Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

200 केवी ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके उच्च-रिज़ॉल्यूशन क्रायो-ईएम डेटासेट का नियमित संग्रह

Published: March 16, 2022 doi: 10.3791/63519
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 3
1Materials and Structural Analysis Division, Thermo Fisher Scientific, 2Max Planck Institute of Biochemistry, Molecular Structural Biology, 3Materials and Structural Analysis Division, Thermo Fisher Scientific
* These authors contributed equally

Summary

मैक्रोमोलेक्यूल्स के उच्च-रिज़ॉल्यूशन क्रायो-ईएम मानचित्र ों को 200 केवी टीईएम माइक्रोस्कोप का उपयोग करके भी प्राप्त किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल सटीक प्रकाशिकी संरेखण, डेटा अधिग्रहण योजनाओं और इमेजिंग क्षेत्रों के चयन को सेट करने के लिए सर्वोत्तम प्रथाओं को दिखाता है जो 200 केवी टीईएम का उपयोग करके उच्च-रिज़ॉल्यूशन डेटासेट के सफल संग्रह के लिए आवश्यक हैं।

Abstract

क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-ईएम) को पिछले दशक के दौरान प्रोटीन संरचना निर्धारण के लिए एक नियमित विधि के रूप में स्थापित किया गया है, जो प्रकाशित संरचनात्मक डेटा का लगातार बढ़ता हिस्सा ले रहा है। TEM प्रौद्योगिकी और स्वचालन में हाल ही में प्रगति ने डेटा संग्रह की गति और अधिग्रहित छवियों की गुणवत्ता दोनों को बढ़ावा दिया है, जबकि साथ ही साथ उप-3 Å संकल्पों पर क्रायो-ईएम मानचित्र प्राप्त करने के लिए विशेषज्ञता के आवश्यक स्तर को कम कर दिया है। जबकि इस तरह की अधिकांश उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचनाओं को अत्याधुनिक 300 केवी क्रायो-टीईएम सिस्टम का उपयोग करके प्राप्त किया गया है, उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचनाओं को 200 केवी क्रायो-टीईएम सिस्टम के साथ भी प्राप्त किया जा सकता है, खासकर जब ऊर्जा फिल्टर से सुसज्जित हो। इसके अतिरिक्त, वास्तविक समय की छवि गुणवत्ता मूल्यांकन के साथ माइक्रोस्कोप संरेखण और डेटा संग्रह का स्वचालन सिस्टम जटिलता को कम करता है और इष्टतम माइक्रोस्कोप सेटिंग्स का आश्वासन देता है, जिसके परिणामस्वरूप उच्च गुणवत्ता वाली छवियों की उपज में वृद्धि होती है और डेटा संग्रह का समग्र थ्रूपुट होता है। यह प्रोटोकॉल 200 केवी क्रायो-ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप पर हाल ही में तकनीकी प्रगति और स्वचालन सुविधाओं के कार्यान्वयन को दर्शाता है और दिखाता है कि 3 डी मानचित्रों के पुनर्निर्माण के लिए डेटा कैसे एकत्र किया जाए जो डे नोवो परमाणु मॉडल निर्माण के लिए पर्याप्त हैं। हम सर्वोत्तम प्रथाओं, महत्वपूर्ण चर और सामान्य मुद्दों पर ध्यान केंद्रित करते हैं जिन्हें इस तरह के उच्च-रिज़ॉल्यूशन क्रायो-ईएम डेटासेट के नियमित संग्रह को सक्षम करने के लिए माना जाना चाहिए। विशेष रूप से निम्नलिखित आवश्यक विषयों की विस्तार से समीक्षा की जाती है: i) माइक्रोस्कोप संरेखण का स्वचालन, ii) डेटा अधिग्रहण के लिए उपयुक्त क्षेत्रों का चयन, iii) उच्च गुणवत्ता, उच्च-थ्रूपुट डेटा संग्रह के लिए इष्टतम ऑप्टिकल पैरामीटर, iv) शून्य-हानि इमेजिंग के लिए ऊर्जा फ़िल्टर ट्यूनिंग, और v) डेटा प्रबंधन और गुणवत्ता मूल्यांकन। सर्वोत्तम प्रथाओं के आवेदन और एक ऊर्जा फिल्टर का उपयोग करके प्राप्त करने योग्य संकल्प के सुधार को एपो-फेरिटिन के उदाहरण पर प्रदर्शित किया जाएगा जिसे 1.6 Å तक पुनर्निर्मित किया गया था, और थर्मोप्लाज्मा एसिडोफिलम 20S को एक ऊर्जा फिल्टर और एक प्रत्यक्ष इलेक्ट्रॉन डिटेक्टर से सुसज्जित 200 केवी टीईएम का उपयोग करके 2.1-Å रिज़ॉल्यूशन में पुनर्निर्मित किया गया था।

Introduction

प्रोटीन संरचना का निर्धारण आणविक वास्तुकला, कार्य और प्रमुख सेलुलर प्रक्रियाओं में शामिल प्रोटीन परिसरों के विनियमन को समझने के लिए महत्वपूर्ण है, जैसे कि सेल चयापचय, सिग्नल ट्रांसडक्शन, या मेजबान-रोगज़नक़ इंटरैक्शन। क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-ईएम) एक शक्तिशाली तकनीक के रूप में उभरा है जो कई प्रोटीनों और उनके परिसरों की 3 डी संरचना को हल करने में सक्षम है जो पारंपरिक संरचनात्मक तकनीकों के लिए बहुत चुनौतीपूर्ण थे, जैसे कि एक्स-रे विवर्तन और एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी। विशेष रूप से, क्रायो-ईएम को झिल्ली प्रोटीन के लिए पसंद की विधि के रूप में साबित किया गया है, जिसे पारंपरिक संरचनात्मक तकनीकों के लिए पर्याप्त मात्रा में आसानी से क्रिस्टलीकृत या तैयार नहीं किया जा सकता है, और महत्वपूर्ण सेलुलर रिसेप्टर्स और आयन चैनलों की संरचना और कार्य में नई अंतर्दृष्टि प्रदान कीगई है 1,2,3,4,5 . हाल ही में, क्रायो-ईएम ने आणविक स्तर पर सार्स-कोव -2 संक्रमण के तंत्र का निर्धारण करके कोविद -19 महामारी से लड़ने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है, जिसने कोविद -19 रोग की उत्पत्ति को स्पष्ट किया और कुशल टीकों और चिकित्सीय 6,7,8,9,10 के तेजी से विकास के लिए आधार प्रदान किया।

आमतौर पर, उच्च अंत 300-केवी संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (टीईएम) का उपयोग क्रायो-ईएम एकल-कण विश्लेषण (एसपीए) द्वारा बायोमोलेक्यूल्स के उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचना निर्धारण के लिए किया जाता है ताकि उनकी संरचना और इंटरैक्शन को प्रकट किया जा सके। हाल ही में, एसपीए तकनीक एक नई सीमा तक पहुंच गई जब सामान्य बेंचमार्क क्रायो-ईएम नमूना एपो-फेरिटिन को परमाणु रिज़ॉल्यूशन (1.2 Å)11,12 पर ठंडा क्षेत्र उत्सर्जन बंदूक (ई-सीएफईजी), एक प्रत्यक्ष इलेक्ट्रॉन डिटेक्टर और एक ऊर्जा फिल्टर से लैस 300-केवी टीईएम का उपयोग करके पुनर्निर्मित किया गया था। इस संकल्प पर, संरचना में व्यक्तिगत परमाणुओं की स्थिति को स्पष्ट रूप से हल करना संभव था, व्यक्तिगत अमीनो एसिड साइड चेन की संरचना के साथ-साथ हाइड्रोजन बॉन्डिंग और अन्य इंटरैक्शन, जो नए लक्ष्यों की संरचना-आधारित दवा की खोज और मौजूदा दवा उम्मीदवारों के अनुकूलन के लिए नई संभावनाएं खोलते हैं।

मध्य-श्रेणी के 200 केवी टीईएम माइक्रोस्कोप का उपयोग अक्सर उच्च-अंत टीईएम माइक्रोस्कोप का उपयोग करके अंतिम उच्च-रिज़ॉल्यूशन डेटा संग्रह से पहले नमूना स्क्रीनिंग और नमूना अनुकूलन के लिए किया जाता है, विशेष रूप से बड़े क्रायो-ईएम सुविधाओं पर। आमतौर पर, imaged नमूने 3-4 Å रिज़ॉल्यूशन श्रेणी में हल किया जा सकता है जो अंतिम डेटा संग्रह के लिए एक उच्च-अंत 300-kV TEM पर जाने के लिए पर्याप्त है। नतीजतन, 200-kV TEM का उपयोग करके डेटा संग्रह अक्सर उच्चतम-संभव रिज़ॉल्यूशन परिणामों के लिए अनुकूलित नहीं होता है। इसके अलावा, कई दिलचस्प जैविक प्रश्नों का पहले से ही जवाब दिया जा सकता है और इन प्रस्तावों पर प्रकाशित किया जा सकता है क्योंकि सभी अमीनो एसिड साइड चेन पहले से ही हल हो चुके हैं, और लिगैंड बाध्यकारी साइटों के अधिभोग को भी मज़बूती से निर्धारित किया जा सकताहै। यह पहले से ही दिखाया गया है कि 200-kV TEMs कई नमूनों 14,15,16,17,18 के लिए 3 Å से परे संकल्प तक पहुंच सकते हैं। 200 केवी पर ली गई छवियां प्रतिबिंबित कणों के स्वाभाविक रूप से उच्च विपरीत प्रदर्शित करती हैं, जो 300 केवी टीईएम छवियों की तुलना में उच्च रिज़ॉल्यूशन पर अधिक क्षीण संकेत के बावजूद कणों के अधिक सटीक प्रारंभिक संरेखण की सुविधा भी प्रदान कर सकती हैं। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि पुनर्निर्मित क्रायो-ईएम मानचित्रों का प्राप्त संकल्प संरचनात्मक लचीलेपन और छविवाले नमूनों की संरचनात्मक विषमता द्वारा भी सीमित है, जो 200-केवी और 300-केवी पुनर्निर्माण दोनों को प्रभावित करता है। वास्तव में, 300-केवी सिस्टम का उपयोग करके प्राप्त किए गए बहुत अधिक क्रायो-ईएम पुनर्निर्माण को उच्च रिज़ॉल्यूशन19 की तुलना में 3-4 Å रिज़ॉल्यूशन रेंज में हल किया गया था। चूंकि 200 केवी टीईएम माइक्रोस्कोप कम जटिल होते हैं और छोटे कमरों में फिट होते हैं, इसलिए ये माइक्रोस्कोप क्रायो-ईएम द्वारा जैविक मैक्रोमोलेक्यूल्स की संरचना निर्धारण के लिए एक अच्छे, कम लागत वाले विकल्प का प्रतिनिधित्व करते हैं, जबकि माइक्रोस्कोप ऑटोलोडर सिस्टम के भीतर संग्रहीत कई नमूनों से लंबे डेटा संग्रह के स्वचालन को संरक्षित करते हैं।

उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचना निर्धारण के लिए क्रायो-ईएम डेटासेट के संग्रह के लिए माइक्रोस्कोप ऑप्टिक्स के सटीक संरेखण की आवश्यकता होती है। स्तंभ संरेखण इलेक्ट्रॉन स्रोत से संघनित्र लेंस प्रणाली, उद्देश्य लेंस और इलेक्ट्रॉन डिटेक्टर के साथ ऊर्जा फ़िल्टर तक व्यवस्थित रूप से आगे बढ़ते हैं। संरेखण का पूरा अनुक्रम आमतौर पर आवश्यक नहीं है। जब आवश्यक हो, तो उपयोगकर्ता को माइक्रोस्कोप उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस (प्रत्यक्ष संरेखण नियंत्रण कक्ष) में संरेखण प्रक्रिया के दौरान संदर्भ-जागरूक सहायता विंडो में प्रत्येक चरण के उचित विवरण के साथ अर्ध-स्वचालित प्रक्रियाओं के माध्यम से निर्देशित किया जाता है। एक बार माइक्रोस्कोप पूरी तरह से संरेखित होने के बाद, इलेक्ट्रॉन प्रकाशिकी स्थिर रहती है, और संरेखण को कम से कम कुछ महीनों के लिए बदलने की आवश्यकता नहीं होती है। केवल सबसे संवेदनशील संरेखण, जैसे कि नमूना विमान की समानांतर रोशनी, उद्देश्य अस्थिरता, और कोमा-मुक्त संरेखण, प्रत्येक डेटासेट के संग्रह को शुरू करने से ठीक पहले परिष्कृत किया जाना चाहिए। एकत्र किए गए डेटा की गुणवत्ता को तब विभिन्न सॉफ़्टवेयर पैकेजों का उपयोग करके डेटा संग्रह के दौरान मॉनिटर किया जा सकता है, जैसे कि EPU गुणवत्ता मॉनिटर, क्रायोस्पार्क लाइव20, रिलिओन21, Scipion22, WARP23, या Appion24।

माइक्रोस्कोप के सटीक संरेखण के अलावा, कम से कम संरचनात्मक और रचनात्मक विषमता के साथ अच्छी तरह से शुद्ध नमूनों की उच्च गुणवत्ता भी उच्च-रिज़ॉल्यूशन डेटासेट के संग्रह और उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचनाओं को हल करने के लिए एक शर्त है। विशिष्ट प्रोटोकॉल, लगातार चुनौतियों और संभावित उपचारों के बारे में अधिक जानकारी इस विषय के लिए समर्पित अन्य समीक्षाओं में पाई जा सकतीहै 25,26,27. अनिवार्य रूप से, किसी दिए गए क्रायो-ईएम ग्रिड पर क्षेत्रों को ढूंढना महत्वपूर्ण है जिसमें उच्च-रिज़ॉल्यूशन जानकारी को संरक्षित करने के लिए पर्याप्त रूप से पतली बर्फ होती है, और व्यक्तिगत कणों को ओवरलैप के बिना यादृच्छिक अभिविन्यास पर घनी रूप से वितरित किया जाता है। हालांकि, विशिष्ट क्रायो-ईएम ग्रिड में गैर-समान बर्फ की मोटाई होती है, और इसलिए इमेजिंग के लिए इष्टतम क्षेत्रों को ढूंढना और चुनना महत्वपूर्ण है। ग्रिड पर बर्फ की मोटाई के आकलन के लिए विभिन्न साधन क्रायो-ईएम डेटासेट के स्वचालित संग्रह के लिए समर्पित सॉफ़्टवेयर पैकेजों में उपलब्ध हैं, जैसे कि EPU 2, Leginon28, या SerialEM29।

तेजी से और संवेदनशील प्रत्यक्ष इलेक्ट्रॉन डिटेक्टरों के आगमन ने फिल्मों के रूप में कई अंशों में छवियों के संग्रह को सक्षम किया, जिसने बीम-प्रेरित आंदोलनों के मुआवजे को सक्षम किया और इसके परिणामस्वरूप छवि प्रसंस्करण और अंतिम 3 डी पुनर्निर्माण30 में उपयोग किए जाने वाले डेटा की गुणवत्ता और मात्रा में पर्याप्त वृद्धि हुई। इसी समय, स्वचालन और उच्च थ्रूपुट डेटा संग्रह हजारों छवियों / फिल्मों के साथ विशाल डेटासेट प्रदान करते हैं जो डेटा भंडारण और पहुंच के लिए चुनौतियों का प्रतिनिधित्व करते हैं। सैकड़ों उपयोगकर्ताओं को दसियों की सेवा करने वाली बड़ी क्रायो-ईएम सुविधाओं के साथ अपनाया गया मॉडल विशेष रूप से स्थापित क्रायो-ईएम पाइपलाइनों31,32 में उचित ट्रैकिंग और डेटा साझा करने के साथ संगठित डेटा प्रबंधन के लिए कहता है।

यह अध्ययन 200 केवी ग्लेसिओस टीईएम माइक्रोस्कोप का उपयोग करके उच्च-रिज़ॉल्यूशन क्रायो-ईएम डेटासेट के नियमित संग्रह के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। माइक्रोस्कोप ऑप्टिक्स के आवश्यक संरेखण क्रायो-ईएम नमूनों के मूल्यांकन और उच्च-रिज़ॉल्यूशन डेटा संग्रह के लिए उपयुक्त क्षेत्रों के चयन के लिए प्रक्रियाओं के साथ एक साथ वर्णित हैं। नमूना जानकारी के साथ एकत्र किए गए डेटा और संबंधित मेटाडेटा के संगठन को एथेना में प्रदर्शित किया गया है - एक डेटा प्रबंधन प्लेटफ़ॉर्म जो नमूना जानकारी और एकत्र किए गए डेटा की समीक्षा की सुविधा प्रदान करता है। माउस apo-ferritin नमूने का उपयोग करते हुए, 1.6 Å संकल्प13 पर एक 3 डी पुनर्निर्माण प्राप्त करना संभव था। वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हमने थर्मोप्लाज्मा एसिडोफिलम से 2.1 Å रिज़ॉल्यूशन पर 20S के 3D घनत्व मानचित्र का भी पुनर्निर्माण किया।

Protocol

प्रोटोकॉल के सभी चरणों को 200 केवी ग्लेसिओस टीईएम सिस्टम (इसके बाद 200 केवी टीईएम के रूप में संदर्भित) के लिए वर्णित किया गया है, जो सेलेक्ट्रिस-एक्स ऊर्जा फिल्टर (इसके बाद ऊर्जा फिल्टर के रूप में संदर्भित) और फाल्कन 4 डिटेक्टर (इसके बाद प्रत्यक्ष इलेक्ट्रॉन डिटेक्टर के रूप में संदर्भित) से सुसज्जित है। प्रोटोकॉल चरण EPU अनुप्रयोग के लिए विशिष्ट हैं, जो डिफ़ॉल्ट SPA-डेटा संग्रह सॉफ़्टवेयर है जो प्रत्येक Glacios सिस्टम पर पूर्व-स्थापित है। नीचे दिए गए प्रोटोकॉल चरण EPU संस्करण 2.14 के अनुरूप हैं और किसी भिन्न EPU संस्करण का उपयोग करते समय छोटे संशोधनों की अपेक्षा की जाती है। इस प्रोटोकॉल के लिए आवश्यकताएँ हैं: i) बंदूक और स्तंभ संरेखण अच्छी तरह से संरेखित हैं, ii) EM अंशांकन सही हैं और iii) EPU ऑटो-फ़ंक्शंस सही ढंग से कैलिब्रेट किए गए हैं।

1. माइक्रोस्कोप में ग्रिड लोड हो रहा है

नोट: इस प्रयोग में उपयोग किए जाने वाले 200 केवी टीईएम एक कैसेट के भीतर 12 ऑटोग्रिड (यानी, पारंपरिक टीईएम ग्रिड एक विशेष कारतूस में clipped) तक पकड़ सकते हैं जो माइक्रोस्कोप के ऑटोलोडर के अंदर लोड किया जाता है और लगातार नमूना devitrification को रोकने के लिए -170 डिग्री सेल्सियस से नीचे के तापमान पर रखा जाता है।

  1. तरल नाइट्रोजन स्थितियों के तहत ऑटोलोडर कैसेट में ऑटोग्रिड डालें।
  2. एक तरल नाइट्रोजन ठंडा स्थानांतरण कैप्सूल में autogrids के साथ कैसेट डालें.
  3. कैप्सूल को माइक्रोस्कोप में डालें और माइक्रोस्कोप के ऑटोलोडर में कैप्सूल से कैसेट लोड करने के लिए माइक्रोस्कोप यूआई में डॉक बटन पर क्लिक करें।
  4. लोड किए गए कैसेट में ऑटोग्रिड की उपस्थिति की जांच करने के लिए इन्वेंट्री बटन पर क्लिक करें।
  5. TEM इमेजिंग के लिए स्तंभ में autogrids सम्मिलित करने के लिए लोड और अनलोड बटन पर क्लिक करें।

2. एक डेटा प्रबंधन मंच (वैकल्पिक) में एक परियोजना की स्थापना

नोट:: नमूना जानकारी और एकत्रित डेटा प्रदान किए गए डेटा प्रबंधन प्लेटफ़ॉर्म में व्यवस्थित किया जा सकता है जो सभी कनेक्टेड उपकरणों के लिए संरचित डेटा के भंडारण की अनुमति देता है। एक प्रोजेक्ट बनाया जा सकता है जिसके लिए समीक्षा और निर्यात के लिए संगठित तरीके से छवियों और मेटाडेटा को कैप्चर करने के लिए किसी भी वर्कफ़्लो चरणों को परिभाषित किया जा सकता है।

  1. डेटा प्रबंधन पोर्टल एप्लिकेशन प्रारंभ करें और उपयोगकर्ता नाम और पासवर्ड के साथ लॉगिन करें।
  2. पोर्टल UI के बाएँ पैनल में, एक नया प्रोजेक्ट बनाने के लिए प्रोजेक्ट जोड़ें बटन पर क्लिक करें या प्रोजेक्ट खोलने के लिए नीचे दी गई सूची में मौजूदा प्रोजेक्ट के बटन पर क्लिक करें।
  3. खुले प्रोजेक्ट के भीतर एक नया प्रयोग बनाने के लिए प्रयोग जोड़ें बटन पर क्लिक करें।
  4. नए प्रयोग के मेटाडेटा पैनल में विवरण भरें और प्रयोग के भीतर एक नया वर्कफ़्लो बनाने के लिए वर्कफ़्लो जोड़ें बटन पर क्लिक करें (उदाहरण के लिए, एकल कण विश्लेषण).
  5. वैकल्पिक रूप से, कस्टम-निर्मित वर्कफ़्लो बनाने के लिए मध्य पैनल में चरण जोड़ें बटन पर क्लिक करें या पूर्वनिर्धारित SPA वर्कफ़्लो (चित्र1 और चित्र2) में अतिरिक्त चरण जोड़ें.
    नोट: चरण नमूना तैयारी, जैव रसायन तकनीकों द्वारा नमूना लक्षण वर्णन, नमूना vitrification, क्रायो-EM ग्रिड की स्क्रीनिंग, डेटा संग्रह सत्र, और डेटा विश्लेषण का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं।
  6. वैकल्पिक रूप से, प्रत्येक चरण के नोट्स में विवरण भरें, जिसमें छवियाँ और फ़ोटो शामिल हो सकते हैं.
  7. वर्कफ़्लो में कोई डेटासेट चरण बनाएँ और डेटासेट प्रकार को EPU के रूप में चुनें.
    नोट:: यह विश्लेषण सॉफ़्टवेयर डेटा अधिग्रहण के दौरान स्वचालित रूप से डेटा प्रबंधन पोर्टल में सभी परिणाम डेटा/मेटाडेटा को सही स्थान पर रखने और सभी चरणों और डेटा स्थानांतरण का पूरा रिकॉर्ड बनाए रखते हुए डेटा को स्वचालित रूप से पसंदीदा गंतव्य पर निर्यात करने की अनुमति देगा.
  8. बायोकेमिस्ट्री चरण में नमूना और EM ग्रिड के बारे में टेम्पलेट्स भरें और प्रत्येक ग्रिड को एक नमूने के साथ संबद्ध करें (ध्यान दें कि एक नमूना एकाधिक ग्रिड के साथ संबद्ध किया जा सकता है)।
  9. डेटासेट चरण के मेटाडेटा अनुभाग में नमूना-ग्रिड संयोजन संबद्ध करें।

3. विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में इमेजिंग प्रीसेट और छवि शिफ्ट अंशांकन सेट अप करें

  1. तालिका 1 में दिखाए गए अनुसार अलग-अलग इमेजिंग मोड के लिए इमेजिंग पैरामीटर सेट करें. विशिष्ट सेटिंग्स के चयन के लिए विचार चर्चा अनुभाग में विस्तार से वर्णित हैं।
  2. विश्लेषण सॉफ़्टवेयर के डेटा अधिग्रहण प्रीसेट में चुने गए आवर्धन के लिए समानांतर रोशनी सेट करें
    नोट: दिए गए स्पॉट आकार (यानी, C1 लेंस की पूर्व निर्धारित शक्तियों) पर नमूने की समानांतर रोशनी के लिए C2 लेंस की केवल एक सेटिंग है, जैसे कि इस अध्ययन में उपयोग किए गए 200 kV TEM। इलेक्ट्रॉन खुराक दर प्रति इकाई क्षेत्र (e-/Å2/s) इसलिए केवल SPOT आकार सेटिंग्स को बदलकर और नीचे दिए गए चरणों के अनुसार C2-strength (बीम तीव्रता) को समायोजित करके समायोजित किया जा सकता है।
    1. समर्थन कार्बन पन्नी और पतली या कोई बर्फ के साथ एक क्षेत्र में ले जाएँ।
    2. TEM UI के एपर्चर मेनू में 100 μm या 70 μm उद्देश्य एपर्चर का चयन करें।
    3. विवर्तन मोड पर स्विच करने के लिए नियंत्रण कक्षों पर विवर्तन बटन दबाएँ.
    4. फ्लोरोसेंट स्क्रीन डालें और उच्च संकल्प करने के लिए FluCam मोड परिवर्तित करें।
    5. केंद्रीय विवर्तन स्थान को एपर्चर के किनारे पर ले जाएं। यदि एपर्चर किनारे दिखाई नहीं देता है, तो कैमरे की लंबाई बढ़ाएं (आवर्धन घुंडी का उपयोग करके)।
    6. ध्यान से नियंत्रण कक्ष पर फोकस घुंडी बारी करने के लिए ध्यान में वापस फोकल विमान लाने के लिए. बैक-फोकल प्लेन तब केंद्रित होता है जब एपर्चर एज स्पष्ट रूप से तेज होता है।
    7. FluCam की संवेदनशीलता को निम्नतम स्तर तक कम करें और FluCam के केंद्र में केंद्रीय विवर्तन स्थान को स्थानांतरित करें।
    8. नियंत्रण कक्ष पर तीव्रता घुंडी का उपयोग कर केंद्रीय स्थान के आकार को कम से कम करें।
    9. TEM UI में उद्देश्य एपर्चर को वापस लें और इमेजिंग मोड पर वापस स्विच करें।
    10. डेटा अधिग्रहण पूर्व निर्धारित करने के लिए सेटिंग्स को बचाने के लिए विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में प्राप्त करें बटन पर क्लिक करें।
  3. डेटा अधिग्रहण प्रीसेट में इलेक्ट्रॉन खुराक दर समायोजित करें जो उपयोग किए गए डिटेक्टर के लिए इष्टतम है:
    1. ग्रिड पर एक खाली क्षेत्र में ले जाएँ (उदाहरण के लिए टूटी हुई कार्बन पन्नी के साथ एक ग्रिड वर्ग)
    2. इलेक्ट्रॉन खुराक दर को मापने के लिए विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में माप खुराक बटन पर क्लिक करें।
    3. इष्टतम खुराक दर प्राप्त करने के लिए स्पॉट आकार बदलें। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले प्रत्यक्ष इलेक्ट्रॉन डिटेक्टर के मामले में, 4-5 ई-/ पिक्सेल / एस की खुराक दर आमतौर पर उच्च-रिज़ॉल्यूशन डेटा अधिग्रहण के लिए उपयोग की जाती है। यह आमतौर पर स्पॉट आकार 4-6 से मेल खाता है।
    4. जाँच करें और ऊपर वर्णित के रूप में नए SPOT आकार सेटिंग पर समानांतर रोशनी समायोजित करें।
    5. प्रत्यक्ष इलेक्ट्रॉन डिटेक्टर33 पर EER मोड का उपयोग करने के लिए भिन्न के तहत EER विकल्प का चयन करें।
    6. डेटा अधिग्रहण पूर्व निर्धारित करने के लिए सेटिंग्स को सहेजने के लिए विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में प्राप्त करें बटन पर क्लिक करें।
    7. Autofocus प्रीसेट पर स्विच करें और ध्यान केंद्रित करने के लिए रोशनी सेटिंग्स को सहेजने के लिए प्राप्त करें बटन दबाएँ. मैन्युअल रूप से एक्सपोज़र समय को 1 s और binning मोड 2 में बदलें.
    8. थॉन रिंग्स प्रीसेट पर स्विच करें और इस प्रीसेट के लिए रोशनी सेटिंग्स को सहेजने के लिए गेट बटन दबाएं। मैन्युअल रूप से एक्सपोज़र समय को 1-2 s और binning मोड 2 में बदलें।
    9. शून्य हानि प्रीसेट पर स्विच करें और इस प्रीसेट के लिए रोशनी सेटिंग्स को सहेजने के लिए प्राप्त करें बटन दबाएं। मैन्युअल रूप से 0.5 s और binning मोड 4 करने के लिए एक्सपोज़र समय परिवर्तित करें।
  4. कैलिब्रेट छवि सेट ऑप्टिकल सेटिंग्स के बीच के रूप में विश्लेषण सॉफ़्टवेयर मैनुअल में वर्णित है तैयारी टैब (अनुपूरक चित्र1) में छवि शिफ्ट अंशांकन कार्य का उपयोग कर।

तालिका 1: एक ऊर्जा फिल्टर और एक प्रत्यक्ष इलेक्ट्रॉन डिटेक्टर से सुसज्जित एक 200 केवी क्रायो-टीईएम का उपयोग करके उच्च-रिज़ॉल्यूशन डेटा अधिग्रहण के लिए विशिष्ट इमेजिंग सेटिंग्स। सेटिंग्स स्वचालित डेटा संग्रह (प्रोटोकॉल के अनुभाग 3) की स्थापना में उपयोग किए जाने वाले प्रत्येक ऑप्टिकल प्रीसेट के लिए दिखाई जाती हैं। ये सेटिंग्स इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले 200 केवी टीईएम माइक्रोस्कोप और प्रत्यक्ष इलेक्ट्रॉन डिटेक्टर के लिए विशिष्ट हैं। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

4. ग्रिड मैपिंग और डेटा संग्रह के लिए सबसे अच्छा क्रायो-EM ग्रिड का चयन

  1. एटलस टैब का चयन करें और एक नया सत्र खोलने के लिए नया सत्र बटन पर क्लिक करें।
  2. सत्र नाम और डेटा संग्रहण स्थान जैसे विवरण भरें और एक नई स्क्रीनिंग कार्य विंडो खोलने के लिए लागू करें बटन पर क्लिक करें, जो ऑटोलोडर इन्वेंट्री में सभी ग्रिड की सूची दिखाता है। वैकल्पिक रूप से, ग्रिड के नाम संपादित करें.
  3. संबंधित ग्रिड संख्या के आगे एक चेकबॉक्स का चयन करके रुचि के ग्रिड का चयन करें।
  4. सभी चयनित ग्रिड के एटलस का पूरी तरह से स्वचालित संग्रह प्रारंभ करने के लिए प्रारंभ बटन पर क्लिक करें।
  5. जब संग्रह पूरा हो जाता है, तो अधिग्रहित एटलस की समीक्षा करने के लिए ग्रिड लेबल पर क्लिक करें।
    नोट: अलग-अलग ग्रिड वर्गों को उनके सापेक्ष बर्फ की मोटाई के अनुसार वर्गीकृत किया जाता है, जो प्रत्येक एटलस में सापेक्ष ग्रेस्केल मूल्य मूल्यांकन पर आधारित है। वर्गीकृत ग्रिड वर्गों को विभिन्न रंग योजनाओं में दर्शाया गया है जिनका उपयोग डेटा अधिग्रहण क्षेत्रों के चयन के मार्गदर्शन के लिए किया जा सकता है। Vitrobot Mk IV के साथ उत्पादित एक ग्रिड आमतौर पर पूरे ग्रिड पर एक बर्फ मोटाई ढाल प्रदर्शित करेगा, जो डेटा संग्रह के लिए आदर्श बर्फ की मोटाई की पहचान करने में मदद कर सकता है। एक इष्टतम ग्रिड में जितना संभव हो उतना कम हस्तांतरण बर्फ संदूषण होना चाहिए और पर्याप्त अटूट और क्रैक-फ्री ग्रिड वर्गों (चित्रा 3) का प्रदर्शन करना चाहिए। उपयुक्त बर्फ वितरण के साथ ग्रिड को उच्च आवर्धन (यानी, व्यक्तिगत कणों के घनत्व और अभिविन्यास) पर बर्फ में कणों के वितरण का आकलन करने के लिए आगे की जांच की जा सकती है।
  6. माइक्रोस्कोप कॉलम में उपयुक्त बर्फ वितरण के साथ एक चुने हुए ग्रिड को सम्मिलित करने के लिए शीर्ष मेनू में लोड नमूना बटन पर क्लिक करें।
  7. एटलस टैब का चयन करें, एटलस छवि में एक उपयुक्त ग्रिड वर्ग पर राइट-क्लिक करें और ग्रिड वर्ग के लिए मंच को स्थानांतरित करने के लिए ड्रॉपडाउन मेनू से यहां चरण ले जाएँ विकल्प का चयन करें।
  8. ग्रिड वर्ग को Eucentric ऊँचाई पर सेट करने के लिए स्वत: फ़ंक्शंस टैब का चयन करें. Eucentric ऊँचाई पूर्व निर्धारित करने के लिए स्विच करें, चुने गए ग्रिड वर्ग के बीच में बीम झुकाव ऑटो-फ़ंक्शन द्वारा ऑटो-Eucentric पर क्लिक करें और प्रारंभ बटन पर क्लिक करें।
  9. ग्रिड स्क्वायर प्रीसेट पर स्विच करें और एक छवि प्राप्त करें। एक राइट-क्लिक द्वारा बर्फ और कोई या न्यूनतम संदूषण के साथ एक छेद के लिए मंच ले जाएँ और यहाँ ले जाएँ चरण विकल्प.
  10. होल / Eucentric ऊंचाई पूर्व निर्धारित करने के लिए स्विच करें और एक छवि प्राप्त करें। एक राइट-क्लिक करके ब्याज के छेद के बगल में एक कार्बन क्षेत्र में चरण ले जाएँ और यहाँ चरण ले जाएँ विकल्प।
  11. AutoFocus ऑटो-फ़ंक्शन पर क्लिक करें और वांछित defocus के लिए मान 0 μm और -2 μm करने के लिए पुनरावृत्ति के लिए सेट करें। Autofocus preset पर स्विच करें और प्रारंभ बटन पर क्लिक करें।
  12. तैयारी टैब का फिर से चयन करें और होल/ पहले से अधिग्रहित छेद छवि पर, छेद के भीतर ब्याज के एक क्षेत्र का चयन करें और राइट-क्लिक करके और ले जाएँ चरण यहाँ विकल्प का चयन करके मंच को इस स्थिति में ले जाएँ।
  13. डेटा अधिग्रहण प्रीसेट पर स्विच करें और बीम शिफ्ट के बाद प्रतीक्षा समय को 0.5 सेकंड पर सेट करें और चरण के बाद प्रतीक्षा समय 20 सेकंड पर ले जाएं। -3 μm और -5 μm के बीच defocus का उपयोग कर एक छवि प्राप्त करने के लिए व्यक्तिगत कणों के बेहतर विज़ुअलाइज़ेशन के लिए कम संकल्प विपरीत को बढ़ावा देने के लिए।
  14. वैकल्पिक रूप से, विभिन्न छेदों में छवि कणों के लिए चरण 4.7-4.13 को दोहराएं और आवश्यकतानुसार विभिन्न बर्फ की मोटाई के साथ विभिन्न ग्रिड वर्गों को दोहराएं।
  15. एक बार उच्च-रिज़ॉल्यूशन डेटा संग्रह के लिए सबसे उपयुक्त ग्रिड की पहचान और चयन किया जाता है, तो चयनित ग्रिड को TEM में लोड करने के लिए शीर्ष मेनू में लोड नमूना बटन पर क्लिक करें।
    नोट:: वैकल्पिक रूप से, यदि अधिक जानकारी की आवश्यकता है और / या इस स्क्रीनिंग प्रक्रिया का स्वचालन वांछित है, तो अनुभाग 5 निष्पादित करें।

5. एकल कण विश्लेषण सॉफ्टवेयर में एक डेटा संग्रह सत्र की स्थापना

नोट:: यदि सोने की पन्नी ग्रिड का उपयोग कर, उद्देश्य अस्थिरता और कोमा संरेखण (अनुभाग 6) का शोधन मज़बूती से काम नहीं हो सकता है। यह एक कार्बन पन्नी ग्रिड या क्रॉस-झंझरी ईएम ग्रिड लोड करने और डेटा संग्रह स्थापित करने से पहले इन अंतिम संरेखणों को करने की सलाह दी जाती है।

  1. EPU टैब का चयन करें और बाएँ पैनल में एक नया सत्र बनाने के लिए सत्र निर्माण बटन पर क्लिक करें। वर्तमान ऑप्टिकल प्रीसेट का उपयोग करने के लिए नया सत्र विकल्प या पहले निर्यात किए गए सत्र सेट-अप को लोड करने के लिए प्राथमिकताओं से नया विकल्प का चयन करें.
  2. सत्र नाम और डेटा संग्रहण स्थान भरें.
    नोट:: इस स्थान का उपयोग सत्र नाम के साथ एक सबफ़ोल्डर में डेटा संग्रह सत्र से एकीकृत छवियों और मेटाडेटा को सहेजने के लिए किया जाएगा. यद्यपि ये डेटा संग्रहण स्थान की एक महत्वपूर्ण मात्रा नहीं लेंगे, फिर भी इन डेटा को DMP सर्वर के फाल्कन ऑफ़लोड डेटा संग्रहण पर सहेजने की सिफारिश की जाती है क्योंकि EER कैमरा फ़्रेम हमेशा सत्र नाम के साथ एक निर्देशिका में इस डेटा संग्रहण की रूट निर्देशिका में संग्रहीत होते हैं।
  3. प्रोटोकॉल में बाद में डेटा संग्रह के लिए चयनित ग्रिड वर्गों में अलग-अलग छेदों के चयन पर नियंत्रण रखने के लिए सत्र के मैन्युअल प्रकार का चयन करें.
  4. अलग-अलग छेदों के बीच चरण आंदोलनों को कम करने, समग्र नमूना बहाव को कम करने और छवि गुणवत्ता की गिरावट के बिना डेटा संग्रह के थ्रूपुट को बढ़ाने के लिए डेटा संग्रह के लिए विपथन-मुक्त छवि स्थानांतरण (AFIS) का उपयोग करने के लिए फास्टर अधिग्रहण मोड का चयन करें।
  5. सहेजे गए एकीकृत छवियों के डिफ़ॉल्ट MRC प्रारूप का चयन करें.
  6. उपयोग की गई ग्रिड और उसका प्रकार निर्दिष्ट करें. इस प्रोटोकॉल ने एपो-फेरिटिन के लिए आर -1.2 / 1.3 अल्ट्राऑफॉइल और 20 एस के लिए आर -2 / 1 क्वांटिफोइल ग्रिड का उपयोग किया। नमूना वाहक के तहत Quantifoil और R1.2/1.3 या Quantifoil प्रकार के तहत 2/1 का चयन करें।
  7. वैकल्पिक: EPU गुणवत्ता मॉनिटर (EQM) का उपयोग करने के लिए नीचे दाएं कोने में एथेना लॉगिन बटन पर क्लिक करें।
    1. सत्र सेटअप ओवरव्यू में सेटिंग्स अनुभाग को सक्रिय करने के लिए ब्राउज़र पॉप-अप विंडो में लॉगिन विवरण दर्ज करें.
    2. सेटिंग्स अनुभाग में चयन करें बटन पर क्लिक करें और इसे वर्तमान डेटा संग्रह के साथ संबद्ध करने के लिए पहले से बनाए गए डेटासेट (प्रोटोकॉल अनुभाग 2) के लिए ब्राउज़ करें। पर गुणवत्ता मॉनिटर सक्षम करें चेक बॉक्स टॉगल करें।
  8. नया सत्र बनाने के लिए लागू करें बटन पर क्लिक करें।
    नोट:: यह क्रिया बाएँ स्तंभ मेनू में नए कार्य खोलेगा। सत्र के दौरान किसी भी बिंदु पर, यदि कुछ विवरण गलत हैं, तो सत्र सेटअप कार्य पर वापस जाना संभव है, विवरण को बदलें/अद्यतन करें और सत्र को अद्यतन करने के लिए फिर से लागू करें पर क्लिक करें।
  9. ग्रिड के एकत्रित एटलस को दिखाने के लिए बाएँ पैनल में वर्ग चयन कार्य का चयन करें।
  10. वैकल्पिक रूप से, ग्रिड वर्गों में बर्फ की गुणवत्ता को बेहतर ढंग से न्याय करने के लिए एक उच्च गुणवत्ता वाली छवि देखने के लिए एटलस के किसी भी टाइल पर डबल क्लिक करें। ग्रिड एटलस पर वापस जाने के लिए छवि पर फिर से क्लिक करें।
  11. निम्नलिखित विशेषताओं के साथ ग्रिड वर्गों की पहचान करें (चित्रा 4): (i) ग्रिड वर्ग में समर्थन पन्नी बिना किसी क्षति के बरकरार है, (ii) पन्नी-छेद में विट्रियस पतली बर्फ (छेद समर्थन कार्बन पन्नी की तुलना में उज्ज्वल दिखाई देते हैं), (iii) ग्रिड वर्ग में जितना संभव हो उतना कम क्रिस्टलीय बर्फ संदूषण (काले धब्बेदार), (iv) ग्रिड वर्ग में और व्यक्तिगत पन्नी-छेद के भीतर न्यूनतम चमक ढाल।
    नोट: चुने गए प्रीसेट के साथ और एक अच्छे ग्रिड के साथ, इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले 200 केवी क्रायो टीईएम ~ 200-300 फिल्मों / एच की दर से छवि बना सकते हैं। इसे ध्यान में रखते हुए, आवश्यकतानुसार कई वर्गों का चयन करें, या माइक्रोस्कोप समय की मात्रा के अनुसार वर्ग चयन कार्य पर लौटकर बाद में अधिक जोड़ें। संदर्भ के लिए, 3000 फिल्मों को एपो-फेरिटिन के 1.6 Å रिज़ॉल्यूशन को प्राप्त करने के लिए एकत्र किया गया था।
  12. पूर्ण एटलस या उच्च गुणवत्ता वाली टाइल छवियों में डेटा संग्रह के लिए ग्रिड वर्गों का चयन करें
    1. ब्याज के ग्रिड वर्ग पर राइट-क्लिक करें और संदर्भ मेनू में चयन करें विकल्प चुनें
    2. वैकल्पिक रूप से, कुंजीपटल पर Ctrl कुंजी को पकड़ो और वांछित ग्रिड वर्गों पर बाएँ-क्लिक करें
    3. इसके विपरीत, राइट-क्लिक करें और अचयनित करें या Shift कुंजी को दबाए रखें और वर्गों को निकालने के लिए बाएँ-क्लिक करें
    नोट:: अगले चरण ों को सुनिश्चित करें कि डेटा संग्रह एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन पुनर्निर्माण में परिणाम के लिए महत्वपूर्ण हैं। एक पतली बर्फ परत के साथ ग्रिड वर्ग में छेद का चयन शुरू करें। इस ग्रिड वर्ग पर राइट-क्लिक करें और होल चयन कार्य शुरू करने के लिए छेद का चयन करें विकल्प का चयन करें।
  13. चयनित ग्रिड वर्गों में छेद का चयन करने के लिए बाएँ पैनल में छेद चयन कार्य का चयन करें।
  14. ऑटो-Eucentric बटन पर क्लिक करें स्वचालित रूप से पहले चयनित ग्रिड वर्ग के लिए स्थानांतरित करने के लिए, Eucentric ऊंचाई समायोजित करें और पन्नी-छेद खोजने के लिए एक ग्रिड वर्ग छवि प्राप्त करें।
  15. छवि में पन्नी-छेद खोजने के लिए फाइंड होल बटन पर क्लिक करें।
    नोट:: यदि छेद ढूँढना अच्छी तरह से काम नहीं किया (यानी, वहाँ या तो छोड़े गए छेद या छवि में गलत तरीके से आकार के छेद हैं), जाँचें कि सही मान सत्र सेटअप कार्य की Quantifoil प्रकार प्रविष्टि में इनपुट थे और फिर से छेद ढूँढें। यदि छेद अभी भी सही ढंग से नहीं पाए जाते हैं, तो छेद व्यास और दूरी को मैन्युअल रूप से सेट करने और फिर से छेद खोजने के लिए माप छेद आकार बटन पर क्लिक करें।
  16. ग्रिड सलाखों के पास छेद को अचयनित करने के लिए ग्रिड बार बटन के करीब छेद निकालें बटन पर क्लिक करें।
  17. बहुत मोटी बर्फ (बाईं सीमा रेखा का उपयोग करके) के साथ-साथ सभी खाली छेद (दाईं ओर सही सीमा रेखा का उपयोग करके) के साथ सभी छेदों को हटाने के लिए आइस फिल्टर (सॉफ़्टवेयर विंडो के नीचे दाईं ओर) की चमक हिस्टोग्राम में सीमाओं को समायोजित करें जैसा कि चित्र 4 में दिखाया गया है।
    नोट:: परिशोधन के लिए, विशिष्ट तीव्रता मान भी लागू करें बटन के आगे संगत पाठ बक्सों में दर्ज किया जा सकता है।
  18. वैकल्पिक रूप से, मैन्युअल रूप से छेद के चयन को परिष्कृत करने के लिए चयन ब्रश का उपयोग करें: बाएँ क्लिक करें और अवांछित छेद का चयन रद्द करने के लिए ब्रश खींचें। Ctrl कुंजी को पकड़ो और पन्नी छेद ों को पुन: चयन करने के लिए बाएँ-क्लिक करें. Shift कुंजी पकड़ो और ब्रश आकार को समायोजित करने के लिए माउस पहिया के साथ स्क्रॉल करें।
  19. डेटा अधिग्रहण टेम्पलेट को सेट करने और परीक्षण करने के लिए एक छेद का चयन करें जिसका उपयोग पूरे डेटा संग्रह में बार-बार किया जाएगा: ग्रिड वर्ग छवि में एक छेद पर राइट-क्लिक करें और स्थान पर चरण ले जाएँ विकल्प का चयन करें।
  20. बाएँ फलक में टेम्पलेट परिभाषा कार्य का चयन करें.
  21. होल / Eucentric पूर्व निर्धारित का चयन करें और एक छवि प्राप्त करने के लिए अधिग्रहण बटन पर क्लिक करें।
  22. छवि में एक छेद केंद्र के लिए ढूँढें और केंद्र छेद बटन पर क्लिक करें।
  23. 0.5 s (डिफ़ॉल्ट) के लिए छवि शिफ्ट के बाद देरी के लिए मान सेट करें और चरण शिफ्ट के बाद 20 s के लिए देरी।
    नोट: जैसा कि समानांतर बीम व्यास इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले 200 केवी क्रायो-टीईएम सिस्टम पर तय किया गया है और आमतौर पर 50-μm एपर्चर के साथ 1.6-1.7 μm से मेल खाता है, R-1.2/1.3 ग्रिड और R-2/1 या R-2/2 ग्रिड का उपयोग करके प्रति छेद 2 छवियों (विपरीत किनारों के पास) प्रति छेद 2 छवियों का उपयोग करके प्रति छेद केवल 1 छवि प्राप्त की जा सकती है। कृपया ध्यान दें कि स्क्रीन पर सेट अधिग्रहण क्षेत्रों का आकार वास्तविक बीम व्यास के अनुरूप नहीं है। छवि स्केल बार का उपयोग एक उपयुक्त प्लेसमेंट दूरी का अनुमान लगाने के लिए किया जा सकता है।
  24. अधिग्रहण क्षेत्र जोड़ें बटन का चयन करें और केंद्रित छेद में उस स्थान का चयन करने के लिए छवि पर क्लिक करें जहां उच्च-आवर्धन छवि अधिग्रहण से लिया जाएगा।
  25. ऑटोफोकस एरिया जोड़ें बटन का चयन करें और केंद्रित छेद के बगल में समर्थन पन्नी पर स्थान का चयन करने के लिए छवि पर क्लिक करें जहां छवि ऑटोफोकस किया जाएगा।
    नोट: ध्यान केंद्रित करने के लिए बीम आकार 1.6-1.7 μm है और कार्बन पर पड़ोसी छेद से समान दूरी पर रखा जाना चाहिए।
  26. सॉफ़्टवेयर विंडो के शीर्ष अनुभाग में Defocus सूची में defocus मानों का एक अनुक्रम सेट करने के लिए हरे रंग के अधिग्रहण क्षेत्र पर क्लिक करें। निम्न टेम्पलेट निष्पादन कार्य के परीक्षण रन में कणों के विज़ुअलाइज़ेशन को एन्हांस करने के लिए पहले के रूप में उच्चतम defocus दर्ज करें।
  27. एक ही क्षेत्र में autofocus-विशिष्ट सेटिंग्स सेट करने के लिए नीले autofocus क्षेत्र पर क्लिक करें:
    1. प्रत्येक AFIS क्लस्टर की शुरुआत में autofocus करने के लिए केंद्रीकरण के बाद विकल्प चुनें।
    2. तेजी से autofocusing और कम चरण बहाव के लिए विकल्प उद्देश्य लेंस चुनें.
  28. टेम्पलेट निष्पादन कार्य का चयन करें और निष्पादित करें बटन पर क्लिक करें।
    1. डेटा अधिग्रहण प्रक्रिया के अलग-अलग चरणों का निरीक्षण करें (चयनित क्षेत्र में छेद, ऑटोफोकस, और सेट क्षेत्रों में छवि अधिग्रहण को केंद्र में रखें) और अंतिम उच्च-आवर्धन छवि में छविकृत कणों की गुणवत्ता की जांच करें।
    2. FFT छवि की जांच करने के लिए उच्च आवर्धन छवि विंडो के नीचे दाईं ओर FFT बटन पर क्लिक करें और नेत्रहीन रूप से आकलन करें कि क्या थॉन के छल्ले कई दोलनों को दिखाते हैं और FFT छवि में उच्च रिज़ॉल्यूशन तक विस्तारित होते हैं।
  29. यदि टेम्पलेट निष्पादन सफलतापूर्वक पूर्ण हो जाता है, तो इस पहले ग्रिड वर्ग में उपयोग की गई सेटिंग्स के अनुसार अन्य सभी चयनित ग्रिड वर्गों में स्वचालित रूप से डेटा संग्रह सेट करने के लिए होल चयन कार्य में सभी वर्ग तैयार करें बटन पर क्लिक करें.

6. डेटा संग्रह शुरू करने से पहले अंतिम माइक्रोस्कोप संरेखण

नोट:: सर्वोत्तम उच्च-रिज़ॉल्यूशन परिणामों को प्राप्त करने के लिए, सबसे संवेदनशील संरेखण डेटा संग्रह सॉफ़्टवेयर में डेटा अधिग्रहण मोड के रूप में और वास्तविक डेटा अधिग्रहण शुरू करने से ठीक पहले एक ही सेटिंग्स पर किया जाना चाहिए। इन संरेखणों को ग्रिड के पतले समर्थन कार्बन के साथ एक स्थिति में किया जाना चाहिए, जो किसी भी ग्रिड सलाखों से पर्याप्त रूप से दूर है, और यूसेंट्रिक ऊंचाई पर संरेखित है।

  1. टेम्पलेट निष्पादन कार्य का चयन करें, एक नई छवि प्राप्त करें और एक राइट-क्लिक करके कार्बन पन्नी पर एक साफ क्षेत्र में मंच के साथ ले जाएँ और मेनू विकल्प का चयन करें स्टेज यहाँ ले जाएँ।
  2. ऑटो फ़ंक्शंस टैब का चयन करें और वांछित defocus को 0 μm पर सेट करें और -2 μm पर पुनरावृत्ति करें। Autofocus preset पर स्विच करें और Autofocus फ़ंक्शन को चलाने के लिए प्रारंभ बटन पर क्लिक करें।
  3. फ्लोरोसेंट स्क्रीन नीचे रखो और TEM UI में प्रत्यक्ष संरेखण के मेनू खोलें।
  4. सर्वोत्तम परिणामों के लिए, अनुभवी उपयोगकर्ता पिवट बिंदु संरेखण सत्यापित कर सकते हैं: प्रत्यक्ष संरेखण मेनू में nP बीम टिल्ट पीपी एक्स कार्य चुनें और नियंत्रण कक्षों पर Multifunction knobs का उपयोग करके उछाल बीम को अधिकतम रूप से ओवरलैप करें। एनपी बीम झुकाव पीपी वाई कार्य के लिए दोहराएँ।
  5. फ्लोरोसेंट स्क्रीन कैमरा मेनू में ईएफ बटन पर क्लिक करें एक हरे रंग का सर्कल दिखाने के लिए जो ऊर्जा-फ़िल्टर प्रवेश द्वार एपर्चर को इंगित करता है और हरे सर्कल पर बीम को केंद्र में रखता है।
    नोट: सुनिश्चित करें कि टर्बो पंप जारी रखने से पहले बंद कर दिया गया है; इससे कंपन दिखाई देने वाले थॉन के छल्ले की संख्या को कम करते हैं और अक्सर ऑटो कार्यों को विफल करने का कारण बनते हैं।
  6. सॉफ़्टवेयर विंडो पर वापस जाएँ और मेनू बार में ऑटो फ़ंक्शंस टैब का चयन करें.
  7. Autostigmate कार्य का चयन करें, थॉन रिंग प्रीसेट पर स्विच करें, और प्रारंभ बटन दबाएँ। यह सुनिश्चित करने के लिए प्रक्रिया का निरीक्षण करें कि (i) ली गई छवियां कार्बन पर हैं, (ii) थॉन-रिंग स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं, और (iii) गणना की गई सीटीएफ फिट (बिंदीदार रेखाएं) अच्छी तरह से थॉन-रिंग मिनिमा (पूरक चित्रा 2) पर रखी गई हैं।
  8. Autocoma कार्य का चयन करें और प्रारंभ करें बटन दबाएँ। यह सुनिश्चित करने के लिए प्रक्रिया का निरीक्षण करें कि ली गई छवियां कार्बन पर हैं और थॉन के छल्ले स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं और गणना की गई फिट बैठती है (बिंदीदार रेखाएं) थॉन-रिंग मिनिमा में अच्छी तरह से रखी गई हैं। माउस स्क्रॉल व्हील (पूरक चित्रा 3) का उपयोग करके प्रत्येक थॉन-रिंग छवि में ज़ूम करें।
    नोट: यदि माइक्रोस्कोप एक ऊर्जा फ़िल्टर से सुसज्जित है, तो ऊर्जा फ़िल्टर ट्यूनिंग को संरेखण अनुक्रम के हिस्से के रूप में किया जाना चाहिए ताकि फ़िल्टर स्लिट को शून्य-हानि शिखर पर केंद्रित किया जा सके और ऊर्जा फ़िल्टर के प्रिज्म में किसी भी विकृतियों को सही किया जा सके (चरण 6.9-6.14)। इन संरेखणों को ग्रिड के खाली क्षेत्र में किया जाना चाहिए, जैसे कि टूटे हुए ग्रिड वर्ग के अंदर।
  9. शेरपा यूआई खोलें और ऊर्जा फ़िल्टर अनुप्रयोग (अनुपूरक चित्रा 4) का चयन करें।
  10. कैमरा को EF-फाल्कन, बिन 4x, एक्सपोज़र समय 0.2 s सेटिंग्स विंडो में सेट करें।
  11. शून्य-हानि ऊर्जा फ़िल्टर भट्ठा केंद्र के लिए शून्य हानि विकल्प में केंद्र बटन पर क्लिक करें।
  12. Isochromaticity विकल्प (अनुपूरक चित्रा 4) में ट्यून बटन पर क्लिक करें।
  13. ज्यामितीय और रंगीन विरूपण के विकल्प में ट्यून आवर्धन और ट्यून विरूपण पर क्लिक करें (अनुपूरक चित्रा 5, पूरक चित्रा 6)
  14. यदि परिणाम संकेतित विनिर्देशों के भीतर नहीं हैं और आउटपुट रिपोर्ट में लाल रंग में दिखाए गए हैं, तो चरण 6.11 से संरेखण को फिर से दोहराएँ।
    नोट: यद्यपि प्रत्यक्ष इलेक्ट्रॉन डिटेक्टर लाभ संदर्भ महीनों में स्थिर हो सकता है, एक नया लाभ संदर्भ फाल्कन 4 संदर्भ छवि प्रबंधक का उपयोग करके लिया जाना चाहिए यदि खाली क्षेत्रों की छवियां समान तीव्रता नहीं दिखाती हैं, लेकिन पट्टियों या अन्य विशिष्ट विशेषताओं को प्रदर्शित करती हैं। वैकल्पिक रूप से, ऐसी छवि के फास्ट फूरियर ट्रांसफॉर्म (एफएफटी) की गणना करें और सुनिश्चित करें कि कोई रेखाएं दिखाई नहीं दे रही हैं।
  15. सॉफ़्टवेयर विंडो में, तैयारी टैब का चयन करें और डेटा अधिग्रहण पूर्व निर्धारित पर स्विच करें।
  16. खुराक सेटिंग को 40 ई-/ Å2 पर सेट करें और खुराक दर को मापें बटन पर क्लिक करें।
  17. EPU टैब पर जाएँ, स्वचालित अधिग्रहण कार्य का चयन करें, और वैकल्पिक रूप से स्वत: शून्य हानि फ़ंक्शन की जाँच करें; पूरी तरह से स्वचालित डेटा संग्रह शुरू करने के लिए प्रारंभ चलाएँ बटन पर क्लिक करें।

7. डेटा संग्रह के दौरान डेटा की गुणवत्ता की निगरानी और अनुकूलन

नोट:: डेटा संग्रह चल रहा है, जबकि एकत्रित डेटा डेटा प्रबंधन पोर्टल के माध्यम से EQM का उपयोग कर मॉनिटर किया जा सकता है। EQM गति सुधार और CTF निर्धारण पर मक्खी प्रदर्शन करता है और पोर्टल में परिणाम प्रदर्शित करता है. उपयोगकर्ता तब व्यक्तिगत अधिग्रहण की गुणवत्ता का न्याय करने में सक्षम होता है, विभिन्न गुणवत्ता संकेतकों पर रेखांकन देखता है, अवांछित अधिग्रहणों को फ़िल्टर करता है और डेटा को मक्खी पर या बैच नौकरी के रूप में अपने अंतिम भंडारण में निर्यात करता है।

  1. उस डेटासेट पर नेविगेट करें जो सॉफ़्टवेयर का विश्लेषण करता है जो डेटा को वेब ब्राउज़र का उपयोग करने के लिए रखता है।
  2. डेटासेट अवलोकन में, अधिग्रहण कार्ड एक ग्राफिक प्रारूप में गति सुधार और CTF निर्धारण के बारे में जानकारी प्रदर्शित करते हैं। अधिक जानकारी प्राप्त करने के लिए व्यक्तिगत कार्ड पर क्लिक करें।
  3. DataViz पैनल को पूर्ण डेटासेट से एकत्रित रेखांकन दिखाने के लिए सक्षम करें जो अधिग्रहण प्रति defocus, astigmatism, और CTF विश्वास श्रेणी दिखाते हैं (अनुपूरक चित्रा 7).
  4. केवल अनुरोधित defocus श्रेणी के भीतर हैं जो डेटा का चयन करने के लिए पैनल के शीर्ष पर फ़िल्टर का उपयोग करें, शून्य के करीब अस्थिरता है, और CTF निर्दिष्ट (लक्ष्य) रिज़ॉल्यूशन तक निर्धारित किया जा सकता है। एक बार फ़िल्टर सेट अप होने के बाद, डेटासेट ओवरव्यू विंडो में केवल चुने गए डेटा को प्रदर्शित करने के लिए लागू करें बटन दबाएँ .
  5. जब अधिग्रहित छवियों में से अधिकांश सेट मापदंड के भीतर होते हैं, तो डेटा संग्रह सत्र को पूरा करना जारी रखने दें। यदि अधिग्रहित छवियों का केवल एक बहुत छोटा सा अंश सेट मानदंडों को पूरा करता है, तो या तो विश्लेषण सॉफ़्टवेयर सेटिंग्स को फिर से कॉन्फ़िगर करें, नमूने पर किसी अन्य क्षेत्र में जाएं (विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में अगला ग्रिड स्क्वायर बटन दबाएं), या डेटा संग्रह को रोकें।

Representative Results

डेटा प्रबंधन पोर्टल एक एकल सॉफ़्टवेयर प्लेटफ़ॉर्म में एकाधिक प्रयोगात्मक वर्कफ़्लोज़ से एकत्रित छवियों, डेटा और मेटाडेटा का कुशल, संरचित संग्रहण प्रदान करता है. किसी बनाए गए प्रोजेक्ट में प्रत्येक परिभाषित प्रयोग में ग्राहक-परिभाषित चरणों के साथ एक वर्कफ़्लो होता है, जो नमूना जानकारी, एकत्र किए गए डेटा और संबंधित मेटाडेटा को कैप्चर करने के लिए बिना किसी बाधा के किसी भी संभावित प्रयोगों और सभी उपयोग मामलों के लिए अधिकतम लचीलापन और प्रयोज्य प्रदान करता है (चित्रा 1, चित्रा 2)। डेटा प्रबंधन पोर्टल में वर्कफ़्लो चरणों को चित्रित करने के लिए एक प्रयोगशाला नोट कार्यक्षमता भी है, जिसमें मध्यवर्ती परिणामों के साथ छवि प्रसंस्करण शामिल है, जो सभी एक साथ एक परियोजना से जुड़े हो सकते हैं और रिपोर्ट और प्रकाशनों के विश्लेषण और निर्माण के लिए यथासंभव पूर्ण रिकॉर्ड प्रदान कर सकते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: डेटा प्रबंधन प्लेटफ़ॉर्म में डेटा और मेटाडेटा के संभावित संगठन का उदाहरण. प्रत्येक परियोजना में कई प्रयोग शामिल हो सकते हैं, जैसे क्रायो-ईएम या मास-स्पेक्ट्रोस्कोपी (जैसे प्रोटोकॉल चरण 2.3)। प्रत्येक प्रयोग में एकाधिक उपयोगकर्ता-परिभाषित वर्कफ़्लोज़ (जैसे प्रोटोकॉल चरण 2.5) शामिल हो सकते हैं, जिनमें से प्रत्येक में एकाधिक कॉन्फ़िगर करने योग्य चरण (जैसे प्रोटोकॉल चरण 2.7) शामिल होते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: डेटा प्रबंधन प्लेटफ़ॉर्म में किसी खुले प्रोजेक्ट वर्कफ़्लो पर देखें. यह आकृति वर्कफ़्लो में खोले गए चरण के लिए संबद्ध मेटाडेटा और नोट्स दिखाती है. माउस के साथ बाईं पट्टी डेटा प्रबंधन प्लेटफ़ॉर्म के विभिन्न विकल्पों और मेनू तक त्वरित पहुंच प्रदान करती है। बाएँ पैनल में सहेजे गए वर्कफ़्लोज़ की एक सूची शामिल है (केवल एक सहेजा गया वर्कफ़्लो "Exp2_ApoF_EFTEM_Grid7" दिखाया गया है) और एक नया वर्कफ़्लो जोड़ने के लिए एक नीला बटन. केंद्रीय पैनल खोले गए वर्कफ़्लो में अलग-अलग चरण दिखाता है, जैसा कि यहां SPA वर्कफ़्लो के लिए दिखाया गया है. ऊपर दाईं ओर नीला बटन खुले वर्कफ़्लो में एक अतिरिक्त चरण जोड़ सकता है. दाएँ पैनल में या तो रिकॉर्ड किए गए मेटाडेटा या वर्कफ़्लो के उपयोगकर्ता-इनपुट नोट्स के लिए स्थान शामिल है, जिसमें पाठ, तालिकाएँ और छवियाँ शामिल हो सकती हैं. पाठ के लिए विभिन्न स्वरूपण विकल्प उपलब्ध हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पारंपरिक डुबकी-फ्रीजिंग उपकरणों के साथ उत्पादित क्रायो-ईएम ग्रिड, जैसे कि विट्रोबॉट आमतौर पर ग्रिड की सतह पर बर्फ की मोटाई का एक ढाल प्रदर्शित करेगा। कुछ ग्रिड को मैन्युअल हैंडलिंग और / या ऑटोग्रिड रिंग कैरियर में क्लिपिंग के बाद क्षतिग्रस्त (मुड़ा हुआ) भी किया जा सकता है। चित्र 3 एटलस सिंहावलोकन में दिखाए गए अनुसार विभिन्न ग्रिड के उदाहरण दिखाता है। मोटी बर्फ या क्षति वाले ग्रिड को आगे की जांच से बाहर रखा जाना चाहिए।

Figure 3
चित्र 3: एटलस अवलोकन में देखे गए विभिन्न ग्रिडों की गैलरी। (A) मोटी बर्फ के साथ एक खराब ग्रिड, (B) खराब बर्फ और बर्फ संदूषण के साथ एक मुड़ा हुआ ग्रिड, (C) अच्छी बर्फ ढाल के साथ एक स्वीकार्य ग्रिड, (D) अच्छी पतली बर्फ और छोटी बर्फ ढाल के साथ एक विशिष्ट ग्रिड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

बिना किसी नुकसान और इष्टतम बर्फ की मोटाई के साथ ग्रिड वर्गों का चयन उच्च-रिज़ॉल्यूशन डेटासेट एकत्र करने के लिए महत्वपूर्ण है। बर्फ की मोटाई व्यक्तिगत ग्रिड वर्गों के स्तर पर भी भिन्न हो सकती है, और इसलिए, प्रत्येक चयनित ग्रिड वर्ग से इष्टतम पतली बर्फ के साथ केवल छेद का चयन करना महत्वपूर्ण है। चित्रा 4 केंद्र में बरकरार पन्नी और पतली बर्फ के साथ एक उपयुक्त ग्रिड वर्ग से पता चलता है। दिखाया गया ग्रिड वर्ग सभी चयनित ग्रिड वर्गों में पतली बर्फ के साथ छेद के स्वचालित चयन के लिए एक फिल्टर सेट करने के लिए अच्छा है क्योंकि इसमें बर्फ की मोटाई के साथ-साथ बर्फ के बिना खाली छेद की एक श्रृंखला शामिल है, जो होल चयन कार्य में बर्फ फिल्टर में तीव्रता की एक उपयुक्त सीमा स्थापित करने के लिए बेहद उपयोगी है।

Figure 4
चित्रा 4: बर्फ मोटाई के एक ढाल के साथ एक उदाहरण ग्रिड वर्ग, केंद्र में खाली ग्रिड वर्गों और ग्रिड सलाखों के पास मोटी बर्फ से। बर्फ की गुणवत्ता के फिल्टर का उपयोग आदर्श बर्फ की मोटाई के साथ छेद के अंदर तीव्रता की सीमा का चयन करने के लिए किया जा सकता है जो तदनुसार ग्रिड वर्ग (हरे ओवरले वाले छेद) में चुने जाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करके बेंचमार्क परिणाम किक्कावा समूह11 से माउस एपो-फेरिटिन (एपीओएफ) के नमूने का उपयोग करके प्राप्त किए गए थे। ApoF एक अत्यधिक α-हेलिकल प्रोटीन है जो एक बहुत ही स्थिर ऑक्टाहेड्रल पिंजरे का निर्माण करता है। उच्च स्थिरता और उच्च समरूपता apoF उच्च संकल्प क्रायो-EM इमेजिंग और छवि प्रसंस्करण के लिए एक इष्टतम नमूना बनाते हैं। इसलिए ApoF क्रायो-ईएम उपकरणों11,12,13 के प्रदर्शन का आकलन करने के लिए एक मानक नमूना बन गया है। 15 मिलीग्राम / एमएल शुद्ध apoF नमूने वाले एक जमे हुए एलीकोट को बर्फ पर पिघलाया गया था और 10 मिनट के लिए 10,000 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा स्पष्ट किया गया था। supernatant 20 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl के साथ 5 mg / mL करने के लिए पतला किया गया था। पतला नमूना के 3 μL एक चमक-डिस्चार्ज R-1.2/ फिर ग्रिड को तरल नाइट्रोजन द्वारा ठंडा किए गए तरल एथेन में डुबकी-फ्रीजिंग से पहले 5 सेकंड के लिए धब्बा दिया गया था। प्लंज-फ्रीजिंग 100% आर्द्रता और 4 डिग्री सेल्सियस पर पूरी तरह से स्वचालित विट्रीफिकेशन सिस्टम का उपयोग करके किया गया था। सभी ग्रिड autogrids में clipped और एक 200 kV क्रायो-TEM में लोड किया गया. लगभग 3000 फिल्मों को 300 फिल्मों / घंटा के थ्रूपुट पर एकत्र किया गया था। डेटा को निम्नलिखित संशोधनों के साथ11 वर्णित विधियों का उपयोग करके संसाधित किया गया था: i) Relion 4-बीटा संस्करण का उपयोग Relion 3.1 के बजाय किया गया था, ii) स्वचालित कण पिकिंग को संदर्भ के रूप में पिछले apoF पुनर्निर्माण के 2 D वर्ग औसत का उपयोग करके किया गया था, और iii) प्रारंभिक 3 D मॉडल पिछले apoF पुनर्निर्माण से उत्पन्न किया गया था जो 15-Å रिज़ॉल्यूशन के लिए कम पारित किया गया था। इस डेटासेट के लिए ऑप्टिक्स ग्रुपिंग नहीं की गई थी क्योंकि उपयोग की गई एएफआईएस प्रक्रिया34 को प्रभावी ढंग से और मज़बूती से बीम-झुकाव प्रेरित चरण बदलावों को कम करने के लिए साबित किया गया है जो रिपोर्ट किए गए प्रस्तावों पर 3 डी मानचित्रों के पुनर्निर्माण के लिए डेटा की गुणवत्ता को सीमित नहीं करते हैं। Bayesian चमकाने और CTF शोधन के बाद 3 डी शोधन 1.68 Å संकल्प मानचित्र के लिए नेतृत्व किया. संकल्प को 1.63 Å रिज़ॉल्यूशन मानचित्र के परिणामस्वरूप Ewald क्षेत्र सुधार के साथ और बेहतर बनाया गया था। डेटा संग्रह और प्रसंस्करण मापदंडों का अवलोकन तालिका 2 में दिखाया गया है, और अंतिम पुनर्निर्मित घनत्व मानचित्र को चित्र 5 में दिखाया गया है, जिसमें पूरक चित्र 8 में दिखाए गए फूरियर शेल सहसंबंध (एफएससी) वक्र हैं।

तालिका 2: डेटा संग्रह और छवि प्रसंस्करण पैरामीटर apo-ferritin के 3 डी पुनर्निर्माण के लिए उपयोग किया जाता है। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: Apo-ferritin के क्रायो-EM पुनर्निर्माण ( बाएं पैनल) 1.6 Å संकल्प पर पुनर्निर्मित apoF क्रायो-EM मानचित्र के 3 D प्रतिपादन। (दायाँ पैनल) व्यक्तिगत अमीनो एसिड साइड चेन के स्तर पर पुनर्निर्मित मानचित्र का विस्तृत दृश्य। अमीनो एसिड साइडचेन का घनत्व अच्छी तरह से हल हो गया है, और परमाणु मॉडल को इस नक्शे के भीतर स्पष्ट रूप से बनाया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

एसपीए पुनर्निर्माण में एक ऊर्जा फिल्टर का उपयोग करने के प्रभाव और लाभों का मूल्यांकन प्रोकैरियोटिक 20एस का उपयोग करके किया गया था जो टी एसिडोफिलम से अलग था। प्रोकैरियोटिक 20एस का उपयोग एक मानक क्रायो-ईएम नमूने के रूप में भी किया गया है क्योंकि यह डी 7 समरूपता के साथ एंटी-कॉम्प्लेक्स के स्थिर उत्प्रेरक कोर का प्रतिनिधित्व करता है। ग्रिड को शुद्ध टी एसिडोफिलम 20एस के 4.5 μL को एक चमक-डिस्चार्ज 200-मेष आर 2/1 कॉपर ग्रिड पर नमूना जोड़कर तैयार किया गया था। नमूनों को एक तरल इथेन / प्रोपेन मिश्रण में एक पूरी तरह से स्वचालित विट्रिफिकेशन सिस्टम का उपयोग करके 4 डिग्री सेल्सियस और 100% आर्द्रता के लिए सेट किया गया था, जिसमें 20 के धब्बा बल और 4.5 सेकंड का धब्बा समय था।

क्रम में ऊर्जा फ़िल्टर की एक अलग भट्ठा चौड़ाई का उपयोग करके समान ग्रिड वर्गों के साथ एक ही क्रायो-ईएम ग्रिड से तीन अलग-अलग डेटासेट एकत्र किए गए थे: i) भट्ठा पूरी तरह से खुला (कोई भट्ठा नहीं डाला गया), ii) 20 ईवी स्लिट और iii) 10 ईवी स्लिट। ग्रिड वर्गों को विश्लेषण सॉफ़्टवेयर के भीतर एक बर्फ गुणवत्ता फ़िल्टर का उपयोग करके चुना गया था। डेटा संग्रह और डेटा प्रसंस्करण के लिए अन्य सभी मापदंडों को समान रखा गया था। डेटासेट को कुल 4000 फिल्मों के साथ 15 घंटे के लिए एकत्र किया गया था और विधियों का उपयोग करके संसाधित किया गया था जैसा कि11 का वर्णन किया गया है, जिसमें संशोधन के साथ रेलिओन 3.1 का उपयोग किया गया था कि लैप्लाशियन-ऑफ-गॉसियन कण पिकिंग एल्गोरिथ्म का उपयोग पूर्ण डेटासेट से संदर्भ-आधारित कण चुनने के लिए प्रारंभिक 2 डी वर्ग औसत का उत्पादन करने के लिए किया गया था। यादृच्छिक रूप से चयनित कणों की एक ही संख्या (102,200) को चुना गया था और प्रत्येक डेटासेट के अंतिम पुनरावृत्ति और 3 डी पुनर्निर्माण के लिए उपयोग किया गया था। डेटा प्रोसेसिंग चर को नीचे दी गई तालिका (तालिका 3) में वर्णित किया गया है ताकि अनुपूरक चित्र 9 में दिखाए गए एफएससी वक्र के साथ चित्र 6 में दिखाए गए अंतिम पुनर्निर्मित ईएम घनत्व मानचित्र को प्राप्त किया जा सके। इन डेटासेट के लिए ऑप्टिक्स ग्रुपिंग और एवाल्ड क्षेत्र सुधार भी नहीं किए गए थे।

तालिका 3: डेटा संग्रह और छवि प्रसंस्करण पैरामीटर टी एसिडोफिलम 20एस के 3 डी पुनर्निर्माण के लिए उपयोग किया जाता है। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

तालिका 4: टी एसिडोफिलम 20एस के क्रायो-ईएम पुनर्निर्माण के लिए प्राप्त संकल्प और बी-फैक्टर का सारांश विभिन्न ऊर्जा भट्ठा चौड़ाई के साथ डेटासेट का उपयोग करके। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: क्रायो-ईएम छवियों पर ऊर्जा फ़िल्टरिंग का प्रभाव( ए) क्रायो-ईएम छवियों को 10 ईवी स्लिट के साथ या बिना एकत्र किए गए विभिन्न डिफोकस मूल्यों पर। (बी) खंडित सबयूनिट्स के साथ 20एस के क्रायो-ईएम मानचित्र का अवलोकन। (C) एक फिट परमाणु मॉडल के साथ 20S के मानचित्र पर ज़ूम दृश्य। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 1: विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में विभिन्न ऑप्टिकल प्रीसेट (लाल दीर्घवृत्त) के बीच छवि बदलावों को संरेखित करने के लिए छवि शिफ्ट कार्य (पीले दीर्घवृत्त) का अंशांकन, हेक्सागोनल बर्फ के क्रिस्टल का उपयोग करके जो 100x से 165,000x के बीच पूर्ण आवर्धन सीमा में दिखाई देता है। (ऊपर) डेटा अधिग्रहण और होल / Eucentric ऊंचाई presets के बीच अंशांकन, (मध्य) होल / Eucentric ऊंचाई और ग्रिड स्क्वायर presets के बीच अंशांकन, (नीचे) ग्रिड स्क्वायर और एटलस presets के बीच अंशांकन. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

अनुपूरक चित्रा 2: विश्लेषण सॉफ्टवेयर (पीला दीर्घवृत्त) में Autostigmate समारोह. (बाएँ छवि) अधिग्रहित छवि. (सही छवि) अधिग्रहित छवि का फूरियर स्थानांतरण जो संकेंद्रित थॉन के छल्ले और रेडियल बीम में दिखाए गए उनके सीटीएफ फिट को दर्शाता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

अनुपूरक चित्रा 3: कोमा संरेखण के लिए विश्लेषण सॉफ़्टवेयर (पीले दीर्घवृत्त) में ऑटोकोमा फ़ंक्शन का उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस। छवि पैनल विभिन्न बीम झुकाव पर अधिग्रहित फूरियर स्थानांतरण छवियों को दिखाता है और उनके सीटीएफ फिट बैठता है जो कोमा की गणना के लिए उपयोग किए जाते हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

अनुपूरक चित्रा 4: ऊर्जा फ़िल्टर ट्यूनिंग के उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस. विनिर्देशों के भीतर सभी मापदंडों (हरे पाठ में दिखाया गया है) के साथ ऊर्जा फ़िल्टर आइसोक्रोमेसिटी की एक अच्छी ट्यूनिंग रिपोर्ट का उदाहरण। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

अनुपूरक चित्रा 5: ऊर्जा फ़िल्टर ट्यूनिंग के उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस. विनिर्देशों के भीतर सभी पैरामीटर (हरे पाठ में दिखाया गया है) के साथ ऊर्जा फ़िल्टर आवर्धन विकृतियों की अच्छी ट्यूनिंग रिपोर्ट का उदाहरण। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

अनुपूरक चित्रा 6: ऊर्जा फ़िल्टर ट्यूनिंग के उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस. विनिर्देशों के भीतर सभी मापदंडों (हरे रंग के पाठ में दिखाया गया) के साथ ऊर्जा फ़िल्टर रंगीन विकृतियों की अच्छी ट्यूनिंग का उदाहरण। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

अनुपूरक चित्रा 7: एक एकत्रित क्रायो-ईएम डेटासेट में डेटा गुणवत्ता के सिंहावलोकन के साथ EPU गुणवत्ता मॉनिटर का DataViz पैनल। सभी एकत्रित छवियों / फिल्मों से एकत्रित डेटा के साथ रेखांकन चयनित महत्वपूर्ण गुणवत्ता संकेतकों के मूल्यों (डॉट प्लॉट्स) और वितरण (बार प्लॉट्स) को दिखाते हैं, जैसे कि सीटीएफ फिट आत्मविश्वास (नीला), डिफोकस (नारंगी), और अस्थिरता (हरा)। एकत्रित छवियों/फिल्मों के सबसेट को DataViz पैनल के शीर्ष में पैरामीटर फ़िल्टर सेट करके चुना जा सकता है. फ़िल्टर लागू करने के बाद, चयनित छवियों / फिल्मों को किसी अन्य छवि प्रसंस्करण पैकेज में आगे के प्रसंस्करण के लिए निर्यात किया जा सकता है, जैसे कि Relion या CryoSpark। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

अनुपूरक चित्रा 8: 1.6 Å संकल्प के लिए apoF के अंतिम पुनर्निर्माण के FSC वक्र, के रूप में Relion 4-बीटा द्वारा रिपोर्ट की गई. नीला वक्र दो पारस्परिक रूप से अनन्य आधे डेटासेट से दो स्वतंत्र रूप से परिष्कृत 3 डी पुनर्निर्माण से नकाबपोश 3 डी मानचित्रों के एफएससी को दिखाता है। 0.143 पर सोने के मानक एफएससी के अनुसार, पूर्ण डेटासेट से पुनर्निर्मित अंतिम 3 डी मानचित्र का संकल्प 1.6 Å से मेल खाता है। नारंगी वक्र यादृच्छिक चरणों के साथ नकाबपोश 3 डी पुनर्निर्माण के एफएससी से पता चलता है। एफएससी वक्र की तेजी से गिरावट इंगित करती है कि उपयोग किए गए मुखौटा ने ~ 2 Å रिज़ॉल्यूशन से परे मूल पुनर्निर्मित मानचित्र (नीले वक्र) के देखे गए एफएससी में योगदान नहीं दिया। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

अनुपूरक चित्रा 9: टी एसिडोफिलम 20एस के अंतिम पुनर्निर्माण के एफएससी वक्र ऊर्जा फिल्टर के विभिन्न भट्ठा चौड़ाई का उपयोग करके, जैसा कि रेलिओन 3.1 द्वारा रिपोर्ट किया गया है। नीले वक्र क्रमशः प्रत्येक डेटासेट के दो आधे डेटासेट से दो स्वतंत्र रूप से परिष्कृत पुनर्निर्माण से नकाबपोश 3 डी मानचित्रों के एफएससी को दिखाते हैं। 0.143 पर स्वर्ण-मानक FSC संबंधित पूर्ण डेटासेट (क्रमशः 2.3 Å, 2.2 Å, और 2.1 Å रिज़ॉल्यूशन) से पुनर्निर्मित अंतिम 3D मानचित्रों के प्राप्त संकल्पों को इंगित करता है। लाल घटता यादृच्छिक चरणों के साथ नकाबपोश नक्शे के FSC दिखाते हैं। लाल FSC घटता की तेजी से ड्रॉप इंगित करता है कि इस्तेमाल किया मुखौटा ~ 3 Å संकल्प से परे मूल पुनर्निर्मित नक्शे के FSC करने के लिए योगदान नहीं किया था. हरे रंग के वक्र बिना मास्क वाले 3 डी मानचित्रों के एफएससी को दिखाते हैं, जो पूरे पुनर्निर्मित 3 डी वॉल्यूम में शोर से प्रभावित होते हैं और इसलिए नकाबपोश 3 डी मानचित्रों के एफएससी की तुलना में जल्द ही छोड़ देते हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

डेटा की उपलब्धता: क्रायो-ईएम घनत्व मानचित्रों को परिग्रहण संख्याओं के तहत ईएम डेटा बैंक में जमा किया गया है: एपोफेरिटिन: ईएमडी 14173, EMPIAR-10973। 20S: EMD 14467, EMPIAR-10976.

Discussion

वर्णित प्रोटोकॉल मानता है कि उपयोग किए गए टीईएम माइक्रोस्कोप का प्रकाशिकी एक अच्छी तरह से संरेखित स्थिति में है। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले 200 केवी टीईएम के लिए, ऐसे कॉलम संरेखण किए जाते हैं, सत्यापित किए जाते हैं, और माइक्रोस्कोप स्थापना या किसी भी महत्वपूर्ण सेवा हस्तक्षेप के बाद एक अनुभवी सेवा इंजीनियर द्वारा सहेजे जाते हैं। इन संरेखण सेटिंग्स को माइक्रोस्कोप यूआई में कभी भी याद किया जा सकता है। उपयोगकर्ता माइक्रोस्कोप UI में प्रत्यक्ष संरेखण प्रक्रियाओं का उपयोग महत्वपूर्ण पैरामीटर को फिर से tweak करने के लिए कर सकते हैं। कुछ संरेखण, जैसे कि बंदूक झुकाव और बंदूक शिफ्ट, स्थिर हैं और दैनिक आधार पर उपयोगकर्ताओं द्वारा समायोजित करने की आवश्यकता नहीं है। माइक्रोस्कोप पर्यवेक्षक द्वारा बंदूक झुकाव और शिफ्ट की जांच और पुन: संरेखण (यदि आवश्यक हो) को वर्ष में दो बार सलाह दी जाती है। दूसरी ओर, कुछ संरेखण महत्वपूर्ण हैं और ऊपर दिए गए प्रोटोकॉल में वर्णित प्रत्येक डेटा संग्रह से पहले संरेखित किया जाना चाहिए (जैसे उद्देश्य अस्थिरता और कोमा-मुक्त संरेखण)। यदि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में ऑटोकोमा फ़ंक्शन अभिसरण करने में विफल रहता है, तो बीम झुकाव धुरी बिंदुओं और / या रोटेशन केंद्र के संरेखण को सत्यापित और समायोजित किया जाना चाहिए, और C2 एपर्चर के सही केंद्रीकरण की पुष्टि की जानी चाहिए। इसके बाद, Autostigmate फ़ंक्शन को चलाया जाना चाहिए क्योंकि उद्देश्य stigmators कोमा सुधार के लिए भी उपयोग किया जाता है। इन संरेखणों को तब तक पुनरावृत्त किया जाना चाहिए जब तक कि ऑटोस्टिगमेट और ऑटोकोमाफ़ंक्शन दोनों अपने पहले पुनरावृत्ति पर सफल न हों। यदि आवश्यक हो, तो एक और क्षेत्र का चयन किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, बर्फ के बिना कार्बन पन्नी का समर्थन करें), इमेज्ड डेफोकस समायोजित, या अधिग्रहित छवियों में सिग्नल-टू-शोर अनुपात को अनुकूलित करने के लिए छवि अधिग्रहण समय में वृद्धि हुई, और अधिग्रहित छवियों के फूरियर रूपांतरण में कई थॉन रिंगों की दृश्यता।

आधुनिक क्रायो-ईएम माइक्रोस्कोप बड़ी मात्रा में डेटा उत्पन्न करते हैं जो अक्सर उच्च-रिज़ॉल्यूशन 3 डी पुनर्निर्माण प्राप्त करने के लिए प्रति डेटासेट 1 टीबी से अधिक होता है, विशेष रूप से कम समरूपता वाले प्रोटीन के लिए। क्रायो-ईएम डेटा और परिणाम भी आमतौर पर प्रत्येक वैज्ञानिक परियोजना में संरचना-कार्य संबंधों को पूरी तरह से समझने के लिए ऑर्थोगोनल तरीकों से डेटा और परिणामों द्वारा पूरक होते हैं। एकत्र किए गए डेटा का संगठन, एक छवि प्रसंस्करण पाइपलाइन में उनका स्थानांतरण, और सहयोगियों के बीच एक परिणामी क्रायो-ईएम पुनर्निर्माण को साझा करने से उनके स्थानीय आईटी बुनियादी ढांचे को स्थापित करने के लिए क्रायो-ईएम पद्धति के नए गोद लेने वालों पर अतिरिक्त आवश्यकताएं रखी गईं। डेटा प्रबंधन सॉफ़्टवेयर, जैसे एथेना, किसी भी कनेक्टेड इंस्ट्रूमेंट या एक पंजीकृत उपयोगकर्ता द्वारा संचालित सॉफ़्टवेयर द्वारा अधिग्रहित डेटा के केंद्रीकृत भंडारण की सुविधा प्रदान करता है। संग्रहीत डेटा और मेटाडेटा कई उपयोगकर्ताओं द्वारा एक साधारण वेब ब्राउज़र इंटरफ़ेस का उपयोग करके सुलभ होते हैं, जिनके पास प्रयोग सेटअप में उनके लॉगिन क्रेडेंशियल्स और डेटा साझाकरण परिभाषा के आधार पर विभिन्न एक्सेस अधिकारों (या तो मालिक, सहयोगी या दर्शक के रूप में) के साथ परियोजना में अलग-अलग भूमिकाएं हो सकती हैं। प्रयोगात्मक वर्कफ़्लोज़ का यह डिजिटलीकरण अनावश्यक दोहराव के बिना सहयोगियों के बीच डेटा और मेटाडेटा साझाकरण के लिए साधन प्रदान करता है और उपयोग किए गए वर्कफ़्लोज़ की उत्पादकता और ट्रेसेबिलिटी को बढ़ाता है। डेटा प्रबंधन सॉफ़्टवेयर में परियोजनाओं, प्रयोगों और वर्कफ़्लोज़ की एक सामान्य और अनुकूलन योग्य संरचना का कार्यान्वयन सार्वभौमिक है और एकल प्रोजेक्ट डेटाबेस में पूरक विधियों का उपयोग करके ऑर्थोगोनल प्रयोगों के अनुकूलन और एकीकरण की अनुमति देता है।

क्रायो-ईएम ग्रिड पर डेटा संग्रह के लिए क्षेत्रों का चयन उच्च-रिज़ॉल्यूशन डेटासेट के सफल अधिग्रहण के लिए महत्वपूर्ण है। पारंपरिक डुबकी-फ्रीजिंग उपकरणों के साथ उत्पादित क्रायो-ईएम ग्रिड, जैसे कि विट्रोबॉट (एक पूरी तरह से स्वचालित विट्रीफिकेशन सिस्टम), आमतौर पर ग्रिड सतह पर बर्फ की मोटाई का एक ढाल प्रदर्शित करेगा (चित्रा 4)। यह फायदेमंद हो सकता है क्योंकि ग्रिड में विभिन्न बर्फ मोटाई वाले क्षेत्र शामिल हैं; हालांकि, डेटा संग्रह के लिए आदर्श बर्फ मोटाई वाले क्षेत्रों को ऊपर दिए गए प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में पहचाना जाना चाहिए। एक इष्टतम क्रायो-ईएम ग्रिड में जितना संभव हो उतना कम हस्तांतरण बर्फ संदूषण होना चाहिए और इसमें बरकरार छेदे समर्थन पन्नी के साथ पर्याप्त ग्रिड वर्ग होने चाहिए। ग्रिड-वर्गों पर डेटा का संग्रह जिसमें दरारें या टूटे हुए क्षेत्र हैं, की सिफारिश नहीं की जाती है क्योंकि एकत्र की गई छवियां बरकरार समर्थन पन्नी के साथ ग्रिड वर्गों की तुलना में इलेक्ट्रॉन बीम द्वारा रोशनी पर काफी मजबूत समग्र बहाव से प्रभावित होंगी। क्रिस्टलीय बर्फ की अधिकता पन्नी-छेद के बहुमत को रोक सकती है और / या ऑटोफोकसिंग के साथ हस्तक्षेप कर सकती है और इस तरह के ग्रिड वर्गों से भी बचा जाना चाहिए। पतली बर्फ के साथ ग्रिड वर्ग आमतौर पर बड़े विट्रियस क्षेत्रों और कई उज्ज्वल पन्नी-छेद प्रदर्शित करते हैं जो एटलस प्रीसेट का उपयोग करके ली गई छवि में दिखाई देते हैं। ग्रिड सलाखों के करीब मोटी बर्फ की घटना की उम्मीद की जा सकती है और ग्रिड वर्ग के इन क्षेत्रों में पन्नी-छेद छेद के रूप में uncritical छेद चयन प्रक्रिया के दौरान बाहर रखा गया है। ग्रिड वर्ग में कई खाली छेदों की उपस्थिति यह संकेत दे सकती है कि आसपास के छेदों में विट्रियस बर्फ बेहद पतली है और इसमें क्षतिग्रस्त कण या कोई कण नहीं हो सकते हैं। आम तौर पर, प्रारंभिक स्क्रीनिंग और मूल्यांकन के लिए ग्रिड पर विभिन्न क्षेत्रों में विभिन्न क्षेत्रों में विभिन्न प्रकार की बर्फ की मोटाई के साथ ग्रिड वर्गों का चयन करना बुद्धिमानी है ताकि यह समझा जा सके कि उच्च-रिज़ॉल्यूशन डेटा संग्रह के लिए किन क्षेत्रों में सबसे अच्छी स्थिति है और आदर्श कण घनत्व और अभिविन्यास वितरण का प्रदर्शन करते हैं। इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले apoF और 20S के नमूनों के लिए, सबसे पतली अवलोकन योग्य बर्फ वाले क्षेत्रों में इन नमूनों के उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के लिए सबसे अच्छी स्थिति होती है।

डेटा संग्रह सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके सभी चयनित ग्रिड वर्गों में स्वचालित रूप से छेद का चयन करते समय, प्रत्येक ग्रिड वर्ग में एक प्रतिनिधि छेद पर टेम्पलेट निष्पादन कार्य करने की सलाह दी जाती है ताकि यह जांच की जा सके और यह सुनिश्चित किया जा सके कि न तो अत्यधिक मोटी और न ही अत्यधिक पतली और न ही अप्रत्याशित रूप से गैर-विट्रियस वर्गों को डेटा संग्रह के लिए चुना गया था। डेटा अधिग्रहण के दौरान, एकत्रित छवियों के प्रमुख गुणवत्ता संकेतक, जैसे छवि बहाव और सीटीएफ फिटिंग, ईक्यूएम का उपयोग करके निगरानी की जा सकती है। डेटा संग्रह को तब उन क्षेत्रों को छोड़कर अनुकूलित किया जा सकता है जो खराब गुणवत्ता की छवियों को उत्पन्न करते हैं। हालांकि, उच्च-रिज़ॉल्यूशन सीटीएफ फिट बैठता है के साथ छवियों में अभी भी कुछ पसंदीदा झुकाव या कणों में कणों के साथ छवियां हो सकती हैं जो बहुत पतली बर्फ की परत में विकृत होती हैं। एकत्रित छवियों से वास्तविक समय कण पिकिंग और 2 डी वर्गीकरण छविवाले कणों में संरचनात्मक डेटा की गुणवत्ता के बारे में अतिरिक्त जानकारी प्रदान करेगा और बर्फ में बरकरार कणों के पसंदीदा झुकाव या (आंशिक रूप से) विकृत कणों की असंगत संरचना दोनों को प्रकट करेगा। इसलिए कक्षा औसत की गणना डेटा संग्रह के लिए उपयुक्त क्षेत्रों को और अधिक परिष्कृत करने में मदद कर सकती है, जैसा कि पहले से ही लागू किया गया है और अन्य सॉफ़्टवेयरपैकेजों 23,28 में दिखाया गया है।

डेटा अधिग्रहण के लिए इमेजिंग सेटिंग्स का चयन, जैसे आवर्धन, इलेक्ट्रॉन खुराक दर और डिफोकस रेंज, कई मानदंडों पर निर्भर करता है, जैसे कि लक्ष्य संकल्प, प्रोटीन का आकार, नमूना एकाग्रता, वांछित माइक्रोस्कोप थ्रूपुट, आदि। इन प्रयोगों में उपयोग किए जाने वाले प्रत्यक्ष इलेक्ट्रॉन डिटेक्टर कैमरे के लिए, इलेक्ट्रॉन खुराक दर को समानांतर रोशनी बनाए रखने के लिए एक उपयुक्त स्पॉट आकार और तीव्रता का चयन करके 4-5 ई-/ जैसा कि तालिका 1 में दिखाया गया है, डेटा संग्रह के दौरान छेद के केंद्रीकरण के लिए छवि में पर्याप्त संकेत-से-शोर अनुपात सुनिश्चित करने के लिए होल / यूसेंट्रिक हाइट प्रीसेट में एक अलग स्पॉट आकार का उपयोग किया जा सकता है। आवर्धन को इस तरह से चुना जाना चाहिए कि पिक्सेल का आकार क्रायो-ईएम पुनर्निर्माण के लिए लक्ष्य रिज़ॉल्यूशन से कम से कम 2-3x छोटा हो। हालांकि, उच्च आवर्धन (यानी, छोटे पिक्सेल आकार) का उपयोग किया जाता है, दृश्य के छोटे क्षेत्र को छवियों में कैप्चर किया जाता है, और प्रति छवि कम कण होते हैं, जो अंततः उच्च रिज़ॉल्यूशन के लिए 3 डी मानचित्रों को फिर से बनाने के लिए पर्याप्त कणों के साथ छवियों को इकट्ठा करने के लिए लंबे समय तक डेटा संग्रह समय की ओर जाता है। apoF नमूने के लिए, हमने 0.43 Å के पिक्सेल आकार का उपयोग किया क्योंकि हमारे पास छवियों में कणों के उच्च घनत्व के लिए पर्याप्त नमूना एकाग्रता थी और पुनर्निर्माण के उप-2 Å रिज़ॉल्यूशन का उद्देश्य था। 20S के नमूने के लिए, हमने अधिग्रहित छवियों में दृश्य के एक बड़े क्षेत्र को कवर करने के लिए 0.68 Å के पिक्सेल आकार का उपयोग किया। आमतौर पर 200 केवी टीईएम माइक्रोस्कोप के लिए, क्रायो-ईएम छवियों को 0.8 से 2.0 μm तक डिफोकस रेंज में अधिग्रहित किया जाता है। हालांकि, ऊर्जा फ़िल्टर का उपयोग करके बेहतर विपरीत और सिग्नल-टू-शोर अनुपात के साथ, डेटा अधिग्रहण को छोटे विपथन के कारण अधिग्रहित छवियों में उच्च-रिज़ॉल्यूशन की जानकारी को बेहतर ढंग से संरक्षित करने और तदनुसार सीटीएफ लिफाफा फ़ंक्शन के क्षय को कम करने के लिए ध्यान केंद्रित करने के लिए बहुत करीब किया जा सकता है। हम एक उद्देश्य एपर्चर का भी उपयोग नहीं करते हैं क्योंकि एपर्चर अतिरिक्त छवि विपथन पेश कर सकता है जबकि छवि कंट्रास्ट पहले से ही ऊर्जा फ़िल्टर का उपयोग करके पर्याप्त रूप से बढ़ाया गया है। apoF और 20S के लिए, हमने 0.5 μm, 0.7μm, और 0.9 μm की defocus सेटिंग्स का उपयोग किया। छोटे प्रोटीन (<200 kDa) के लिए, हमने कणों के विपरीत में सुधार करने और 3 डी पुनर्निर्माण के 3 डी शोधन चरण में आसान कण चुनने और प्रारंभिक मोटे संरेखण की सुविधा के लिए -0.5 μm, -0.7 μm, -0.9 μm की defocus सेटिंग्स का उपयोग किया, जिसके कारण ~ 2.5 Å रिज़ॉल्यूशन 3 D मानचित्र (अप्रकाशित परिणाम) का नेतृत्व किया गया।

हमने पहले ही दिखाया है कि ऊर्जा फिल्टर के साथ इमेजिंग उच्च-अंत 300-केवी टीईएम माइक्रोस्कोप11 पर एकत्र क्रायो-ईएम छवियों में सिग्नल-टू-शोर अनुपात (एसएनआर) में सुधार करती है। वास्तव में, जब इलेक्ट्रॉन एक नमूने से गुजरते हैं, तो दो मुख्य प्रकार के इंटरैक्शन होते हैं: i) लोचदार रूप से बिखरे हुए इलेक्ट्रॉन अपनी ऊर्जा को बनाए रखते हैं और चरण-विपरीत तंत्र के माध्यम से गैर-बिखरे हुए घटना बीम के साथ हस्तक्षेप करके छवि गठन में योगदान करते हैं ii) लोचदार रूप से बिखरे हुए इलेक्ट्रॉन नमूने में कुछ ऊर्जा खो देते हैं और मुख्य रूप से छवियों में शोर में योगदान करते हैं। इसलिए, एसएनआर को लोचदार रूप से बिखरे हुए इलेक्ट्रॉनों को फ़िल्टर करके काफी सुधार किया जा सकता है, जिसमें एक संकीर्ण ऊर्जा भट्ठा का उपयोग करके घटना बीम और लोचदार रूप से बिखरे हुए इलेक्ट्रॉनों की तुलना में कम ऊर्जा होती है। हालांकि, पर्याप्त रूप से स्थिर ऊर्जा फ़िल्टर का उपयोग करना महत्वपूर्ण है, जैसे कि Selectris या Selectris-X, उच्च-रिज़ॉल्यूशन क्रायोईएम डेटासेट के लंबे (12 + घंटे) स्वचालित डेटा अधिग्रहण पर बहुत संकीर्ण (10 ईवी या छोटे) स्लिट्स का उपयोग करने में सक्षम होने के लिए।

क्रायो-ईएम छवियों को 200 केवी टीईएम माइक्रोस्कोप के साथ उसी स्थिति में अधिग्रहित किया गया है जैसा कि 300 केवी टीईएम माइक्रोस्कोप के साथ है, सीटीएफ लिफाफा कार्यों के तेजी से क्षय के कारण उच्च रिज़ॉल्यूशन (विशेष रूप से <4 Å) पर छोटे एसएनआर प्रदर्शित करते हैं। नतीजतन, 200 केवी टीईएम का उपयोग करते समय एक निश्चित रिज़ॉल्यूशन प्राप्त करने के लिए कणों की एक उच्च संख्या (और इसलिए एकत्र की गई छवियों की एक उच्च संख्या) की आवश्यकता होती है। इसके अतिरिक्त, क्षेत्र की गहराई (2-3 Å रिज़ॉल्यूशन रेंज में 10-25 एनएम) भी 200 केवी छवियों35 में लगभग 20% छोटी है, जिसका अर्थ है कि बर्फ की परत में कम कण (आमतौर पर 20-50 एनएम मोटी) पूरी तरह से ध्यान में होंगे और रचनात्मक रूप से एक गणना किए गए 3 डी पुनर्निर्माण की सभी उच्च-रिज़ॉल्यूशन विशेषताओं में योगदान देंगे जब तक कि डिफोकस मूल्यों को 3 डी पुनर्निर्माण प्रक्रिया के बाद के चरणों में स्वतंत्र रूप से प्रत्येक कण के लिए परिष्कृत नहीं किया जाता है। बड़े कणों (जैसे कि icosahedral virions या अन्य macromolecular assemblies) के लिए, कण का आकार उच्च रिज़ॉल्यूशन पर क्षेत्र की गहराई से अधिक हो सकता है और मानक 3 डी पुनर्निर्माण एल्गोरिदम36 में एवाल्ड क्षेत्र के प्लानर सन्निकटन के कारण चरण त्रुटियों को पेश कर सकता है। इन त्रुटियों को उन्नत एल्गोरिदम द्वारा परिष्कृत किया जा सकता है जो पहले से ही सामान्य क्रायो-ईएम छवि प्रसंस्करण पैकेज 37,28,39 में लागू किए गए हैं। चूंकि एवाल्ड क्षेत्र में 300 केवी डेटा की तुलना में 200 केवी डेटा में बड़ी वक्रता होती है, इसलिए 200 केवी टीईएम का उपयोग करते समय अपेक्षाकृत कम रिज़ॉल्यूशन और / या अपेक्षाकृत छोटे मैक्रोमोलेक्यूलर असेंबली के लिए एवाल्ड क्षेत्र सुधार की आवश्यकता होती है। दूसरी ओर, 200 केवी छवियां पतली बर्फ (20-50 एनएम) में कणों के उच्च विपरीत को प्रदर्शित करती हैं जो 200-300 केवी इलेक्ट्रॉन मतलब मुक्त पथ (220-280 एनएम) की तुलना में काफी पतली है। उच्च कंट्रास्ट व्यक्तिगत कणों के सही वैश्विक संरेखण में सुधार करने में मदद करता है, विशेष रूप से कमजोर रूप से छोटे प्रोटीन को फैलाने के लिए जिनकी संरचना अभी तक ज्ञात नहीं है, और 3 डी संदर्भ मॉडल अभी तक अच्छी तरह से स्थापित नहीं है।

यहां, हमने 20एस के उदाहरण पर प्रदर्शित किया कि 200 केवी टीईएम माइक्रोस्कोप का उपयोग करते समय ऊर्जा फिल्टर के साथ छवि कंट्रास्ट और गुणवत्ता में समान रूप से सुधार किया जा सकता है। कणों की एक ही संख्या का उपयोग करते हुए, 20 ईवी स्लिट का उपयोग करके एकत्र किए गए डेटा को पूरी तरह से खुले ऊर्जा भट्ठा के साथ एकत्र किए गए डेटा की तुलना में 2.26 Å रिज़ॉल्यूशन में पुनर्निर्मित किया गया था जिसे केवल 2.34 Å रिज़ॉल्यूशन में पुनर्निर्मित किया गया था। सबसे अच्छा पुनर्निर्माण 10 ईवी स्लिट का उपयोग करके एकत्र किए गए डेटा से प्राप्त किया गया था जिसे 2.14 Å रिज़ॉल्यूशन में पुनर्निर्मित किया गया था। ये परिणाम सैद्धांतिक भविष्यवाणी के साथ समझौते में हैं कि लोचदार रूप से बिखरे हुए इलेक्ट्रॉनों का फ़िल्टरिंग एकत्र की गई छवियों में एसएनआर को बढ़ाता है और दिए गए कणों की संख्या से क्रायो-ईएम पुनर्निर्माण में उच्च रिज़ॉल्यूशन की सुविधा प्रदान करता है, जैसा कि तालिका 4 में संक्षेप में बताया गया है। इन परिणामों को इन डेटासेट से गणना किए गए बी-कारकों द्वारा आगे की पुष्टि की गई थी जो ऊर्जा-फ़िल्टर किए गए डेटासेट में छवियों की उच्च गुणवत्ता का संकेत देते हैं।

इसलिए हम यह निष्कर्ष निकाल सकते हैं कि जबकि 300 केवी टीईएम माइक्रोस्कोप क्रायो-ईएम पुनर्निर्माण में उच्चतम थ्रूपुट और उच्चतम संभव रिज़ॉल्यूशन प्रदान करते हैं, 200 केवी टीईएम माइक्रोस्कोप भी उच्च-रिज़ॉल्यूशन क्रायो-ईएम पुनर्निर्माण के लिए उच्च गुणवत्ता वाले डेटासेट प्रदान करते हैं। हमने यहां दिखाया कि अधिग्रहित छवियों की गुणवत्ता, और इसलिए समग्र समय-से-संरचना, एक ऊर्जा फिल्टर और प्रत्यक्ष इलेक्ट्रॉन डिटेक्टर से सुसज्जित 200 केवी टीईएम का उपयोग करके और बेहतर बनाया जा सकता है। प्रस्तुत प्रोटोकॉल इस सेटअप का उपयोग करके नियमित रूप से उच्च-रिज़ॉल्यूशन क्रायो-ईएम डेटा प्राप्त करने और मैक्रोमोलेक्यूलर 3 डी संरचनाओं के ठीक संरचनात्मक विवरणों को प्रकट करने के तरीके पर सभी आवश्यक चरणों का वर्णन करता है, जो संरचनात्मक जीव विज्ञान और संरचना-आधारित दवा डिजाइन में प्रमुख संरचना-फ़ंक्शन संबंधों को समझने के लिए आवश्यक हैं।

Disclosures

सागर खावनेकर ने हितों के टकराव की कोई रिपोर्ट नहीं दी है। अन्य लेखक थर्मो फिशर साइंटिफिक, एमएसडी-ईएम डिवीजन के कर्मचारी हैं।

Acknowledgments

कोई नहीं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AutoGrid rings Thermo Fisher Scientific 1036173 Package of 100x AutoGrid rings for the standard EM grids.
C-Clip Thermo Fisher Scientific 1036171 Package of 100 clips that secure
the standard EM grids inside the AutoGrid rings.
Data Management Platform Thermo Fisher Scientific 1160939 Part of the Glacios base configuraiton; includes Athena Software
EPU Quality Monitor Thermo Fisher Scientific 1179770
EPU Software Thermo Fisher Scientific 1025080 Part of the Glacios base configuration
Ethane 3.5 Westfalen A06010110 Ethane gas used for making liquid ethane (puritiy at least N35, i.e. 99.95% vol)
Falcon 4 200kV Thermo Fisher Scientific 1166936 Direct electron detector
Glacios Thermo Fisher Scientific 1149551 200 kV TEM
GloQube Plus Glow Discharge System for TEM Grids and surface modification Quorum N/A also available via Thermo Fisher Scientific (PN 1160602)
QuantiFoil grids Quantifoil N/A R-2/1, 300 mesh; carbon foil grid
Relion MRC Laboratory of Molecular Biology N/A open source software:
https://relion.readthedocs.io/en/release-3.1/
Selectris with Falcon
4 for 200 kV		 Thermo Fisher Scientific 1191753 Energy filter
Selectris X with Falcon
4 for 200 kV		 Thermo Fisher Scientific 1191755 Energy filter
UltrAuFoil grids Quantifoil N/A R-1.2/1.2, 300 mesh; gold foil grids
Vitrobot Mk. IV Thermo Fisher Scientific 1086439 Automated vitrification system
Whatman 595 filter paper Thermo Fisher Scientific AA00420S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, J., Hua, T., Liu, Z. -J. Structural features of activated GPCR signaling complexes. Current Opinions in Structural Biology. 63, 82-89 (2020).
  2. Chen, S., Gouaux, E. Structure and mechanism of AMPA receptor - auxiliary protein complexes. Current Opinions in Structural Biology. 54, 104-111 (2019).
  3. Kühlbrandt, W. Structure and mechanisms of F-Type ATP synthases. Annual Review of Biochemistry. 88, 515-549 (2019).
  4. Laverty, D., et al. Cryo-EM structure of the human α1β3γ2 GABA A receptor in a lipid bilayer. Nature. 565 (7740), 516-520 (2019).
  5. Liu, F., Zhang, Z., Csanády, L., Gadsby, D. C., Chen, J. Molecular structure of the Human CFTR ion channel. Cell. 169 (1), 85-95 (2017).
  6. Wrapp, D., et al. Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation. Science. 367 (6483), 1260-1263 (2020).
  7. Ke, Z., et al. Structures and distributions of SARS-CoV-2 spike proteins on intact virions. Nature. 588, 498-502 (2020).
  8. Yan, R., Zhang, Y., Li, Y., Xia, L., Guo, Y., Zhou, Q. Structural basis for the recognition of SARS-CoV-2 by full-length human ACE2. Science. 367 (6485), 1444-1448 (2020).
  9. Walls, A. C., Park, Y. -J., Tortorici, M. A., Wall, A., McGuire, A. T., Veesler, D. Structure, function, and antigenicity of the SARS-CoV-2 spike glycoprotein. Cell. 180, 281-292 (2020).
  10. Chiba, S., et al. Multivalent nanoparticle-based vaccines protect hamsters against SARS-CoV-2 after a single immunization. Communications Biology. 4 (1), 597 (2021).
  11. Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587, 152-156 (2020).
  12. Bai, X. C. Seeing atoms by single-particle Cryo-EM. Trends in Biochemical Sciences. 46 (4), 253-254 (2021).
  13. Koh, A., et al. High-resolution cryo-EM at 200kV enabled by Selectris-X and Falcon 4. Microscience Microscopy Congress 2021. , Abstract 212 (2021).
  14. Herzik, M. A., Wu, M., Lander, G. C. Achieving better-than-3-Å resolution by single-particle cryo-EM at 200 keV. Nature Methods. 14 (11), 1075-1078 (2017).
  15. Herzik, M. A., Wu, M., Lander, G. C. High-resolution structure determination of sub-100 kDa complexes using conventional cryo-EM. Nature Communications. 10 (1), 1032 (2019).
  16. Wu, M., Lander, G. C., Herzik, M. A. Sub-2 Angstrom resolution structure determination using single-particle cryo-EM at 200 keV. Journal of Structural Biology X. 4, 100020-100029 (2020).
  17. Mori, T., et al. C-Glycoside metabolism in the gut and in nature: Identification, characterization, structural analyses and distribution of C-C bond-cleaving enzymes. Nature Communications. 12 (1), 6294 (2021).
  18. Hamdi, F., et al. 2.7 Å cryo-EM structure of vitrified M. musculus H-chain apoferritin from a compact 200 keV cryo-microscope. PLoS One. 15 (5), 0232540 (2020).
  19. Abbott, S., et al. EMDB web resources. Current Protocols in Bioinformatics. 61 (1), 1-12 (2018).
  20. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  21. Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  22. Gómez-Blanco, J., et al. Using Scipion for stream image processing at Cryo-EM facilities. Journal of Structural Biology. 204 (3), 457-463 (2018).
  23. Tegunov, D., Cramer, P. Real-time cryo-electron microscopy data preprocessing with Warp. Nature Methods. 16 (11), 1146-1152 (2019).
  24. Lander, G. C., et al. Appion: an integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing. Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).
  25. Carragher, B., et al. Current outcomes when optimizing 'standard' sample preparation for single-particle cryo-EM. Journal of Microscopy. 276 (1), 39-45 (2019).
  26. Drulyte, I., et al. Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation. Acta Crystallographica. Section D, Structural Biology. 74 (6), 560-571 (2018).
  27. Bloch, M., Santiveri, M., Taylor, N. M. I. Membrane protein Cryo-EM: Cryo-grid optimization and data collection with protein in detergent. Methods in Molecular Biology. 2127, 227-244 (2020).
  28. Cheng, A., et al. Leginon: New features and applications. Protein Science. 30 (1), 136-150 (2021).
  29. Schorb, M., et al. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).
  30. Li, X., et al. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nature Methods. 10 (6), 584-590 (2013).
  31. Alewijnse, B., et al. Best practices for managing large CryoEM facilities. Journal of Structural Biology. 199, 225-236 (2017).
  32. Baldwin, P. R., et al. Big data in cryoEM: automated collection, processing and accessibility of EM data. Current Opinion in Microbiology. 43, 1-8 (2018).
  33. Guo, H., et al. Electron-event representation data enable efficient cryoEM file storage with full preservation of spatial and temporal resolution. International Union of Crystallography Journal. 7, 860-869 (2020).
  34. Weis, F., Hagen, W. J. H. Combining high throughput and high quality for cryo-electron microscopy data collection. Acta Crystallographica. Section D, Structural Biology. 76 (8), 724-728 (2020).
  35. Zhou, H., Chiu, W. Determination of icosahedral virus structures by electron cryomicroscopy at subnanometer resolution. Advances in Protein Chemistry. 64, 93-124 (2005).
  36. DeRosier, D. J. Correction of high-resolution data for curvature of the Ewald sphere. Ultramicroscopy. 81 (2), 83-98 (2000).
  37. Wolf, M., DeRosier, D. J., Grigorieff, N. Ewald sphere correction for single-particle electron microscopy. Ultramicroscopy. 106 (4-5), 376-382 (2006).
  38. Leong, P. A., Yu, X., Hong Zhou, Z., Jensen, G. J. Correcting for the ewald sphere in high-resolution single-particle reconstructions. Methods in Enzymology. 482, 369-380 (2010).
  39. Zivanov, J., et al. New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3. eLife. 7, 42166 (2018).

Tags

जैव रसायन अंक 181 क्रायो-ईएम उच्च संकल्प संरचना संरेखण डेटा संग्रह डेटा प्रबंधन Glacios EPU ऊर्जा फिल्टर
200 केवी ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके उच्च-रिज़ॉल्यूशन क्रायो-ईएम डेटासेट का नियमित संग्रह
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Koh, A., Khavnekar, S., Yang, W.,… More

Koh, A., Khavnekar, S., Yang, W., Karia, D., Cats, D., van der Ploeg, R., Grollios, F., Raschdorf, O., Kotecha, A., Němeček, D. Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope. J. Vis. Exp. (181), e63519, doi:10.3791/63519 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter