Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

मायोकार्डियल Ischemia और Reperfusion चोट के बेहतर कृंतक मॉडल

Published: March 7, 2022 doi: 10.3791/63510
Automatic Translation
*1,2,3, *3, 3, 4, 5, 3, 5, 6, 1,2, 7
1Department of Cardiology, Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine, 2Department of Cardiology, Jiangsu Province Hospital of Chinese Medicine, 3First College of Clinical Medicine, Biological Technology Center for Innovation in Chinese Medicine, Nanjing University of Chinese Medicine, 4School of Health Preservation and Rehabilitation, Key Laboratory of Acupuncture and Medicine Research of Ministry of Education, 5Department of Cardiology, Jiangsu Provincial Hospital of Chinese Medicine, 6Department of Cardiology, Yancheng TCM Hospital Affiliated to Nanjing University of Chinese Medicine, 7Jiangsu Collaborative Innovation Center of Traditional Chinese Medicine (TCM) Prevention and Treatment of Tumor, Nanjing University of Chinese Medicine
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

चूहे के दिल के मायोकार्डियल ischemia-reperfusion मॉडल एक स्व-निर्मित retractor, polyvinyl क्लोराइड ट्यूब, और एक अद्वितीय knotting विधि का उपयोग करके सुधार किया जाता है। इलेक्ट्रोकार्डियोग्राम, ट्राइफिनाइलटेट्राज़ोलियम क्लोराइड और हिस्टोलॉजिकल स्टेनिंग, और प्रतिशत उत्तरजीविता विश्लेषण परिणामों से पता चला है कि बेहतर मॉडल समूह में पहले से मौजूद मॉडल समूह की तुलना में उच्च सफलता और उत्तरजीविता दर है।

Abstract

मायोकार्डियल ischemia और reperfusion चोट (MIRI), कोरोनरी हृदय रोग (CHD) से प्रेरित, कार्डियोमायोसाइट्स को नुकसान का कारण बनता है। इसके अलावा, सबूत बताते हैं कि थ्रोम्बोलिटिक थेरेपी या प्राथमिक पर्कुटेनियस कोरोनरी हस्तक्षेप (पीपीसीआई) reperfusion चोट को नहीं रोकता है। MIRI के लिए अभी भी कोई आदर्श पशु मॉडल नहीं है। इस अध्ययन का उद्देश्य सर्जरी को आसान और अधिक व्यवहार्य बनाने के लिए चूहों में एमआईआरआई मॉडल में सुधार करना है। MIRI की स्थापना के लिए एक अद्वितीय विधि ischemic अवधि के एक महत्वपूर्ण चरण के दौरान एक नरम ट्यूब का उपयोग करके विकसित किया गया है। इस विधि का पता लगाने के लिए, तीस चूहों को यादृच्छिक रूप से तीन समूहों में विभाजित किया गया था: शाम समूह (एन = 10); प्रयोगात्मक मॉडल समूह (एन = 10); और मौजूदा मॉडल समूह (एन = 10)। ट्राइफिनाइलटेट्राज़ोलियम क्लोराइड स्टेनिंग, इलेक्ट्रोकार्डियोग्राफी, और प्रतिशत उत्तरजीविता के निष्कर्षों की तुलना ऑपरेशन की सटीकता और जीवित रहने की दर को निर्धारित करने के लिए की जाती है। अध्ययन के परिणामों के आधार पर, यह निष्कर्ष निकाला गया है कि बेहतर सर्जरी विधि एक उच्च जीवित रहने की दर, उन्नत एसटी-टी सेगमेंट और बड़े इंफार्क्ट आकार से जुड़ी हुई है, जिससे एमआईआरआई की विकृति की बेहतर नकल करने की उम्मीद है।

Introduction

इस्केमिक हृदय रोग दुनिया भर में मृत्यु दर का प्रमुख कारण है। कार्डियोवैस्कुलर मृत्यु दर की सार्वजनिक स्वास्थ्य और महामारी विज्ञान में विश्व स्तर पर एक महत्वपूर्ण भूमिकाहै। मायोकार्डियल इस्केमिया और reperfusion चोट ischemic हृदय रोग में आवश्यक कार्य खेलते हैं, जो एक जटिल pathophysiological प्रक्रिया है कि एडेनोसिन triphosphate 2 की कमी, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियोंकी अत्यधिक पीढ़ी3, भड़काऊ प्रतिक्रियाओं4, और माइटोकॉन्ड्रियल शिथिलता कैल्शियम अधिभार5 के कारण शामिल है, जो चयापचय रोग और संरचनात्मक क्षति6 के माध्यम से तीव्र रोधगलन को ट्रिगर करता है।

हालांकि, मायोकार्डियल इस्केमिया और reperfusion चोट (MIRI) अंतर्निहित विस्तृत तंत्र अज्ञात रहते हैं। वर्तमान कार्य का उद्देश्य एक अद्वितीय पशु मॉडल विकसित करना है जो एमआईआरआई की नैदानिक प्रस्तुति और उपचार को पर्याप्त रूप से अनुकरण करता है। अन्यथा, MIRI मॉडल अनुसंधान की प्रक्रिया में, बड़े जानवरों7 (जैसे सूअरों) को इंटरवेंशनल सर्जरी की आवश्यकता होती है, जो महंगा है। छोटे जानवरों (जैसे खरगोश8, चूहों 9,10,11,12, और चूहों 13) को माइक्रोस्कोपी10, रिमोट-नियंत्रित सैक्यूल्स 8,11, या गुहा 9 से दिल को निचोड़ने के तहत नाजुक सर्जरी की आवश्यकता होती है, जिसके लिए उच्च स्तर की तकनीक की आवश्यकता होती है और कई पश्चात की जटिलताओं का कारण बन सकता है जो निष्कर्षों की सटीकता को परेशान करते हैं। एक उच्च जीवित रहने की दर और कम लागत के साथ एक आदर्श MIRI मॉडल रोग अनुसंधान में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाएगा।

इस अध्ययन का उद्देश्य चूहों में MIRI के अधिक सुलभ और व्यवहार्य मॉडल की स्थापना करके इन मुद्दों का मुकाबला करना था ताकि MIRI की विकृति पर शोध को सुविधाजनक बनाया जा सके, जिससे MIRI के लिए नैदानिक उपचारों की खोज हो सकती है।

Protocol

अध्ययन को नानजिंग यूनिवर्सिटी ऑफ चाइनीज मेडिसिन (अनुमति संख्या 202004A002) की पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। अध्ययन ने प्रयोगशाला जानवरों के उपयोग पर राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) के दिशानिर्देशों का सख्ती से पालन किया (एनआईएच प्रकाशन संख्या 85-23, संशोधित 2011)। इस काम में तीस नर स्प्राग-डॉली चूहों (वजन, 300 ± 50 ग्राम; आयु, 12 ± 14 सप्ताह) का उपयोग किया गया था।

1. पशु तैयारी

  1. सर्जरी से पहले चूहों को 12 घंटे के लिए भोजन और पानी से वंचित करें। प्रीपेरेटिव उपवास का उद्देश्य फुफ्फुसीय आकांक्षा को रोकनाहै 14।
  2. एक उच्च दबाव भाप sterilizer का उपयोग कर सर्जरी से पहले सभी उपकरणों sterilize.
  3. इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन के माध्यम से पेंटोबार्बिटल सोडियम (1.5%, 75 मिलीग्राम / किग्रा) का प्रशासन करके चूहों को बेहोश करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  4. चुटकी-पैर की अंगुली परीक्षण करके संज्ञाहरण की प्रभावशीलता का आकलन करें।
    नोट: चूहे को पर्याप्त रूप से एनेस्थेटिक माना जाता है यदि चिमटी द्वारा इसके हिंद पंजे को आयोजित किए जाने पर कोई सजगता नहीं देखी जाती है।
  5. एक "एस" आकार बनाने के लिए दो पेपर क्लिप के मध्य खंड को सीधा करें। एक छोटे से retractor बनाने के लिए प्रत्येक "एस" के विस्तृत अनुभाग को नीचे खींचें।
  6. एक 2 मिमी व्यास polyvinyl क्लोराइड (पीवीसी) ट्यूब 7 मिमी लंबाई टुकड़ों में काटें। पीवीसी ट्यूब में एक 10 सेमी लंबा 4-0 टांका डालें, और इसके सिरों को बांधें।
  7. बाएं पूर्वकाल अवरोही (एलएडी) कोरोनरी धमनी और पीवीसी ट्यूब को एक साथ 6-0 टांके का उपयोग करके लिगेट करें। नेत्र कैंची का उपयोग करके पीवीसी ट्यूब के बीच में एक नाली काटें, और इसे गिरने से रोकने के लिए ट्यूब के माध्यम से 6-0 टांके को थ्रेड करने के लिए नाली का उपयोग करें।
    नोट:: परमवीर चक्र ट्यूब और "S" आकार retractors अनुपूरक चित्र 1 में दिखाए गए हैं।

2. सर्जरी प्रक्रिया

  1. नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए बेहतर MIRI चूहा मॉडल उत्पन्न करने के लिए सर्जरी करें।
    नोट:: बेहतर MIRI विधि द्वारा उत्पन्न पशु मॉडल समूह को पूरे आलेख में प्रयोगात्मक मॉडल समूह के रूप में संदर्भित किया जाता है।
    1. संज्ञाहरण (चरण 1.2) के बाद, चूहे को सर्जिकल बोर्ड पर सुपाइन स्थिति में रखकर टेप के साथ चूहे के अंगों को ठीक करें। डिपिलेटरी क्रीम के साथ गर्दन और बाएं पूर्वकाल छाती क्षेत्र को शेव करें, और 75% अल्कोहल और आयोडोफोर स्क्रब के साथ त्वचा को साफ करें।
    2. नेत्र कैंची का उपयोग करके माध्य ग्रीवा रेखा के साथ गर्दन की त्वचा को लंबाई में काटें।
    3. नेत्र चिमटी का उपयोग करके गर्दन की मांसपेशियों को अलग करें, और उन्हें आगे वापस लेने के लिए प्रत्येक तरफ एक रिट्रेक्टर (चरण 1.4) रखें।
      नोट: श्वासनली को पर्याप्त रूप से उजागर करना आवश्यक है, क्योंकि इस चरण के दौरान थायरॉयड ग्रंथि से रक्तस्राव को रोकने के लिए यह महत्वपूर्ण है।
    4. श्वासनली को उजागर करने के बाद, चौथे और पांचवें श्वासनली के छल्ले के बीच की जगह की पहचान करें। यह स्थान पंचर बिंदु है।
    5. सुई की नोक के कुंद किनारे का उपयोग करके इस बिंदु को चिह्नित करें। इस बिंदु पर cricoid उपास्थि के समानांतर एक 3 मिमी चीरा बनाओ।
    6. चीरा (चरण 2.1.5) के माध्यम से श्वासनली में एक सक्शन ट्रॉकर (सामग्री की तालिका देखें) डालें, और 80 सांस / मिनट की दर से सामान्य श्वसन बनाए रखने के लिए चूहे को यांत्रिक रूप से हवादार करें और 8 मिलीलीटर / किग्रा की ज्वारीय मात्रा।
    7. इसके बाद, एक 4-5 सेमी चीरा xiphoid से दूसरे बाएं intercostal अंतरिक्ष के मध्य के लिए एक 4-5 सेमी चीरा बनाने के लिए, जबकि एक 45 ° कोण पर scalpel पकड़. धीरे-धीरे और धीरे-धीरे, इंटरकोस्टल स्पेस तक पहुंचने के लिए नेत्र चिमटी का उपयोग करके पेक्टोरलिस प्रमुख और सेराटस पूर्वकाल की मांसपेशियों को अलग करें।
    8. नेत्र कैंची का उपयोग करके बाएं तीसरे और चौथे पसलियों के बीच अनुप्रस्थ रूप से 1.5 सेमी चीरा बनाएं।
    9. यदि आवश्यक हो, तो बाएं फेफड़े द्वारा कवर किए गए दिल को उजागर करने के लिए चौथी पसली को काट लें। इससे बेहतर विजिबिलिटी मिलती है।
    10. चोटों को रोकने के लिए, वक्ष गुहा में फेफड़ों के ऊपर शारीरिक खारा समाधान में भिगोए गए कपास की गेंदों को रखें। नेत्र चिमटी का उपयोग करके पेरिकार्डियम को विच्छेदित करें, चिमटी द्वारा बाएं अलिंद उपांग को उठाएं, और महाधमनी धमनी की जड़ में मौजूद कोरोनरी ओस्टियम की पहचान करें।
    11. बाएं फेफड़े और ऑरिकल के बीच के अनुभाग में, एलएडी और पूर्व-तैयार छोटी ट्यूब (चरण 1.6) को 6-0 सर्जिकल टांके का उपयोग करके एक साथ लिगेट करें, और इसे स्लिपनॉट का उपयोग करके बांधें। पीवीसी ट्यूब के नाली में slipknot जगह है, और 45 मिनट15 (चित्रा 1A, बी) के लिए एक दूसरे slipknot का उपयोग कर ligated ट्यूब और LAD कस.
    12. ischemia अवधि के दौरान इलेक्ट्रोकार्डियोग्राम (ईसीजी) पर बाएं वेंट्रिकल और एसटी-सेगमेंट ऊंचाई के पूर्वकाल भाग में रंग परिवर्तन रिकॉर्ड करें।
      नोट: बाएं वेंट्रिकल का पूर्वकाल हिस्सा ischemia अवधि के दौरान पीला हो जाता है।
    13. एक धमनी क्लिप का उपयोग करके छाती की मांसपेशियों और त्वचा को क्लैंप करें, और नम खारा धुंध के साथ घाव को कवर करें।
    14. slipknot ढीला, और 45 मिनट15 (चित्रा 1C) के बाद पूर्व तैयार छोटी ट्यूब को हटा दें।
    15. 2 ज के लिए reperfusion के दौरान चूहों anesthetized रखें।
  2. पहले प्रकाशित प्रक्रिया16 के बाद चूहे मॉडल उत्पन्न करने के लिए सर्जरी करें।
    नोट:: इस पशु मॉडल समूह को पूरे आलेख में मौजूदा मॉडल समूह के रूप में संदर्भित किया जाता है।
    1. एलएडी कोरोनरी धमनी के बंधाव से पहले, प्रयोगात्मक मॉडल समूह के समान चरणों का प्रदर्शन करें।
    2. इस्केमिक अवधि के दौरान, प्रत्येक चूहे की समीपस्थ एलएडी कोरोनरी धमनी को एक स्लिपके साथ लिगेट करें, न केवल प्रयोगात्मक मॉडल समूह के समान स्थिति में 6-0 सर्जिकल टांके का उपयोग करके और 45 मिनट के लिए एक स्लिपनॉट बांधें।
    3. बंधाव के बाद, चिमटी के साथ स्लिपनॉट को ढीला करें, एक सीवन सुई और चिमटी के साथ चूहे के चीरों को सीवन करें, और चूहे के दिल की कटाई से पहले 2 घंटे के लिए17,18,19 के reperfusion 17,18,19 की अवधि के दौरान जानवर को 1.5% पेंटोबार्बिटल सोडियम के गहरे संज्ञाहरण में रखें।

3. triphenyltetrazolium क्लोराइड धुंधला का आकलन

  1. reperfusion के अंत में, चूहों euthenized कर रहे हैं, जबकि अभी भी गहराई से anesthetized. चूहों की बलि चढ़ाओ और उनके दिलोंको तुरंत 16,20 काट लें। पीबीएस समाधान में दिल को धोएं, और ऊतकों को कठोर करने के लिए उन्हें ~ 20 मिनट के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. इसके बाद, एक माइक्रोटोम ब्लेड के साथ 2 मिमी स्लाइस में दिल को काटें, उन्हें 2% ट्राइफिनाइलटेट्राज़ोलियम क्लोराइड (टीटीसी) ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ ~ 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, और उन्हें 10% तटस्थ फॉर्मेलिन में ठीक करें।
  3. दिल स्लाइस की तस्वीर, और ImageJ सॉफ्टवेयर के एक छवि प्रसंस्करण कार्यक्रम का उपयोग कर infarct क्षेत्रों की गणना ( सामग्री की तालिका देखें).
    नोट: धुंधला होने के कारण, इंफार्क्ट साइटें पीली सफेद दिखाई देती हैं, जबकि सामान्य ऊतक गहरे लाल दिखाई देते हैं।

4. हिस्टोलॉजिकल धुंधला

  1. reperfusion अवधि के अंत में 1.5% pentobarbital सोडियम के गहरे संज्ञाहरण के तहत दिल फसल.
  2. 48 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 10% फॉर्मेलिन में दिल को ठीक करें।
  3. इसके बाद, कम से कम 6 स्लाइस (5 μm मोटी) में एक माइक्रोटोम के साथ दिल को अनुभाग करें और हेमेटोक्सिलिन और ईोसिन (एच एंड ई) और मैसनस्टेनिंग 20,21 के लिए कम से कम तीन स्लाइस सुनिश्चित करें।
  4. एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत स्लाइड का निरीक्षण करें, और उन्हें तस्वीर.

5. ईसीजी मूल्यांकन

  1. ईसीजी परिवर्तनों का आकलन करने के लिए बेतरतीब ढंग से जानवरों को प्रयोगात्मक या मौजूदा एमआईआरआई मॉडल समूहों या शाम समूहों में विभाजित करें।
  2. सर्जिकल ligations के दौरान सभी चूहों anesthetize और मानक अंग नेतृत्व द्वितीय20,21 ट्रेसिंग का आकलन करने के लिए ईसीजी परिवर्तन की पहचान करने और myocardial ischemia की पुष्टि.
  3. सभी छवियों को डिजिटल लाइब्रेरी में संग्रहीत करें।

6. सांख्यिकीय विश्लेषण

  1. वैज्ञानिक ग्राफिंग और सांख्यिकी सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके सांख्यिकीय विश्लेषण करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  2. माध्य के मानक त्रुटि ± माध्य के रूप में सभी डेटा को व्यक्त करें। प्रत्येक समूह की सामान्यता और लॉगसामान्यता परीक्षणों के बाद, समूहों के बीच महत्वपूर्ण अंतर निर्धारित करने के लिए विचरण और टी-परीक्षण22 का एक-तरफ़ा विश्लेषण करें। पी-मान <0.05 को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण मानते हैं।

Representative Results

TTC धुंधला
चूहों से दिल के वर्गों कि या तो मौजूदा या बेहतर MIRI प्रक्रिया या शाम सर्जरी से गुजरना टीटीसी के साथ दाग दिया गया था, और छवियों को डिजिटल रूप से संग्रहीत किया गया था और ImageJ का उपयोग करके विश्लेषण किया गया था। चूहों कि या तो पहले से ही मौजूदा या बेहतर MIRI प्रक्रियाओं से गुजरना मायोकार्डियल रोधगलन था, जबकि शाम समूह के चूहों (चित्रा 2 बी) नहीं था। शाम समूह में चूहों की तुलना में, मौजूदा (पी < 0.0001) और प्रयोगात्मक (पी < 0.0001) एमआईआरआई मॉडल समूहों में चूहों में मायोकार्डियल इन्फार्क्ट आकार में महत्वपूर्ण अंतर था, और प्रयोगात्मक मॉडल समूह में मौजूदा मॉडल समूह (पी = 0.0176) (चित्रा 3 बी) की तुलना में एक बड़ा मायोकार्डियल इंफार्क्ट आकार था।

हिस्टोलॉजिकल धुंधला
एच एंड ई और मैसन दाग22,23 का उपयोग करके दागे गए नमूनों के विश्लेषण से पता चला है कि शाम समूह की तुलना में, प्रयोगात्मक और मौजूदा मॉडल समूहों दोनों के कार्डियोमायोसाइट्स ने महत्वपूर्ण क्षति और न्यूक्लियोलिसिस का अनुभव किया था और कई न्यूट्रोफिल (चित्रा 3) द्वारा घुसपैठ की गई थी।

ईसीजी परीक्षण
मौजूदा और प्रयोगात्मक MIRI मॉडल समूहों में चूहों के ईसीजी एसटी-टी खंडों को शाम समूह (चित्रा 4 ए) में चूहों की तुलना में ऊंचा किया गया था, और प्रयोगात्मक मॉडल और शाम समूहों (पी < 0.0001) या मौजूदा मॉडल और शाम समूहों (पी < 0.0001) के बीच अंतर महत्वपूर्ण थे (चित्रा 4 बी)। इसके अलावा, एसटी-टी सेगमेंट मौजूदा मॉडल समूह (पी = 0.0274) (चित्रा 4 सी) की तुलना में प्रयोगात्मक मॉडल समूह में अधिक ऊंचा था।

प्रतिशत उत्तरजीविता
जीवित रहने की दर दो MIRI मॉडल समूहों (चित्रा 4 D) के बीच काफी अलग थी। दस चूहों में से चार की मौजूदा मॉडल समूह में मृत्यु हो गई। reperfusion अवधि के दौरान मृत्यु दर 40% थी। इसके विपरीत, प्रयोगात्मक मॉडल समूह में चूहों में से कोई भी सर्जरी के दौरान मर नहीं गया, यह दर्शाता है कि वर्तमान बेहतर मॉडल में उच्च जीवित रहने की दर (पी = 0.0291) थी।

Figure 1
चित्रा 1: मायोकार्डियल इस्केमिक और reperfusion चोट (MIRI) मॉडल सर्जरी के प्रमुख कदम। हरे रंग के बिंदु इस्केमिक अवधि के दौरान लिगेचर के प्रोटोकॉल को इंगित करते हैं, जिसमें कोरोनरी धमनियों (ए) पर नरम ट्यूब रखना, पूर्व-तैयार नरम ट्यूब (बी) के नाली में सीवन लाइन को हुक करना, स्लिपनॉट को ढीला करना, और नरम ट्यूब को हटाना जब रिपरफ्यूजन अवधि शुरू की गई थी (स्केल बार = 1 सेमी) (सी) ). LAA: बाएं अलिंद उपांग, RAA: सही अलिंद उपांग, LAD: बाएं पूर्वकाल अवरोही, आरसीए: सही कोरोनरी धमनी, IVC: अवर वेना कावा, SVC: सुपीरियर वेना कावा, एओ: महाधमनी धमनी, पीए: फुफ्फुसीय धमनी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: पूरी सर्जरी प्रक्रिया और triphenyltetrazolium क्लोराइड (TTC) में अंतर विभिन्न समूहों के बीच धुंधला. पूर्व-तैयार छोटे रिट्रेक्टर (स्केल बार = 15 मिमी), नरम ट्यूब (स्केल बार = 10 मिमी), और पूरी सर्जरी (स्केल बार = 15 मिमी) को दिखाया गया है (ए)। तीस चूहों को बेतरतीब ढंग से प्रयोगात्मक (एन = 10), शाम समूह (एन = 10), और मौजूदा मॉडल (एन = 10) समूहों में विभाजित किया गया था। टीटीसी स्टेनिंग ने संकेत दिया कि प्रयोगात्मक और मौजूदा मॉडल के समूहों दोनों में शाम समूह (बी) की तुलना में महत्वपूर्ण परिवर्तन थे। प्रयोगात्मक में मायोकार्डियम की पूर्वकाल की दीवार और मौजूदा मॉडल समूहों में पार्श्व दीवार पीला सफेद हो गया, इस्केमिक क्षेत्र के स्थान (स्केल बार = 5 मिमी) की पुष्टि करता है। "मौजूदा मॉडल" को आकृति में "पुराने मॉडल" के रूप में दर्शाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: समूहों के बीच एच एंड ई और मैसन स्टेनिंग में अंतर। तीस नर स्प्राग डॉली चूहों को बेतरतीब ढंग से प्रयोगात्मक (एन = 10), शाम समूह (एन = 10), और मौजूदा मॉडल (एन = 10) समूहों में विभाजित किया गया था, और समूहों के बीच सेल रूपात्मक परिवर्तनों की तुलना (स्केल बार = 2 मिमी) दिखाई गई है। Hematoxylin और Eosin (H & E), और Masson धुंधला से पता चलता है कि प्रयोगात्मक मॉडल और मौजूदा मॉडल समूहों की मायोकार्डियल कोशिकाओं में महत्वपूर्ण क्षति, न्यूक्लियोलिसिस है, और शाम समूह (स्केल बार = 100 μm) की तुलना में कई न्यूट्रोफिल द्वारा घुसपैठ की जाती है। "मौजूदा मॉडल" को आकृति में "पुराने मॉडल" के रूप में दर्शाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: समूहों के बीच सांख्यिकीय परिणामों में अंतर। तीस नर स्प्राग डॉली चूहों को बेतरतीब ढंग से प्रयोगात्मक (एन = 10), शाम समूह (एन = 10), और मौजूदा मॉडल (एन = 10) समूहों में विभाजित किया गया था। इलेक्ट्रोकार्डियोग्राम निष्कर्षों से पता चलता है कि पहले से मौजूद मॉडल समूह की तुलना में, प्रयोगात्मक मॉडल समूह में एक बड़ा मायोकार्डियल इन्फार्क्ट आकार है (******* पी < 0.0001, * पी = 0.0176) (ए), एक उच्च एसटी-सेगमेंट ऊंचाई (***** पी < 0.0001, * पी = 0.0274) (बी), और एक उच्च उत्तरजीविता प्रतिशत (पी = 0.0291) (सी ) ). विशेष रूप से, मौजूदा मॉडल समूह के चूहों को इस्केमिया अवधि की शुरुआत में मरने की अधिक संभावना थी और reperfusion अवधि (डी) की शुरुआत में। "मौजूदा मॉडल" को आकृति में "पुराने मॉडल" के रूप में दर्शाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 1: पूर्व-तैयार रिट्रेक्टर और पीवीसी ट्यूब का विवरण। पूर्व-तैयार रिट्रेक्टर (ए) और पीवीसी ट्यूब (बी) दिखाए गए हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Discussion

पहले से मौजूद और बेहतर तरीकों के बीच मुख्य अंतर बंधाव प्रक्रिया में पीवीसी ट्यूबों का उपयोग था। मौजूदा सर्जरी विधि में, मायोकार्डियल ऊतक को केवल 6-0 रेशम टांके का उपयोग करके लिगेट किया गया था, जिसने बंधाव के दौरान मायोकार्डियम को नुकसान पहुंचाया जिसके परिणामस्वरूप इंट्राऑपरेटिव मृत्यु हो गई। इसके अलावा, दिल की स्पंदन स्लिपनॉट को ढीला कर देगी। इसके विपरीत, पीवीसी ट्यूब के साथ बेहतर विधि में, ट्यूब के नाली में रखे गए स्लिपनॉट को कस दिया जा सकता है, और बंधाव से प्रभावित मायोकार्डियम के क्षेत्र में वृद्धि हुई है। इन लाभों को प्रयोगात्मक प्रक्रिया के दौरान देखा गया था और टीटीसी स्टेनिंग और प्रतिशत उत्तरजीविता निष्कर्षों द्वारा पुष्टि की गई थी।

बेहतर सर्जरी विधि का महत्वपूर्ण कदम इस्कीमिक अवधि में बंधाव के दौरान नसों, लसीका वाहिकाओं और मायोकार्डियल ऊतक के साथ समीपस्थ एलएडी कोरोनरी धमनी पर नरम ट्यूब को रख रहा था। यह पूर्व-तैयार नरम ट्यूब एक तकिया के रूप में कार्य कर सकती है जो परिधीय ऊतकों (नसों, मायोकार्डिया और लसीका वाहिकाओं) की रक्षा करती है और कोरोनरी धमनी बंधाव के दौरान मृत्यु दर को कम करती है। पहले से मौजूद विधि द्वारा की गई सर्जरी मायोकार्डियल रोधगलन के लिए सर्जरी के समान थी। प्रतिशत उत्तरजीविता निष्कर्षों ने संकेत दिया कि मौजूदा मॉडल समूह में चूहों की मुख्य रूप से इस्केमिक अवधि के दौरान मृत्यु हो गई (दो चूहों की मृत्यु 2 मिनट के बाद-बंधाव में हुई, और दो चूहों की मृत्यु 45 मिनट के बाद बंधाव में हो गई)। अन्यथा, मृत्यु के अंतर्निहित कारण अभी भी अस्पष्ट हैं, और परिकल्पनाओं की एक श्रृंखला है, जिसमें तंत्रिका संरचनाओं23, लसीका वाहिकाओं और मायोकार्डिया को अतिरिक्त नुकसान शामिल है।

तंत्रिका क्षति के बारे में, पिछले अध्ययनों ने संकेत दिया है कि पशु मॉडल में इस्केमिक अवधि के दौरान, तंत्रिका संरचनाओं पर इस्केमिया के प्रत्यक्ष स्थानीय प्रभावों के अलावा, संभवतः न्यूरोपेप्टाइड वाई (एनपीवाई) के स्तर में भी महत्वपूर्ण कमी आई है जो सहानुभूतिपूर्ण संरक्षण24 में एक्सोप्लाज्मिक परिवहन में गड़बड़ी में योगदान करती है। यह खोज हान एट अल.25 द्वारा रिपोर्ट किए गए परिणामों से सहमत है, जिन्होंने खुलासा किया कि चूहों में एलएडी कोरोनरी धमनी के बंधन के बाद एनपीवाई का क्रमिक गायब होना रोधगलित मायोकार्डियम के भीतर हुआ था। हालांकि, इस संदर्भ में एनपीवाई की भूमिका अस्पष्ट बनी हुई है। इसका विलोपन तीव्र मायोकार्डियल रोधगलन26 के दौरान कार्डियक डिसफंक्शन और एपोप्टोसिस को कम करता है, और अतालता27, उच्च रक्तचाप और कोरोनरी माइक्रोवैस्कुलर फ़ंक्शन28 से जुड़ा हुआ है।

इसके अलावा, इस्केमिक अवधि के दौरान कार्डियक लिम्फ प्रवाह की प्रतिकूल रुकावट हुई, जिससे गंभीर कार्डियक एडिमा, बाएं शिथिलता और रक्तस्राव29 हो सकता है, जो चूहों में मृत्यु का एक और कारण हो सकता है। इस पैथोलॉजिकल प्रक्रिया के दौरान, एलएडी कोरोनरी धमनी के लिगेचर को इंफार्क्ट क्षेत्र के भीतर कोरोनरी धमनियों या कार्डियक लसीका परिवहन की बाधा के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है, जो अतिरिक्त जटिलताओं का कारण बन सकता है, जैसे कि एपिकार्डियल कलेक्टर लसीका के प्रतिकूल रीमॉडलिंग, कम लसीका प्रवाह, और लगातार एडिमा30।

इसलिए, लसीका वाहिकाओं में परिसंचरण कार्डियक होमोस्टेसिस31 और घाव भरने32 में एक कार्यात्मक भूमिका निभाता है, और इस अध्ययन में प्रतिशत उत्तरजीविता निष्कर्ष बताते हैं कि बेहतर एमआईआरआई सर्जिकल प्रक्रिया लसीका क्षति से बच सकती है और लिगेचर के दौरान एलएडी कोरोनरी धमनी पर नरम ट्यूब रखकर लसीका रिपरफ्यूजन को बढ़ावा दे सकती है। इसकी तुलना में, मौजूदा सर्जरी विधि हृदय की मांसपेशियों को फाड़ने की अधिक संभावना है और नरम ट्यूब के कुशनिंग प्रभाव के बिना एलएडी कोरोनरी धमनी के बंधाव के दौरान बड़े पैमाने पर रक्तस्राव का कारण बनती है। इसके अतिरिक्त, पूर्व-तैयार नरम ट्यूब व्यास 6-0 रेशम सिवनी की तुलना में बहुत बड़ा था, और ट्यूब ने इस्केमिक अवधि के दौरान स्लिपनॉट को ट्यूब से बंधे होने पर एक बड़े इंफार्क्ट आकार को अनुबंधित और प्रेरित किया हो सकता है।

इस अध्ययन की कुछ सीमाएं थीं। प्रारंभिक प्रयोग में हृदय के इन्फार्क्ट आकार का विश्लेषण किया गया था। प्रतिस्थापन सूत्र (N = 7.75) की गणना पहले रिपोर्ट किए गए समीकरण33 का उपयोग करके की गई थी। ऑपरेशन के दौरान चूहों की संभावित मौत को ध्यान में रखते हुए, एन को 25% तक बढ़ाया गया था; इसलिए, n = 10 (प्रत्येक समूह के लिए दस चूहे) का निर्णय लिया गया था। अन्यथा, MIRI मॉडल उत्पन्न करने के लिए पहले से मौजूद विधि में उच्च मृत्यु दर थी। इसलिए, प्रयोगात्मक मॉडल समूह में कुछ मामलों (कम नमूना आकार) ने सांख्यिकीय निष्कर्षों को प्रभावित किया। इकोकार्डियोग्राफी30, इवांस ब्लू स्टेनिंग34, और मायोकार्डियल एंजाइम माप35 सहित कई आकलन, कार्डियक फ़ंक्शन मूल्यांकन और विश्लेषण के लिए आवश्यक थे। इस काम के कम नमूना आकार के कारण, इन आकलनों को निष्पादित नहीं किया गया था और एमआईआरआई में फार्माकोडायनेमिक अनुसंधान के भविष्य के अध्ययन में वर्णित किया जाएगा। हालांकि, यह देखते हुए कि MIRI मॉडल उत्पन्न करने के लिए मौजूदा सर्जिकल प्रक्रिया व्यापक मायोकार्डियल क्षति से जुड़ी हुई है, चूहों में MIRI के मॉडलिंग में सुधार करने और इस प्रीक्लिनिकल मॉडल पर प्रकाश लाने के लिए इस वर्तमान विधि की रिपोर्ट करना सार्थक है जो इस्केमिक हृदय रोग को सही ढंग से अनुकरण करता है।

निष्कर्ष में, MIRI मॉडल उत्पन्न करने के लिए बेहतर सर्जरी विधि में एक उच्च उत्तरजीविता दर, एक ऊंचा एसटी-टी सेगमेंट, और मौजूदा MIRI मॉडल पीढ़ी विधि की तुलना में एक बड़ा इन्फार्क्ट आकार था, यह सुझाव देते हुए कि बेहतर मॉडल MIRI पैथोलॉजी का बेहतर अनुकरण करता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को पारंपरिक चीनी चिकित्सा के प्रशासन [SLJ0204], चीनी चिकित्सा के Jiangsu प्रांतीय अस्पताल (Y21017), चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन [81973763, 81973824,82004239] द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% Neutral Formalin Chunyu, China _
2,3,5-Triphenyl-2H-Tetrazolium Chloride Solarbio, China T8107
75% Alchol SCR, China 10009261
Artery Clip Zhonglin Dongsheng, China 6.5cm
Camera Olympus Corporation, Japan EPL5
Cotton ball Huachen, China _
Dpilatory cream Veet, China _
Eye speculum Shanghai Jingzhong, China _
Gauze Zhonggan, China _
GraphPad GraphPad Software, USA 8.0
H&E Kit Solarbio, China G1120
High-pressure steam sterilizer TOMY, Japan SX-500
ImageJ NIH, USA _
Masson Kit Solarbio, China G1340
Medical Tape Mr.Song, China _
Microscope Olympus Corporation, Japan CKX31
Microscopy TEKSQRAY, China _
Microtome Leica, Germany RM2235
Microtome Blade Leica, Germany 819
Needle holder Shanghai Jingzhong, China _
Ophthalmic scissors Shanghai Jingzhong, China _
Ophthalmic tweezers Shanghai Jingzhong, China _
Paper clip Chenguang, China ABS91613
Physiological saline solution Kelun, China _
Powerlab ECG ADINSTRUMENTS ,China 4/35
PVC tube Guanzhijia, China _
Small animal ventilator TECHMAN, China HX-101E
Sodium Pentobarbital SIGEMA, USA 1030001
Suction trocar TECHMAN, China HX-101E
Suture line Lingqiao, China 4-0
Suture needle with thread Shanghai Pudong Jinhua Medical Products Co LTD, China 6-0

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mozaffarian, D., et al. Heart disease and stroke statistics-2016 update: a report from the American heart association. Circulation. 133 (4), 38 (2016).
  2. Allen, D. G., Orchard, C. H. Myocardial contractile function during ischemia and hypoxia. Circulation Research. 60 (2), 153-168 (1987).
  3. Ashraf, M. I., et al. A p38MAPK/MK2 signaling pathway leading to redox stress, cell death and ischemia/reperfusion injury. Cell Communication and Signaling. 12, 6 (2014).
  4. Hernandez-Resendiz, S., et al. The role of redox dysregulation in the inflammatory response to acute myocardial ischaemia-reperfusion injury - adding fuel to the fire. Current Medicinal Chemistry. 25 (11), 1275-1293 (2018).
  5. Heidrich, F., et al. The role of phospho-adenosine monophosphate-activated protein kinase and vascular endothelial growth factor in a model of chronic heart failure. Artificial Organs. 34 (11), 969-979 (2010).
  6. Shen, Y., Liu, X., Shi, J., Wu, X. Involvement of Nrf2 in myocardial ischemia and reperfusion injury. International Journal of Biological Macromolecules. 125, 496-502 (2019).
  7. Hinkel, R., et al. AntimiR-21 prevents myocardial dysfunction in a pig model of ischemia/reperfusion injury. Journal of the American College of Cardiology. 75 (15), 1788-1800 (2020).
  8. Torrado, J., et al. Sacubitril/Valsartan averts adverse post-infarction ventricular remodeling and preserves systolic function in rabbits. Journal of the American College of Cardiology. 72 (19), 2342-2356 (2018).
  9. Guan, L., et al. MCU Up-regulation contributes to myocardial ischemia-reperfusion Injury through calpain/OPA-1-mediated mitochondrial fusion/mitophagy Inhibition. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (11), 7830-7843 (2019).
  10. Fan, Q., et al. Dectin-1 contributes to myocardial ischemia/reperfusion injury by regulating macrophage polarization and neutrophil infiltration. Circulation. 139 (5), 663-678 (2019).
  11. Huang, C., et al. Effect of myocardial ischemic preconditioning on ischemia-reperfusion stimulation-induced activation in rat thoracic spinal cord with functional MRI. International Journal of Cardiology. 285, 59-64 (2019).
  12. Li, D., et al. Cardioprotection of CAPE-oNO2 against myocardial ischemia/reperfusion induced ROS generation via regulating the SIRT1/eNOS/NF-κB pathway in vivo and in vitro. Redox Biology. 15, 62-73 (2018).
  13. Cui, Y., Wang, Y., Liu, G. Protective effect of Barbaloin in a rat model of myocardial ischemia reperfusion injury through the regulation of the CNPY2PERK pathway. International Journal of Molecular Medicine. 43 (5), 2015-2023 (2019).
  14. Lin, M. W., et al. Prolonged preoperative fasting induces postoperative insulin resistance by ER-stress mediated Glut4 down-regulation in skeletal muscles. Int J Med Sci. 11 (5), 1189-1197 (2021).
  15. Wu, J., et al. Sevoflurane alleviates myocardial ischemia reperfusion injury by inhibiting P2X7-NLRP3 mediated pyroptosis. Frontiers in Molecular Biosciences. 26 (8), 768594 (2021).
  16. Wu, Y., Yin, X., Wijaya, C., Huang, M. H., McConnell, B. K. Acute myocardial infarction in rats. Journal of Visualized Experiments. (48), e2464 (2011).
  17. Zhang, C. X., et al. Mitochondria-targeted cyclosporin: A delivery system to treat myocardial ischemia reperfusion injury of rats. Journal of Nanobiotechnology. 17 (1), 18 (2019).
  18. Liu, X. M., et al. Long non-coding RNA MALAT1 modulates myocardial ischemia-reperfusion injury through the PI3K/Akt/eNOS pathway by sponging miRNA-133a-3p to target IGF1R expression. European Journal of Pharmacology. 916, 174719 (2022).
  19. Li, L., et al. Ginsenoside Rg3-loaded, reactive oxygen species-responsive polymeric nanoparticles for alleviating myocardial ischemia-reperfusion injury. Journal of Controlled Release. 317, 259-272 (2020).
  20. Mickelson, J. K., et al. Streptokinase improves reperfusion blood flow after coronary artery occlusion. International Journal of Cardiology. 23 (3), 373-384 (1989).
  21. Verscheure, Y., Pouget, G., De Courtois, F., Le Grand, B., John, G. W. Attenuation by R 56865, a novel cytoprotective drug, of regional myocardial ischemia- and reperfusion-induced electrocardiographic disturbances in anesthetized rabbits. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 25 (1), 126-133 (1995).
  22. Fan, M. L., et al. Animal model of coronary microembolization under transthoracic echocardiographic guidance in rats. Biochemical and Biophysical Research Communications. 568 (3), 174-179 (2021).
  23. Lim, M., et al. Intravenous injection of allogeneic umbilical cord-derived multipotent mesenchymal stromal cells reduces the infarct area and ameliorates cardiac function in a porcine model of acute myocardial infarction. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 129 (2018).
  24. Trautner, H., et al. Heart innervation after ligation of the left anterior descending coronary artery (LAD). Histochemistry. 92 (2), 103-108 (1989).
  25. Han, C., Wang, X. A., Fiscus, R. R., Gu, J., McDonald, J. K. Changes in cardiac neuropeptide Y after experimental myocardial infarction in rat. Neuroscience Letters. 104 (1-2), 141-146 (1989).
  26. Huang, W., et al. Deletion of neuropeptide Y attenuates cardiac dysfunction and apoptosis during acute myocardial infarction. Frontiers in Pharmacology. 10, 1268 (2019).
  27. Kalla, M., et al. The cardiac sympathetic co-transmitter neuropeptide Y is pro-arrhythmic following ST-elevation myocardial infarction despite beta-blockade. European Heart Journal. 41 (23), 2168-2179 (2020).
  28. Cuculi, F., et al. Relationship of plasma neuropeptide Y with angiographic, electrocardiographic and coronary physiology indices of reperfusion during ST elevation myocardial infarction. Heart (British Cardiac Society). 99 (16), 1198-1203 (2013).
  29. Vuorio, T., Tirronen, A., Ylä-Herttuala, S. Cardiac Lymphatics - a new avenue for therapeutics. Trends in Endocrinology and Metabolism: TEM. 28 (4), 285-296 (2017).
  30. Henri, O., et al. Selective stimulation of cardiac lymphangiogenesis reduces myocardial edema and fibrosis leading to improved cardiac function following myocardial infarction. Circulation. 133 (15), 1484-1497 (2016).
  31. Oliver, G., Kipnis, J., Randolph, G. J., Harvey, N. L. The lymphatic vasculature in the 21st century: novel functional roles in homeostasis and disease. Cell. 182 (2), 270-296 (2020).
  32. Klotz, L., et al. Cardiac lymphatics are heterogeneous in origin and respond to injury. Nature. 522 (7554), 62-67 (2015).
  33. Percie du Sert, N., et al. Reporting animal research: Explanation and elaboration for the ARRIVE guidelines 2.0. PLoS Biology. 18 (7), 3000411 (2020).
  34. Miller, D. L., Li, P., Dou, C., Armstrong, W. F., Gordon, D. Evans blue staining of cardiomyocytes induced by myocardial contrast echocardiography in rats: evidence for necrosis instead of apoptosis. Ultrasound in Medicine & Biology. 33 (12), 1988-1996 (2007).
  35. Deng, C., et al. α-Lipoic acid reduces infarct size and preserves cardiac function in rat myocardial ischemia/reperfusion injury through activation of PI3K/Akt/Nrf2 pathway. PLoS ONE. 8 (3), 58371 (2013).

Tags

चिकित्सा अंक 181

Erratum

Formal Correction: Erratum: Improved Rodent Model of Myocardial Ischemia and Reperfusion Injury
Posted by JoVE Editors on 07/27/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Improved Rodent Model of Myocardial Ischemia and Reperfusion Injury. The Authors section was updated.

The Authors section was updated from:

Hua-Qin Tong*1
Man-Lu Fan*1
Tong Sun1
Hao-Wen Zhang2
Jie Han3
Meng-Xi Wang1
Jian-Dong Chen3
Wei-Xin Sun4
Xiao-Hu Chen3
Mian-Hua Wu5
1First College of Clinical Medicine, Biological Technology Center for Innovation in Chinese Medicine, Nanjing University of Chinese Medicine
2School of Health Preservation and Rehabilitation, Key Laboratory of Acupuncture and Medicine Research of Ministry of Education
3Department of Cardiology, Jiangsu Provincial Hospital of Chinese Medicine
4Department of Cardiology, Yancheng TCM Hospital Affiliated to Nanjing University of Chinese Medicine
5Jiangsu Collaborative Innovation Center of Traditional Chinese Medicine (TCM) Prevention and Treatment of Tumor, Nanjing University of Chinese Medicine
* These authors contributed equally

to:

Hua-Qin Tong*1,2,3
Man-Lu Fan*3
Tong Sun3
Hao-Wen Zhang4
Jie Han5
Meng-Xi Wang3
Jian-Dong Chen5
Wei-Xin Sun6
Xiao-Hu Chen1,2
Mian-Hua Wu7
1Department of Cardiology, Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine
2Department of Cardiology, Jiangsu Province Hospital of Chinese Medicine
3First College of Clinical Medicine, Biological Technology Center for Innovation in Chinese Medicine, Nanjing University of Chinese Medicine
4School of Health Preservation and Rehabilitation, Key Laboratory of Acupuncture and Medicine Research of Ministry of Education
5Department of Cardiology, Jiangsu Provincial Hospital of Chinese Medicine
6Department of Cardiology, Yancheng TCM Hospital Affiliated to Nanjing University of Chinese Medicine
7Jiangsu Collaborative Innovation Center of Traditional Chinese Medicine (TCM) Prevention and Treatment of Tumor, Nanjing University of Chinese Medicine
* These authors contributed equally

मायोकार्डियल Ischemia और Reperfusion चोट के बेहतर कृंतक मॉडल
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tong, H. Q., Fan, M. L., Sun, T.,… More

Tong, H. Q., Fan, M. L., Sun, T., Zhang, H. W., Han, J., Wang, M. X., Chen, J. D., Sun, W. X., Chen, X. H., Wu, M. H. Improved Rodent Model of Myocardial Ischemia and Reperfusion Injury. J. Vis. Exp. (181), e63510, doi:10.3791/63510 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter