Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Analyser af proteinuri, renal infiltration af leukocytter og renal aflejring af proteiner i lupus-udsatte MRL/lpr-mus

Published: June 8, 2022 doi: 10.3791/63506
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biomedical Sciences and Pathobiology, Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine, Virginia Polytechnic Institute and State University

Summary

Den nuværende protokol beskriver en metode til at spore lupus progression i mus. To yderligere procedurer præsenteres for at karakterisere lupus nefritis baseret på celleinfiltration og proteinaflejring i nyrerne.

Abstract

Systemisk lupus erythematosus (SLE) er en autoimmun lidelse uden kendt kur og er karakteriseret ved vedvarende betændelse i mange organer, herunder nyrerne. Under sådanne omstændigheder mister nyrerne sin evne til at rense affald fra blodet og regulere salt- og væskekoncentrationer, hvilket i sidste ende fører til nyresvigt. Kvinder, især kvinder i den fødedygtige alder, diagnosticeres ni gange oftere end mænd. Nyresygdom er den hyppigste årsag til dødelighed hos SLE-patienter. Den nuværende protokol beskriver en hurtig og enkel metode til at måle udskilte proteinniveauer i opsamlet urin, sporing af lupus progression over tid. Derudover tilvejebringes en tilgang til isolering af nyremononukleære celler baseret på størrelse og densitetsvalg for at undersøge renal infiltration af leukocytter. Desuden er der udviklet en immunohistokemisk metode til at karakterisere proteinaflejring i glomeruli og leukocytinfiltration i tubulointerstitielt rum. Sammen kan disse metoder hjælpe med at undersøge udviklingen af kronisk inflammation forbundet med nyrerne hos lupus-udsatte MRL / lpr-mus.

Introduction

Nyrens primære funktion er eliminering af giftige stoffer gennem urin, samtidig med at homeostase af vand og salte opretholdes1. Denne funktion er truet hos patienter med systemisk lupus erythematosus (SLE), hvilket fører til såkaldt lupus nefritis (LN). LN er en konsekvens af, at immunsystemet angriber nyrerne, hvilket fører til vedvarende nyrebetændelse og derfor mister sin evne til at rense affald fra blodet og regulere salt- og væskekoncentrationer. Dette vil i sidste ende føre til nyresvigt, hvilket kan være dødeligt. Under den nefritiske proces rekrutteres cirkulerende B-celler, T-celler og monocytter til nyrerne og udskiller kemokiner, cytokiner og immunkompleksdannende autoantistoffer. Dette resulterer i sidste ende i endotelcelleskader, membranøse skader, renal tubulær atrofi og fibrose2.

MRL / Mp-Faslpr (MRL / lpr) lupus-udsatte mus er en klassisk musemodel, der udviser lupus-lignende kliniske tegn, der ligner human SLE3. Denne model har været medvirkende til at forstå en af de førende årsager til dødelighed hos SLE-patienter, lupus nefritis (LN)4. I både human og mus SLE er LN karakteriseret ved gradvis inflammation udløst af renal aflejring af immunkomplekser efterfulgt af komplementaktivering, rekruttering af inflammatoriske celler og tab af nyrefunktion5. Immunkompleksaflejringen er det første skridt til at inducere kemokin- og cytokinproduktion af iboende nyreceller, hvilket udvider det inflammatoriske respons ved at rekruttere immunceller6. Den nuværende protokol præsenterer flere teknikker til at følge nyresygdomsprogression, der analyserer celleinfiltration og immunkompleksaflejring.

Urin indsamlet hver uge giver mulighed for påvisning og visualisering af tidsforløbet af proteinuri før, under og efter lupus debut. Proteinuri som biomarkør kan bestemme den biologiske progression af LN. Andre fordele ved denne teknik er, at den er ikke-invasiv, omkostningseffektiv og nem at implementere7. Når nyrerne fungerer perfekt, er proteinuriniveauet konsekvent lavt; hos MRL/lpr-mus observeres dog efter 8-9 ugers alderen en gradvis stigning i proteinuriniveauet, der til sidst er højt nok til at forårsage nyresvigt8. Flere reagensstrimler og kolorimetriske reagenser er kommercielt tilgængelige for at overvåge problemet. Bradford-analysen er imidlertid billig og meget præcis til bestemmelse af begyndelsen af proteinuri og forløbet af lupus nefritis. Dette assay er hurtigt, og reagenset påvirkes ikke af tilstedeværelsen af opløsningsmidler, buffere, reduktionsmidler og metalcheleringsmidler, der kan være i din prøve 9,10,11.

