Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Routinematige verzameling van cryo-EM-datasets met hoge resolutie met behulp van 200 KV transmissie-elektronenmicroscoop

Published: March 16, 2022 doi: 10.3791/63519
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 3
1Materials and Structural Analysis Division, Thermo Fisher Scientific, 2Max Planck Institute of Biochemistry, Molecular Structural Biology, 3Materials and Structural Analysis Division, Thermo Fisher Scientific
* These authors contributed equally

Summary

Cryo-EM-kaarten met hoge resolutie van macromoleculen kunnen ook worden bereikt met behulp van 200 kV TEM-microscopen. Dit protocol toont de best practices voor het instellen van nauwkeurige optische uitlijningen, data-acquisitieschema's en selectie van beeldvormingsgebieden die allemaal essentieel zijn voor het succesvol verzamelen van datasets met hoge resolutie met behulp van een 200 kV TEM.

Abstract

Cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) is het afgelopen decennium vastgesteld als een routinemethode voor het bepalen van de eiwitstructuur, waarbij een steeds groter deel van de gepubliceerde structurele gegevens is ingenomen. Recente ontwikkelingen in TEM-technologie en automatisering hebben zowel de snelheid van gegevensverzameling als de kwaliteit van verkregen beelden verhoogd, terwijl tegelijkertijd het vereiste niveau van expertise voor het verkrijgen van cryo-EM-kaarten met sub-3 Å-resoluties is verminderd. Hoewel de meeste van dergelijke structuren met hoge resolutie zijn verkregen met behulp van state-of-the-art 300 kV cryo-TEM-systemen, kunnen structuren met hoge resolutie ook worden verkregen met 200 kV cryo-TEM-systemen, vooral wanneer ze zijn uitgerust met een energiefilter. Bovendien vermindert automatisering van microscoopuitlijningen en gegevensverzameling met real-time beeldkwaliteitsbeoordeling de complexiteit van het systeem en zorgt het voor optimale microscoopinstellingen, wat resulteert in een hogere opbrengst van beelden van hoge kwaliteit en de algehele doorvoer van gegevensverzameling. Dit protocol demonstreert de implementatie van recente technologische vooruitgang en automatiseringsfuncties op een 200 kV cryotransmissie-elektronenmicroscoop en laat zien hoe gegevens kunnen worden verzameld voor de reconstructie van 3D-kaarten die voldoende zijn voor de novo atomaire modelbouw. We richten ons op best practices, kritieke variabelen en veelvoorkomende problemen waarmee rekening moet worden gehouden om de routinematige verzameling van dergelijke cryo-EM-datasets met hoge resolutie mogelijk te maken. In het bijzonder worden de volgende essentiële onderwerpen in detail besproken: i) automatisering van microscoopuitlijningen, ii) selectie van geschikte gebieden voor gegevensverzameling, iii) optimale optische parameters voor hoogwaardige gegevensverzameling met hoge doorvoer, iv) energiefilterafstemming voor verliesvrije beeldvorming, en v) gegevensbeheer en kwaliteitsbeoordeling. Toepassing van de beste praktijken en verbetering van de haalbare resolutie met behulp van een energiefilter zal worden gedemonstreerd op het voorbeeld van apo-ferritine dat werd gereconstrueerd tot 1,6 Å, en Thermoplasma acidophilum 20S proteasoom gereconstrueerd tot 2,1-Å resolutie met behulp van een 200 kV TEM uitgerust met een energiefilter en een directe elektronendetector.

Introduction

Bepaling van de eiwitstructuur is van cruciaal belang voor het begrijpen van de moleculaire architectuur, functie en regulatie van eiwitcomplexen die betrokken zijn bij belangrijke cellulaire processen, zoals celmetabolisme, signaaltransductie of gastheer-pathogeeninteracties. Cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) is naar voren gekomen als een krachtige techniek die in staat is om de 3D-structuur van veel eiwitten en hun complexen op te lossen die te uitdagend waren voor de traditionele structurele technieken, zoals röntgendiffractie en NMR-spectroscopie. Cryo-EM is met name bewezen als de voorkeursmethode voor membraaneiwitten, die niet gemakkelijk kunnen worden gekristalliseerd of bereid in voldoende hoeveelheden voor de traditionele structurele technieken, en heeft nieuwe inzichten opgeleverd in de structuur en functie van belangrijke cellulaire receptoren en ionkanalen 1,2,3,4,5 . Meest recent heeft cryo-EM een belangrijke rol gespeeld in de strijd tegen de Covid-19-pandemie door het mechanisme van SARS-CoV-2-infectie op moleculair niveau te bepalen, wat de oorsprong van de ziekte Covid-19 ophelderde en de basis vormde voor de snelle ontwikkeling van efficiënte vaccins en therapeutica 6,7,8,9,10.

Doorgaans worden high-end 300-kV transmissie-elektronenmicroscopen (TEM) gebruikt voor structuurbepaling met hoge resolutie van biomoleculen door cryo-EM single-particle analysis (SPA) om hun conformatie en interacties te onthullen. Onlangs bereikte de SPA-techniek een nieuwe grens toen de gemeenschappelijke benchmark cryo-EM-monster apo-ferritine werd gereconstrueerd met atomaire resolutie (1,2 Å) 11,12 met behulp van een 300 kV TEM uitgerust met het cold field emission gun (E-CFEG), een directe elektronendetector en een energiefilter. Bij deze resolutie was het mogelijk om posities van individuele atomen in de structuur, conformatie van individuele aminozuurzijketens, evenals waterstofbinding en andere interacties ondubbelzinnig op te lossen, die nieuwe mogelijkheden openen voor op structuur gebaseerde medicijnontdekking van nieuwe doelen en optimalisatie van bestaande kandidaat-geneesmiddelen.

Mid-range 200 kV TEM microscopen worden vaak gebruikt voor monsterscreening en monsteroptimalisatie voordat de uiteindelijke hoge resolutie gegevensverzameling met behulp van de high-end TEM microscopen, met name bij grotere cryo-EM-faciliteiten. Doorgaans kunnen afgebeelde monsters worden opgelost in het resolutiebereik van 3-4 Å dat voldoende is om over te stappen naar een high-end 300 kV TEM voor de uiteindelijke gegevensverzameling. Bijgevolg wordt de gegevensverzameling met behulp van de 200 kV TEM vaak niet verder geoptimaliseerd voor de hoogst mogelijke resolutieresultaten. Bovendien kunnen veel interessante biologische vragen al bij deze resoluties worden beantwoord en gepubliceerd, omdat alle aminozuurzijketens al zijn opgelost en de bezetting van ligandbindingsplaatsen ook betrouwbaar kan worden bepaald13. Het is al aangetoond dat 200-kV TEM's resoluties kunnen bereiken van meer dan 3 Å voor tal van monsters 14,15,16,17,18. Beelden genomen bij 200 kV vertonen inherent een hoger contrast van afgebeelde deeltjes, wat zelfs een nauwkeurigere initiële uitlijning van de deeltjes kan vergemakkelijken, ondanks meer verzwakt signaal bij hoge resolutie in vergelijking met 300 kV TEM-beelden. Het is belangrijk op te merken dat de bereikte resolutie van gereconstrueerde cryo-EM-kaarten ook wordt beperkt door structurele flexibiliteit en conformatie heterogeniteit van afgebeelde monsters, die van invloed is op zowel 200-kV- als 300-kV-reconstructies. In feite werden veel meer cryo-EM-reconstructies verkregen met behulp van de 300-kV-systemen opgelost in het resolutiebereik van 3-4 Å dan bij hogere resoluties19. Omdat 200 kV TEM-microscopen minder complex zijn en in kleinere ruimtes passen, vormen deze microscopen een goede, goedkopere optie voor structuurbepaling van biologische macromoleculen door cryo-EM met behoud van automatisering van lange gegevensverzamelingen van meerdere monsters die zijn opgeslagen in het microscoop Autoloader-systeem.

Het verzamelen van cryo-EM datasets voor het bepalen van de structuur met hoge resolutie vereist een nauwkeurige uitlijning van de microscoopoptiek. Kolomuitlijningen gaan systematisch van de elektronenbron naar het condensorlenssysteem, de objectieflens en het energiefilter met een elektronendetector. De volledige volgorde van uitlijningen is meestal niet vereist. Indien nodig wordt de gebruiker begeleid via semi-geautomatiseerde procedures met een juiste beschrijving van elke stap in een contextbewust helpvenster tijdens de uitlijningsprocedure in de gebruikersinterface van de microscoop (Direct Alignments-bedieningspaneel). Zodra de microscoop volledig is uitgelijnd, blijft de elektronenoptiek stabiel en hoeven de uitlijningen gedurende ten minste een paar maanden niet te worden gewijzigd. Alleen de meest gevoelige uitlijningen, zoals parallelle verlichting van het monstervlak, objectief astigmatisme en comavrije uitlijning, moeten worden verfijnd vlak voordat met het verzamelen van elke dataset wordt begonnen. De kwaliteit van de verzamelde gegevens kan vervolgens tijdens het verzamelen van gegevens worden bewaakt met behulp van verschillende softwarepakketten, zoals EPU Quality Monitor, cryoSPARC Live20, Relion21, Scipion22, WARP23 of Appion24.

Naast nauwkeurige uitlijningen van de microscoop, is de hoge kwaliteit van goed gezuiverde monsters met minimale conformatie- en compositionele heterogeniteit ook een voorwaarde voor het verzamelen van datasets met hoge resolutie en het oplossen van structuren met hoge resolutie. Meer details over typische protocollen, frequente uitdagingen en mogelijke remedies zijn te vinden in andere beoordelingen gewijd aan dit onderwerp 25,26,27. In wezen is het van cruciaal belang om gebieden op een bepaald cryo-EM-raster te vinden die voldoende dun ijs hebben om informatie met hoge resolutie te behouden, en individuele deeltjes zijn dicht verdeeld in willekeurige oriëntaties zonder overlappingen. Typische cryo-EM-roosters hebben echter een niet-uniforme ijsdikte en het is daarom belangrijk om de optimale gebieden voor beeldvorming te vinden en te selecteren. Verschillende middelen voor schatting van de ijsdikte op het rooster zijn beschikbaar in softwarepakketten voor het geautomatiseerd verzamelen van cryo-EM-datasets, zoals EPU 2, Leginon28 of SerialEM29.

