Summary
Este artículo detalla cómo realizar una miografía de impedancia eléctrica in vivo (usando matrices de electrodos de superficie y aguja) y ex vivo (usando una celda dieléctrica) en el músculo gastrocnemio de roedores. Demostrará la técnica tanto en ratones como en ratas y detallará las modificaciones disponibles (es decir, animales obesos, cachorros).
Abstract
La miografía de impedancia eléctrica (EIM) es una técnica conveniente que se puede utilizar en estudios preclínicos y clínicos para evaluar la salud y la enfermedad del tejido muscular. EIM se obtiene aplicando una corriente eléctrica de baja intensidad, enfocada direccionalmente, a un músculo de interés en un rango de frecuencias (es decir, de 1 kHz a 10 MHz) y registrando los voltajes resultantes. A partir de estos, se obtienen varios componentes de impedancia estándar, incluyendo la reactancia, la resistencia y la fase. Al realizar mediciones ex vivo en el músculo extirpado, también se pueden calcular las propiedades eléctricas pasivas inherentes del tejido, a saber, la conductividad y la permitividad relativa. EIM se ha utilizado ampliamente en animales y humanos para diagnosticar y rastrear alteraciones musculares en una variedad de enfermedades, en relación con la atrofia simple por desuso, o como una medida de intervención terapéutica. Clínicamente, EIM ofrece el potencial de rastrear la progresión de la enfermedad a lo largo del tiempo y evaluar el impacto de las intervenciones terapéuticas, ofreciendo así la oportunidad de acortar la duración del ensayo clínico y reducir los requisitos de tamaño de la muestra. Debido a que se puede realizar de forma no invasiva o mínimamente invasiva en modelos animales vivos, así como en humanos, EIM ofrece el potencial de servir como una nueva herramienta traslacional que permite el desarrollo preclínico y clínico. Este artículo proporciona instrucciones paso a paso sobre cómo realizar mediciones de EIM in vivo y ex vivo en ratones y ratas, incluidos enfoques para adaptar las técnicas a condiciones específicas, como para su uso en cachorros o animales obesos.
Introduction
La miografía de impedancia eléctrica (EIM) proporciona un método poderoso para evaluar la condición muscular, lo que potencialmente permite el diagnóstico de trastornos neuromusculares, el seguimiento de la progresión de la enfermedad y la evaluación de la respuesta a la terapia 1,2,3. Se puede aplicar de manera análoga a modelos de enfermedades animales y humanos, lo que permite una traducción relativamente fluida de estudios preclínicos a clínicos. Las mediciones de EIM se obtienen fácilmente utilizando cuatro electrodos colocados linealmente, con los dos externos aplicando una corriente eléctrica débil e indolora en un rango de frecuencias (generalmente entre 1 kHz y aproximadamente 2 MHz), y los dos internos registrando los voltajes resultantes1. A partir de estos voltajes, se pueden obtener las características de impedancia del tejido, incluida la resistencia (R), una medida de cuán difícil es que la corriente pase a través del tejido, y la reactancia (X) o "cargabilidad" del tejido, una medida relacionada con la capacidad del tejido para almacenar carga (capacitancia). A partir de la reactancia y la resistencia, el ángulo de fase (θ) se calcula mediante la siguiente ecuación: 
, proporcionando una única medida de impedancia sumativa. Dichas mediciones se pueden obtener utilizando cualquier dispositivo de bioimpedancia multifrecuencia. Como las miofibras son esencialmente cilindros largos, el tejido muscular también es altamente anisótropo, con corriente que fluye más fácilmente a lo largo de las fibras que a través de ellas 4,5. Por lo tanto, EIM a menudo se realiza en dos direcciones: con la matriz colocada a lo largo de las fibras de tal manera que la corriente corre paralela a ellas, y a través del músculo de tal manera que la corriente fluye perpendicular a ellas. Además, en las mediciones ex vivo, donde se mide un volumen conocido de tejido en una celda de medición de impedancia, se pueden derivar las propiedades eléctricas inherentes del músculo (es decir, la conductividad y la permitividad relativa)6.
El término "trastornos neuromusculares" define una amplia gama de enfermedades primarias y secundarias que conducen a la alteración y disfunción muscular estructural. Esto incluye la esclerosis lateral amiotrófica y varias formas de distrofia muscular, así como cambios más simples relacionados con el envejecimiento (por ejemplo, sarcopenia), atrofia por desuso (por ejemplo, debido a reposo prolongado en cama o microgravedad) o incluso lesiones7. Si bien las causas son abundantes y pueden originarse en la neurona motora, los nervios, las uniones neuromusculares o el músculo en sí, EIM se puede usar para detectar alteraciones tempranas en el músculo debido a muchos de estos procesos y para rastrear la progresión o la respuesta a la terapia. Por ejemplo, en pacientes con distrofia muscular de Duchenne (DMD), EIM ha demostrado detectar la progresión de la enfermedad y la respuesta a los corticosteroides8. Trabajos recientes también han demostrado que EIM es sensible a diferentes estados de desuso, incluida la gravedad fraccional9, como se experimentaría en la Luna o Marte, y los efectos del envejecimiento10,11. Finalmente, mediante la aplicación de algoritmos predictivos y de aprendizaje automático al conjunto de datos obtenidos con cada medición (datos multifrecuencia y dependientes direccionalmente), es posible inferir aspectos histológicos del tejido, incluyendo el tamaño de la miofibra 12,13, los cambios inflamatorios y edema 14, y el tejido conectivo y el contenido de grasa 15,16.
Varios otros métodos no invasivos o mínimamente invasivos también se utilizan para evaluar la salud muscular en humanos y animales, incluyendo la electromiografía con aguja17 y tecnologías de imagen como la resonancia magnética, la tomografía computarizada y el ultrasonido18,19. Sin embargo, EIM demuestra beneficios distintos en comparación con estas tecnologías. Por ejemplo, la electromiografía registra solo las propiedades eléctricas activas de las membranas de miofibras y no las propiedades pasivas, y por lo tanto no puede proporcionar una verdadera evaluación de la composición o estructura muscular. En cierto sentido, los métodos de imagen están más estrechamente relacionados con EIM, ya que también proporcionan información sobre la estructura y composición del tejido. Pero, en cierto sentido, proporcionan demasiados datos, lo que requiere una segmentación detallada de la imagen y un análisis experto en lugar de simplemente proporcionar una salida cuantitativa. Además, dadas sus complejidades, las técnicas de imagen también se ven muy afectadas por las características específicas tanto del hardware como del software que se utilizan, lo que idealmente requiere el uso de sistemas idénticos para que se puedan comparar los conjuntos de datos. Por el contrario, el hecho de que EIM sea mucho más simple significa que se ve menos afectado por estos problemas técnicos y no requiere ninguna forma de procesamiento de imágenes o análisis experto.
El siguiente protocolo demuestra cómo realizar EIM in vivo en ratas y ratones, utilizando técnicas no invasivas (matriz de superficie) y mínimamente invasivas (matriz de agujas subdérmicas), así como EIM ex vivo en músculo recién extirpado.
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Protocol
Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Centro Médico Beth Israel Deaconess bajo los números de protocolo (031-2019; 025-2019). Use el equipo de EPP adecuado para manejar animales y cumpla con las pautas de IACUC para todo el trabajo con animales.
1. EIM superficial in vivo
- Coloque al animal en una caja de anestesia para inducir la anestesia.
NOTA: Para ratas, se utilizó isoflurano 1.5% -3.5% y 2 O 2 L·min-1, y para ratones, isoflurano al 2% y 1 O2 L·min-1. - Una vez completamente anestesiado, como indica la ausencia de respuesta tras pellizcar el pie del animal, colocar el ratón en el banco en decúbito prono y utilizar el cono nasal para mantener la anestesia utilizando isoflurano al 1,5% y un flujo de oxígeno de 1 L·min-1.
- Coloque la pata del animal a analizar en un ángulo de 45° con la articulación de la cadera (rodilla extendida) y asegure el pie con cinta médica.
- Use un cortapelos para recortar el pelaje que se superpone al músculo gastrocnemio.
- Aplique una capa gruesa de crema depilatoria sobre la piel del animal y déjelo reposar durante 1 minuto. Luego, use una gasa saturada de solución salina para eliminar el agente depilatorio. Repita este proceso hasta tres veces hasta que se elimine todo el pelaje que recubre el músculo gastrocnemio.
NOTA: Coloque una gasa empapada en solución salina sobre la piel cuando no se adquieran mediciones para prevenir la deshidratación de la piel. - Conecte la matriz de superficie (Figura 1) al dispositivo EIM y deje que los electrodos descansen sobre un trozo de gasa empapado en solución salina.
- Coloque la matriz superficial directamente sobre la piel sobre el músculo gastrocnemio, orientada longitudinalmente a las fibras musculares.
- Después de verificar el contacto apropiado, que se indica con todas las barras que aparecen en verde en el software que muestran la estabilidad de los valores de resistencia, reactancia y fase de 50 kHz, adquiera las mediciones EIM.
NOTA: Las curvas deben verificarse en tiempo real para garantizar la adquisición adecuada de datos. - Gire la matriz de superficie 90° y vuelva a colocarla sobre la piel sobre el gastrocnemio para obtener las medidas transversales (compruebe si hay barras verdes que indiquen la estabilidad).
- Repita los pasos 1.7, 1.8 y 1.9 para obtener un total de cuatro mediciones por músculo: dos longitudinales y dos transversales.
NOTA: No use un agente depilatorio más de una vez (es decir, hasta tres aplicaciones en el mismo caso) cada dos semanas para prevenir la irritación excesiva de la piel y lesiones. Es importante realizar las mediciones dentro de los 5-10 minutos posteriores a la retirada de la crema depilatoria, ya que el desarrollo de edema cutáneo localizado inducido por el agente depilatorio puede afectar los datos de impedancia recogidos. La recuperación del animal es inmediata después de suspender la anestesia con isoflurano y el procedimiento no requiere tratamiento analgésico.
2. Matriz de agujas in vivo EIM
- Anestesiar al animal y preparar la pata utilizando el mismo procedimiento descrito en los pasos 1.1-1.4. Sin embargo, no es necesario utilizar un agente depilatorio cuando se realiza EIM in vivo utilizando una matriz de agujas.
- Conecte la matriz de agujas (Figura 2A-F) al dispositivo EIM y déjela reposar en un bote de pesaje que contenga solución salina. Compruebe la conectividad y la estabilidad de la señal (indicada por barras verdes).
- Desinfecte la piel y las agujas con alcohol. Coloque la matriz de agujas en una posición longitudinal en comparación con las miofibras y presiónela firmemente en la piel hasta que todas las agujas penetren en la piel y el músculo subyacente hasta el protector de plástico en la matriz. Adquirir datos.
- Retire suavemente la matriz y vuelva a insertarla a través de la piel y en el músculo en un ángulo de 90 ° con respecto a la primera medición, en la dirección transversal. Adquirir datos.
NOTA: Cuando se utilizan matrices de agujas, las mediciones solo deben adquirirse una vez en cada dirección para reducir el impacto de los electrodos de aguja en la piel y el tejido muscular. Si se produce sangrado, limpie suavemente la sangre antes de realizar la segunda medición. La recuperación del animal es inmediata después de suspender la anestesia con isoflurano y el procedimiento no requiere tratamiento analgésico.
3. EIM ex vivo
- Prepare la celda dieléctrica ex vivo (Figura 2G, H), agregue solución salina a la cámara y conecte la celda al dispositivo EIM para obtener los valores de referencia.
NOTA: Los valores de fase y reactancia de la solución salina deben permanecer constantes en o cerca de cero y los valores de resistencia de la solución salina deben permanecer constantes en aproximadamente 100 ± 25 Ω en el rango de frecuencias de 1 kHz a 1 MHz. - Eutanasia del animal de acuerdo con las respectivas directrices de IACUC.
- Con un par de tijeras, corte la piel cerca del tendón de Aquiles. Usando pinzas, tire de la piel en un movimiento hacia arriba para revelar los músculos subyacentes y la fascia. Diseccionar suavemente el bíceps femoral que se superpone al músculo gastrocnemio y seccionar el nervio ciático.
- Corte el tendón de Aquiles para liberar el extremo distal de los músculos gastrocnemio y sóleo y tire suavemente del tendón hacia arriba mientras usa tijeras para quitar cualquier accesorio. Una vez que se retiren todos los accesorios, use tijeras para cortar el extremo rostral del músculo sóleo y retirarlo.
- Use tijeras para diseccionar las cabezas del músculo gastrocnemio alrededor de la rótula.
NOTA: Después de la extirpación del músculo gastrocnemio, es importante recordar la orientación original de las miofibras. - Coloque el músculo gastrocnemio en una lámina de cera dental y seccionarlo con una cuchilla de afeitar y una regla para obtener una sección de 10 mm x 10 mm desde el centro del músculo gastrocnemio.
NOTA: El tamaño de la celda dieléctrica se puede personalizar. Para ratas, se utilizó una celda de 10 mm x 10 mm y para ratones, se utilizó una celda de 5 mm x 5 mm. - Usando pinzas, coloque suavemente el gastrocnemio en las células dieléctricas, asegurándose de que las fibras estén orientadas longitudinalmente (es decir, las extremidades caudales y rostrales deben tocar los electrodos). Asegúrese de que el músculo esté completamente en contacto con los electrodos metálicos.
- Acople la parte superior de la celda dieléctrica e inserte dos agujas monopolares (26 G) en los dos orificios. Conecte los cables del dispositivo EIM a la celda ex vivo en el siguiente orden: (1: I +, 2: V +, 3: V-, 4: I-, donde I representa los electrodos de corriente y V representa los electrodos de voltaje). Adquirir la medida longitudinal.
- Abra la celda dieléctrica y reoriente el músculo en la dirección transversal girándolo 90 °. Vuelva a conectar la parte superior de la celda dieléctrica. Adquirir la medida transversal.
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Representative Results
EIM se puede obtener en muchas condiciones, incluyendo matrices de superficie in vivo (Figura 1), matrices de aguja in vivo (Figura 2A-F) y células dieléctricas ex vivo (Figura 2G, H).
EIM proporciona una instantánea casi instantánea de la condición muscular basada en los valores de impedancia medidos. Las mediciones se adquieren rápidamente y dan como resultado un archivo de datos de salida simple que no requiere ningún software especial (Figura 3A). De hecho, cualquier dispositivo de impedancia multifrecuencia que proporcione datos para frecuencias individuales podrá producir una salida .csv estándar que se puede abrir de forma independiente. El sistema descrito en este protocolo también proporciona el nombre y las condiciones del experimento, con valores de fase, reactancia y resistencia para cada ensayo en cada frecuencia medida, dentro del archivo de salida. Para garantizar la reproducibilidad, generalmente se obtienen y promedian dos ensayos de valores longitudinales (ensayos 1 y 3) y transversales (ensayos 2 y 4), y se utilizan para todos los análisis posteriores.
Cuando se muestran en función de la frecuencia, los valores de EIM dan como resultado curvas estándar que se pueden analizar para detectar datos falsos o contaminados con artefactos. Tales irregularidades generalmente están relacionadas con problemas de contacto en las mediciones de superficie, lo que resulta en valores extremos observados a bajas frecuencias (típicamente grandes valores positivos o negativos). Se muestran curvas representativas para las mediciones de fase (Figura 3B), reactancia (Figura 3C) y resistencia (Figura 3D) para mediciones longitudinales (círculos azules) y transversales (cuadrados grises). También se muestra un gráfico que muestra la reactancia en función de la resistencia (diagrama de Cole-Cole) tanto en dirección longitudinal como transversal (Figura 3E). Este paso es crítico ya que es parte de la verificación de datos, lo que permite la detección directa de datos espurios o contaminados con artefactos. Si se detecta un artefacto excesivo (generalmente debido a un contacto deficiente entre la matriz superficial y la piel), se pueden seguir varios procedimientos para mejorar el contacto. Estos incluyen aplicar una aplicación adicional de crema depilatoria, humedecer la piel durante aproximadamente 1 minuto con una gasa empapada en solución salina o aplicar una presión suave a la matriz de electrodos. En general, el simple proceso de repetir la medición varias veces también ayudará a resolver esto.
Las mediciones de EIM reflejan la respuesta del tejido muscular a la corriente eléctrica en una amplia gama de frecuencias, cada una dirigida a diferentes estructuras. Por ejemplo, las bajas frecuencias (es decir, 5 kHz) no penetran en la membrana de miofibra, proporcionando así un análisis de las características extracelulares que pueden ser utilizadas para detectar inflamación e infiltración de neutrófilos14. Por el contrario, las altas frecuencias (>1 MHz) pueden penetrar las membranas celulares y, por lo tanto, interrogar tanto los espacios intracelulares como los extracelulares y se han utilizado para diferenciar la fibra muscular tipo1.
Figura 1: Matriz de superficies impresas en 3D. Fotografías de una matriz de superficie que se imprimió en 3D para obtener mediciones de impedancia superficial (tanto longitudinal como transversal) en ratones in vivo. (A) Una fotografía que muestre la matriz de superficie conectada al dispositivo de adquisición. (B) Un primer plano de la matriz de superficie que muestra la rueda utilizada para girar la matriz a 90 ° para obtener mediciones longitudinales y transversales. (C) Un primer plano de los electrodos de superficie. Los electrodos de superficie tienen las siguientes características: ancho de los electrodos = 0,5 mm, longitud de los electrodos exteriores = 4 mm, longitud de los electrodos internos = 3 mm y espacio entre electrodos = 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Otras matrices que se pueden usar para acomodar diseños experimentales específicos. Fotografías de: (A) un arreglo de agujas utilizado para ratas y recubierto (utilizando laca de uñas no metálica) para disminuir la contribución de grasa subcutánea (espacio de 2 mm, 4 mm de profundidad, recubrimiento de 2 mm); (B) una matriz de agujas con una separación de 2 mm y una profundidad de 4 mm; (C) una matriz de agujas con una separación de 2 mm y una profundidad de 3 mm; (D) una matriz de agujas con una separación de 2 mm y una profundidad de 2 mm; E) un conjunto de agujas para animales más pequeños y crías con una separación de 1 mm y una profundidad de 2 mm; (F) una matriz de agujas con una separación de 1 mm y una profundidad de 1 mm; (G) una célula dieléctrica ex vivo adaptada a los músculos de ratón adulto (5 mm x 5 mm); y (H) una célula dieléctrica ex vivo adaptada a los músculos de rata (10 mm x 10 mm). Las modificaciones (resultados no presentados aquí) para adquirir mediciones en animales obesos (es decir, ratones ob / ob o db / db) se pueden realizar aumentando la longitud de la aguja, agregando recubrimiento no conductor y aumentando / disminuyendo el espaciado de la aguja. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Salida de datos y curvas representativas obtenidas en ratones con EIM de superficie in vivo en las direcciones longitudinal (azul) y transversal (gris). (A) Archivo de salida en .csv formato obtenido tras la adquisición de dos mediciones de EIM longitudinales (medidas 1 y 3, coloreadas en azul) y dos transversales (medidas 2 y 4, coloreadas en gris) in vivo . Los valores se indican para cada frecuencia (columna A). Los análisis se realizan posteriormente utilizando el valor promedio de las mediciones longitudinales y transversales, respectivamente. La información que se encuentra en las celdas A1:B4 es rellenada automáticamente por el software, de acuerdo con las etiquetas elegidas durante la adquisición de EIM. Curvas representativas para valores longitudinales (círculos azules) y transversales (cuadrados grises) de fase (B), reactancia (C) y resistencia (D) en función de la frecuencia. De acuerdo con las prácticas estándar en el campo de impedancia, el eje x se indica utilizando una escala logarítmica. (E) Curvas representativas de reactancia en función de la resistencia para mediciones longitudinales y transversales. LP: fase longitudinal; TP: fase transversal; LX: reactancia longitudinal; TX: reactancia transversal; LR: resistencia longitudinal; y TR: resistencia transversal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este artículo proporciona los métodos básicos para realizar EIM en roedores, tanto in vivo como ex vivo. Para adquirir mediciones confiables, es fundamental realizar una serie de pasos. Primero, uno necesita identificar adecuadamente el músculo de interés, ya que cada músculo tendrá diferentes respuestas a enfermedades, tratamiento y patología. Uno debe ser consciente de que los datos adquiridos en un músculo (por ejemplo, gastrocnemio) no proporcionarán la misma información que en otro músculo (por ejemplo, tibial anterior). En segundo lugar, uno necesita elegir cuidadosamente la mejor matriz de electrodos para realizar las mediciones de impedancia. Si bien cada tipo de matriz tiene ventajas y desventajas, es importante elegir una matriz que se ajuste al diseño experimental teniendo en cuenta la progresión de la enfermedad y el efecto sobre la anatomía (por ejemplo, atrofia severa). Por último, EIM permite a los investigadores recopilar una cantidad increíble de datos en pocos segundos, pero el control de calidad debe realizarse correctamente para garantizar la ausencia de artefactos.
El sistema EIM es altamente personalizable en varios niveles. Si bien el sistema utilizado aquí ha sido diseñado para la recopilación de datos clínicos y preclínicos, cualquier sistema de medición de impedancia multifrecuencia se puede utilizar para este propósito, siempre que proporcione datos de frecuencia individuales. Generalmente, los sistemas de impedancia proporcionan un archivo .csv estándar como salida. Del mismo modo, se pueden hacer modificaciones adicionales con respecto a las matrices, ya que todo lo que realmente se requiere son cuatro electrodos colocados en una línea. Por ejemplo, en este protocolo, se han utilizado una variedad de electrodos hechos a medida para cumplir con los requisitos, pero las matrices se pueden adaptar a las necesidades individuales utilizando herramientas simples (por ejemplo, pegamento epoxi, agujas subdérmicas) o complejas (por ejemplo, impresoras 3D). Alternativamente, los cuatro electrodos se pueden combinar en una sola aguja, como se describió anteriormente20. En nuestro laboratorio, se han desarrollado matrices para cachorros disminuyendo el espacio entre los electrodos para garantizar que los músculos pequeños puedan medirse tanto en dirección longitudinal como transversal. Cuando se trabaja con animales obesos, que tienen una capa significativamente mayor de grasa subcutánea, se recomienda el uso de electrodos de aguja parcialmente recubiertos. Esto permite una mayor contribución del tejido muscular a la medición de la impedancia, disminuyendo la contribución del tejido adiposo21.
Si bien los métodos de aguja y los métodos de superficie se pueden usar tanto en ratas como en ratones, como se describe y demuestra, generalmente se recomienda usar las mediciones de aguja en ratas, ya que son más rápidas ya que no requieren esfuerzo para preparar la piel. Además, su mayor tamaño significa que los electrodos de la aguja solo lesionan mínimamente el músculo. En ratones, dado su pequeño tamaño, se recomiendan mediciones superficiales para evitar lesiones musculares y dado que la preparación de la piel es relativamente simple y rápida.
Cada técnica EIM viene con su propio conjunto de limitaciones. Una limitación clave es que las matrices de electrodos no están fácilmente disponibles a través de los proveedores y, en cambio, requieren una generación personalizada en el laboratorio. Para ayudar a los nuevos investigadores, este protocolo incluye mediciones para varias matrices (tanto hechas a mano como impresas en 3D), y los autores proporcionarán matrices personalizadas o pondrán a disposición los archivos CAD relacionados a pedido. Como se mencionó anteriormente, la calidad de los datos es crítica y los problemas adicionales pueden interferir con la calidad de los datos para cada uno de los tipos de medición (por ejemplo, superficie, aguja y ex vivo). Para obtener buenos datos de superficie, es necesario eliminar el vello por completo, y probablemente también el estrato córneo de la piel, para obtener los mejores resultados con un artefacto de contacto mínimo. Sin embargo, el uso del agente depilatorio también significa que la piel se volverá edematosa lentamente con el tiempo, por lo que es necesario completar rápidamente las mediciones de impedancia después de la depilación. Esperar 10 minutos o más puede producir valores significativamente diferentes en comparación con la realización de las mediciones dentro de un minuto o dos de la depilación. Las mediciones de la matriz de agujas en ratas o ratones generalmente inducirán al menos una pequeña cantidad de sangrado, lo que podría afectar las lecturas si se convierte en un hematoma más grande alrededor de las agujas insertadas. Finalmente, las mediciones ex vivo requieren un cuidado especial para garantizar que las fibras musculares dentro de la celda dieléctrica estén alineadas con precisión con respecto a las placas metálicas. Finalmente, en ratones pequeños o enfermos, puede ser imposible obtener mediciones transversales, dado el pequeño tamaño de los músculos. Pero, como se señaló anteriormente, sigue siendo posible diseñar matrices personalizadas de 4 electrodos que podrían ser lo suficientemente pequeñas como para tomar mediciones longitudinales incluso dentro de los músculos más pequeños.
El análisis de datos puede mantenerse bastante simple, por ejemplo, midiendo una sola salida (por ejemplo, fase) a una sola frecuencia (por ejemplo, 50 kHz) en una sola dirección (por ejemplo, longitudinal), o bastante complejo, incorporando todos los parámetros de impedancia en todo el espectro de frecuencias en direcciones longitudinales y transversales. Cuando se utilizan valores de impedancia de frecuencia única, suelen estar en el rango de 30-100 kHz, ya que el músculo tiende a ser más reactivo (es decir, es más "cargable") en este rango de frecuencia. Sin embargo, también se han utilizado parámetros condensados o colapsados, que intentan capturar la forma del espectro de frecuencias. Estos valores han incluido pendientes de ajustes lineales de los datos de resistencia, reactancia y fase22 y relaciones de frecuencia23. Alternativamente, los parámetros de Cole-Cole se pueden calcular a partir de ajustes de los datos de impedancia, incluyendo el R0 (determinación de la resistencia a frecuencia cero), Rinf (determinación de la resistencia a la frecuencia infinita) y fc (frecuencia central)24,25,26,27. Finalmente, el aprendizaje automático se puede utilizar para analizar todos los datos a la vez y mejorar los modelos predictivos, tanto para la regresión12,13,15,16 como para la clasificación.
A pesar de estas limitaciones, EIM es una herramienta poderosa y relativamente simple para evaluar múltiples aspectos de la salud muscular. Si bien el enfoque de este manuscrito está en un solo músculo (gastrocnemio), no hay nada que impida el uso de EIM en otros músculos superficiales (por ejemplo, cuádriceps o bíceps braquial) utilizando electrodos de superficie o músculos más profundos utilizando la matriz de electrodos de aguja. De hecho, en humanos, la técnica se ha utilizado en una amplia variedad de músculos, incluidos los músculos de las extremidades superiores e inferiores 8,28, así como los músculos axiales (por ejemplo, músculos paraespinales y músculos abdominales)29,30.
Se ha demostrado que la EIM proporciona medidas confiables con respecto a la progresión de la enfermedad, la remisión de la atrofia y el tratamiento a lo largo del tiempo. Los datos de frecuencia única pueden ser totalmente suficientes para evaluar el estado de la enfermedad a lo largo del tiempo31; Sin embargo, el valor de los datos multifrecuencia es que aún pueden ayudar a evaluar la calidad de la medición, como se describió anteriormente. Los datos de frecuencia única de forma aislada podrían estar sustancialmente contaminados por artefactos de contacto, y esto no sería evidente sin revisar todo el espectro de impedancia. En estudios clínicos, la EIM superficial puede ser utilizada frecuentemente para obtener mediciones indoloras, por lo que es una herramienta simple de aplicar32. Esta abundancia de datos puede ser crítica para rastrear de manera más sensible la progresión de la enfermedad. Además, la adición de EIM a los protocolos clínicos puede reducir significativamente el número de participantes requeridos durante un ensayo clínico28,31.
EIM está encontrando una aplicación cada vez mayor en la evaluación de una variedad de condiciones neuromusculares en humanos. En consecuencia, la capacidad de realizar la técnica de manera efectiva en roedores ayuda a expandir el valor práctico potencial de la tecnología al tiempo que mejora nuestra comprensión de la relación entre varios resultados de EIM e histología subyacente. La técnica es generalmente fácil de usar y, junto con los útiles datos cuantitativos que proporciona, merece ser incluida en el arsenal estándar de herramientas para la evaluación de trastornos nerviosos y musculares en modelos de enfermedades de roedores.
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Disclosures
S. B. Rutkove tiene participación y se desempeña como consultor y asesor científico de Myolex, Inc., una compañía que diseña dispositivos de impedancia para uso clínico y de investigación, y el sistema mView utilizado aquí. También es miembro del Consejo de Administración de la compañía. La compañía también tiene la opción de licenciar la tecnología de impedancia patentada de la cual S. B. Rutkove es nombrado como inventor. Los otros autores no tienen otras afiliaciones relevantes o participación financiera con ninguna organización o entidad con un interés financiero o conflicto financiero con el tema o los materiales discutidos en el manuscrito, aparte de los divulgados.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por Charley's Fund y NIH R01NS055099.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D Printer | Formlabs Inc. | Form 2 Desktop | 3D printer |
| 3D Printer | Shenzhen Creality 3D Technology Co. LTD | Creality Ender 3 V2 | 3D printer |
| 3M Micropore surgical tape | Fisher | 19-027761 and 19-061655 | models 1530-0 and 1530-1 |
| 3M TRANSPORE surgical tape | Fisher | 18-999-380 and 18-999-381 | models 1527-0 and 1527-1 |
| Connector header vertical 10 POS 1 mm spacing | Digi-Key (Sullins connector solution) | S9214-ND (SMH100-LPSE-S10-ST-BK) | Plastic spacer 1 mm holes for the rat in vivo array displayed in Figure 2A |
| Cotton-tipped applicators | Fisher | 22-363-172 | |
| Dental Wax | Fisher | NC9377103 | |
| Depilatory agent | NAIR | NA | hair remover lotion with softening baby oil |
| Dumont #7b Forceps | Fine Science Tools | No. 11270-20 | Used for dissection, Style: #7b, Tip Shape: Curved, Tips: Standard, Tip Dimensions: 0.17 mm x 0.1 mm, Alloy/Material: Inox, Length: 11 cm |
| Electronic Digital Caliper | Fisher | 14-648-17 | Used to measure out the dimensions of the Gastrocnemius muscle |
| Epoxy adhesive dual cartridge 4 min work life | Devcon | series 14265, model 2217 | Glue used in the rat in vivo array displayed in Figure 2A |
| Ex vivo dielectric impedance cell | Custom | NA | Dielectric cells were 3D printed in the Rutkove laboratory |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | No. 11051-10 | Used for muscle to place and adjust, Length: 10 cm, Tip Shape: Curved, Tips: Serrated, Tip Width: 0.8 mm, Tip Dimensions: 0.8 mm x 0.7 mm, Alloy/Material |
| Hair clipper | Amazon | NA | Wahl professional animal BravMini+ |
| Impedance Animal Device | Myolex | EIM1103 | mView system - investigational electrical impedance myography device for use in animal research |
| In vivo needle arrays | Custom | NA | Custom arrays using 27 G subdermal needles from Ambu. The construction was finalized using a 3D printer in the Rutkove laboratory |
| In vivo surface array | Custom | NA | The in vivo surface array was printed and assembled in the Rutkove laboratory |
| Isoflurane | Patterson Veterinary Supplies | 07-893-8441 (NDC: 46066-755-04) | Pivetal - 250 mL bottle |
| Non-woven gauze | Fisher | 22-028-559 | 2 x 2 inch |
| Polystyrene Weighing Dishes | Fisher | S67090A | Dimensions (L x W x H): 88.9 mm x 88.9 mm x 25.4 mm |
| Razor Blades | Fisher | 12-640 | Used to cut muscle to right dimensions, Single-edge carbon steel blades |
| Student Fine Scissors | Fine Science Tools | No. 91460-11 | Used for dissection, Tips: Sharp-Sharp, Alloy/Material: Student Stainless Steel, Serrated: No, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 20 mm, Length: 11.5 cm, Feature: Student Quality |
| Subdermal needles 27 G Neuroline | Ambu | 745 12-50/24 | Needles used in the rat in vivo array displayed in Figure 2A |
| Surgical Scissors - Sharp | Fine Science Tools | No. 14002-13 | Used to cut skin, Tips: Sharp-Sharp, Alloy/Material: Stainless Steel, Serrated: No, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 42 mm, Length: 13 cm |
| TECA ELITE monopolar needle electrodes | Natus | 902-DMG50-S | 0.46 mm diameter (26 G). Blue hub |
| Teknova 0.9% saline solution | Fisher | S5815 | 1000 mL sterile |
References
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