Et vigtigt aspekt at overveje er celleinfiltration i nyrerne. Disse infiltrater fremmer patogenese ved at udløse udskillelsen af opløselige faktorer såsom cytokiner for at forværre inflammation12. For bedre at forstå, hvilke cellepopulationer der er til stede i infiltraterne, er en nyttig metode at isolere leukocytter13. Her anvendes påvisning af renal infiltration af B-celler som et eksempel. Proceduren begynder med en fordøjelsesproces med deoxyribonuklease (DNase) og collagenase efterfulgt af densitetsgradientseparation, der fjerner snavs, røde blodlegemer og tætte granulocytter. Årsagen til at isolere B-celler (CD19+) og plasmaceller (CD138+) er, at lupus nyrer kan koncentrere disse celler14. Det foreslås, at tilstedeværelsen af B-celler i små aggregater i nyrerne kan indikere klonal ekspansion og følgelig immunoglobulin (Ig) produktion. Plasmaceller er velkendte for at være til stede i disse aggregater såvel15. Når leukocytter er blevet isoleret, kan fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) bruges til at analysere cellerne af interesse ved farvning med forskellige fluorescenskonjugerede antistoffer.

Immunofluorescens er en af de immunohistokemiske (IHC) detektionsmetoder, der muliggør fluorescerende visualisering af proteiner i 4 μm tykke nyrevævsprøver. Andre IHC-detektionsmetoder afhænger af analytters art, bindingskemi og andre faktorer16. Immunofluorescens er en hurtig identifikationsmetode, der udsætter antigenet for dets modstykke antistof mærket med et specifikt fluorokrom (eller et fluorescerende farvestof). Når det er ophidset, producerer det lys, som et fluorescensmikroskop kan detektere. Denne teknik kan bruges til at observere aflejringen af komplement C3 og IgG2a17. Overdreven komplementkaskadeaktivering kan være forbundet med et ukontrolleret immunrespons og funktionstab18. Immunaflejring af anti-dobbeltstrenget DNA (anti-dsDNA) autoantistoffer i nyrerne er et stort problem19, hvor de med IgG2a isotype har været forbundet med LN20. Specifikt udviser anti-dsDNA-antistoffer mere patogenicitet og affinitet til nukleare materialer, der danner immunkomplekser21. Når IgG2a er til stede, aktiveres komplementkaskaden, inklusive C3, for at rydde immunkomplekserne22. C3- og IgG2a-markørerne kan kvantificeres individuelt eller overlejres for at fastslå deres korrelation.

Især serumkreatininmåling er en anden pålidelig teknik, der kan bruges sammen med mikroskopisk hæmaturi og nyrebiopsier til diagnosticering af LN23. Tilstedeværelsen af proteinuri er imidlertid en stærk indikator for glomerulær skade. I den forstand kan overvågning af proteinuriniveauet under lupus detektere sygdomsdebut og supplere andre metoder til diagnosticering af lupus. Derudover kan immunkomplekser deponeret i glomeruli inducere et inflammatorisk respons, aktivere komplementsystemet og rekruttere flere inflammatoriske celler. Et andet bemærkelsesværdigt punkt i denne protokol er B-celleinfiltration i nyrerne. Dette, sammen med de infiltrerede T-celler, forstærker lokale immunresponser, der udløser organskader. Det er vigtigt, at klassificeringen af LN ikke kun er baseret på glomerulære morfologiske ændringer set i mikroskopi, men også immunaflejringer observeret med immunfluorescens. Derfor tilbydes i denne protokol nøjagtige og omkostningseffektive metoder til analyse af nyrefunktion i laboratorieindstillinger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Den nuværende protokol er godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) på Virginia Tech. Da lupus sygdom har en højere forekomst hos kvinder, kun kvindelige MRL / lpr mus blev brugt. Prøveindsamlingen blev påbegyndt ved 4 ugers alderen og afsluttet ved 15 uger. Musene blev fremstillet fra kommercielle kilder (se Materialetabel) og blev opdrættet og vedligeholdt i et specifikt patogenfrit miljø efter de institutionelle retningslinjer.