De komst van snelle en gevoelige directe elektronendetectoren maakte het mogelijk om beelden in vele fracties te verzamelen als films die compensatie van door bundels geïnduceerde bewegingen mogelijk maakten en resulteerden in een aanzienlijke toename van de kwaliteit en kwantiteit van gegevens die worden gebruikt bij beeldverwerking en uiteindelijke 3D-reconstructie30. Tegelijkertijd bieden automatisering en gegevensverzameling met hoge doorvoer enorme datasets met duizenden afbeeldingen / films die uitdagingen vormen voor gegevensopslag en -toegang. Het aangenomen model met grote cryo-EM-faciliteiten die tientallen tot honderden gebruikers bedienen, vraagt vooral om georganiseerd gegevensbeheer met de juiste tracking en gegevensuitwisseling in gevestigdecryo-EM-pijplijnen 31,32.

Deze studie beschrijft een protocol voor het routinematig verzamelen van cryo-EM datasets met hoge resolutie met behulp van de 200 kV Glacios TEM microscoop. Noodzakelijke uitlijningen van de microscoopoptiek worden beschreven, samen met procedures voor de evaluatie van cryo-EM-monsters en de selectie van geschikte gebieden voor gegevensverzameling met hoge resolutie. De organisatie van verzamelde gegevens en gerelateerde metagegevens met voorbeeldinformatie wordt gedemonstreerd in Athena - een gegevensbeheerplatform dat de beoordeling van voorbeeldinformatie en verzamelde gegevens vergemakkelijkt. Met behulp van het apo-ferritinemonster van de muis was het mogelijk om een 3D-reconstructie te bereiken met een resolutie van 1,6 Å13. Met behulp van het beschreven protocol hebben we ook de 3D-dichtheidskaart van het 20S-proteasoom uit Thermoplasma acidophilum gereconstrueerd met een resolutie van 2,1 Å.

Protocol

Alle stappen van het protocol worden beschreven voor het 200 kV Glacios TEM-systeem (hierna 200 kV TEM genoemd) uitgerust met het Selectris-X energiefilter (hierna energiefilter genoemd) en de Falcon 4-detector (hierna direct elektronendetector genoemd). De protocolstappen zijn specifiek voor de EPU-toepassing, de standaard SPA-gegevensverzamelingssoftware die vooraf is geïnstalleerd op elk Glacios-systeem. De onderstaande protocolstappen komen overeen met de EPU-versie 2.14 en kleine wijzigingen worden verwacht bij gebruik van een andere EPU-versie. Vereisten voor dit protocol zijn: i) de uitlijningen van het pistool en de kolommen zijn goed uitgelijnd, ii) de EM-kalibraties zijn correct en iii) de automatische EPU-functies zijn correct gekalibreerd.

1. Rasters in de microscoop laden

OPMERKING: De 200 kV TEM die in dit experiment wordt gebruikt, kan maximaal 12 autogrids (d.w.z. conventionele TEM-rasters die in een speciale cartridge zijn geknipt) bevatten in een cassette die in de Autoloader van de microscoop wordt geladen en constant op temperaturen onder -170 °C wordt gehouden om devitrificatie van het monster te voorkomen.

  1. Plaats autogrids in de Autoloader-cassette onder vloeibare stikstofomstandigheden.
  2. Plaats de cassette met autogrids in een vloeistof-stikstofgekoelde transfercapsule.
  3. Plaats de capsule in de microscoop en klik op de Dock-knop in de microscoopgebruikersinterface om de cassette van de capsule in de Autoloader van de microscoop te laden.
  4. Klik op de knop Inventaris om de aanwezigheid van autogrids in de geladen cassette te controleren.
  5. Klik op de knoppen Laden en Verwijderen om autogrids in de kolom in te voegen voor TEM-beeldvorming.

2. Een project instellen in een datamanagementplatform (optioneel)

OPMERKING: Voorbeeldinformatie en verzamelde gegevens kunnen worden georganiseerd in het meegeleverde gegevensbeheerplatform dat de opslag van gestructureerde gegevens voor alle aangesloten instrumenten mogelijk maakt. Er kan een project worden gemaakt waarvoor workflowstappen kunnen worden gedefinieerd om de afbeeldingen en metagegevens op een georganiseerde manier vast te leggen voor revisie en export.

  1. Start de portaltoepassing voor gegevensbeheer en log in met een gebruikersnaam en wachtwoord.
  2. Klik in het linkerdeelvenster van de gebruikersinterface van de portal op de knop Project toevoegen om een nieuw project te maken of klik op een knop van een bestaand project in de onderstaande lijst om een project te openen.
  3. Klik op de knop Experiment toevoegen om een nieuw experiment te maken binnen het geopende project.
  4. Vul de beschrijving in het deelvenster Metagegevens van het nieuwe experiment in en klik op de knop Workflow toevoegen om een nieuwe workflow binnen het experiment te maken (bijvoorbeeld Single Particle Analysis).
  5. Klik eventueel op de knop Stap toevoegen in het middelste deelvenster om een aangepaste workflow te maken of extra stappen toe te voegen aan de vooraf gedefinieerde SPA-workflow (afbeelding 1 en figuur 2).
    OPMERKING: De stappen kunnen betrekking hebben op monstervoorbereiding, monsterkarakterisering door biochemische technieken, monsterverglazing, screening van cryo-EM-rasters, gegevensverzamelingssessies en gegevensanalyse.
  6. Vul desgewenst beschrijvingen in de notities van elke stap in, die afbeeldingen en foto's kunnen bevatten.
  7. Maak een gegevenssetstap in de workflow en selecteer het gegevenssettype als EPU.
    OPMERKING: Hierdoor kan de analysesoftware alle resultatengegevens / metagegevens automatisch op de juiste plaats in het gegevensbeheerportaal plaatsen tijdens gegevensverzameling en de gegevens automatisch exporteren naar de gewenste bestemming met behoud van een volledig register van alle stappen en gegevensoverdracht.
  8. Vul sjablonen over de monster- en EM-rasters in de stap Biochemie en koppel elk raster aan een monster (houd er rekening mee dat één monster aan meerdere rasters kan worden gekoppeld).
  9. Koppel combinaties van voorbeeld-rasters in de sectie metagegevens van de stap Gegevensset .

3. Stel beeldvoorinstellingen en beeldverschuivingskalibraties in de analysesoftware in

  1. Stel beeldparameters in voor afzonderlijke beeldvormingsmodi zoals weergegeven in tabel 1. Overwegingen voor de selectie van specifieke instellingen worden in detail beschreven in de sectie Discussie.
  2. Stel parallelle verlichting in voor de gekozen vergroting in de data-acquisitievoorinstelling van de analysesoftware
    OPMERKING: Er is slechts één instelling van de C2-lens voor parallelle verlichting van het monster bij de gegeven SPOT-grootte (d.w.z. vooraf ingestelde sterktes van de C1-lens) op TEM-systemen met 2 condensors, zoals de 200 kV TEM die in dit onderzoek wordt gebruikt. Het elektronendosistempo per oppervlakte-eenheid (e-/Å2/s) kan daarom alleen worden aangepast door de instellingen voor de SPOT-grootte te wijzigen en de C2-sterkte (bundelintensiteit) aan te passen volgens de onderstaande stappen.
    1. Ga naar een gebied met steun koolstoffolie en dun of geen ijs.
    2. Selecteer het objectiefopening van 100 μm of 70 μm in het menu Diafragma van de TEM-gebruikersinterface.
    3. Druk op de diffractieknop op de bedieningspanelen om over te schakelen naar de diffractiemodus.
    4. Plaats het fluorescerende scherm en wijzig de FluCam-modus in Hoge resolutie.
    5. Verplaats de centrale diffractieplek naar een rand van het diafragma. Als de rand van het diafragma niet zichtbaar is, vergroot u de lengte van de camera (met behulp van de vergrotingsknop).
    6. Draai voorzichtig aan de Focus-knop op het bedieningspaneel om het terug-brandpuntsvlak scherp te stellen. Het terugbrandvlak wordt scherpgesteld wanneer de diafragmarand zichtbaar scherp is.
    7. Verlaag de gevoeligheid van de FluCam tot het laagste niveau en verplaats de centrale diffractieplek naar het midden van de FluCam.
    8. Minimaliseer de grootte van de centrale plek met behulp van de intensiteitsknop op het bedieningspaneel.
    9. Trek het objectiefopening in de TEM UI in en schakel terug naar de beeldmodus.
    10. Klik op de knop Ophalen in de analysesoftware om de instellingen op te slaan in de voorinstelling Gegevensverzameling.
  3. Pas het elektronendosistempo aan in de voorinstelling Data Acquisition die optimaal is voor de gebruikte detector:
    1. Ga naar een leeg gebied op het rooster (bijvoorbeeld een rastervierkant met gebroken koolstoffolie)
    2. Klik op de knop Dosis meten in de analysesoftware om de elektronendosissnelheid te meten.
    3. Verander de SPOT-grootte om het optimale dosistempo te bereiken. In het geval van de directe elektronendetector die in dit protocol wordt gebruikt, wordt doorgaans een dosissnelheid van 4-5 e-/pixel/s gebruikt voor gegevensverzameling met hoge resolutie. Dit komt meestal overeen met de SPOT maat 4-6.
    4. Controleer en pas de parallelle verlichting aan bij de nieuwe SPOT-maatinstelling zoals hierboven beschreven.
    5. Selecteer de OPTIE EER onder Breuken om de EER-modus op de directe elektronendetector33 te gebruiken.
    6. Klik op de knop Ophalen in de analysesoftware om de instellingen op te slaan in de voorinstelling Gegevensverzameling.
    7. Schakel over naar de autofocusvoorinstelling en druk op de knop Get om de verlichtingsinstellingen voor scherpstellen op te slaan. Wijzig de belichtingstijd handmatig in 1 s en binning-modus 2.
    8. Schakel over naar de Thon Rings-voorinstelling en druk op de knop Get om de verlichtingsinstellingen voor deze voorinstelling op te slaan. Wijzig de belichtingstijd handmatig in 1-2 s en binning-modus 2.
    9. Schakel over naar de voorinstelling Zero Loss en druk op de knop Ophalen om de verlichtingsinstellingen voor deze voorinstelling op te slaan. Wijzig de belichtingstijd handmatig in 0,5 s en binning-modus 4.
  4. Kalibreer beeldverschuivingen tussen de ingestelde optische instellingen zoals beschreven in de handleiding van de analysesoftware met behulp van de kalibratietaak Beeldverschuiving op het tabblad Voorbereiding (aanvullende figuur 1).

Tabel 1: Typische beeldvormingsinstellingen voor gegevensverzameling met hoge resolutie met behulp van een cryo-TEM van 200 kV uitgerust met een energiefilter en een directe elektronendetector. De instellingen worden weergegeven voor elke optische voorinstelling die wordt gebruikt bij het instellen van geautomatiseerde gegevensverzameling (sectie 3 van het protocol). Deze instellingen zijn specifiek voor de 200 kV TEM microscoop en directe elektronendetector die in deze studie worden gebruikt. Klik hier om deze tabel te downloaden.

4. Grid mapping en selectie van de beste cryo-EM grids voor dataverzameling

  1. Selecteer het tabblad Atlas en klik op de knop Nieuwe sessie om een nieuwe sessie te openen.
  2. Vul details in zoals sessienaam en locatie voor gegevensopslag en klik op de knop Toepassen om een nieuw taakvenster Screening te openen, dat een lijst met alle rasters in de Autoloader-inventaris toont. U kunt desgewenst de namen van de rasters bewerken.
  3. Selecteer de betreffende rasters door een selectievakje naast het bijbehorende rasternummer in te schakelen.
  4. Klik op de knop Start om een volledig geautomatiseerde verzameling atlassen van alle geselecteerde rasters te starten.
  5. Wanneer de collectie is voltooid, klikt u op rasterlabels om de verworven atlassen te bekijken.
    OPMERKING: Individuele rastervierkanten worden geclassificeerd op basis van hun relatieve ijsdikte, die is gebaseerd op de beoordeling van de relatieve grijswaardenwaarde in elke atlas. De geclassificeerde rastervierkanten worden weergegeven in verschillende kleurenschema's die kunnen worden gebruikt voor het begeleiden van de selectie van gegevensverzamelingsgebieden. Een raster geproduceerd met een Vitrobot Mk IV zal meestal een ijsdiktegradiënt over het hele raster weergeven, wat kan helpen om de ideale ijsdikte voor gegevensverzameling te identificeren. Een optimaal raster moet zo min mogelijk transferijsvervuiling bevatten en voldoende ononderbroken en scheurvrije rastervierkanten vertonen (figuur 3). Roosters met een geschikte ijsverdeling kunnen verder worden onderzocht om de verdeling van deeltjes in ijs bij hoge vergroting (d.w.z. dichtheid en oriëntaties van individuele deeltjes) te beoordelen.
  6. Klik op de knop Monster laden in het bovenste menu om een gekozen raster met geschikte ijsverdeling in de microscoopkolom in te voegen.
  7. Selecteer het tabblad Atlas , klik met de rechtermuisknop op een geschikt rastervierkant in de atlasafbeelding en selecteer de optie Werkgebied hier verplaatsen in het vervolgkeuzemenu om het werkgebied naar het rastervierkant te verplaatsen.
  8. Selecteer het tabblad Automatische functies om het rastervierkant in te stellen op de eucentrische hoogte. Schakel over naar de eucentrische hoogte preset, klik op de Auto-Eucentric by Beam Tilt auto-functie in het midden van het gekozen raster vierkant en klik op de Start knop.
  9. Schakel over naar de voorinstelling Grid Square en verkrijg een afbeelding. Verplaats het werkgebied naar een gat met ijs en geen of minimale vervuiling door met de rechtermuisknop en de optie Werkgebied hierheen verplaatsen .
  10. Schakel over naar de vooraf ingestelde hole/eucentric height en verkrijg een afbeelding. Verplaats het werkgebied naar een koolstofgebied naast het betreffende gat door met de rechtermuisknop te klikken en met de optie Werkgebied hierheen verplaatsen .
  11. Klik op de autofocus-functie en stel waarden in voor de gewenste onscherpte tot 0 μm en iteratie tot -2 μm. Schakel over naar de autofocusvoorinstelling en klik op de knop Start .
  12. Selecteer het tabblad Voorbereiding opnieuw en schakel over naar de vooraf ingestelde gat/eucentrische hoogte . Selecteer op de eerder verkregen gatafbeelding een interessegebied in het gat en verplaats het werkgebied naar deze positie door met de rechtermuisknop te klikken en de optie Werkgebied hier verplaatsen te selecteren.
  13. Schakel over naar de data-acquisitievoorinstelling en stel de wachttijd na beam shift in op 0,5 s en de wachttijd na stage move op 20 s. Verkrijg een afbeelding met behulp van onscherpte tussen -3 μm en -5 μm om het contrast met lage resolutie te verbeteren voor een betere visualisatie van individuele deeltjes.
  14. Herhaal eventueel stap 4.7-4.13 om deeltjes in verschillende gaten en verschillende rastervierkanten met verschillende ijsdiktes in beeld te brengen als dat nodig is.
  15. Zodra het meest geschikte raster voor gegevensverzameling met hoge resolutie is geïdentificeerd en geselecteerd, klikt u op de knop Voorbeeld laden in het bovenste menu om het geselecteerde raster in de TEM te laden.
    OPMERKING: Als er meer informatie nodig is en/of automatisering van dit screeningsproces gewenst is, voert u sectie 5 uit.

5. Het opzetten van een dataverzamelingssessie in de single particle analysis software

OPMERKING: Bij gebruik van de goudfolieroosters werkt verfijning van objectief astigmatisme en coma-uitlijningen (rubriek 6) mogelijk niet betrouwbaar. Het wordt geadviseerd om een koolstoffolierooster of cross-grating EM-raster te laden en deze laatste uitlijningen uit te voeren voordat u gegevensverzameling instelt.

  1. Selecteer het tabblad EPU en klik op de knop Sessie maken om een nieuwe sessie in het linkerdeelvenster te maken. Selecteer de optie Nieuwe sessie om de huidige optische voorinstellingen te gebruiken of de optie Nieuw uit voorkeuren om eerder geëxporteerde sessie-instellingen te laden.
  2. Vul de sessienaam en de locatie van de gegevensopslag in.
    OPMERKING: Deze locatie wordt gebruikt voor het opslaan van geïntegreerde afbeeldingen en metagegevens van de gegevensverzamelingssessie in een submap met de sessienaam. Hoewel deze gegevens geen aanzienlijke hoeveelheid opslagruimte in beslag nemen, wordt het aanbevolen om deze gegevens op te slaan op de Falcon offload-gegevensopslag van de DMP-server, omdat de EER-cameraframes altijd worden opgeslagen in de hoofdmap van deze gegevensopslag in een map met de sessienaam.
  3. Selecteer het handmatige type van de sessie om controle te hebben over de selectie van afzonderlijke gaten in rastervierkanten die zijn geselecteerd voor gegevensverzameling later in het protocol.
  4. Selecteer de modus Snellere acquisitie om aberratievrije beeldverschuiving (AFIS) te gebruiken voor gegevensverzameling om fasebewegingen tussen afzonderlijke gaten te verminderen, de algehele monsterdrift te verminderen en de doorvoer van gegevensverzameling te verhogen zonder verslechtering van de beeldkwaliteit.
  5. Selecteer de standaard MRC-indeling van opgeslagen geïntegreerde afbeeldingen.
  6. Geef het gebruikte raster en het bijbehorende type op. Dit protocol gebruikte het R-1.2/1.3 UltraAufoil voor apo-ferritine en het R-2/1 Quantifoil grid voor het 20S proteasoom. Selecteer Quantifoil onder Specimendrager en R1.2/1.3 of 2/1 onder Quantifoil Type.
  7. OPTIONEEL: Klik op de Athena Login knop in de rechterbenedenhoek om EPU Quality Monitor (EQM) te gebruiken.
    1. Voer inloggegevens in het pop-upvenster van de browser in om het gedeelte Instellingen in het overzicht sessie-instellingen te activeren.
    2. Klik op de knop Selecteren in het gedeelte Instellingen en blader naar de eerder gemaakte gegevensset (protocolsectie 2) om deze te koppelen aan de huidige gegevensverzameling. Schakel het selectievakje Kwaliteitsmonitor inschakelen in .
  8. Klik op de knop Toepassen om een nieuwe sessie aan te maken.
    OPMERKING: Met deze actie worden nieuwe taken geopend in het menu van de linkerkolom. Op elk moment tijdens de sessie, als sommige details onjuist zijn, is het mogelijk om terug te keren naar de taak Sessie-instelling , de details te wijzigen / bij te werken en opnieuw op Toepassen te klikken om de sessie bij te werken.
  9. Selecteer de taak Vierkante selectie in het linkerdeelvenster om de verzamelde atlas van het raster weer te geven.
  10. Dubbelklik eventueel op een tegel van de atlas om een afbeelding van hogere kwaliteit te zien om de ijskwaliteit in de rastervierkanten beter te beoordelen. Dubbelklik nogmaals op de afbeelding om terug te keren naar de rasteratlas.
  11. Identificeer rastervierkanten met de volgende kenmerken (figuur 4): (i) De steunfolie in het rastervierkant is intact zonder schade, (ii) Glasachtig dun ijs in foliegaten (de gaten lijken helderder dan de steunkoolstoffolie), (iii) Zo min mogelijk kristallijne ijsverontreiniging (zwarte spikkels) in het rastervierkant, (iv) Minimale helderheidsgradiënt over het rastervierkant en binnen afzonderlijke foliegaten.
    OPMERKING: Met de gekozen presets en met een goed raster kan de 200 kV cryo TEM die in deze studie wordt gebruikt, beelden maken met een snelheid van ~ 200-300 films / h. Met dat in gedachten, selecteert u zoveel vierkanten als nodig is, of voegt u later meer toe door terug te keren naar de vierkante selectietaak op basis van de hoeveelheid beschikbare microscooptijd. Ter referentie, 3000 films werden verzameld voor het bereiken van 1,6 Å resolutie van apo-ferritine.
  12. Selecteer rastervakken voor gegevensverzameling in de volledige atlas of tegelafbeeldingen van hoge kwaliteit
    1. Klik met de rechtermuisknop op een interessant raster en kies de optie Selecteren in het contextmenu
    2. U kunt ook de Ctrl-toets op het toetsenbord ingedrukt houden en met de linkermuisknop op de gewenste rastervierkanten klikken
    3. Klik daarentegen met de rechtermuisknop en hef de selectie op of houd de Shift-toets ingedrukt en klik met de linkermuisknop om vierkanten te verwijderen
    OPMERKING: De volgende stappen zijn van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat gegevensverzameling resulteert in een reconstructie met hoge resolutie. Begin met het selecteren van gaten in het rastervierkant met een dunne ijslaag. Klik met de rechtermuisknop op dit rastervierkant en selecteer de optie Gaten selecteren om de taak Gatselectie te starten.
  13. Selecteer de taak Gat selecteren in het linkerdeelvenster om gaten in de geselecteerde rastervakken te selecteren.
  14. Klik op de knop Auto-Eucentric om automatisch naar het eerste geselecteerde rastervierkant te gaan, de eucentrische hoogte aan te passen en een rastervierkantafbeelding te verkrijgen voor het vinden van foliegaten.
  15. Klik op de knop Gaten zoeken om foliegaten in de afbeelding te vinden.
    OPMERKING: Als het vinden van gaten niet goed werkte (d.w.z. er zijn overgeslagen gaten of gaten met een verkeerde grootte in de afbeelding), controleert u of de juiste waarden zijn ingevoerd in de quantifoil-type-vermelding van de taak Sessie-instelling en zoekt u opnieuw gaten. Als gaten nog steeds niet correct worden gevonden, klikt u op de knop Gatgrootte meten om de gatdiameter en afstand handmatig in te stellen en gaten opnieuw te vinden.
  16. Klik op de knop Gaten verwijderen dicht bij de rasterbalkknop om gaten in de buurt van rasterbalken te deselecteren.
  17. Pas de limieten aan in het helderheidshitogram van het ijsfilter (rechtsonder in het softwarevenster) om alle gaten met te dik ijs (met behulp van de linker limietlijn) en alle lege gaten (met behulp van de rechter limietlijn) te verwijderen, zoals weergegeven in figuur 4.
    OPMERKING: Voor verfijning kunnen specifieke intensiteitswaarden ook worden ingevoerd in de bijbehorende tekstvakken naast de knop Toepassen .
  18. Gebruik desgewenst het selectiepenseel om de selectie van gaten handmatig te verfijnen: Klik met de linkermuisknop en sleep het penseel om ongewenste gaten te deselecteren. Houd de Ctrl-toets ingedrukt en klik met de linkermuisknop om foliegaten opnieuw te selecteren. Houd de Shift-toets ingedrukt en scrol met het muiswiel om de penseelgrootte aan te passen.
  19. Selecteer een gat voor het instellen en testen van een sjabloon voor gegevensverzameling die herhaaldelijk wordt gebruikt tijdens het verzamelen van gegevens: Klik met de rechtermuisknop op een gat in de vierkante rasterafbeelding en selecteer de optie Werkgebied naar locatie verplaatsen.
  20. Selecteer de taak Sjabloondefinitie in het linkerdeelvenster.
  21. Selecteer de hole/eucentric preset en klik op de knop Acquireren om een afbeelding te verkrijgen.
  22. Klik op de knop Gat zoeken en centreren om een gat in de afbeelding te centreren.
  23. Stel waarden voor Delay After Image Shift in op 0,5 s (standaard) en Delay After Stage Shift op 20 s.
    OPMERKING: Aangezien de parallelle bundeldiameter is bevestigd op het cryo-TEM-systeem van 200 kV dat in deze studie wordt gebruikt en doorgaans overeenkomt met 1,6-1,7 μm met een diafragma van 50 μm, kan slechts 1 beeld per gat worden verkregen met behulp van de R-1.2 / 1.3-rasters en 2 afbeeldingen per gat (in de buurt van tegenovergestelde randen) met behulp van de R-2 / 1- of R-2 / 2-rasters. Houd er rekening mee dat de grootte van de ingestelde acquisitiegebieden op het scherm niet overeenkomt met de werkelijke straaldiameter. De afbeeldingsschaalbalk kan worden gebruikt om een geschikte plaatsingsafstand in te schatten.
  24. Selecteer de knop Acquisitiegebied toevoegen en klik op de afbeelding om de locatie in het gecentreerde gat te selecteren waar beeldacquisitie met hoge vergroting vandaan wordt gehaald.
  25. Selecteer de knop Autofocusgebied toevoegen en klik op de afbeelding om de locatie op de ondersteuningsfolie naast het gecentreerde gat te selecteren waar de autofocus van het beeld wordt uitgevoerd.
    OPMERKING: De bundelgrootte voor het scherpstellen is 1,6-1,7 μm en moet onmiddellijk uit naburige gaten op koolstof worden geplaatst.
  26. Klik op het groene acquisitiegebied om een reeks onscherpe waarden in te stellen in de Onscherpe lijst in het bovenste gedeelte van het softwarevenster. Voer als eerste de hoogste onscherpte in om de visualisatie van deeltjes te verbeteren in een testrun van de volgende sjabloonuitvoeringstaak .
  27. Klik op het blauwe autofocusgebied om de autofocusspecifieke instellingen in hetzelfde gebied in te stellen:
    1. Kies de optie Na centreren om autofocus aan het begin van elk AFIS-cluster.
    2. Kies de optie Objectieflens voor snellere autofocus en minder podiumdrift.
  28. Selecteer de taak Sjabloonuitvoering en klik op de knop Uitvoeren.
    1. Observeer afzonderlijke stappen van de gegevensverzamelingsprocedure (centreer het gat, autofocus in het geselecteerde gebied en beeldacquisitie in de ingestelde gebieden) en controleer de kwaliteit van de afgebeelde deeltjes in het uiteindelijke beeld met hoge vergroting.
    2. Klik op de FFT-knop rechtsonder in het afbeeldingsvenster met hoge vergroting om de FFT-afbeelding te controleren en visueel te beoordelen of Thon-ringen meerdere oscillaties vertonen en zich uitstrekken tot een hoge resolutie in de FFT-afbeelding.
  29. Als de uitvoering van de sjabloon met succes is voltooid, klikt u op de knop Alle vierkanten voorbereiden in de taak Gatselectie om gegevensverzameling automatisch in alle andere geselecteerde rastervierkanten in te stellen volgens de gebruikte instellingen in dit eerste rastervierkant.

6. Laatste microscoopuitlijningen voordat u begint met het verzamelen van gegevens

OPMERKING: Om de beste resultaten met hoge resolutie te bereiken, moeten de meest gevoelige uitlijningen precies op dezelfde instellingen worden uitgevoerd als de data-acquisitiemodus in de software voor gegevensverzameling en vlak voordat de daadwerkelijke gegevensverzameling wordt gestart. Deze uitlijningen moeten worden uitgevoerd op een positie met dunne steunkoolstof van het raster, voldoende ver weg van eventuele rasterbalken en uitgelijnd op de eucentrische hoogte.

  1. Selecteer de taak Sjabloonuitvoering , verkrijg een nieuwe afbeelding en ga met het werkgebied naar een schoon gebied op koolstoffolie door met de rechtermuisknop te klikken en selecteer de menuoptie Werkgebied hierheen verplaatsen.
  2. Selecteer het tabblad Automatische functies en stel de gewenste onscherpte in op 0 μm en Itereren op -2 μm. Schakel over naar de autofocusvoorinstelling en klik op de knop Start om de autofocusfunctie uit te voeren.
  3. Zet het fluorescerende scherm neer en open het menu van Directe uitlijningen in de TEM-gebruikersinterface.
  4. Voor het beste resultaat kunnen ervaren gebruikers draaipuntuitlijningen controleren: kies de nP Beam Tilt pp X-taak in het menu Directe uitlijningen en overlap de stuiterende balken maximaal met behulp van de multifunctionele knoppen op de bedieningspanelen. Herhaal dit voor de taak np Beam Tilt pp Y .
  5. Klik op de EF-knop in het cameramenu van het fluorescerende scherm om een groene cirkel weer te geven die het ingangsopeningsopening van het energiefilter aangeeft en de straal over de groene cirkel centreert.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de Turbo pomp is gestopt voordat u doorgaat; trillingen ervan verminderen het aantal zichtbare thon-ringen en zorgen er vaak voor dat de automatische functies uitvallen.
  6. Ga terug naar het softwarevenster en selecteer het tabblad Automatische functies in de menubalk.
  7. Selecteer de taak Autostigmate , schakel over naar de Thon Ring-voorinstelling en druk op de Startknop . Observeer het proces om ervoor te zorgen dat (i) de gemaakte foto's op koolstof zijn, (ii) de Thon-ringen duidelijk zichtbaar zijn en (iii) de berekende CTF-pasvorm (stippellijnen) goed zijn geplaatst bij de Thon-ring minima (aanvullende figuur 2).
  8. Selecteer de taak Automatisch opcomen en druk op de knop Start . Observeer het proces om ervoor te zorgen dat de gemaakte foto's op koolstof zijn en dat de Thon-ringen duidelijk zichtbaar zijn en dat de berekende pasvormen (stippellijnen) goed zijn geplaatst bij de Thon-ring minima. Zoom in op elke Thon-ringafbeelding met behulp van het muiswiel (aanvullende figuur 3).
    OPMERKING: Als de microscoop is uitgerust met een energiefilter, moet het afstemmen van het energiefilter worden uitgevoerd als onderdeel van de uitlijningsvolgorde om de filterspleet te centreren naar de nulverliespiek en om eventuele vervormingen in het prisma van het energiefilter te corrigeren (stappen 6.9-6.14). Deze uitlijningen moeten worden uitgevoerd op een leeg gebied van het raster, zoals in een gebroken rastervierkant.
  9. Open Sherpa UI en selecteer de toepassing Energiefilter (Aanvullende figuur 4).
  10. Stel de camera in op EF-Falcon, bin 4x, belichtingstijd 0,2 s in het venster Instellingen .
  11. Klik op de knop Centreren in de optie Zero Loss om de zero-loss energiefilterspleet te centreren.
  12. Klik op de knop Tune in de optie Isochromaticity (aanvullende figuur 4).
  13. Klik op de Tune Vergroting en Tune Distortions in de optie geometrische en chromatische vervormingen (aanvullende figuur 5, aanvullende figuur 6)
  14. Als de resultaten niet binnen de aangegeven specificaties vallen en in rode kleuren worden weergegeven in het uitvoerrapport, herhaalt u de uitlijningen uit stap 6.11 opnieuw.
    OPMERKING: Hoewel de directe elektronendetectorversterkingsreferentie gedurende maanden stabiel kan zijn, moet een nieuwe versterkingsreferentie worden gemaakt met behulp van de Falcon 4 Reference Image Manager als afbeeldingen van lege gebieden geen uniforme intensiteit vertonen, maar strepen of andere onderscheidende kenmerken vertonen. U kunt ook een Fast Fourier Transform (FFT) van een dergelijke afbeelding berekenen en ervoor zorgen dat er geen lijnen zichtbaar zijn.
  15. Selecteer in het softwarevenster het tabblad Voorbereiding en schakel over naar de voorinstelling Gegevensverzameling .
  16. Stel de dosisinstelling in op 40 e-/Å2 en klik op de knop De dosissnelheid meten .
  17. Ga naar het tabblad EPU , selecteer de taak Geautomatiseerde acquisitie en controleer optioneel de functie Auto Zero Loss ; klik op de knop Start Run om te beginnen met volledig geautomatiseerde gegevensverzameling.

7. Monitoring en optimalisatie van de datakwaliteit tijdens het verzamelen van data

OPMERKING: Terwijl de gegevensverzameling aan de gang is, kunnen de verzamelde gegevens worden bewaakt met behulp van het EQM via het gegevensbeheerportaal. EQM voert bewegingscorrectie en CTF-bepaling on-the-fly uit en geeft de resultaten weer in het portaal. De gebruiker kan vervolgens de kwaliteit van individuele acquisities beoordelen, grafieken op verschillende kwaliteitsindicatoren bekijken, ongewenste acquisities filteren en de gegevens exporteren naar hun uiteindelijke opslag, hetzij on the fly of als een batchtaak.

  1. Navigeer naar de gegevensset waar analysesoftware de gegevens naartoe plaatst met behulp van een webbrowser.
  2. In het datasetoverzicht tonen acquisitiekaarten de informatie over bewegingscorrectie en CTF-bepaling in een grafisch formaat. Klik op afzonderlijke kaarten voor meer informatie.
  3. Schakel het dataviz-paneel in om geaggregeerde grafieken uit de volledige gegevensset weer te geven die het onscherpte-, astigmatisme- en CTF-betrouwbaarheidsbereik per acquisitie weergeven (aanvullende figuur 7).
  4. Gebruik de filters bovenop het paneel om alleen de gegevens te selecteren die zich binnen het gevraagde onscherptebereik bevinden, astigmatisme dicht bij nul hebben en de CTF kan worden bepaald tot de opgegeven (doel)resolutie. Zodra de filters zijn ingesteld, drukt u op de knop Toepassen om alleen de gekozen gegevens weer te geven in het overzichtsvenster van de gegevensset.
  5. Wanneer de meeste van de verkregen beelden binnen de gestelde criteria vallen, laat u de gegevensverzamelingssessie doorgaan tot voltooiing. Als slechts een zeer klein deel van de verkregen afbeeldingen aan de gestelde criteria voldoet, configureert u de instellingen van de analysesoftware opnieuw, gaat u naar een ander gebied in het monster (druk op de knop Next Grid Square in de analysesoftware) of stopt u de gegevensverzameling.

Representative Results

De portal voor gegevensbeheer biedt efficiënte, gestructureerde opslag van verzamelde afbeeldingen, gegevens en metagegevens van meerdere experimentele workflows in één softwareplatform. Elk gedefinieerd experiment in een gemaakt project bestaat uit een workflow met door de klant gedefinieerde stappen om voorbeeldinformatie, verzamelde gegevens en gerelateerde metagegevens zonder enige beperking vast te leggen om maximale flexibiliteit en bruikbaarheid te bieden voor mogelijke experimenten en alle gebruiksscenario's (figuur 1, figuur 2). De portal voor gegevensbeheer heeft ook een labnotitiefunctionaliteit om workflowstappen te illustreren, inclusief beeldverwerking met tussentijdse resultaten, die allemaal samen aan een project kunnen worden gekoppeld en een zo volledig mogelijk record kunnen bieden voor analyse en het maken van rapporten en publicaties.

Figure 1
Figuur 1: Voorbeeld van mogelijke organisatie van data en metadata in het data management platform. Elk project kan bestaan uit meerdere experimenten, zoals cryo-EM of massaspectroscopie (namelijk Protocol stap 2.3). Elk experiment kan meerdere door de gebruiker gedefinieerde workflows bevatten (namelijk protocolstap 2.5), die elk uit meerdere configureerbare stappen bestaan (namelijk protocolstap 2.7). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Weergave van een geopende projectworkflow in het datamanagementplatform. De afbeelding toont de bijbehorende metagegevens en notities aan de geopende stap in de workflow. De linkerbalk met pictogrammen biedt snelle toegang tot verschillende opties en menu's van het gegevensbeheerplatform. Het linkerdeelvenster bevat een lijst met opgeslagen werkstromen (slechts één opgeslagen workflow "Exp2_ApoF_EFTEM_Grid7") en een blauwe knop om een nieuwe workflow toe te voegen. Het centrale paneel toont afzonderlijke stappen in de geopende workflow, zoals hier wordt getoond voor de SPA-workflow. De blauwe knop rechtsboven kan een extra stap toevoegen aan de geopende workflow. Het rechterdeelvenster bevat ruimte voor opgenomen metagegevens of opmerkingen van de workflow die door de gebruiker zijn ingevoerd, waaronder tekst, tabellen en afbeeldingen. Er zijn verschillende opmaakopties voor de tekst beschikbaar. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Cryo-EM-rasters geproduceerd met traditionele dompelvriessystemen, zoals Vitrobot, geven meestal een gradiënt van ijsdikte over het rasteroppervlak weer. Sommige roosters kunnen ook beschadigd raken (gebogen) na handmatige hantering en/of clipping in een autogrid ringdrager. Figuur 3 toont voorbeelden van verschillende rasters zoals weergegeven in het Atlasoverzicht. De roosters met dik ijs of schade moeten worden uitgesloten van verder onderzoek.

Figure 3
Figuur 3: Galerij van verschillende rasters zoals te zien in het Atlasoverzicht. (A) Een slecht raster met dik ijs, (B) een gebogen raster met slecht ijs en ijsverontreiniging, (C) een acceptabel raster met een goede ijsgradiënt, (D) een typisch raster met goed dun ijs en een kleine ijsgradiënt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De selectie van rastervierkanten zonder schade en optimale ijsdikte is van cruciaal belang voor het verzamelen van datasets met hoge resolutie. De ijsdikte kan variëren, zelfs op het niveau van individuele rastervierkanten, en het is daarom belangrijk om alleen gaten met optimaal dun ijs uit elk geselecteerd rastervierkant te selecteren. Figuur 4 toont een geschikt rastervierkant met intacte folie en dun ijs in het midden. Het getoonde rastervierkant is goed voor het instellen van een filter voor geautomatiseerde selectie van gaten met dun ijs in alle geselecteerde rastervierkanten, omdat het een bereik van verschillende ijsdiktes bevat, evenals lege gaten zonder ijs, wat uiterst handig is voor het instellen van een geschikt intensiteitsbereik in het ijsfilter in de taak Gatselectie.

Figure 4
Figuur 4: Een voorbeeldrastervierkant met een gradiënt van ijsdikte, van lege rastervierkanten in het midden en dik ijs bij de rasterbalken. Het filter van ijskwaliteit kan worden gebruikt om het bereik van intensiteiten in gaten met de ideale ijsdikte te selecteren die dienovereenkomstig worden geselecteerd in het rastervierkant (de gaten met groene overlay). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Benchmarkresultaten met behulp van het beschreven protocol werden verkregen met behulp van het monster van muisapo-ferritine (apoF) uit de Kikkawa-groep11. ApoF is een zeer α-spiraalvormig eiwit dat een zeer stabiele octaëdrische kooi vormt. De hoge stabiliteit en hoge symmetrie maken apoF een optimaal monster voor cryo-EM-beeldvorming en beeldverwerking met hoge resolutie. ApoF is daarom een standaardmonster geworden voor het beoordelen van de prestaties van cryo-EM-instrumenten 11,12,13. Een bevroren aliquot met 15 mg/ml gezuiverd apoF-monster werd ontdooid op ijs en geklaard door centrifugeren bij 10.000 x g gedurende 10 minuten. Het supernatant werd verdund tot 5 mg/ml met 20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl. 3 μL van het verdunde monster werd aangebracht op een gloeiende R-1.2/1.3, 300 mesh gouden roosters gedurende 30 s. Vervolgens werden de roosters gedurende 5 s afgeveegd voordat ze invroren in vloeibaar ethaan, gekoeld door vloeibare stikstof. Het invriezen werd uitgevoerd met behulp van een volledig geautomatiseerd vitrificatiesysteem bij 100% vochtigheid en 4 °C. Alle roosters werden in autogrids geknipt en in een 200 kV Cryo-TEM geladen. Ongeveer 3000 films werden verzameld bij een doorvoersnelheid van 300 films/u. Gegevens werden verwerkt met behulp van de methoden zoals beschreven11 met de volgende wijzigingen: i) Relion 4-beta-versie werd gebruikt in plaats van Relion 3.1, ii) geautomatiseerde deeltjespicking werd gedaan met behulp van 2D-klassegemiddelden van eerdere apoF-reconstructies als referenties, en iii) het initiële 3D-model werd gegenereerd uit de vorige apoF-reconstructie laag doorgegeven aan 15-Å-resolutie. Opticagroepering werd niet gedaan voor deze dataset, omdat de gebruikte AFIS-procedure34 heeft bewezen dat het efficiënt en betrouwbaar beam-tilt geïnduceerde faseverschuivingen minimaliseert die de gegevenskwaliteit niet beperken om 3D-kaarten te reconstrueren met de gerapporteerde resoluties. 3D-verfijning na Bayesiaanse polijsten en CTF-verfijning leidde tot een kaart met een resolutie van 1,68 Å. De resolutie werd verder verbeterd met Ewald-bolcorrectie, wat resulteerde in een kaart met een resolutie van 1,63 Å. Het overzicht van de parameters voor gegevensverzameling en -verwerking is weergegeven in tabel 2 en de uiteindelijke gereconstrueerde dichtheidskaart wordt weergegeven in figuur 5, met de Fourier Shell Correlation (FSC) -curve weergegeven in aanvullende figuur 8.

Tabel 2: Gegevensverzameling en beeldverwerkingsparameters die worden gebruikt voor de 3D-reconstructie van apo-ferritine. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Figure 5
Figuur 5: Cryo-EM reconstructie van apo-ferritine. (Linker paneel) 3D rendering van de gereconstrueerde apoF cryo-EM kaart bij 1,6 Å resolutie. (Rechter paneel) Gedetailleerde weergave van de gereconstrueerde kaart op het niveau van individuele aminozuurzijketens. De dichtheid van aminozuur sidechains is goed opgelost en het atoommodel kan ondubbelzinnig binnen deze kaart worden gebouwd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Effecten en voordelen van het gebruik van een energiefilter in de SPA-reconstructies werden geëvalueerd met behulp van het prokaryote 20S-proteasoom geïsoleerd uit T. acidophilum. Het prokaryote 20S-proteasoom is ook gebruikt als een standaard cryo-EM-monster omdat het de stabiele katalytische kern van het proteasoomcomplex vertegenwoordigt met de D7-symmetrie. Roosters werden voorbereid door 4,5 μL van het gezuiverde T. acidophilum 20S proteasoommonster toe te voegen aan een gloeiend ontladen R 2/1 koperen rooster met 200 mazen. Monsters werden verglaasd in een vloeibaar ethaan/propaanmengsel met behulp van een volledig geautomatiseerd vitrificatiesysteem dat was ingesteld op 4 °C en 100% vochtigheid met een depkracht van 20 en een deptijd van 4,5 s.

Drie verschillende datasets werden verzameld uit hetzelfde cryo-EM-raster met vergelijkbare rastervierkanten met behulp van een andere spleetbreedte van het energiefilter in de volgorde: i) volledig opengesneden (geen spleet ingevoegd), ii) 20 eV-spleet en iii) 10 eV-spleet. De rastervierkanten werden geselecteerd met behulp van een ijskwaliteitsfilter in de analysesoftware. Alle andere parameters voor gegevensverzameling en gegevensverwerking werden hetzelfde gehouden. Datasets werden verzameld gedurende 15 uur met een totaal van 4000 films en verwerkt met behulp van de methoden zoals beschreven11 met behulp van Relion 3.1 met de modificatie dat Laplacian-of-Gaussian deeltjeskiesalgoritme werd gebruikt om initiële 2D-klassegemiddelden te produceren voor referentiegebaseerde deeltjesselectie uit de volledige datasets. Hetzelfde aantal (102.200) willekeurig geselecteerde deeltjes werd gekozen en gebruikt voor de uiteindelijke iteratie en 3D-reconstructie van elke dataset. De variabelen voor gegevensverwerking worden beschreven in de onderstaande tabel (tabel 3) om de uiteindelijke gereconstrueerde EM-dichtheidskaart in figuur 6 te verkrijgen met de FSC-curve in aanvullende figuur 9. Opticagroepering en Ewald-bolcorrectie werden ook niet gedaan voor deze datasets.

Tabel 3: Gegevensverzameling en beeldverwerkingsparameters die worden gebruikt voor de 3D-reconstructie van het T. acidophilum 20S-proteasoom. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 4: Samenvatting van de bereikte resolutie en B-factor voor cryo-EM reconstructies van het T. acidophilum 20S proteasoom met behulp van datasets met verschillende energiespleetbreedte. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Figure 6
Figuur 6: Effect van energiefiltering op cryo-EM-beelden. (A) Cryo-EM-beelden bij verschillende onscherptewaarden verzameld met of zonder 10 eV-spleet. (B) Overzicht van de 20S proteasoom cryo-EM kaart met gesegmenteerde subeenheden. (C) Zoomweergave op de 20S proteasoomkaart met een aangepast atoommodel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende figuur 1: Kalibratie van beeldverschuivingen taak (gele ellips) om beeldverschuivingen tussen verschillende optische presets (rode ellipsen) in de analysesoftware uit te lijnen, met behulp van een kristal van zeshoekig ijs dat zichtbaar is in het volledige vergrotingsbereik tussen 100x en 165.000x. (Naar boven) Kalibratie tussen de data-acquisitie- en gat/eucentrische hoogtevoorinstellingen, (middelste) kalibratie tussen de voorinstellingen gat/eucentrische hoogte en rastervierkant, (onderste) kalibratie tussen de rasterplein- en atlasvoorinstellingen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 2: Autostigmate functie in analysesoftware (gele ellips). (Linker afbeelding) Verworven imago. (Rechter afbeelding) Fourieroverdracht van het verkregen beeld met concentrische Thon-ringen en hun CTF-pasvorm weergegeven in radiale stralen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 3: Gebruikersinterface van de Autocoma-functie in analysesoftware (gele ellips) voor coma-uitlijning. Het beeldpaneel toont Fourier-overdrachtsbeelden die zijn verkregen bij verschillende bundelkantelen en hun CTF-pasvormen die worden gebruikt voor de berekening van de coma. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 4: Gebruikersinterface van energiefilterafstemming. Voorbeeld van een goed tunning rapport van de energiefilter isochromacity met alle parameters (weergegeven in groene tekst) binnen specificaties. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 5: Gebruikersinterface van energiefilterafstemming. Voorbeeld van goed afstemmingsrapport van de energiefiltervergrotingsvervormingen met alle parameters (weergegeven in groene tekst) binnen specificaties. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 6: Gebruikersinterface van energiefilterafstemming. Voorbeeld van een goede afstemming van de energiefilter chromatische vervormingen met alle parameters (weergegeven in groene tekst) binnen specificaties. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 7: DataViz panel van de EPU Quality Monitor met een overzicht van datakwaliteit in een verzamelde cryo-EM dataset. De grafieken met geaggregeerde gegevens van alle verzamelde afbeeldingen/films tonen waarden (puntplots) en verdeling (staafplots) van geselecteerde kritische kwaliteitsindicatoren, zoals de CTF-pasvormconstantie (blauw), onscherpte (oranje) en astigmatisme (groen). Een subset van de verzamelde afbeeldingen/films kan worden geselecteerd door parameterfilters in te stellen in de bovenkant van het deelvenster DataViz. Na het toepassen van de filters kunnen geselecteerde afbeeldingen/films worden geëxporteerd voor verdere verwerking in een ander beeldverwerkingspakket, zoals Relion of CryoSpark. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 8: FSC-curve van de uiteindelijke reconstructie van apoF tot 1,6 Å resolutie, zoals gerapporteerd door Relion 4-beta. De blauwe curve toont de FSC van gemaskeerde 3D-kaarten van twee onafhankelijk verfijnde 3D-reconstructies uit twee elkaar uitsluitende halve datasets. Volgens de gouden standaard FSC op 0,143 komt de resolutie van de uiteindelijke 3D-kaart gereconstrueerd uit de volledige dataset overeen met 1,6 Å. De oranje curve toont de FSC van de gemaskeerde 3D-reconstructies met gerandomiseerde fasen. De snelle daling van de FSC-curve geeft aan dat het gebruikte masker niet heeft bijgedragen aan de waargenomen FSC van de oorspronkelijke gereconstrueerde kaarten (blauwe curve) boven ~ 2 Å resolutie. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 9: FSC-curven van de uiteindelijke reconstructie van T. acidophilum 20S proteasoom met behulp van verschillende spleetbreedtes van het energiefilter, zoals gerapporteerd door Relion 3.1. De blauwe curven tonen de FSC van gemaskeerde 3D-kaarten uit twee onafhankelijk verfijnde reconstructies van respectievelijk twee halve datasets van elke dataset. De gouden standaard FSC op 0,143 geeft de bereikte resoluties aan van de uiteindelijke 3D-kaarten gereconstrueerd uit de respectieve volledige datasets (respectievelijk 2,3 Å, 2,2 Å en 2,1 Å resolutie). De rode curven tonen de FSC van gemaskeerde kaarten met gerandomiseerde fasen. De snelle daling van de rode FSC-curven geeft aan dat het gebruikte masker niet heeft bijgedragen aan de FSC van de oorspronkelijke gereconstrueerde kaarten boven ~ 3 Å resolutie. De groene curves tonen de FSC van ontmaskerde 3D-kaarten, die worden beïnvloed door ruis in het gehele gereconstrueerde 3D-volume en daardoor eerder dalen dan de FSC van de gemaskeerde 3D-kaarten. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Beschikbaarheid van gegevens: De cryo-EM-dichtheidskaarten zijn gedeponeerd in de EM Data Bank onder toetredingsnummers: apoferritine: EMD 14173, EMPIAR-10973. 20S proteasoom: EMD 14467, EMPIAR-10976.

Discussion

Het beschreven protocol gaat ervan uit dat de optiek van de gebruikte TEM-microscoop zich in een goed uitgelijnde toestand bevindt. Voor de 200 kV TEM die in dit protocol wordt gebruikt, worden dergelijke kolomuitlijningen uitgevoerd, geverifieerd en opgeslagen door een ervaren servicetechnicus na microscoopinstallatie of een significante service-interventie. Deze uitlijningsinstellingen kunnen op elk moment worden opgeroepen in de gebruikersinterface van de microscoop. Gebruikers kunnen de direct uitlijningsprocedures in de microscoopgebruikersinterface gebruiken om kritieke parameters opnieuw aan te passen. Sommige uitlijningen, zoals kantelbaar en pistoolverschuiving, zijn stabiel en hoeven niet dagelijks door gebruikers te worden aangepast. Controles en heruitlijningen (indien nodig) van het kantelen en verschuiven van het pistool door de microscoopbegeleider worden twee keer per jaar geadviseerd. Aan de andere kant zijn sommige uitlijningen van cruciaal belang en moeten ze vóór elke gegevensverzameling worden uitgelijnd zoals beschreven in het bovenstaande protocol (zoals objectief astigmatisme en coma-vrije uitlijning). Als de Autocoma-functie in de analysesoftware niet convergeert, moet de uitlijning van de kantelpunten en/of het rotatiecentrum worden gecontroleerd en aangepast en moet de juiste centrering van het C2-diafragma worden bevestigd. Daarna moet de Autostigmate-functie worden uitgevoerd, omdat objectieve stigmatoren ook worden gebruikt voor comacorrectie. Deze uitlijningen moeten worden herhaald totdat zowel Autostigmate als Autocomafunctions slagen bij hun eerste iteratie. Indien nodig kan een ander gebied worden geselecteerd (bijv. koolstoffolie ondersteunen zonder ijs), de vervaging van afbeeldingen aangepast of de beeldacquisitietijd worden verhoogd om de signaal-ruisverhouding in verworven beelden te optimaliseren en de zichtbaarheid van meerdere Thon-ringen in de Fouriertransformatie van de verkregen beelden te optimaliseren.

Moderne cryo-EM microscopen genereren enorme hoeveelheden gegevens die vaak meer dan 1 TB per dataset bedragen om 3D-reconstructies met hoge resolutie te bereiken, met name voor eiwitten met een lage symmetrie. Cryo-EM-gegevens en -resultaten worden meestal ook aangevuld met gegevens en resultaten van orthogonale methoden om structuur-functierelaties in elk wetenschappelijk project volledig te begrijpen. Organisatie van verzamelde gegevens, hun overdracht naar een beeldverwerkingspijplijn en het delen van een resulterende cryo-EM-reconstructie onder medewerkers stellen aanvullende eisen aan nieuwe gebruikers van cryo-EM-methodologie om hun lokale IT-infrastructuur op te zetten. Gegevensbeheersoftware, zoals Athena, vergemakkelijkt gecentraliseerde opslag van gegevens die zijn verkregen door elk aangesloten instrument of software die wordt beheerd door een geregistreerde gebruiker. Opgeslagen gegevens en metagegevens zijn toegankelijk via een eenvoudige webbrowserinterface voor meerdere gebruikers, die verschillende rollen in het project kunnen hebben met verschillende toegangsrechten (als eigenaar, medewerker of kijker) op basis van hun aanmeldingsgegevens en definitie voor het delen van gegevens in de experimentinstellingen. Deze digitalisering van experimentele workflows biedt middelen voor het delen van gegevens en metadata tussen medewerkers zonder onnodige duplicatie en verhoogt de productiviteit en traceerbaarheid van gebruikte workflows. Implementatie van een algemene en aanpasbare structuur van projecten, experimenten en workflows in datamanagementsoftware is universeel en maakt aanpassing en integratie van orthogonale experimenten mogelijk met behulp van complementaire methoden in een enkele projectdatabase.

De selectie van gebieden voor de gegevensverzameling op een cryo-EM-raster is van cruciaal belang voor de succesvolle verwerving van datasets met hoge resolutie. Cryo-EM-roosters geproduceerd met traditionele dompelvriesmiddelen, zoals de Vitrobot (een volledig geautomatiseerd vitrificatiesysteem), geven doorgaans een gradiënt van ijsdikte over het rasteroppervlak weer (figuur 4). Dit kan gunstig zijn omdat het raster gebieden met verschillende ijsdiktes bevat; gebieden met de ideale ijsdikte voor gegevensverzameling moeten echter worden geïdentificeerd zoals beschreven in het bovenstaande protocol. Een optimaal cryo-EM-raster moet zo min mogelijk transferijsvervuiling bevatten en voldoende rastervierkanten bevatten met intacte gatvormige ondersteuningsfolie. Het verzamelen van gegevens over rastervierkanten met scheuren of gebroken gebieden wordt niet aanbevolen, omdat verzamelde afbeeldingen worden beïnvloed door een aanzienlijk sterkere algehele drift bij verlichting door een elektronenbundel in vergelijking met de rastervierkanten met intacte ondersteuningsfolie. Een teveel aan kristallijn ijs kan de meeste foliegaten dichten en/of de autofocus verstoren en dergelijke rastervierkanten moeten ook worden vermeden. Rastervierkanten met dun ijs vertonen meestal grote glasachtige gebieden en veel heldere foliegaten die zichtbaar zijn in een afbeelding die is gemaakt met de Atlas-preset. Het voorkomen van dikker ijs in de buurt van roosterbalken is te verwachten en kritiekloos omdat foliegaten in deze delen van het rastervierkant worden uitgesloten tijdens de gatselectieprocedure. De aanwezigheid van verschillende lege gaten in een rastervierkant kan betekenen dat glasachtig ijs in de omliggende gaten extreem dun is en beschadigde deeltjes of helemaal geen deeltjes kan bevatten. Over het algemeen is het verstandig om rastervierkanten te kiezen met een verscheidenheid aan ijsdiktes op verschillende regio's op het raster voor initiële screening en beoordeling om te begrijpen welke gebieden de beste omstandigheden hebben voor gegevensverzameling met hoge resolutie en de ideale deeltjesdichtheid en oriëntatieverdeling vertonen. Voor de apoF- en 20S-proteasoommonsters die in deze studie worden gebruikt, bevatten gebieden met het dunste waarneembare ijs de beste omstandigheden voor beeldvorming met hoge resolutie van deze monsters.

Bij het automatisch selecteren van gaten in alle geselecteerde rastervierkanten met behulp van de software voor gegevensverzameling, wordt geadviseerd om de sjabloonuitvoeringstaak uit te voeren op een representatief gat in elk rastervierkant om te controleren en ervoor te zorgen dat er geen te dikke of te dunne of onverwacht niet-glasachtige vierkanten zijn gekozen voor gegevensverzameling. Tijdens data-acquisitie kunnen belangrijke kwaliteitsindicatoren van verzamelde beelden, zoals beelddrift en CTF-fitting, worden bewaakt met behulp van EQM. Gegevensverzameling kan vervolgens worden geoptimaliseerd door gebieden over te slaan die afbeeldingen van slechte kwaliteit opleveren. Afbeeldingen met ctf-pasvormen met een hoge resolutie kunnen echter nog steeds afbeeldingen bevatten met deeltjes in een paar voorkeursoriëntaties of deeltjes die zijn gedenatureerd in een te dunne ijslaag. Real-time deeltjesselectie en 2D-classificatie van verzamelde beelden zouden aanvullende informatie opleveren over de kwaliteit van structurele gegevens in afgebeelde deeltjes en zowel voorkeursoriëntaties van intacte deeltjes in ijs als inconsistente structuur van (gedeeltelijk) gedenatureerde deeltjes onthullen. De berekening van klassegemiddelden kan daarom helpen om geschikte regio's voor gegevensverzameling verder te verfijnen, zoals al is geïmplementeerd en getoond in andere softwarepakketten23,28.

De selectie van de beeldvormingsinstellingen voor gegevensverzameling, zoals vergroting, elektronendosissnelheid en onscherpbereik, is afhankelijk van verschillende criteria, zoals de doelresolutie, grootte van het eiwit, monsterconcentratie, gewenste microscoopdoorvoer, enz. Voor de directe elektronendetectorcamera die in deze experimenten werd gebruikt, werd het elektronendosistempo gekozen in het bereik van 4-5 e-/pix/s door een geschikte SPOT-grootte en -intensiteit te selecteren om parallelle verlichting te behouden. Zoals weergegeven in tabel 1, kan een andere SPOT-grootte worden gebruikt in de vooraf ingestelde hole/eucentric height om te zorgen voor voldoende signaal-ruisverhouding in het beeld voor het centreren van gaten tijdens het verzamelen van gegevens. De vergroting moet zo worden gekozen dat de pixelgrootte minstens 2-3x kleiner is dan de doelresolutie voor de cryo-EM-reconstructie. De hogere vergroting (d.w.z. kleinere pixelgrootte) wordt echter gebruikt, het kleinere gezichtsveld wordt vastgelegd in afbeeldingen en er zijn minder deeltjes per afbeelding, wat uiteindelijk leidt tot een langere tijd voor het verzamelen van gegevens om afbeeldingen te verzamelen met voldoende deeltjes om 3D-kaarten te reconstrueren tot een hoge resolutie. Voor het apoF-monster gebruikten we de pixelgrootte van 0,43 Å omdat we voldoende monsterconcentratie hadden voor een hoge dichtheid van deeltjes in afbeeldingen en gericht waren op sub-2 Å-resolutie van de reconstructie. Voor het 20S proteasoommonster gebruikten we de pixelgrootte van 0,68 Å om een groter gezichtsveld in verkregen afbeeldingen te bestrijken. Typisch voor 200 kV TEM microscopen worden cryo-EM beelden verkregen in het onscherptebereik van 0,8 tot 2,0 μm. Met het verbeterde contrast en de signaal-ruisverhouding met behulp van het energiefilter kunnen gegevensacquisities echter veel dichter bij de focus worden gedaan om informatie met hoge resolutie in verkregen beelden beter te behouden als gevolg van kleinere aberraties en dienovereenkomstig verminderd verval van de CTF-envelopfunctie. We gebruiken ook geen objectief diafragma omdat het diafragma extra beeldafwijkingen kan introduceren terwijl het beeldcontrast al voldoende is verbeterd door het energiefilter te gebruiken. Voor de apoF- en 20S-proteasoommonsters gebruikten we de onscherpte-instellingen van 0,5 μm, 0,7 μm en 0,9 μm. Voor kleinere eiwitten (<200 kDa) gebruikten we onscherpte-instellingen van -0,5 μm, -0,7 μm en -0,9 μm om het contrast van deeltjes te verbeteren en gemakkelijker deeltjes te verzamelen en initiële grove uitlijning te vergemakkelijken in de 3D-verfijningsstap van 3D-reconstructie, wat leidde tot ~ 2,5 Å resolutie 3D-kaarten (ongepubliceerde resultaten).

We hebben al aangetoond dat beeldvorming met een energiefilter de signaal-ruisverhouding (SNR) verbetert in cryo-EM-beelden verzameld op de high-end 300 kV TEM microscopen11. In feite, wanneer elektronen door een monster gaan, treden twee hoofdtypen interacties op: i) Elastisch verstrooide elektronen behouden hun energie en dragen bij aan beeldvorming door interferentie met de niet-verstrooide invallende bundel via het fasecontrastmechanisme ii) inelastisch verstrooide elektronen verliezen wat energie in het monster en dragen voornamelijk bij aan ruis in beelden. Daarom kan SNR aanzienlijk worden verbeterd door de inelastisch verstrooide elektronen, die een lagere energie hebben dan de invallende bundel en elastisch verstrooide elektronen, te filteren met behulp van een smalle energiespleet. Het is echter van cruciaal belang om een voldoende stabiel energiefilter te gebruiken, zoals de Selectris of Selectris-X, om zeer smalle (10 eV of kleinere) spleten te kunnen gebruiken gedurende lange (12+ uur) geautomatiseerde gegevensverzameling van cryoEM-datasets met hoge resolutie.

Cryo-EM-beelden verkregen met 200 kV TEM microscopen onder dezelfde omstandigheden als met 300 kV TEM microscopen vertonen kleinere SNR bij hoge resolutie (met name <4 Å) als gevolg van sneller verval van de CTF-envelopfuncties. Bijgevolg is een groter aantal deeltjes (en dus een hoger aantal verzamelde beelden) vereist om een bepaalde resolutie te bereiken bij gebruik van 200 kV TEM's. Bovendien is de scherptediepte (10-25 nm in het resolutiebereik van 2-3 Å) ook ongeveer 20% kleiner in 200 kV-beelden35, wat betekent dat minder deeltjes in de ijslaag (meestal 20-50 nm dik) volledig scherp zullen zijn en constructief bijdragen aan alle hoge resolutiekenmerken van een berekende 3D-reconstructie, tenzij de onscherptewaarden voor elk deeltje onafhankelijk worden verfijnd in de latere stadia van de 3D-reconstructieprocedure. Voor grotere deeltjes (zoals icosaëdrale virionen of andere macromoleculaire assemblages) kan de deeltjesgrootte de scherptediepte bij hoge resoluties overschrijden en fasefouten introduceren als gevolg van planaire benadering van de Ewald-bol in de standaard 3D-reconstructiealgoritmen36. Deze fouten kunnen worden verfijnd door geavanceerde algoritmen die al zijn geïmplementeerd in gemeenschappelijke cryo-EM-beeldverwerkingspakketten 37,28,39. Omdat de Ewald-bol een grotere kromming heeft in 200 kV-gegevens dan 300 kV-gegevens, is de Ewald-bolcorrectie nodig bij relatief lagere resoluties en/of voor relatief kleinere macromoleculaire assemblages bij gebruik van 200 kV TEM's. Aan de andere kant vertonen 200 kV-beelden een hoger contrast van deeltjes in dun ijs (20-50 nm) dat aanzienlijk dunner is dan het gemiddelde vrije pad van 200-300 keV-elektron (220-280 nm). Het hogere contrast helpt om de juiste globale uitlijning van individuele deeltjes te verbeteren, met name voor het zwak verstrooien van kleinere eiwitten waarvan de structuur nog niet bekend is en het 3D-referentiemodel nog niet goed is ingeburgerd.

Hier hebben we op het voorbeeld van een 20S-proteasoom aangetoond dat het beeldcontrast en de kwaliteit op dezelfde manier kunnen worden verbeterd met een energiefilter bij gebruik van een 200 kV TEM-microscoop. Met hetzelfde aantal deeltjes werden gegevens verzameld met behulp van de 20 eV-spleet gereconstrueerd tot een resolutie van 2,26 Å in vergelijking met gegevens die werden verzameld met de volledig geopende energiespleet die alleen werd gereconstrueerd tot een resolutie van 2,34 Å. De beste reconstructie werd bereikt op basis van gegevens die werden verzameld met behulp van de 10 eV-spleet die werd gereconstrueerd tot een resolutie van 2,14 Å. Deze resultaten komen overeen met de theoretische voorspelling dat filtering van de inelastisch verstrooide elektronen de SNR in verzamelde beelden verhoogt en een hogere resolutie in cryo-EM-reconstructies van het gegeven aantal deeltjes mogelijk maakt, zoals samengevat in tabel 4. Deze resultaten werden verder bevestigd door de B-factoren berekend uit deze datasets die wijzen op een hogere kwaliteit van beelden in de energie-gefilterde datasets.

We kunnen daarom concluderen dat terwijl 300 kV TEM microscopen de hoogste doorvoer en de hoogst mogelijke resolutie leveren in cryo-EM reconstructies, de 200 kV TEM microscopen ook hoogwaardige datasets bieden voor cryo-EM reconstructies met hoge resolutie. We hebben hier laten zien dat de kwaliteit van de verkregen beelden, en dus de algehele time-to-structure, verder kan worden verbeterd door gebruik te maken van de 200 kV TEM uitgerust met een energiefilter en een directe elektronendetector. Het gepresenteerde protocol beschrijft alle noodzakelijke stappen voor het routinematig verkrijgen van cryo-EM-gegevens met hoge resolutie met behulp van deze opstelling en onthult fijne structurele details van macromoleculaire 3D-structuren, die essentieel zijn voor het begrijpen van de belangrijkste structuur-functierelaties in structurele biologie en op structuur gebaseerd medicijnontwerp.

Disclosures

Sagar Khavnekar meldt geen belangenverstrengeling. De andere auteurs zijn medewerkers van Thermo Fisher Scientific, de MSD-EM divisie.

Acknowledgments

Geen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AutoGrid rings Thermo Fisher Scientific 1036173 Package of 100x AutoGrid rings for the standard EM grids.
C-Clip Thermo Fisher Scientific 1036171 Package of 100 clips that secure
the standard EM grids inside the AutoGrid rings.
Data Management Platform Thermo Fisher Scientific 1160939 Part of the Glacios base configuraiton; includes Athena Software
EPU Quality Monitor Thermo Fisher Scientific 1179770
EPU Software Thermo Fisher Scientific 1025080 Part of the Glacios base configuration
Ethane 3.5 Westfalen A06010110 Ethane gas used for making liquid ethane (puritiy at least N35, i.e. 99.95% vol)
Falcon 4 200kV Thermo Fisher Scientific 1166936 Direct electron detector
Glacios Thermo Fisher Scientific 1149551 200 kV TEM
GloQube Plus Glow Discharge System for TEM Grids and surface modification Quorum N/A also available via Thermo Fisher Scientific (PN 1160602)
QuantiFoil grids Quantifoil N/A R-2/1, 300 mesh; carbon foil grid
Relion MRC Laboratory of Molecular Biology N/A open source software:
https://relion.readthedocs.io/en/release-3.1/
Selectris with Falcon
4 for 200 kV		 Thermo Fisher Scientific 1191753 Energy filter
Selectris X with Falcon
4 for 200 kV		 Thermo Fisher Scientific 1191755 Energy filter
UltrAuFoil grids Quantifoil N/A R-1.2/1.2, 300 mesh; gold foil grids
Vitrobot Mk. IV Thermo Fisher Scientific 1086439 Automated vitrification system
Whatman 595 filter paper Thermo Fisher Scientific AA00420S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, J., Hua, T., Liu, Z. -J. Structural features of activated GPCR signaling complexes. Current Opinions in Structural Biology. 63, 82-89 (2020).
  2. Chen, S., Gouaux, E. Structure and mechanism of AMPA receptor - auxiliary protein complexes. Current Opinions in Structural Biology. 54, 104-111 (2019).
  3. Kühlbrandt, W. Structure and mechanisms of F-Type ATP synthases. Annual Review of Biochemistry. 88, 515-549 (2019).
  4. Laverty, D., et al. Cryo-EM structure of the human α1β3γ2 GABA A receptor in a lipid bilayer. Nature. 565 (7740), 516-520 (2019).
  5. Liu, F., Zhang, Z., Csanády, L., Gadsby, D. C., Chen, J. Molecular structure of the Human CFTR ion channel. Cell. 169 (1), 85-95 (2017).
  6. Wrapp, D., et al. Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation. Science. 367 (6483), 1260-1263 (2020).
  7. Ke, Z., et al. Structures and distributions of SARS-CoV-2 spike proteins on intact virions. Nature. 588, 498-502 (2020).
  8. Yan, R., Zhang, Y., Li, Y., Xia, L., Guo, Y., Zhou, Q. Structural basis for the recognition of SARS-CoV-2 by full-length human ACE2. Science. 367 (6485), 1444-1448 (2020).
  9. Walls, A. C., Park, Y. -J., Tortorici, M. A., Wall, A., McGuire, A. T., Veesler, D. Structure, function, and antigenicity of the SARS-CoV-2 spike glycoprotein. Cell. 180, 281-292 (2020).
  10. Chiba, S., et al. Multivalent nanoparticle-based vaccines protect hamsters against SARS-CoV-2 after a single immunization. Communications Biology. 4 (1), 597 (2021).
  11. Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587, 152-156 (2020).
  12. Bai, X. C. Seeing atoms by single-particle Cryo-EM. Trends in Biochemical Sciences. 46 (4), 253-254 (2021).
  13. Koh, A., et al. High-resolution cryo-EM at 200kV enabled by Selectris-X and Falcon 4. Microscience Microscopy Congress 2021. , Abstract 212 (2021).
  14. Herzik, M. A., Wu, M., Lander, G. C. Achieving better-than-3-Å resolution by single-particle cryo-EM at 200 keV. Nature Methods. 14 (11), 1075-1078 (2017).
  15. Herzik, M. A., Wu, M., Lander, G. C. High-resolution structure determination of sub-100 kDa complexes using conventional cryo-EM. Nature Communications. 10 (1), 1032 (2019).
  16. Wu, M., Lander, G. C., Herzik, M. A. Sub-2 Angstrom resolution structure determination using single-particle cryo-EM at 200 keV. Journal of Structural Biology X. 4, 100020-100029 (2020).
  17. Mori, T., et al. C-Glycoside metabolism in the gut and in nature: Identification, characterization, structural analyses and distribution of C-C bond-cleaving enzymes. Nature Communications. 12 (1), 6294 (2021).
  18. Hamdi, F., et al. 2.7 Å cryo-EM structure of vitrified M. musculus H-chain apoferritin from a compact 200 keV cryo-microscope. PLoS One. 15 (5), 0232540 (2020).
  19. Abbott, S., et al. EMDB web resources. Current Protocols in Bioinformatics. 61 (1), 1-12 (2018).
  20. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  21. Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  22. Gómez-Blanco, J., et al. Using Scipion for stream image processing at Cryo-EM facilities. Journal of Structural Biology. 204 (3), 457-463 (2018).
  23. Tegunov, D., Cramer, P. Real-time cryo-electron microscopy data preprocessing with Warp. Nature Methods. 16 (11), 1146-1152 (2019).
  24. Lander, G. C., et al. Appion: an integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing. Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).
  25. Carragher, B., et al. Current outcomes when optimizing 'standard' sample preparation for single-particle cryo-EM. Journal of Microscopy. 276 (1), 39-45 (2019).
  26. Drulyte, I., et al. Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation. Acta Crystallographica. Section D, Structural Biology. 74 (6), 560-571 (2018).
  27. Bloch, M., Santiveri, M., Taylor, N. M. I. Membrane protein Cryo-EM: Cryo-grid optimization and data collection with protein in detergent. Methods in Molecular Biology. 2127, 227-244 (2020).
  28. Cheng, A., et al. Leginon: New features and applications. Protein Science. 30 (1), 136-150 (2021).
  29. Schorb, M., et al. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).
  30. Li, X., et al. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nature Methods. 10 (6), 584-590 (2013).
  31. Alewijnse, B., et al. Best practices for managing large CryoEM facilities. Journal of Structural Biology. 199, 225-236 (2017).
  32. Baldwin, P. R., et al. Big data in cryoEM: automated collection, processing and accessibility of EM data. Current Opinion in Microbiology. 43, 1-8 (2018).
  33. Guo, H., et al. Electron-event representation data enable efficient cryoEM file storage with full preservation of spatial and temporal resolution. International Union of Crystallography Journal. 7, 860-869 (2020).
  34. Weis, F., Hagen, W. J. H. Combining high throughput and high quality for cryo-electron microscopy data collection. Acta Crystallographica. Section D, Structural Biology. 76 (8), 724-728 (2020).
  35. Zhou, H., Chiu, W. Determination of icosahedral virus structures by electron cryomicroscopy at subnanometer resolution. Advances in Protein Chemistry. 64, 93-124 (2005).
  36. DeRosier, D. J. Correction of high-resolution data for curvature of the Ewald sphere. Ultramicroscopy. 81 (2), 83-98 (2000).
  37. Wolf, M., DeRosier, D. J., Grigorieff, N. Ewald sphere correction for single-particle electron microscopy. Ultramicroscopy. 106 (4-5), 376-382 (2006).
  38. Leong, P. A., Yu, X., Hong Zhou, Z., Jensen, G. J. Correcting for the ewald sphere in high-resolution single-particle reconstructions. Methods in Enzymology. 482, 369-380 (2010).
  39. Zivanov, J., et al. New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3. eLife. 7, 42166 (2018).

Tags

Biochemie cryo-EM hoge resolutie structuur uitlijningen gegevensverzameling gegevensbeheer Glacios EPU energiefilter
Routinematige verzameling van cryo-EM-datasets met hoge resolutie met behulp van 200 KV transmissie-elektronenmicroscoop
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Koh, A., Khavnekar, S., Yang, W.,… More

Koh, A., Khavnekar, S., Yang, W., Karia, D., Cats, D., van der Ploeg, R., Grollios, F., Raschdorf, O., Kotecha, A., Němeček, D. Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope. J. Vis. Exp. (181), e63519, doi:10.3791/63519 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter