجراءين إضافيين لتوصيف التهاب الكلية الذئبي بناء على تسلل الخلايا وترسب البروتين في الكلى.
Abstract
الذئبة الحمامية الجهازية (SLE) هي اضطراب مناعي ذاتي بدون علاج معروف ويتميز بالتهاب مستمر في العديد من الأعضاء ، بما في ذلك الكلى. في ظل هذه الظروف ، تفقد الكلى قدرتها على تنظيف النفايات من الدم وتنظيم تركيزات الملح والسوائل ، مما يؤدي في النهاية إلى الفشل الكلوي. يتم تشخيص النساء ، وخاصة النساء في سن الإنجاب ، تسع مرات أكثر من الرجال. أمراض الكلى هي السبب الرئيسي للوفيات في مرضى الذئبة الحمراء. يصف هذا البروتوكول طريقة سريعة وبسيطة لقياس مستويات البروتين المفرزة في البول الذي تم جمعه ، وتتبع تطور مرض الذئبة بمرور الوقت. بالإضافة إلى ذلك ، يتم توفير نهج لعزل خلايا الكلى أحادية النواة بناء على اختيار الحجم والكثافة للتحقيق في التسلل الكلوي للكريات البيضاء. علاوة على ذلك ، تم تطوير طريقة كيميائية نسيجية مناعية لتوصيف ترسب البروتين في الكبيبات وتسلل الكريات البيض في الفضاء الأنبوبي الخلالي. معا ، يمكن أن تساعد هذه الطرق في التحقيق في تطور الالتهاب المزمن المرتبط بكلى الفئران المعرضة للذئبة MRL / lpr.
Introduction
الوظيفة الأساسية للكلية هي القضاء على المواد السامة عن طريق البول مع الحفاظ على توازن الماء والأملاح1. هذه الوظيفة مهددة في المرضى الذين يعانون من الذئبة الحمامية الجهازية (SLE) ، مما يؤدي إلى ما يسمى التهاب الكلية الذئبة (LN). LN هو نتيجة لمهاجمة الجهاز المناعي للكلى ، مما يؤدي إلى التهاب الكلى المستمر ، وبالتالي فقدان قدرته على تنظيف النفايات من الدم وتنظيم تركيزات الملح والسوائل. هذا سيؤدي في النهاية إلى الفشل الكلوي ، والذي يمكن أن يكون قاتلا. أثناء العملية الكلوية ، يتم تجنيد الخلايا البائية المتداولة والخلايا التائية والخلايا الوحيدة في الكلى ، وإفراز الكيموكينات والسيتوكينات والأجسام المضادة الذاتية المكونة للمجمع المناعي. هذا يؤدي في نهاية المطاف إلى تلف الخلايا البطانية ، والإصابات الغشائية ، وضمور أنبوبي كلوي ، وتليف2.
MRL / Mp-Faslpr (MRL / lpr) الفئران المعرضة للذئبة هي نموذج فأر كلاسيكي يظهر علامات سريرية تشبه الذئبة تشبه SLE3 البشري. كان لهذا النموذج دور فعال في فهم أحد الأسباب الرئيسية للوفيات لدى مرضى الذئبة الحمراء ، التهاب الكلية الذئبي (LN)4. في كل من الذئبة الحمراء البشرية والفأرية ، يتميز LN بالتهاب تدريجي ناتج عن ترسب كلوي للمجمعات المناعية ، يليه تنشيط مكمل ، وتجنيد الخلايا الالتهابية ، وفقدان وظائف الكلى5. ترسب المركب المناعي هو الخطوة الأولى للحث على إنتاج الكيموكين والسيتوكين بواسطة الخلايا الكلوية الجوهرية ، مما يوسع الاستجابة الالتهابية عن طريق تجنيد الخلايا المناعية6. يقدم البروتوكول الحالي العديد من التقنيات لمتابعة تطور أمراض الكلى التي تحلل تسلل الخلايا والترسب المعقد المناعي.
يسمح البول الذي يتم جمعه كل أسبوع بالكشف عن الدورة الزمنية للبيلة البروتينية وتصورها قبل وأثناء وبعد ظهور مرض الذئبة. يمكن للبيلة البروتينية كعلامة حيوية تحديد التقدم البيولوجي ل LN. المزايا الأخرى لهذه التقنية هي أنها غير غازية وفعالة من حيث التكلفة وسهلة التنفيذ7. عندما تعمل الكلى بشكل مثالي ، يكون مستوى البيلة البروتينية منخفضا باستمرار. ومع ذلك ، في الفئران MRL / lpr ، بعد 8-9 أسابيع من العمر ، لوحظ زيادة تدريجية في مستوى البيلة البروتينية ، والتي هي في نهاية المطاف عالية بما يكفي للتسبب في الفشل الكلوي8. تتوفر شرائط كاشف متعددة وكواشف قياس الألوان تجاريا لمراقبة المشكلة. ومع ذلك ، فإن فحص برادفورد رخيص ودقيق للغاية في تحديد بداية البيلة البروتينية ومسار التهاب الكلية الذئبي. هذا الفحص سريع ، ولا يتأثر الكاشف بوجود المذيبات والمخازن المؤقتة وعوامل الاختزال وعوامل تخلب المعادن التي قد تكون في عينتك9،10،11.
أحد الجوانب المهمة التي يجب مراعاتها هو تسلل الخلايا في الكلى. هذه التسلل تعزز التسبب في المرض عن طريق تحفيز إفراز العوامل القابلة للذوبان مثل السيتوكينات لتفاقم الالتهاب12. لفهم أفضل لمجموعات الخلايا الموجودة في التسلل ، فإن الطريقة المفيدة هي عزل الكريات البيض13. هنا ، يتم استخدام الكشف عن التسلل الكلوي للخلايا البائية كمثال. يبدأ الإجراء بعملية هضم مع ديوكسي ريبونوكلياز (DNase) والكولاجيناز ، يليه فصل تدرج الكثافة الذي يزيل الحطام وخلايا الدم الحمراء والخلايا المحببة الكثيفة. سبب عزل الخلايا البائية (CD19+) وخلايا البلازما (CD138+) هو أن الكلى الذئبية يمكن أن تركز هذه الخلايا14. يقترح أن وجود الخلايا البائية في مجاميع صغيرة في الكلى يمكن أن يشير إلى التوسع النسيلي ، وبالتالي إنتاج الغلوبولين المناعي (Ig). من المعروف أن خلايا البلازما موجودة في هذه المجاميع بالإضافة إلى15. بمجرد عزل الكريات البيض ، يمكن استخدام فرز الخلايا المنشط بالفلور (FACS) لتحليل الخلايا ذات الأهمية عند تلطيخ الأجسام المضادة المختلفة المترافقة مع التألق.
التألق المناعي هو أحد طرق الكشف عن الكيمياء النسيجية المناعية (IHC) التي تسمح بالتصور الفلوري للبروتينات في عينات أنسجة الكلى السميكة 4 ميكرومتر. تعتمد طرق الكشف الأخرى عن المدينة العالمية للخدمات الإنسانية على طبيعة التحليلات وكيمياء الربط وعوامل أخرى16. التألق المناعي هو طريقة تحديد سريعة تعرض المستضد لنظيره من الأجسام المضادة الموسومة بفلوروكروم معين (أو صبغة فلورسنت). عندما يكون متحمسا ، فإنه ينتج ضوءا يمكن أن يكتشفه المجهر الفلوري. يمكن استخدام هذه التقنية لمراقبة ترسب المكمل C3 و IgG2a17. يمكن أن يرتبط التنشيط المفرط للتسلسل التكميلي باستجابة مناعية غير منضبطة وفقدان الوظيفة18. يعد الترسب المناعي للأجسام المضادة للحمض النووي المزدوج (anti-dsDNA) في الكلى مصدر قلق كبير19 ، حيث ارتبط أولئك الذين لديهم النمط المتماثل IgG2a ب LN20. على وجه التحديد ، تظهر الأجسام المضادة المضادة ل dsDNA المزيد من الإمراض والتقارب مع المواد النووية ، وتشكل مجمعات مناعية21. عندما يكون IgG2a موجودا ، يتم تنشيط سلسلة المكمل ، بما في ذلك C3 ، لإزالة المجمعات المناعية22. يمكن تحديد علامات C3 و IgG2a كميا بشكل فردي أو تراكبها لإنشاء ارتباطها.
والجدير بالذكر أن قياس الكرياتينين في الدم هو تقنية أخرى موثوقة يمكن استخدامها مع بيلة دموية مجهرية وخزعات الكلى لتشخيص LN23. ومع ذلك ، فإن وجود البيلة البروتينية هو مؤشر قوي على تلف الكبيبات. وبهذا المعنى ، فإن مراقبة مستوى البيلة البروتينية أثناء مرض الذئبة يمكن أن تكشف عن بداية المرض وتكمل الطرق الأخرى لتشخيص مرض الذئبة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن للمجمعات المناعية المودعة في الكبيبات أن تحفز استجابة التهابية ، وتنشط نظام التكملة ، وتجند المزيد من الخلايا الالتهابية. نقطة أخرى جديرة بالملاحظة في هذا البروتوكول هي تسلل الخلايا البائية في الكلى. هذا ، جنبا إلى جنب مع الخلايا التائية المخترقة ، يضخم الاستجابات المناعية المحلية التي تؤدي إلى تلف الأعضاء. الأهم من ذلك ، أن تصنيف LN لا يعتمد فقط على التغيرات المورفولوجية الكبيبية التي شوهدت في الفحص المجهري ولكن أيضا على الرواسب المناعية التي لوحظت مع التألق المناعي. لذلك ، في هذا البروتوكول ، يتم تقديم طرق دقيقة وفعالة من حيث التكلفة لتحليل وظائف الكلى في إعدادات المختبر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على هذا البروتوكول من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات (IACUC) في Virginia Tech. نظرا لأن مرض الذئبة لديه معدل حدوث أعلى في الإناث ، فقد تم استخدام الفئران MRL / lpr الإناث فقط. بدأ جمع العينات في عمر 4 أسابيع وانتهى في 15 أسبوعا. تم الحصول على الفئران من مصادر تجارية (انظر جدول المواد) وتم تربيتها وصيانتها في بيئة محددة خالية من مسببات الأمراض وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية.
1. اختبار البيلة البروتينية
- جمع البول باتباع الخطوات أدناه.
- تعقيم الغطاء عن طريق رش 70٪ من الإيثانول. ضع ورقة بلاستيكية معقمة على السطح. قم بإعداد نصائح وأنابيب 1.5 مل وماصة لجمع حوالي 20 ميكرولتر من السائل.
ملاحظة: يجب أن تكون النصائح والأنابيب معقمة وبدون أي معالجة مسبقة. - خذ القفص ورش 70٪ من الإيثانول قبل وضعه داخل الغطاء.
- أمسك الماوس بيد واحدة واستخدم اليد الأخرى لتدليك المنطقة البطنية من الأعلى إلى الأسفل بلطف.
- استخدم أنبوبا أو ماصة سعة 1.5 مل لجمع البول مباشرة ، أو إذا سقطت العينة ، فقم بجمعها من الغطاء البلاستيكي. استخدم قفازات وملاءات ونصائح جديدة لكل عينة.
ملاحظة: إذا لم ينجح ذلك ، فاستخدم دورقا معقما لعزل الماوس ، ثم اجمع البول من الكأس بعد تبول الماوس. - ضع الماوس مرة أخرى في القفص. أخرج ماوس آخر وكرر الخطوات 1.1.3-1.1.4.
ملاحظة: قم دائما بتنظيف الورقة البلاستيكية والكأس باستخدام 70٪ من الإيثانول بعد جمع العينة لكل ماوس. ما لا يقل عن خمسة فئران لكل مجموعة ضرورية للدلالة الإحصائية. يمكن تخزين عينات البول عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام لمدة تصل إلى 12 شهرا.
- تعقيم الغطاء عن طريق رش 70٪ من الإيثانول. ضع ورقة بلاستيكية معقمة على السطح. قم بإعداد نصائح وأنابيب 1.5 مل وماصة لجمع حوالي 20 ميكرولتر من السائل.
- حدد كمية البروتينات بطريقة برادفورد24.
- اسمح لعينات البول ومعيار الألبومين وكاشف برادفورد بالوصول إلى درجة حرارة الغرفة (RT) عن طريق الاحتفاظ بها خارج الفريزر لمدة 10-20 دقيقة.
ملاحظة: يتم تضمين كاشف برادفورد ومعيار الألبومين في مجموعة متاحة تجاريا (انظر جدول المواد). تركيز البدء من معيار الألبومين هو 2 ملغ / مل. يجب أن يتم التخفيف التسلسلي (1: 2 ست مرات) بالماء. - أضف كاشف برادفورد إلى صفيحة 96 بئرا (200 ميكرولتر / بئر) ، غير مخففة.
- ماصة 5 ميكرولتر من عينة البول غير المخففة لكل بئر واستخدام الطرف لماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات لخلط بشكل صحيح.
- أضف المعايير (400 و 200 و 100 و 50 و 25 و 12.5 ملغم / ديسيلتر) في نسخ مكررة. اترك اثنين من الآبار كفراغات.
ملاحظة: يجب أن تتم إضافة العينات والمعايير بسرعة. - دعها تقف لمدة 5-10 دقائق في RT.
- اقرأ اللوحة عند 595 نانومتر في قارئ اللوحات وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
- اسمح لعينات البول ومعيار الألبومين وكاشف برادفورد بالوصول إلى درجة حرارة الغرفة (RT) عن طريق الاحتفاظ بها خارج الفريزر لمدة 10-20 دقيقة.
2. عزل خلايا الكلى
- القتل الرحيم للفأر باستخدام CO2 (معدل التدفق: 30٪ -70٪ حجم / دقيقة ، لتحقيق فقدان الوعي أو الموت) في غرفة تليها خلع عنق الرحم. المضي قدما في تشريح لجمع كلتا الكليتين. ضع كلية ونصف في وسط C10 بارد مثلج. ضع نصف الكلى الآخر في OCT (الخطوة 3.1.1).
ملاحظة: C10 مصنوع من RPMI 1640 مكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ ، و 1 mM من بيروفات الصوديوم ، و 1٪ من الأحماض الأمينية غير الأساسية 100x MEM ، و 10 mM من HEPES ، و 55 μM من 2-mercaptoethanol ، و 100 U / mL من البنسلين الستربتومايسين (انظر جدول المواد). - قطع الكلى إلى حجم الحبوب (1-2 مم3 قطع) وهضمها في 5 مل من المخزن المؤقت للهضم الذي يحتوي على 1 ملغ / مل من الكولاجيناز و 0.2 ملغ / مل من DNase I (انظر جدول المواد) في وسط RPMI 1640 يحتوي على 10 مليمول / لتر من HEPES لمدة 1 ساعة مع اهتزاز لطيف مستمر عند 37 درجة مئوية.
ملاحظة: أضف 1 مل من المخزن المؤقت للهضم في أنبوب معقم سعة 2 مل واستخدم مقص معقم لتقطيع الكلى. - أضف 10 مل من 1x PBS بارد يحتوي على 10 mM من حمض الإيثيلين ديامين رباعي أسيتيك (EDTA) واحتضنه لمدة 10 دقائق على الجليد. ثم دوامة التعليق مرتين.
- قم بتصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة 100 ميكرومتر واغسلها ب 10 مل من HBSS-full.
ملاحظة: يحتوي HBSS-full على 5 ملليمتر من EDTA و 0.1٪ BSA و 10 ملليمتر من HEPES. - جهاز طرد مركزي عند 350 × g لمدة 10 دقائق في RT.
- تحضير 30٪ و 37٪ و 70٪ من محلول Percoll متساوي التوتر (SIP).
ملاحظة: امزج حجم جزء واحد من 10x PBS وحجم 9 أجزاء من Percoll لإعداد SIP (انظر جدول المواد) ؛ استخدم HBSS-full لتخفيف SIP إلى 30٪ و 37٪ و 70٪ SIP. - أعد تعليق الخلايا في 5 مل من 30٪ SIP وقم بتحميل 37٪ من 5 مل (أعلى) و 70٪ من 5 مل (أسفل) ، مما يجعل تدرج SIP ، ببطء باستخدام ماصة باستر.
- جهاز طرد مركزي مع Up9 down0 (أو الفرامل 0) عند 1000 × g لمدة 30 دقيقة في RT.
- جمع الكريات البيض من واجهة 37٪ -70٪ وإعادة تعليقها في 5 مل من C10.
- جهاز طرد مركزي عند 350 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- أعد تعليق بيليه الخلية في 3 مل من المخزن المؤقت FACS. الخلايا جاهزة لتلطيخ FACS.
ملاحظة: يحتوي المخزن المؤقت FACS على 1x PBS و 0.1٪ ألبومين مصل البقر (BSA). - جهاز طرد مركزي عند 350 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وتخلص من supernatant (SN) ، تاركا حوالي 50 ميكرولتر.
ملاحظة: لإزالة السوبرناتانت، صب المحلول أو ماصه بعناية بعيدا عن المادة الصلبة أو استخدم فراغا شبه أوتوماتيكي لشفط السوبرناتانت. - إضافة 50 ميكرولتر من كتلة FcR (انظر جدول المواد) لكل أنبوب (مخفف 1/50 في 1x PBS) ؛ تخلط وتحضن على الثلج في الظلام لمدة 10 دقائق.
- أضف 2 مل من المخزن المؤقت FACS للغسيل.
- جهاز طرد مركزي عند 350 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وتجاهل SN ، تاركا حوالي 50 ميكرولتر.
- أضف 20 ميكرولتر من صبغة الفلورسنت المناسبة (تمييع 1/100 مع 1x PBS ، انظر جدول المواد) واتركها تقف لمدة 15-30 دقيقة على الجليد.
- أضف 50 ميكرولتر من مزيج الأجسام المضادة 15 لكل أنبوب: CD138-BV711 (1/200 في 1x PBS) و CD45-AF700 (1/200 في1x PBS) (انظر جدول المواد).
- احتضن على الثلج في الظلام لمدة 15-30 دقيقة وأضف 3 مل من المخزن المؤقت FACS.
- جهاز طرد مركزي عند 350 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وفراغ SN ، تاركا حوالي 50 ميكرولتر. هذا جاهز الآن ليتم تحليله عن طريق قياس التدفق الخلوي.
3. تلطيخ الفلورسنت المناعي
- قم بإجراء جمع العينات.
- قم بتضمين نصف الكلى في المبرد البلاستيكي الصغير باستخدام مركب درجة حرارة القطع المثلى (OCT) (انظر جدول المواد).
- أضف الثلج الجاف إلى صندوق رغوة البوليسترين (انظر جدول المواد) ، وضع المبرد بعناية فوق الثلج الجاف. تأكد من وضع قوالب التبريد بشكل مسطح.
ملاحظة: يستغرق مركب OCT 3-4 دقائق حتى يتصلب ويتحول إلى اللون الأبيض. - أخرج المبرد ولفه بورق الألمنيوم. قم بتخزينه على درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى مزيد من الاستخدام.
ملاحظة: يمكن تخزين هذا في -80 درجة مئوية لمدة 1 سنة على الأقل.
- إجراء تقسيم وتثبيت العينة.
- قطع العينات إلى أقسام 4 ميكرومتر ، وانتظر لمدة 2-3 ساعات على الأقل حتى تجف ، ثم قم بإصلاحها باستخدام الأسيتون البارد (عند 4 درجات مئوية) لمدة 10 دقائق.
ملاحظة: كن حذرا عند استخدام الأسيتون ، والذي يتطلب غطاء كيميائي متخصص. - بعد تثبيت الشرائح ، تجف في الهواء لمدة 0.5-1 ساعة وتخزنها لفترة قصيرة عند -20 درجة مئوية ، أو لفترة طويلة عند -80 درجة مئوية.
- قطع العينات إلى أقسام 4 ميكرومتر ، وانتظر لمدة 2-3 ساعات على الأقل حتى تجف ، ثم قم بإصلاحها باستخدام الأسيتون البارد (عند 4 درجات مئوية) لمدة 10 دقائق.
- وصمة عار العينات.
- أعد إصلاح الشرائح في الأسيتون البارد لمدة 5-10 دقائق.
- اسمح للأقسام بالإحماء إلى RT. استخدم قلم PAP (انظر جدول المواد) حول القسم واتركه حتى يجف.
ملاحظة: يمكن استخدام مينا الأظافر أيضا. تمنع هذه الخطوة تخفيف الأجسام المضادة من الطفو في جميع أنحاء الشريحة. - ضع الشرائح في 1x محلول ملحي مخزن مؤقتا (TBS) في جرة كوبلن (انظر جدول المواد) لمدة 20 دقيقة ، وضع الجرة على الخلاط ، ورجها بلطف.
- صب 1x TBS واملأ الجرة ب 1x TBS و 5٪ BSA و 0.1٪ Tween 20. احتضن لمدة 20 دقيقة على الشاكر ، رجه بلطف.
- أخرج الشرائح وامسح الجزء السفلي من الشرائح جافا. إذا لزم الأمر ، هز الشرائح جافة. أضف 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة المترافقة25 C3-FITC (1/100) و IgG2a-PE (1/100) إلى القسم (انظر جدول المواد). احتضان في RT في غرفة رطبة لمدة 1 ساعة.
- اغسل القسم 3 مرات في 1x TBS و 5٪ BSA و 0.1٪ Tween 20 لمدة 10 دقائق على الخلاط.
- رج الشرائح الجافة وقم بتركيب القسم باستخدام كاشف مضاد للتلاشي (انظر جدول المواد) ثم غطاء.
- قم بتخزين الشرائح عند 4 درجات مئوية حتى عرضها تحت المجهر (على سبيل المثال، المجهر البؤري أو مجهر نظام التصوير). حدد الصور باستخدام البرامج واطرح إشارات الخلفية عند مقارنة كثافة التألق بين المناطق.
- لتحليل الصور باستخدام برنامج ImageJ (انظر جدول المواد)، حدد المنطقة المطلوبة.
- قم بتعيين المعلمات القياسية بالنقر فوق تحليل، ثم تعيين القياسات وقياس المنطقة للحصول على النتائج.
- نقل البيانات التي تم الحصول عليها من نوافذ القياس إلى جدول بيانات.
ملاحظة: يمكن تحديد مساحة صغيرة من الصورة كخلفية؛ لا ينبغي أن يكون لها أي تألق. - بمجرد الانتهاء من ذلك ، انقر فوق تحليل لقياس المنطقة ونقل البيانات مرة أخرى إلى جدول البيانات السابق.
- كرر الخطوات 3.3.11-3.3.12 لعدة مناطق.
- احسب متوسط التألق كتألق خلية مصحح (CCF) = الكثافة المتكاملة - (منطقة الخلية المحددة × متوسط تألق الخلفية).
- حساب لكل منطقة وتحليل البيانات باستخدام برنامج الرسوم البيانية والإحصاءات (انظر جدول المواد).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يستخدم البروتوكول طرقا متعددة لتقييم الفئران MRL / lpr لالتهاب الكلية الذئبة. أولا ، يتم وصف إجراء لدراسة زيادة مستويات البيلة البروتينية بسبب اختلال وظائف الكلى بمرور الوقت. وكما هو مبين في الشكل 1، عولجت إناث الفئران بجرعة فموية تبلغ 200 ميكرولتر من المياه المالحة العازلة بالفوسفات (1x PBS) كمجموعة ضابطة وبروبيوتيك لاكتوباسيلوس رويتيري كمجموعة علاجية، بتركيز 109 سيفو فوفو/مل، مرتين في الأسبوع. بدأ العلاج في عمر 3 أسابيع وانتهى في عمر 15 أسبوعا. كان لدى مجموعة الفئران المعالجة ب L. reuteri تطور بروتينية أكثر عدوانية من المجموعة الضابطة.
الشكل 1: الكشف عن مستويات البروتين في بول الفئران MRL / lpr مع مرور الوقت. n = 5 الفئران لكل مجموعة. تم إجراء الإحصائيات باستخدام اختبار الانحدار الخطي البسيط. * P < 0.05 ، ** P < 0.01. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
ويبين الشكل 2 تحليل FACS لكريات الدم البيضاء الكلوية المعزولة. عولجت الفئران بالفانكومايسين (2 جم / لتر) أو فانكومايسين بالإضافة إلى E. coli dsDNA (80 ميكروغرام) في هذه التجربة. تم إعطاء فانكومايسين جنبا إلى جنب مع مياه الشرب خلال الفترة الزمنية المشار إليها. تم إعطاء اللقاح الفموي للحمض النووي البكتيري للفئران المعالجة بالفانكومايسين مرة واحدة في الأسبوع لمدة أربعة أسابيع متتالية في عمر 4 و 5 و 6 و 7 أسابيع. كان من المتوقع أن يؤدي E. coli dsDNA إلى التسلل الكلوي لخلايا البلازما مما يؤدي إلى ضعف وظائف الكلى ، ولكن لم يتم العثور على فرق كبير.
الشكل 2: تحليل خلايا البلازما في الكريات البيض الكلوية المعزولة. (أ) استراتيجية البوابة التسلسلية: الخلايا الكلية ، الخلايا المفردة ، الخلايا الحية ، خلايا CD45 + ، وأخيرا خلايا CD138 +. (ب) النسبة المئوية لخلايا البلازما بعد العلاج بالفان (فانكومايسين) أو فان + الحمض النووي (فانكومايسين + إي كولي dsDNA) لمدة 3 أسابيع (ن ≥ 5 فئران لكل مجموعة). لم يلاحظ أي دلالة إحصائية ('ns'). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
يوضح الشكل 3 تلطيخ التألق المناعي للمكمل C3 و IgG2a على أقسام الكلى MRL / lpr للإناث. في هذه التجربة ، تمت مقارنة تأثير العوامل البيئية فيما يتعلق بالترسب الكلوي ل C3 و IgG2a. تم تربية الفئران الداخلية في منشأة الحيوانات لعدة أجيال ، وتمت مقارنتها بالفئران التي تم شراؤها مؤخرا من بائع. لم يظهر التحليل الكيميائي النسيجي المناعي أي فرق بين المرافق المختلفة.
الشكل 3: الكشف عن المكمل C3 و IgG2a في أقسام الكلى عن طريق تلطيخ التألق المناعي. (أ) صور تمثيلية لأقسام الكلى الملطخة بمضاد C3-FITC (أخضر) ومضاد ل IgG2a-PE (أحمر). (ب) مقارنة تألق الخلايا المصحح (CCF) بين المجموعتين (n ≥ 5 فئران لكل مجموعة). شريط المقياس = 100 ميكرومتر. لم يلاحظ أي دلالة إحصائية ('ns'). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
LN هو السبب الرئيسي للوفيات في مرضى الذئبة الحمراء ، ولا تزال العوامل التي تؤدي إلى تفاقم المرض غير واضحة. تطبيق هذا البروتوكول هو توصيف وظائف الكلى باستخدام طرق متعددة ، بما في ذلك قياس البيلة البروتينية ، وتحليل FACS لكريات الدم البيضاء المعزولة في الكلى ، وتلطيخ التألق المناعي لأقسام الكلى المجمدة.
إحدى النقاط المهمة التي يجب مراعاتها أثناء جمع البول هي أنه يجب أن يكون المرء متسقا مع الوقت من اليوم وموقع جمع البول. الفئران هي ليلية ، لذلك يتم جمع العينات الأكثر دقة في وقت متأخر من بعد الظهر قبل أن تبدأ الفئران في النشاط. سبب آخر لاختيار هذه المرة هو أن الفئران MRL / lpr تميل إلى شرب الكثير من الماء في الليل ، مما يؤدي إلى البول المخفف. وبالتالي ، قد يؤدي الجمع في الوقت الخطأ إلى زيادة تركيز البول و / أو تغيرات الحجم. من المهم أيضا جمع أكبر قدر ممكن من البول للحصول على نتائج دقيقة.
يعطينا فحص برادفورد تقديرا لكمية البروتين الموجودة. وهي ليست محددة لأي بروتينات علامة SLE ولكنها جيدة بما يكفي لإعطاء فكرة عن تطور المرض26. بالإضافة إلى ذلك ، هذه الطريقة فعالة من حيث التكلفة مقارنة بغيرها. والجدير بالذكر أن فحص برادفورد حساس للوقت. لذلك ، يجب إكماله في غضون نصف ساعة. تميل العينات إلى الحصول على قيم متزايدة أو نتائج خاطئة عالية إذا انتظر المرء لفترة طويلة جدا. فائدة أخرى مقارنة بشرائط الكاشف التجاري لتحليل البول هي أنه يعطي أرقاما دقيقة بدلا من نطاق داخل عينة البول. يمكن أن تعطي شرائط التسجيل نتائج غامضة ، خاصة في النطاق الأعلى9،10،24.
لعزل الكريات البيض في الكلى ، فإن الخطوة الرئيسية الأولى هي إجراء التشريح في أسرع وقت ممكن. تؤثر صلاحية خلايا الكلى بشكل كبير على نجاح تحليل FACS اللاحق. عندما تتم معالجة الكلى ، تكون كل خطوة حساسة للوقت ودرجة الحرارة. تجدر الإشارة إلى أن تركيزات DNase I والكولاجيناز ودرجة الحرارة مهمة لتحقيق أقصى قدر من الكفاءة ، لأنها تقضي على الحمض النووي وتسمح بتفكك العضو ، على التوالي27. الخطوة الرئيسية الثانية هي عزل الخلايا ، مقسمة إلى عمليتين مهمتين. الأول هو استخدام المصفاة التي تسمح بإزالة حطام الأنسجة. العملية الثانية التي تنطوي على Percoll هي الخطوة الأكثر أهمية وتتطلب التركيز والصبر. عند القيام بتدرج الكثافة باستخدام Percoll ، من المهم الحفاظ على واجهات واضحة بين تركيزات مختلفة من SIP. يوصى باستخدام ماصة باستور حيث يمكن التحكم في التدفق والضغط يدويا. يمكن بناء مراحل إضافية بشكل أفضل مع التوزيع البطيء لحل SIP أو حتى قطرة بقطرة. بمجرد إنشاء المراحل ، يجب التعامل مع الأنبوب بلطف ؛ خلاف ذلك ، سوف تختلط المراحل على الفور ، وسيتم فقدان العينات ، لأنه من المستحيل فصل المراحل مرة أخرى. بالإضافة إلى ذلك ، من المهم طرد الأنبوب مركزيا دون انقطاع لأن الكسر قد يكون عدوانيا للغاية ، مما يؤدي إلى فقدان مراحل منفصلة. ثم يتم استرداد الكريات البيض من الطور البيني بين 30٪ و 37٪ SIP. قمنا بتحليل مجموعة خلايا واحدة في هذا المثال ، خلايا البلازما (CD45 + و CD138 +). ومع ذلك ، لا تقتصر هذه التقنية على الخلايا البائية. يمكن استخدامه لأنواع الخلايا الأخرى وتلطيخ داخل الخلايا28.
الطريقة الثالثة هي أداة قوية لتصور التوطين داخل الخلايا لترسبات بروتين معينة. بمجرد إصلاح الأنسجة باستخدام الأسيتون ، من المهم إجراء غسيل كاف ، لذلك تعلق الأجسام المضادة فقط على الهدف. بعد ذلك ، يقلل الحظر باستخدام BSA من الربط غير المحدد والإيجابيات الخاطئة. عادة ما يوصى بالتألق المناعي المباشر ، لأنه أسرع من التألق المناعي غير المباشر مع جسم مضاد ثانوي ، وهو أمر يستغرق وقتا طويلا ، خاصة بالنظر إلى خطوات الغسيل والحضانة الإضافية. ومع ذلك ، فإن التألق المناعي المباشر يحد من مرونة اختيار الأجسام المضادة مقارنة بالتألق المناعي غير المباشر29. لذلك ، يمكن أن يكون كلاهما طرقا قيمة اعتمادا على الغرض. علاوة على ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن عوامل التخفيف هي المفتاح أثناء تلطيخ المدينة العالمية للخدمات الإنسانية. إذا لم يتم التخفيف بشكل جيد ، فستظهر الخلفية المتزايدة (لا يوجد تخفيف كاف للأجسام المضادة) أو تلطيخ ضعيف (الكثير من التوسع) على صور الفحص المجهري. من المهم البدء بالتخفيف التسلسلي للجسم المضاد لتحسين تركيز الأجسام المضادة لتحسين نسبة الهدف إلى الخلفية. خطوة أخرى يجب مراعاتها هي مقدار وقت الحضانة مع الأجسام المضادة. كلما طالت مدة اتصال الجسم المضاد بالعينة ، يمكن إنشاء ربط غير محدد.
وفيما يلي القيود المفروضة على الأساليب الحالية. لا يمكن الكشف عن بعض المعلمات السريرية ل LN ، مثل نسبة الألبومين / الكرياتينين ، باستخدام هذه الطرق. بالإضافة إلى ذلك ، قد يكون لبعض العينات قابلية ضعيفة للذوبان في الحمض مما يؤدي إلى قراءة تركيز عالية فوق المنحنى القياسي. وهذا يتطلب المزيد من التخفيفات من العينات أو إضافة المواد الخافضة للتوتر السطحي لتعجيل الصبغة30. علاوة على ذلك ، قد لا يكون هذا البروتوكول مناسبا إذا كانت هناك حاجة إلى العديد من الخلايا بعد عزل الكريات البيض في الكلى. يتضمن بروتوكول عزل خلايا الكلى الحالي عدة خطوات غسيل وهضم وعزل لزيادة إزالة الخلايا الأخرى إلى أقصى حد ، لذلك على الرغم من أن نقاء الخلية مرتفع في النهاية ، إلا أن عدد الخلايا عادة ما يكون منخفضا. علاوة على ذلك ، إنه إجراء طويل ، لذلك يمكن اختراق صلاحية الخلية. الفحوصات الأخرى الجاهزة للاستخدام هي أكثر ملاءمة للاستخدام السريري. ومع ذلك ، قد توفر الأساليب الحالية نتائج دقيقة بميزانية أصغر لمختبرات البحوث.
باختصار ، يتم تقديم ثلاث تقنيات مختلفة فعالة ودقيقة في هذا البروتوكول لتوصيف تقدم LN. الجمع بين طريقة برادفورد لمستوى البيلة البروتينية ، وتحليل FACS للتسلل الكلوي لكريات الدم البيضاء ، وتحليل IHC للترسب الكلوي ل IgG2a و C3 ، يتم بنجاح إنشاء صورة واضحة للاختلال الوظيفي الكلوي في الفئران MRL / lpr الإناث كنموذج ل LN البشري.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن صاحبا البلاغ أنه لا يوجد تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نشكر المرفق الأساسي لقياس التدفق الخلوي ، ومختبر علم الأنسجة المرضي ، ومركز فرالين للتصوير في معهد فرجينيا للفنون التطبيقية ، وجامعة الولاية على الدعم الفني. يتم دعم هذا العمل من خلال العديد من المعاهد الوطنية للصحة والمنح الداخلية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Tris-Buffered Saline (TBS) | Thermo Fisher Scientific | J60764.K2 | |
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | |
| Anti-Human/Mouse C3 | Cedarlane | CL7632F | |
| Anti-Mouse CD138 BV711 | Biolegend | 142519 | |
| Anti-Mouse CD45 AF700 | Biolegend | 103127 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418-100G | |
| Collagenase D | Sigma-Aldrich | 11088882001 | |
| Confocal Microscope LSM 880 | Zeiss | LSM 880 | |
| Coplin jar | Fisher Scientific | 50-212-281 | |
| Cryomold | Fisher Scientific | NC9511236 | |
| Density gradient medium | GE Healthcare | 17-1440-02 | Percoll |
| DEPC-Treated water | Thermo Fisher Scientific | AM9906 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | D4527 | |
| dsDNA-EC | InvivoGen | tlrl-ecdna | |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid | Fisher Scientific | S311-500 | EDTA |
| EVOS M5000 Microscope imaging system | Thermo Fisher Scientific | AMF5000 | |
| FACS Fusion Cell sorter | BD Biosciences | FACS Fusion | |
| Fetal Bovine Serum - Premium, Heat Inactivated | R&D systems | S11150H | |
| Fisherbrand 96-Well Polystyrene Plates | Fisher Scientific | 12-565-501 | |
| Graphpad prism | GraphPad | N/A | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Thermo Fisher Scientific | 14175-079 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | |
| ImageJ software | National Institutes of Health | N/A | |
| Lactobacillus reuteri Kandler et al. | ATCC | 23272 | |
| MEM non-essential amino acids | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| MRL/MpJ-Fas lpr /J Mice (MRL/lpr) | Jackson Lab | 485 | |
| Nail enamel | N/A | N/A | Any conventional store |
| O.C.T compound | Tisse-Tek | 4583 | |
| PAP pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
| Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | Polysciences | R-30 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 70011069 | |
| Pierce 20x TBS Buffer | Thermo Fisher Scientific | 28358 | |
| Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay kit | Thermo Fisher Scientific | 23236 | Albumin standard included |
| ProLon Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36934 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 | BD Biosciences | 553141 | FcR block |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875-093 | |
| Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | |
| SpectraMax M5 | Molecular Devices | N/A | SoftMax Pro 6.1 software |
| Sterile cell Strainers 100 µM | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Vancomycin Hydrochloride | Goldbio | V-200-1 | |
| Zombie Aqua | Biolegend | 423102 | fluorescent dye for flow cytometry analysis |
References
- Tsokos, G. C.
- Davidson, A., Aranow, C. Lupus nephritis: lessons from murine models. Nature Reviews Rheumatology. 6 (1), 13-20 (2010).
- Maldonado, M. A., et al. The role of environmental antigens in the spontaneous development of autoimmunity in MRL-lpr mice. Journal of Immunology. 162 (11), 6322-6330 (1999).
- Lech, M., Anders, H. J.
- Bagavant, H., Fu, S. M. Pathogenesis of kidney disease in systemic lupus erythematosus. Current Opinion in Rheumatology. 21 (5), 489-494 (2009).
- Li, Q. Z., et al. Identification of autoantibody clusters that best predict lupus disease activity using glomerular proteome arrays. Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3428-3439 (2005).
- Aragón, C. C., et al.
- Mu, Q., et al. Control of lupus nephritis by changes of gut microbiota. Microbiome. 5 (1), 73 (2017).
- Lu, T. -S., Yiao, S. -Y., Lim, K., Jensen, R. V., Hsiao, L. -L. Interpretation of biological and mechanical variations between the Lowry versus Bradford method for protein quantification. North American Journal of Medical Sciences. 2 (7), 325-328 (2010).
- Lamb, E. J., MacKenzie, F., Stevens, P. E. How should proteinuria be detected and measured. Annals of Clinical Biochemistry. 46, Pt 3 205-217 (2009).
- Viswanathan, G., Upadhyay, A.
- Hsieh, C., et al. Predicting outcomes of lupus nephritis with tubulointerstitial inflammation and scarring. Arthritis Care & Research. 63 (6), 865-874 (2011).
- Hill, G. S., Delahousse, M., Nochy, D., Mandet, C., Bariéty, J. Proteinuria and tubulointerstitial lesions in lupus nephritis. Kidney International. 60 (5), 1893-1903 (2001).
- Chang, A., et al. In situ B cell-mediated immune responses and tubulointerstitial inflammation in human lupus nephritis. Journal of Immunology. 186 (3), 1849-1860 (2011).
- Schrezenmeier, E., Jayne, D., Dörner, T. Targeting B Cells and plasma cells in glomerular diseases: translational perspectives. Journal of the American Society of Nephrology. 29 (3), 741 (2018).
- Fitzgibbons, P. L., et al. Principles of analytic validation of immunohistochemical assays: Guideline from the college of American pathologists pathology and laboratory quality center. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 138 (11), 1432-1443 (2014).
- Lewis, M. J., Botto, M. Complement deficiencies in humans and animals: links to autoimmunity. Autoimmunity. 39 (5), 367-378 (2006).
- Watanabe, H., et al. Modulation of renal disease in MRL/lpr mice genetically deficient in the alternative complement pathway factor B. Journal of Immunology. 164 (2), 786-794 (2000).
- Yin, Z., et al.
- Singh, R. R., et al. Differential contribution of IL-4 and STAT6 vs STAT4 to the development of lupus nephritis. Journal of Immunology. 170 (9), 4818-4825 (2003).
- van Bavel, C. C., Fenton, K. A., Rekvig, O. P., vander Vlag, J., Berden, J. H. Glomerular targets of nephritogenic autoantibodies in systemic lupus erythematosus. Arthritis & Rheumatism. 58 (7), 1892-1899 (2008).
- Zuniga, R., et al. Identification of IgG subclasses and C-reactive protein in lupus nephritis: the relationship between the composition of immune deposits and FCgamma receptor type IIA alleles. Arthritis & Rheumatism. 48 (2), 460-470 (2003).
- Wang, S., Wang, F., Wang, X., Zhang, Y., Song, L. Elevated creatinine clearance in lupus nephritis patients with normal creatinine. International Journal of Medical Sciences. 18 (6), 1449-1455 (2021).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1), 248-254 (1976).
- Cabana-Puig, X., et al. Phenotypic drift in lupus-prone MRL/lpr Mice: potential roles of micrornas and gut microbiota. Immunohorizons. 6 (1), 36-46 (2022).
- Wang, S., Wang, F., Wang, X., Zhang, Y., Song, L. Elevated creatinine clearance in lupus nephritis patients with normal creatinine. International Journal of Medical Sciences. 18 (6), 1449-1455 (2021).
- Kienzle, N., Young, D., Zehntner, S., Bushell, G., Sculley, T. B. DNaseI treatment is a prerequisite for the amplification of cDNA from episomal-based genes. Biotechniques. 20 (4), 612-616 (1996).
- Park, J. G. -, et al. Immune cell composition in normal human kidneys. Scientific Reports. 10 (1), 15678 (2020).
- Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. An introduction to performing immunofluorescence staining. Methods in Molecular Biology. 1897, 299-311 (2019).
- Okutucu, B., Dınçer, A., Habib, Ö, Zıhnıoglu, F. Comparison of five methods for determination of total plasma protein concentration. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 70 (5), 709-711 (2007).