1. Test af proteinuri

  1. Saml urin ved at følge nedenstående trin.
    1. Steriliser emhætten ved at sprøjte 70% ethanol. Læg et sterilt plastark på overfladen. Forbered spidser, 1,5 ml rør og en pipette til opsamling af ca. 20 μL af væsken.
      BEMÆRK: Spidser og rør skal være sterile og uden forbehandling.
    2. Tag buret og sprøjt 70% ethanol, inden du sætter det inde i emhætten.
    3. Hold musen med den ene hånd og brug den anden hånd til at massere det ventrale område fra top til bund forsigtigt.
    4. Brug et 1,5 ml rør eller pipette til at opsamle urinen direkte, eller hvis prøven falder, opsamles den fra plastpladen. Brug friske handsker, lagner og spidser til hver prøve.
      BEMÆRK: Hvis dette ikke virker, skal du bruge et sterilt bægerglas til at isolere musen og derefter opsamle urinen fra bægerglasset, når musen har urineret.
    5. Sæt musen tilbage i buret. Tag en anden mus ud, og gentag trin 1.1.3-1.1.4.
      BEMÆRK: Rengør altid plastfolien og bægerglasset med 70 % ethanol, når prøven er opsamlet for hver mus. Mindst fem mus pr. gruppe er nødvendige for statistisk signifikans. Urinprøver kan opbevares ved -80 °C indtil brug i op til 12 måneder.
  2. Kvantificer proteinerne ved Hjælp af Bradford-metoden24.
    1. Lad urinprøver, Albumin-standard og Bradford-reagenset komme til stuetemperatur (RT) ved at holde dem uden for fryseren i 10-20 minutter.
      BEMÆRK: Bradford reagens og Albumin standard er inkluderet i et kommercielt tilgængeligt sæt (se Materialetabel). Startkoncentrationen af Albumin-standarden er 2 mg / ml. Serielle fortyndinger (1:2 seks gange) skal udføres med vand.
    2. Bradford-reagens tilsættes til en 96-brønds plade (200 μL/brønd), ufortyndet.
    3. Pipetter 5 μL ufortyndet urinprøve pr. brønd, og brug spidsen til at pipettere op og ned flere gange for at blande korrekt.
    4. Tilsæt standarder (400, 200, 100, 50, 25, 12,5 mg / dL) i duplikater. Efterlad et par brønde som emner.
      BEMÆRK: Tilføjelsen af prøver og standarder skal ske hurtigt.
    5. Lad den stå i 5-10 min ved RT.
    6. Aflæs pladen ved 595 nm i en pladelæser i henhold til producentens protokol (se Materialetabel).

2. Isolering af nyrecellerne

  1. Afliv musen med CO 2 (flowhastighed : 30%-70% volumen/min, for at opnå bevidstløshed eller død) i et kammer efterfulgt af cervikal dislokation. Fortsæt med dissektionen for at samle begge nyrer. Placer halvanden nyre i et iskoldt C10-medium. Den anden halvdel af nyren anbringes i OCT (trin 3.1.1).
    BEMÆRK: C10 er lavet med RPMI 1640 suppleret med 10% føtalt bovint serum, 1 mM natriumpyruvat, 1% 100x MEM uvæsentlige aminosyrer, 10 mM HEPES, 55 μM 2-mercaptoethanol og 100 U / ml penicillin-streptomycin (se materialetabel).
  2. Skær nyrerne i kornstørrelse (1-2 mm3 stykker) og fordøjes i 5 ml fordøjelsesbuffer indeholdende 1 mg / ml collagenase og 0,2 mg / ml DNase I (se materialetabel) i RPMI 1640 medium indeholdende 10 mmol / l HEPES i 1 time med kontinuerlig skånsom omrystning ved 37 ° C.
    BEMÆRK: Tilsæt 1 ml fordøjelsesbuffer i et sterilt 2 ml rør og brug steril saks til at hugge nyren.
  3. Der tilsættes 10 ml 1x iskold PBS indeholdende 10 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) og inkuberes i 10 minutter på is. Derefter hvirvel suspensionen to gange.
  4. Cellesuspensionen filtreres gennem en 100 μM si og vaskes med 10 ml HBSS-fuld.
    BEMÆRK: HBSS-fuld indeholder 5 mM EDTA, 0,1% BSA og 10 mM HEPES.
  5. Centrifuger ved 350 x g i 10 min ved RT.
  6. Forbered 30%, 37% og 70% Stock Isotonic Percoll (SIP) opløsning.
    BEMÆRK: Bland 1 del volumen af 10x PBS og 9 dele volumen af Percoll for at forberede SIP (se Tabel over materialer); brug HBSS-fuld til at fortynde SIP til 30%, 37% og 70% SIP.
  7. Resuspend celler i 5 ml 30% SIP og belastning 37% af 5 ml (øverst) og 70% af 5 ml (bund), hvilket gør SIP-gradient langsomt med en pasterpipette.
  8. Centrifuger med Up9 down0 (eller bremse 0) ved 1000 x g i 30 min ved RT.
  9. Saml leukocytter fra 37%-70% grænsefladen og resuspend dem i 5 ml C10.
  10. Centrifuger ved 350 x g i 10 minutter ved 4 °C.
  11. Resuspender cellepillen i 3 ml FACS-buffer. Celler er klar til FACS-farvning.
    BEMÆRK: FACS-buffer indeholder 1x PBS og 0,1% bovint serumalbumin (BSA).
  12. Centrifuger ved 350 x g i 5 minutter ved 4 °C, og supernatanten (SN) kasseres, så der efterlades ca. 50 μL.
    BEMÆRK: For at fjerne supernatanten skal du forsigtigt hælde eller pipettere opløsningen væk fra det faste stof eller bruge et semiautomatisk vakuum til at aspirere supernatanten.
  13. Der tilsættes 50 μL FcR-blok (se materialetabel) pr. rør (forfortyndet 1/50 i 1x PBS); bland og inkuber på is i mørke i 10 min.
  14. Tilsæt 2 ml FACS-buffer til vask.
  15. Centrifuger ved 350 x g i 5 minutter ved 4 °C, og SN kasseres, så der efterlades ca. 50 μL.
  16. Tilsæt 20 μL af det passende fluorescerende farvestof (fortynd 1/100 med 1x PBS, se Materialetabel) og lad det stå i 15-30 min på is.
  17. Der tilsættes 50 μL antistof15 blanding pr. rør: CD138-BV711 (1/200 i 1x PBS) og CD45-AF700 (1/200 i 1x PBS) (se materialetabel).
  18. Inkuberes på is i mørke i 15-30 min og tilsæt 3 ml FACS buffer.
  19. Centrifuger ved 350 x g i 5 minutter ved 4 °C og vakuum SN, hvilket efterlader ca. 50 μL. Resuspend i 200 μL 1x PBS. Dette er nu klar til at blive analyseret ved flowcytometri.

3. Immunofluorescerende farvning

  1. Udfør prøveindsamlingen.
    1. Indlejr den halve nyre i den lille plastkryomold med OCT-forbindelsen (Optimal Cutting Temperature) (se Materialetabel).
    2. Tilsæt tøris i en polystyrenskumkasse (se Materialetabel), og læg forsigtigt kryoladen oven på tørisen. Sørg for, at kryogrammerne placeres fladt.
      BEMÆRK: Det tager 3-4 minutter for OCT-forbindelsen at størkne og blive hvid.
    3. Tag kryoflen ud og pakk den ind i aluminiumsfolie. Opbevar den ved -80 °C indtil videre brug.
      BEMÆRK: Dette kan opbevares ved -80 °C i mindst 1 år.
  2. Udfør sektionering og fastgørelse af prøven.
    1. Skær prøverne i 4 μm sektioner, vent i mindst 2-3 timer for at tørre, og fastgør derefter med kold acetone (ved 4 ° C) i 10 minutter.
      BEMÆRK: Vær forsigtig, når du bruger acetone, som kræver en specialiseret kemisk hætte.
    2. Efter fastgørelse af gliderne lufttørres i 0,5-1 time og opbevares i kort tid ved -20 °C eller i lang tid ved -80 °C.
  3. Pletter prøverne.
    1. Fastgør diasene i kold acetone i 5-10 min.
    2. Lad sektionerne varme op til RT. Brug en PAP-pen (se Materialetabel) rundt om sektionen, og lad den tørre.
      BEMÆRK: Negleemalje kan også bruges. Dette trin forhindrer antistoffortynding i at flyde over hele diaset.
    3. Læg dias i 1x Tris-buffered saltvand (TBS) i Coplin-krukken (se Materialetabel) i 20 minutter, læg krukken på rysteren og ryst forsigtigt.
    4. Hæld 1x TBS af og fyld krukken med 1x TBS, 5% BSA og 0,1% Tween 20. Inkuber i 20 minutter på rysteren, ryst forsigtigt.
    5. Tag gliderne ud og tør bunden af diasene tør. Ryst om nødvendigt gliderne tørre. Der tilsættes 100 μL konjugerede antistoffer25 C3-FITC (1/100) og IgG2a-PE (1/100) til afsnittet (se Materialetabel). Inkuberes ved RT i et befugtet kammer i 1 time.
    6. Vask sektionen 3 gange i 1x TBS, 5% BSA og 0,1% Tween 20 i 10 min på shakeren.
    7. Tør gliderne og monter sektionen med et antifadereagens (se Materialetabel) og derefter en dækslip.
    8. Opbevar diasene ved 4 °C, indtil de ses under mikroskopet (f.eks. konfokalt mikroskop eller billeddannelsessystemmikroskop). Kvantificer billeder ved hjælp af software, og træk baggrundssignaler, når du sammenligner fluorescensintensiteten mellem regioner.
    9. Til billedanalyse ved hjælp af ImageJ-softwaren (se Materialetabel) skal du skitsere det ønskede område.
    10. Indstil standardparametre ved at klikke på Analyser og derefter Indstil målinger og målareal for at få resultaterne.
    11. Overfør de data, der er hentet fra målevinduerne, til et regneark.
      BEMÆRK: Et lille område kan vælges fra billedet som baggrund; det bør ikke have nogen fluorescens.
    12. Når du er færdig, skal du klikke på Analyser for at måle regionen og overføre data igen til det forrige regneark.
    13. Gentag trin 3.3.11-3.3.12 for flere regioner.
    14. Beregn den gennemsnitlige fluorescens som korrigeret cellefluorescens (CCF) = Integreret densitet - (Valgt celleområde x Gennemsnitlig baggrundsfluorescens).
    15. Beregn for hver region, og analysér data ved hjælp af graf- og statistiksoftwaren (se Materialetabel).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokollen bruger flere metoder til at vurdere MRL / lpr mus for lupus nefritis. For det første beskrives en procedure for at studere øgede proteinuriniveauer på grund af nyredysfunktion over tid. Som vist i figur 1 blev hunmus behandlet med oral sonde på 200 μL phosphatbufferet saltvand (1x PBS) som kontrolgruppe og probiotisk Lactobacillus reuteri som behandlingsgruppe i en koncentration på 109 cfu/ml to gange om ugen. Behandlingen startede ved 3 uger gammel og sluttede ved 15 uger gammel. Musegruppen behandlet med L. reuteri havde en mere aggressiv proteinuriprogression end kontrolgruppen.

Figure 1
Figur 1: Påvisning af proteinniveauer i urinen hos MRL/lpr-mus over tid. n = 5 mus pr. gruppe. Statistikken blev udført med den simple lineære regressionstest. *P < 0,05, **P < 0,01. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2 viser FACS-analysen af de isolerede nyreleukocytter. Musene blev behandlet med vancomycin (2 g/l) eller vancomycin plus E. coli dsDNA (80 μg) i dette forsøg. Vancomycin blev givet sammen med drikkevandet i den angivne periode. Oral sonde af bakterielt DNA blev administreret til de vancomycin-behandlede mus en gang om ugen i fire på hinanden følgende uger ved 4, 5, 6 og 7 uger. E. coli dsDNA forventedes at udløse renal infiltration af plasmaceller, hvilket førte til kompromitteret nyrefunktion, men der blev ikke fundet nogen signifikant forskel.

Figure 2
Figur 2: Analyse af plasmaceller i isolerede nyreleukocytter. (A) Sekventiel gatingstrategi: samlede celler, enkeltceller, levende celler, CD45+ celler og endelig CD138+ celler. (B) Procentdel af plasmaceller efter behandling med van (Vancomycin) eller van + DNA (Vancomycin + E. coli dsDNA) i 3 uger (n ≥ 5 mus pr. gruppe). Der blev ikke observeret nogen statistisk signifikans ('ns'). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3 viser immunfluorescensfarvning af komplement C3 og IgG2a på kvindelige MRL/lpr nyresektioner. I dette forsøg blev effekten af miljøfaktorer sammenlignet med hensyn til renal aflejring af C3 og IgG2a. Interne mus blev opdrættet i dyrefaciliteten i flere generationer, og de blev sammenlignet med nyligt købte mus fra en sælger. Den immunhistokemiske analyse viste ingen forskel mellem forskellige faciliteter.

Figure 3
Figur 3: Påvisning af komplement C3 og IgG2a i nyreafsnit via immunfluorescensfarvning. (A) Repræsentative billeder af nyresektioner farvet med anti-C3-FITC (grøn) og anti-IgG2a-PE (rød). (B) Sammenligning af korrigeret cellefluorescens (CCF) mellem de to grupper (n ≥ 5 mus pr. Gruppe). Skala bar = 100 μM. Der blev ikke observeret nogen statistisk signifikans ('ns'). Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

LN er en førende årsag til dødelighed hos SLE-patienter, og faktorer, der forværrer sygdommen, forbliver uklare. Anvendelsen af denne protokol er at karakterisere nyrefunktionen ved anvendelse af flere metoder, herunder måling af proteinuri, FACS-analyse af isolerede nyreleukocytter og immunfluorescensfarvning af frosne nyresektioner.

Et vigtigt punkt at overveje, mens man samler urin, er, at man skal være i overensstemmelse med tidspunktet på dagen og placeringen af urinopsamling. Mus er natdyr, så de mest nøjagtige prøver indsamles sidst på eftermiddagen, før musene begynder at være aktive. En anden grund til at vælge denne gang er, at MRL / lpr mus har tendens til at drikke meget vand om natten, hvilket fører til fortyndet urin. Således kan indsamling på det forkerte tidspunkt øge urinens koncentration og / eller volumenvariabiliteter. Det er også vigtigt at indsamle så meget urin som muligt for at få nøjagtige resultater.

Bradford-analysen giver os et skøn over, hvor meget protein der er til stede. Det er ikke specifikt for nogen SLE-markørproteiner, men godt nok til at give en idé om sygdomsprogression26. Derudover er denne metode omkostningseffektiv sammenlignet med andre. Især bradford-analysen er tidsfølsom; derfor skal den være afsluttet inden for en halv time. Prøver har tendens til at have øgede værdier eller høje falske resultater, hvis man venter for længe. En anden fordel i forhold til de kommercielle reagensstrimler til urinalyse er, at det giver nøjagtige tal snarere end et interval inden for urinprøven. Scoringsstrimler kan give tvetydige resultater, især i det højere interval 9,10,24.

Til isolering af nyreleukocytter er det første nøgletrin at udføre dissektionen så hurtigt som muligt. Levedygtigheden af nyreceller påvirker i høj grad succesen med efterfølgende FACS-analyse. Når nyrerne behandles, er hvert trin tids- og temperaturfølsomt. Det skal bemærkes, at DNase I og collagenasekoncentrationer og temperatur er vigtige for maksimal effektivitet, da de eliminerer DNA og tillader opløsning af organet henholdsvis27. Det andet nøgletrin er isolering af celler, opdelt i to vigtige processer. Den første bruger silen, der tillader fjernelse af vævsrester; den anden proces, der involverer Percoll, er det mest afgørende skridt og kræver fokus og tålmodighed. Når du udfører densitetsgradienten med Percoll, er det vigtigt at opretholde klare grænseflader mellem forskellige koncentrationer af SIP. Det anbefales at bruge en Pasteur-pipette, da flux og tryk kan styres manuelt. Yderligere faser kan bygges bedre med langsom dispensering af SIP-opløsningen eller endda dråbe for dråbe. Når faser er etableret, skal røret håndteres forsigtigt; Ellers blandes faserne med det samme, og prøver går tabt, da det er umuligt at adskille faserne igen. Derudover er det vigtigt at centrifugere røret uden pause, fordi brud kan være for aggressivt, hvilket fører til tab af separate faser. Leukocytterne genvindes derefter fra interfase mellem 30% og 37% SIP. Vi analyserede en cellepopulation i dette eksempel, plasmaceller (CD45+ og CD138+). Denne teknik er imidlertid ikke begrænset til B-celler; det kan bruges til andre celletyper og intracellulær farvning28.

Den tredje metode er et kraftfuldt værktøj til visualisering af intracellulære lokaliseringer af givne proteinaflejringer. Når væv er fastgjort med acetone, er det vigtigt at udføre tilstrækkelig vask, så antistoffer kun fastgøres til målet. Dernæst reducerer blokering med BSA uspecifikke bindinger og falske positiver. Direkte immunfluorescens anbefales normalt, da det er hurtigere end indirekte immunfluorescens med et sekundært antistof, hvilket er tidskrævende, især i betragtning af de ekstra vaske- og inkubationstrin. Imidlertid begrænser direkte immunfluorescens fleksibiliteten af antistofudvælgelse sammenlignet med indirekte immunfluorescens29. Derfor kan begge være værdifulde metoder afhængigt af formålet. Desuden skal det nævnes, at fortyndingsfaktorer er nøglen under farvning til IHC. Hvis fortyndingen ikke er godt udført, vises øget baggrund (ikke nok antistoffortynding) eller svag farvning (for meget dilatation) på mikroskopibillederne. Det er vigtigt at starte med serielle fortyndinger af antistoffet for at optimere antistofkoncentrationen for et bedre mål-til-baggrundsforhold. Et andet skridt at overveje er mængden af inkubationstid med antistofferne. Jo længere antistoffet er i kontakt med prøven, jo mere uspecifik binding kan der skabes.

Begrænsningerne ved de nuværende metoder er som følger. Visse kliniske parametre for LN, såsom albumin / kreatininforholdet, kan ikke afsløres ved hjælp af disse metoder. Derudover kan nogle prøver have dårlig syreopløselighed, hvilket fører til en høj koncentrationsaflæsning over standardkurven. Dette kræver yderligere fortyndinger af prøver eller tilsætning af overfladeaktive stoffer for at udfælde farvestoffet30. Desuden er denne protokol muligvis ikke egnet, hvis der er behov for mange celler efter nyreleukocytterisolering. Den nuværende nyrecelleisoleringsprotokol involverer flere vasketrin, fordøjelses- og isolationstrin for at maksimere fjernelsen af andre celler, så selvom cellerenhed er høj i slutningen, er celletallet normalt lavt. Desuden er det en lang procedure, så celle levedygtighed kan kompromitteres. Andre brugsklare assays er mere egnede til klinisk brug; De nuværende metoder kan dog give nøjagtige resultater med et mindre budget for forskningslaboratorier.

Sammenfattende præsenteres tre forskellige effektive og nøjagtige teknikker i denne protokol for at karakterisere LN-progressionen. Ved at kombinere Bradford-metoden for proteinuriniveauet, FACS-analyse for renal infiltration af leukocytterne og IHC-analyse for renal aflejring af IgG2a og C3 etableres et klart billede af nyresvigt hos kvindelige MRL/ lpr-mus som en model af human LN med succes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at der ikke er nogen interessekonflikt.

Acknowledgments

Vi takker Flow Cytometry Core Facility, Histopathology Laboratory, Fralin Imaging Center ved Virginia Polytechnic Institute og State University for teknisk support. Dette arbejde understøttes af forskellige NIH og interne tilskud.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x Tris-Buffered Saline (TBS) Thermo Fisher Scientific J60764.K2
2-mercaptoethanol Thermo Fisher Scientific 21985-023
Anti-Human/Mouse C3 Cedarlane CL7632F
Anti-Mouse CD138 BV711 Biolegend 142519
Anti-Mouse CD45 AF700 Biolegend 103127
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A9418-100G
Collagenase D Sigma-Aldrich 11088882001
Confocal Microscope LSM 880 Zeiss LSM 880
Coplin jar Fisher Scientific 50-212-281
Cryomold Fisher Scientific NC9511236
Density gradient medium GE Healthcare 17-1440-02 Percoll
DEPC-Treated water Thermo Fisher Scientific AM9906
DNase I Sigma-Aldrich D4527
dsDNA-EC InvivoGen tlrl-ecdna
Ethylenediaminetetraacetic Acid Fisher Scientific S311-500 EDTA
EVOS M5000 Microscope imaging system Thermo Fisher Scientific AMF5000
FACS Fusion Cell sorter BD Biosciences FACS Fusion
Fetal Bovine Serum - Premium, Heat Inactivated R&D systems S11150H
Fisherbrand 96-Well Polystyrene Plates Fisher Scientific 12-565-501
Graphpad prism GraphPad N/A
Hank’s Balanced Salt Solution Thermo Fisher Scientific 14175-079
HEPES Thermo Fisher Scientific 15630-080
ImageJ software National Institutes of Health N/A
Lactobacillus reuteri Kandler et al. ATCC 23272
MEM non-essential amino acids Thermo Fisher Scientific 11140-050
MRL/MpJ-Fas lpr /J Mice (MRL/lpr) Jackson Lab 485
Nail enamel N/A N/A Any conventional store
O.C.T compound Tisse-Tek 4583
PAP pen Sigma-Aldrich Z377821
Peel-A-Way Disposable Embedding Molds Polysciences R-30
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140-122
Phosphate-buffered saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 70011069
Pierce 20x TBS Buffer Thermo Fisher Scientific 28358
Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay kit Thermo Fisher Scientific 23236 Albumin standard included
ProLon Gold Antifade Mountant ThermoFisher P36934
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 BD Biosciences 553141 FcR block
RPMI 1640 Thermo Fisher Scientific 11875-093
Sodium pyruvate Thermo Fisher Scientific 11360-070
SpectraMax M5 Molecular Devices N/A SoftMax Pro 6.1 software
Sterile cell Strainers 100 µM Fisher Scientific 22363549
Tween 20 Fisher Scientific BP337-500
Vancomycin Hydrochloride Goldbio V-200-1
Zombie Aqua Biolegend 423102 fluorescent dye for flow cytometry analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tsokos, G. C. Systemic Lupus Erythematosus. New England Journal of Medicine. 365 (22), 2110-2121 (2011).
  2. Davidson, A., Aranow, C. Lupus nephritis: lessons from murine models. Nature Reviews Rheumatology. 6 (1), 13-20 (2010).
  3. Maldonado, M. A., et al. The role of environmental antigens in the spontaneous development of autoimmunity in MRL-lpr mice. Journal of Immunology. 162 (11), 6322-6330 (1999).
  4. Lech, M., Anders, H. J. The pathogenesis of lupus nephritis. Journal of the American Society of Nephrology. 24 (9), 1357-1366 (2013).
  5. Bagavant, H., Fu, S. M. Pathogenesis of kidney disease in systemic lupus erythematosus. Current Opinion in Rheumatology. 21 (5), 489-494 (2009).
  6. Li, Q. Z., et al. Identification of autoantibody clusters that best predict lupus disease activity using glomerular proteome arrays. Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3428-3439 (2005).
  7. Aragón, C. C., et al. Urinary biomarkers in lupus nephritis. Journal of Translational Autoimmunity. 3, 100042 (2020).
  8. Mu, Q., et al. Control of lupus nephritis by changes of gut microbiota. Microbiome. 5 (1), 73 (2017).
  9. Lu, T. -S., Yiao, S. -Y., Lim, K., Jensen, R. V., Hsiao, L. -L. Interpretation of biological and mechanical variations between the Lowry versus Bradford method for protein quantification. North American Journal of Medical Sciences. 2 (7), 325-328 (2010).
  10. Lamb, E. J., MacKenzie, F., Stevens, P. E. How should proteinuria be detected and measured. Annals of Clinical Biochemistry. 46, Pt 3 205-217 (2009).
  11. Viswanathan, G., Upadhyay, A. Assessment of proteinuria. Advances in Chronic Kidney Disease. 18 (4), 243-248 (2011).
  12. Hsieh, C., et al. Predicting outcomes of lupus nephritis with tubulointerstitial inflammation and scarring. Arthritis Care & Research. 63 (6), 865-874 (2011).
  13. Hill, G. S., Delahousse, M., Nochy, D., Mandet, C., Bariéty, J. Proteinuria and tubulointerstitial lesions in lupus nephritis. Kidney International. 60 (5), 1893-1903 (2001).
  14. Chang, A., et al. In situ B cell-mediated immune responses and tubulointerstitial inflammation in human lupus nephritis. Journal of Immunology. 186 (3), 1849-1860 (2011).
  15. Schrezenmeier, E., Jayne, D., Dörner, T. Targeting B Cells and plasma cells in glomerular diseases: translational perspectives. Journal of the American Society of Nephrology. 29 (3), 741 (2018).
  16. Fitzgibbons, P. L., et al. Principles of analytic validation of immunohistochemical assays: Guideline from the college of American pathologists pathology and laboratory quality center. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 138 (11), 1432-1443 (2014).
  17. Lewis, M. J., Botto, M. Complement deficiencies in humans and animals: links to autoimmunity. Autoimmunity. 39 (5), 367-378 (2006).
  18. Watanabe, H., et al. Modulation of renal disease in MRL/lpr mice genetically deficient in the alternative complement pathway factor B. Journal of Immunology. 164 (2), 786-794 (2000).
  19. Yin, Z., et al. IL-10 regulates murine lupus. Journal of Immunology. 169 (4), 2148-2155 (2002).
  20. Singh, R. R., et al. Differential contribution of IL-4 and STAT6 vs STAT4 to the development of lupus nephritis. Journal of Immunology. 170 (9), 4818-4825 (2003).
  21. van Bavel, C. C., Fenton, K. A., Rekvig, O. P., vander Vlag, J., Berden, J. H. Glomerular targets of nephritogenic autoantibodies in systemic lupus erythematosus. Arthritis & Rheumatism. 58 (7), 1892-1899 (2008).
  22. Zuniga, R., et al. Identification of IgG subclasses and C-reactive protein in lupus nephritis: the relationship between the composition of immune deposits and FCgamma receptor type IIA alleles. Arthritis & Rheumatism. 48 (2), 460-470 (2003).
  23. Wang, S., Wang, F., Wang, X., Zhang, Y., Song, L. Elevated creatinine clearance in lupus nephritis patients with normal creatinine. International Journal of Medical Sciences. 18 (6), 1449-1455 (2021).
  24. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1), 248-254 (1976).
  25. Cabana-Puig, X., et al. Phenotypic drift in lupus-prone MRL/lpr Mice: potential roles of micrornas and gut microbiota. Immunohorizons. 6 (1), 36-46 (2022).
  26. Wang, S., Wang, F., Wang, X., Zhang, Y., Song, L. Elevated creatinine clearance in lupus nephritis patients with normal creatinine. International Journal of Medical Sciences. 18 (6), 1449-1455 (2021).
  27. Kienzle, N., Young, D., Zehntner, S., Bushell, G., Sculley, T. B. DNaseI treatment is a prerequisite for the amplification of cDNA from episomal-based genes. Biotechniques. 20 (4), 612-616 (1996).
  28. Park, J. G. -, et al. Immune cell composition in normal human kidneys. Scientific Reports. 10 (1), 15678 (2020).
  29. Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. An introduction to performing immunofluorescence staining. Methods in Molecular Biology. 1897, 299-311 (2019).
  30. Okutucu, B., Dınçer, A., Habib, Ö, Zıhnıoglu, F. Comparison of five methods for determination of total plasma protein concentration. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 70 (5), 709-711 (2007).

Tags

Immunologi og infektion udgave 184 SLE lupus nefritis nyre nyreinfiltration dysfunktionelle B-celler proteinaflejring
Analyser af proteinuri, renal infiltration af leukocytter og renal aflejring af proteiner i lupus-udsatte MRL/lpr-mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cabana-Puig, X., Luo, X. M. Analyses … More

Cabana-Puig, X., Luo, X. M. Analyses of Proteinuria, Renal Infiltration of Leukocytes, and Renal Deposition of Proteins in Lupus-prone MRL/lpr Mice. J. Vis. Exp. (184), e63506, doi:10.3791/63506 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter