Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Rutinemæssig indsamling af kryo-EM-datasæt i høj opløsning ved hjælp af 200 KV transmissionselektronmikroskop

Published: March 16, 2022 doi: 10.3791/63519
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 3
1Materials and Structural Analysis Division, Thermo Fisher Scientific, 2Max Planck Institute of Biochemistry, Molecular Structural Biology, 3Materials and Structural Analysis Division, Thermo Fisher Scientific
* These authors contributed equally

Summary

Kryo-EM-kort over makromolekyler i høj opløsning kan også opnås ved hjælp af 200 kV TEM-mikroskoper. Denne protokol viser de bedste fremgangsmåder til indstilling af nøjagtige optikjusteringer, dataindsamlingsordninger og udvælgelse af billedbehandlingsområder, der alle er afgørende for en vellykket indsamling af datasæt i høj opløsning ved hjælp af en 200 kV TEM.

Abstract

Kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) er blevet etableret som en rutinemæssig metode til bestemmelse af proteinstruktur i løbet af det sidste årti og har taget en stadigt stigende andel af offentliggjorte strukturelle data. De seneste fremskridt inden for TEM-teknologi og automatisering har øget både hastigheden af dataindsamlingen og kvaliteten af erhvervede billeder og samtidig reduceret det krævede ekspertiseniveau for at opnå cryo-EM-kort i opløsninger under 3 Å. Mens de fleste af sådanne højopløsningsstrukturer er opnået ved hjælp af state-of-the-art 300 kV cryo-TEM-systemer, kan højopløsningsstrukturer også opnås med 200 kV cryo-TEM-systemer, især når de er udstyret med et energifilter. Derudover reducerer automatisering af mikroskopjusteringer og dataindsamling med billedkvalitetsvurdering i realtid systemkompleksiteten og sikrer optimale mikroskopindstillinger, hvilket resulterer i øget udbytte af billeder i høj kvalitet og samlet gennemstrømning af dataindsamling. Denne protokol demonstrerer implementeringen af de seneste teknologiske fremskridt og automatiseringsfunktioner på et 200 kV kryotransmissionselektronmikroskop og viser, hvordan man indsamler data til rekonstruktion af 3D-kort, der er tilstrækkelige til de novo atommodelbygning. Vi fokuserer på bedste praksis, kritiske variabler og almindelige problemer, der skal overvejes for at muliggøre rutinemæssig indsamling af sådanne kryo-EM-datasæt i høj opløsning. Især følgende væsentlige emner gennemgås i detaljer: i) automatisering af mikroskopjusteringer, ii) udvælgelse af egnede områder til dataindsamling, iii) optimale optiske parametre til dataindsamling af høj kvalitet, høj gennemstrømning, iv) energifilterindstilling til nul-tabsbilleddannelse og v) datastyring og kvalitetsvurdering. Anvendelse af bedste praksis og forbedring af opnåelig opløsning ved hjælp af et energifilter vil blive demonstreret på eksemplet med apo-ferritin, der blev rekonstrueret til 1,6 Å, og Thermoplasma acidophilum 20S proteasom rekonstrueret til 2,1-Å opløsning ved hjælp af en 200 kV TEM udstyret med et energifilter og en direkte elektrondetektor.

Introduction

Bestemmelse af proteinstruktur er afgørende for at forstå den molekylære arkitektur, funktion og regulering af proteinkomplekser involveret i vigtige cellulære processer, såsom cellemetabolisme, signaltransduktion eller værtspatogeninteraktioner. Kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) har vist sig som en kraftfuld teknik, der er i stand til at løse 3D-strukturen af mange proteiner og deres komplekser, der var for udfordrende for de traditionelle strukturelle teknikker, såsom røntgendiffraktion og NMR-spektroskopi. Især er cryo-EM blevet bevist som den foretrukne metode til membranproteiner, som ikke let kan krystalliseres eller fremstilles i tilstrækkelige mængder til de traditionelle strukturelle teknikker, og gav ny indsigt i strukturen og funktionen af vigtige cellulære receptorer og ionkanaler 1,2,3,4,5 . Senest har cryo-EM spillet en vigtig rolle i bekæmpelsen af Covid-19-pandemien ved at bestemme mekanismen for SARS-CoV-2-infektion på molekylært niveau, som belyste oprindelsen af Covid-19-sygdommen og gav grundlaget for den hurtige udvikling af effektive vacciner og terapi 6,7,8,9,10.

Typisk anvendes high-end 300-kV transmissionselektronmikroskoper (TEM) til højopløsningsstrukturbestemmelse af biomolekyler ved kryo-EM enkeltpartikelanalyse (SPA) for at afsløre deres konformation og interaktioner. For nylig nåede SPA-teknikken en ny grænse, da den fælles benchmark cryo-EM-prøve apo-ferritin blev rekonstrueret ved atomopløsning (1,2 Å) 11,12 ved hjælp af en 300 kV TEM udstyret med koldfeltemissionspistolen (E-CFEG), en direkte elektrondetektor og et energifilter. Ved denne beslutning var det muligt entydigt at løse positioner af individuelle atomer i strukturen, konformation af individuelle aminosyresidekæder samt hydrogenbinding og andre interaktioner, hvilket åbner nye muligheder for strukturbaseret lægemiddelopdagelse af nye mål og optimering af eksisterende lægemiddelkandidater.

Mellemklasse 200 kV TEM-mikroskoper bruges ofte til prøvescreening og prøveoptimering inden endelig dataindsamling i høj opløsning ved hjælp af avancerede TEM-mikroskoper, især på større cryo-EM-faciliteter. Typisk kan afbildede prøver løses i opløsningsområdet 3-4 Å, der er tilstrækkeligt til at flytte til en avanceret 300-kV TEM til endelig dataindsamling. Derfor er dataindsamling ved hjælp af 200 kV TEM ofte ikke yderligere optimeret til de højest mulige opløsningsresultater. Desuden kan mange interessante biologiske spørgsmål allerede besvares og offentliggøres ved disse opløsninger, da alle aminosyresidekæder allerede er løst, og belægningen af ligandbindingssteder kan også bestemmes pålideligt13. Det er allerede blevet påvist, at 200 kV TEM'er kan nå opløsninger ud over 3 Å for adskillige prøver 14,15,16,17,18. Billeder taget ved 200 kV udviser i sagens natur højere kontrast af afbildede partikler, hvilket endda kan lette mere nøjagtig indledende justering af partiklerne på trods af mere dæmpet signal i høj opløsning sammenlignet med 300 kV TEM-billeder. Det er vigtigt at bemærke, at den opnåede opløsning af rekonstruerede cryo-EM-kort også er begrænset af strukturel fleksibilitet og konformationel heterogenitet af afbildede prøver, hvilket påvirker både 200 kV og 300 kV rekonstruktioner. Faktisk blev langt flere cryo-EM-rekonstruktioner opnået ved hjælp af 300-kV-systemerne løst i 3-4 Å-opløsningsområdet end ved højere opløsninger19. Da 200 kV TEM-mikroskoper er mindre komplekse og passer ind i mindre rum, repræsenterer disse mikroskoper en god, billigere mulighed for strukturbestemmelse af biologiske makromolekyler ved hjælp af cryo-EM, samtidig med at automatisering af lange dataindsamlinger fra flere prøver, der er gemt i mikroskopet Autoloader-systemet, bevares.

Indsamling af cryo-EM-datasæt til bestemmelse af struktur i høj opløsning kræver nøjagtig justering af mikroskopoptikken. Kolonnejusteringer foregår systematisk fra elektronkilden ned til kondensatorlinsesystemet, objektivlinsen og energifilteret med en elektrondetektor. Den fulde sekvens af justeringer er typisk ikke påkrævet. Når det er nødvendigt, guides brugeren via halvautomatiske procedurer med en korrekt beskrivelse af hvert trin i et kontekstbevidst hjælpevindue gennem hele justeringsproceduren i mikroskopets brugergrænseflade (Kontrolpanel for direkte justeringer). Når mikroskopet er fuldt justeret, forbliver elektronoptikken stabil, og justeringerne behøver ikke ændres i mindst et par måneder. Kun de mest følsomme justeringer, f.eks. parallel belysning af prøveplanet, objektiv bygningsfejl og komafri justering, skal finjusteres, lige før indsamlingen af hvert datasæt påbegyndes. Kvaliteten af indsamlede data kan derefter overvåges under dataindsamling ved hjælp af forskellige softwarepakker, såsom EPU Quality Monitor, cryoSPARC Live20, Relion21, Scipion22, WARP23 eller Appion24.

Ud over nøjagtige justeringer af mikroskopet er den høje kvalitet af velrensede prøver med minimal konformationel og sammensætningsmæssig heterogenitet også en forudsætning for indsamling af datasæt i høj opløsning og løsning af højopløsningsstrukturer. Flere detaljer om typiske protokoller, hyppige udfordringer og mulige retsmidler kan findes i andre anmeldelser dedikeret til dette emne 25,26,27. I det væsentlige er det afgørende at finde områder på et givet cryo-EM-gitter, der har tilstrækkelig tynd is til at bevare information i høj opløsning, og individuelle partikler fordeles tæt i tilfældige retninger uden overlapninger. Typiske cryo-EM-gitre har dog ikke-ensartet istykkelse, og det er derfor vigtigt at finde og udvælge de optimale områder til billeddannelse. Forskellige midler til estimering af istykkelsen på nettet er tilgængelige i softwarepakker dedikeret til automatiseret indsamling af cryo-EM-datasæt, såsom EPU 2, Leginon28 eller SerialEM29.

Fremkomsten af hurtige og følsomme direkte elektrondetektorer muliggjorde indsamling af billeder i mange fraktioner som film, der muliggjorde kompensation for stråleinducerede bevægelser og resulterede i en betydelig stigning i kvaliteten og mængden af data, der blev brugt til billedbehandling og endelig 3D-rekonstruktion30. Samtidig giver automatisering og dataindsamling med høj kapacitet enorme datasæt med tusindvis af billeder /film, der repræsenterer udfordringer for datalagring og adgang. Den vedtagne model med store cryo-EM-faciliteter, der betjener titusinder til hundreder af brugere, kræver især organiseret datastyring med korrekt sporing og datadeling i etablerede cryo-EM-rørledninger31,32.

Denne undersøgelse beskriver en protokol til rutinemæssig indsamling af kryo-EM-datasæt i høj opløsning ved hjælp af 200 kV Glacios TEM-mikroskopet. Nødvendige justeringer af mikroskopoptikken beskrives sammen med procedurer for evaluering af cryo-EM-prøver og udvælgelse af egnede områder til dataindsamling i høj opløsning. Organiseringen af indsamlede data og relaterede metadata med prøveoplysninger er demonstreret i Athena - en datastyringsplatform, der letter gennemgangen af prøveoplysninger og indsamlede data. Ved hjælp af musens apo-ferritinprøve var det muligt at opnå en 3D-rekonstruktion ved 1,6 Å-opløsning13. Ved hjælp af den beskrevne protokol rekonstruerede vi også 3D-densitetskortet over 20S-proteasomet fra Thermoplasma acidophilum ved 2,1 Å-opløsning.

Protocol

Alle trin i protokollen er beskrevet for 200 kV Glacios TEM-systemet (i det følgende benævnt 200 kV TEM) udstyret med Selectris-X-energifilteret (i det følgende benævnt energifilter) og Falcon 4-detektoren (i det følgende benævnt direkte elektrondetektor). Protokoltrinnene er specifikke for EPU-applikationen, som er standard SPA-dataindsamlingssoftwaren, der er forudinstalleret på hvert Glacios-system. Protokoltrinnene nedenfor svarer til EPU version 2.14, og der forventes små ændringer, når du bruger en anden EPU-version. Forudsætningerne for denne protokol er: i) pistol- og kolonnejusteringerne er godt justeret, ii) EM-kalibreringerne er korrekte, og iii) EPU's autofunktioner er korrekt kalibreret.

1. Indlæsning af gitter i mikroskopet

BEMÆRK: Den 200 kV TEM, der anvendes i dette eksperiment, kan rumme op til 12 autogrids (dvs. konventionelle TEM-gitre, der er klippet ind i en speciel patron) i en kassette, der er indlæst inde i mikroskopets Autoloader og konstant holdes ved temperaturer under -170 ° C for at forhindre prøvedevitering.

  1. Indsæt autogrids i Autoloader-kassetten under flydende nitrogenforhold.
  2. Indsæt kassetten med autogitter i en væske-nitrogenkølet overførselskapsel.
  3. Indsæt kapslen i mikroskopet, og klik på Dock-knappen i mikroskopets brugergrænseflade for at indlæse kassetten fra kapslen i mikroskopets Autoloader.
  4. Klik på knappen Beholdning for at kontrollere tilstedeværelsen af autogrids i den indlæste kassette.
  5. Klik på knapperne Indlæs og aflæs for at indsætte autogrids i kolonnen til TEM-billeddannelse.

2. Indstilling af et projekt i en datastyringsplatform (valgfrit)

BEMÆRK: Eksempeloplysninger og indsamlede data kan organiseres i den medfølgende datastyringsplatform, der muliggør lagring af strukturerede data for alle tilsluttede instrumenter. Der kan oprettes et projekt, for hvilket alle arbejdsgangstrin kan defineres for at fange billederne og metadataene på en organiseret måde til gennemgang og eksport.

  1. Start applikationen til datastyringsportalen, og log ind med et brugernavn og en adgangskode.
  2. I venstre panel på portalens brugergrænseflade skal du klikke på knappen Tilføj projekt for at oprette et nyt projekt eller klikke på en knap for et eksisterende projekt på listen nedenfor for at åbne et projekt.
  3. Klik på knappen Tilføj eksperiment for at oprette et nyt eksperiment inden for det åbnede projekt.
  4. Udfyld beskrivelsen i panelet Metadata for det nye eksperiment, og klik på knappen Tilføj arbejdsgang for at oprette en ny arbejdsproces i eksperimentet (f.eks. Enkeltpartikelanalyse).
  5. Klik eventuelt på knappen Tilføj trin i midterpanelet for at oprette en skræddersyet arbejdsgang eller tilføje yderligere trin til den foruddefinerede SPA-arbejdsgang (figur 1 og figur 2).
    BEMÆRK: Trinene kan repræsentere prøveforberedelse, prøvekarakterisering ved biokemiske teknikker, prøveglasning, screening af cryo-EM-gitre, dataindsamlingssessioner og dataanalyse.
  6. Udfyld eventuelt beskrivelser i noterne for hvert trin, som kan omfatte billeder og fotos.
  7. Opret et datasættrin i arbejdsgangen, og vælg datasættypen som EPU.
    BEMÆRK: Dette gør det muligt for analysesoftwaren at placere alle resultatdata / metadata på det rigtige sted i datastyringsportalen automatisk under dataindsamling og eksportere dataene automatisk til den foretrukne destination, samtidig med at der opretholdes en komplet registrering af alle trin og dataoverførsel.
  8. Udfyld skabeloner om skemaerne Eksempel og EM i trinnet Biokemi , og knyt hvert gitter til et eksempel (bemærk, at én prøve kan knyttes til flere gitre).
  9. Tilknyt kombinationer af eksempelgitre i metadatasektionen i trinnet Datasæt .

3. Konfigurer billedforudindstillinger og billedskiftkalibreringer i analysesoftwaren

  1. Indstil billedparametre for individuelle billedbehandlingstilstande som vist i tabel 1. Overvejelser i forbindelse med valg af specifikke indstillinger er beskrevet detaljeret i afsnittet Diskussion.
  2. Indstil parallel belysning for den valgte forstørrelse i forudindstillingen for dataindsamling i analysesoftwaren
    BEMÆRK: Der er kun én indstilling af C2-objektivet til parallel belysning af prøven ved den givne SPOT-størrelse (dvs. forudindstillede styrker for C1-objektivet) på 2-kondensator TEM-systemer, såsom 200 kV TEM, der anvendes i denne undersøgelse. Elektrondosishastigheden pr. arealenhed (e-/Å2/s) kan derfor kun justeres ved at ændre indstillingerne for SPOT-størrelse og justere C2-styrken (stråleintensiteten) i overensstemmelse med nedenstående trin.
    1. Flyt til et område med støtte kulstoffolie og tynd eller ingen is.
    2. Vælg objektiv blændeåbningen på 100 μm eller 70 μm i menuen Blænde i TEM-brugergrænsefladen.
    3. Tryk på diffraktionsknappen på kontrolpanelerne for at skifte til diffraktionstilstand.
    4. Indsæt den fluorescerende skærm, og skift FluCam-tilstand til Høj opløsning.
    5. Flyt det centrale diffraktionspunkt til en kant af blænden. Hvis blændekanten ikke er synlig, skal du øge kameralængden (ved hjælp af knappen Forstørrelse).
    6. Drej forsigtigt fokusknappen på kontrolpanelet for at bringe det bageste fokusplan i fokus. Det bageste fokusplan er fokuseret, når blændekanten er synligt skarp.
    7. Reducer følsomheden af FluCam til det laveste niveau, og flyt det centrale diffraktionssted til midten af FluCam.
    8. Minimer størrelsen på det centrale sted ved hjælp af knappen Intensitet på kontrolpanelet.
    9. Træk objektivblænden tilbage i TEM-brugergrænsefladen, og skift tilbage til billedbehandlingstilstanden.
    10. Klik på knappen Hent i analysesoftware for at gemme indstillingerne i forudindstillingen For dataindsamling.
  3. Juster elektrondosishastigheden i den forudindstilling for dataindsamling, der er optimal for brugt detektor:
    1. Flyt til et tomt område på gitteret (f.eks. en gitterfirkant med brudt kulfolie)
    2. Klik på knappen Mål dosis i analysesoftwaren for at måle elektrondosishastigheden.
    3. Skift SPOT-størrelse for at opnå den optimale dosishastighed. I tilfælde af den direkte elektrondetektor, der anvendes i denne protokol, anvendes en dosishastighed på 4-5 e-/pixel/s typisk til dataindsamling i høj opløsning. Dette svarer typisk til SPOT størrelse 4-6.
    4. Kontroller og juster parallel belysning ved den nye indstilling for SPOT-størrelse som beskrevet ovenfor.
    5. Vælg EER-indstillingen under Brøker for at bruge EER-tilstanden på den direkte elektrondetektor33.
    6. Klik på knappen Hent i analysesoftwaren for at gemme indstillingerne i forudindstillingen Til dataindsamling.
    7. Skift til forudindstillingen Autofokus , og tryk på knappen Hent for at gemme belysningsindstillingerne til fokusering. Skift eksponeringstiden manuelt til 1 s og binning-tilstand 2.
    8. Skift til forudindstillingen Thon Rings , og tryk på knappen Hent for at gemme belysningsindstillingerne for denne forudindstilling. Skift eksponeringstiden manuelt til 1-2 s og binning-tilstand 2.
    9. Skift til zero loss-forudindstillingen, og tryk på knappen Hent for at gemme belysningsindstillingerne for denne forudindstilling. Skift eksponeringstiden manuelt til 0,5 s og binning-tilstand 4.
  4. Kalibrer billedskift mellem de indstillede optiske indstillinger som beskrevet i analysesoftwaremanualen ved hjælp af opgaven Billedskiftkalibrering under fanen Forberedelse (supplerende figur 1).

Tabel 1: Typiske billedindstillinger for dataindsamling i høj opløsning ved hjælp af en 200 kV cryo-TEM udstyret med et energifilter og en direkte elektrondetektor. Indstillingerne vises for hver optisk forudindstilling, der bruges til opsætning af automatisk dataindsamling (afsnit 3 i protokollen). Disse indstillinger er specifikke for 200 kV TEM-mikroskopet og den direkte elektrondetektor, der anvendes i denne undersøgelse. Klik her for at downloade denne tabel.

4. Gitterkortlægning og udvælgelse af de bedste cryo-EM-net til dataindsamling

  1. Vælg fanen Atlas , og klik på knappen Ny session for at åbne en ny session.
  2. Udfyld detaljer som sessionsnavn og datalagringsplacering, og klik på knappen Anvend for at åbne et nyt screeningsopgavevindue , der viser en liste over alle gitre i Autoloader-opgørelsen. Du kan også redigere navnene på gitterene.
  3. Markér de gitre, der er af interesse, ved at markere et afkrydsningsfelt ud for det tilsvarende gitternummer.
  4. Klik på knappen Start for at starte en fuldautomatisk samling af atlasser over alle valgte gitre.
  5. Når samlingen er afsluttet, skal du klikke på gitteretiketter for at gennemgå de erhvervede atlasser.
    BEMÆRK: Individuelle gitterkvadrativer klassificeres efter deres relative istykkelse, som er baseret på relativ gråtoneværdivurdering i hvert atlas. De klassificerede gitterfirkanter er afbildet i forskellige farveskemaer, der kan bruges til at styre udvælgelsen af dataindsamlingsområder. Et gitter produceret med en Vitrobot Mk IV vil typisk vise en istykkelsesgradient over hele gitteret, hvilket kan hjælpe med at identificere den ideelle istykkelse til dataindsamling. Et optimalt gitter skal indeholde så lidt overførselsisforurening som muligt og udvise nok ubrudte og revnefrie gitterfirkanter (figur 3). Gitter med passende isfordeling kan undersøges yderligere for at vurdere fordelingen af partikler i is ved høj forstørrelse (dvs. densitet og orientering af individuelle partikler).
  6. Klik på knappen Indlæs prøve i topmenuen for at indsætte et valgt gitter med passende isfordeling i mikroskopkolonnen.
  7. Vælg fanen Atlas , højreklik på en passende gitterfirkant i atlasbilledet, og vælg indstillingen Flyt fase her i rullemenuen for at flytte scenen til gitterfirkanten.
  8. Vælg fanen Automatiske funktioner for at indstille gitterkvadrappet til den eucentriske højde. Skift til den forudindstillede Eucentric Height , klik på Auto-Eucentric by Beam Tilt auto-funktionen midt i det valgte gitterfirkant og klik på Start-knappen .
  9. Skift til forudindstillingen Grid Square , og hent et billede. Flyt scenen til et hul med is og ingen eller minimal forurening med et højreklik og indstillingen Flyt fase her .
  10. Skift til forudindstillingen Hole/Eucentric Height , og hent et billede. Flyt scenen til et kulstofområde ved siden af det interessante hul ved et højreklik og indstillingen Flyt fase her .
  11. Klik på AutoFocus auto-funktionen og indstil værdier for den ønskede defokusering til 0 μm og Iterate til -2 μm. Skift til Autofokus-forudindstillingen , og klik på Start-knappen .
  12. Vælg fanen Forberedelse igen, og skift til forudindstillingen Hole/Eucentric Height . På det tidligere erhvervede hulbillede skal du vælge et interesseområde i hullet og flytte scenen til denne position ved at højreklikke og vælge indstillingen Flyt fase her .
  13. Skift til forudindstillingen For dataindsamling , og indstil ventetiden efter stråleskift til 0,5 s, og ventetiden efter fase flyttes til 20 s. Anskaf et billede ved hjælp af defokusering mellem -3 μm og -5 μm for at øge kontrasten med lav opløsning for bedre visualisering af individuelle partikler.
  14. Gentag eventuelt trin 4.7-4.13 for at afbilde partikler i forskellige huller og forskellige gitterfirkanter med forskellige istykkelser efter behov.
  15. Når det mest egnede gitter til dataindsamling i høj opløsning er identificeret og valgt, skal du klikke på knappen Indlæs eksempel i topmenuen for at indlæse det valgte gitter i TEM.
    BEMÆRK: Alternativt, hvis der er behov for flere oplysninger, og /eller automatisering af denne screeningsproces ønskes, skal du udføre afsnit 5.

5. Opsætning af en dataindsamlingssession i enkeltpartikelanalysesoftwaren

BEMÆRK: Hvis du bruger guldfoliegitterene, fungerer forfining af objektiv bygningsfejl og komajusteringer (afsnit 6) muligvis ikke pålideligt. Det anbefales at indlæse et kulstoffoliegitter eller em-net på tværs af gitter og udføre disse endelige justeringer, inden der oprettes dataindsamling.

  1. Vælg fanen EPU , og klik på knappen Sessionsoprettelse for at oprette en ny session i venstre panel. Vælg indstillingen Ny session for at bruge aktuelle optiske forudindstillinger eller indstillingen Ny fra Indstillinger til at indlæse tidligere eksporteret sessionsopsætning.
  2. Udfyld sessionsnavn og datalagringsplacering.
    BEMÆRK: Denne placering vil blive brugt til at gemme integrerede billeder og metadata fra dataindsamlingssessionen i en undermappe med sessionsnavnet. Selvom disse data ikke optager en betydelig mængde lagerplads, anbefales det at gemme disse data på Falcon offload datalagring af DMP-serveren, da EER-kamerarammerne altid gemmes i rodmappen til dette datalager i en mappe med sessionsnavnet.
  3. Vælg sessionstypen Manuel for at have kontrol over valget af individuelle huller i gitterfirkanter, der er valgt til dataindsamling senere i protokollen.
  4. Vælg tilstanden Hurtigere anskaffelse for at bruge aberrationsfri billedforskydning (AFIS) til dataindsamling for at reducere scenebevægelser mellem individuelle huller, reducere den samlede prøveafdrift og øge gennemstrømningen af dataindsamling uden at forringe billedkvaliteten.
  5. Vælg standard mrc-formatet for gemte integrerede billeder.
  6. Angiv det anvendte gitter og dets type. Denne protokol brugte R-1.2/1.3 UltraAufoil til apo-ferritin og R-2/1 Quantifoil-gitteret til 20S-proteasomet. Vælg Quantifoil under Prøvebærer og R1.2/1.3 eller 2/1 under Quantifoil Type.
  7. VALGFRIT: Klik på Athena Login-knappen i nederste højre hjørne for at bruge EPU Quality Monitor (EQM).
    1. Indtast loginoplysninger i browserens pop op-vindue for at aktivere indstillingsafsnittet i oversigten over sessionsopsætning .
    2. Klik på knappen Vælg i indstillingsafsnittet, og søg efter det tidligere oprettede datasæt (protokolafsnit 2) for at knytte det til den aktuelle dataindsamling. Slå afkrydsningsfeltet Aktivér kvalitetsovervågning til.
  8. Klik på knappen Anvend for at oprette en ny session.
    BEMÆRK: Denne handling åbner nye opgaver i menuen til venstre kolonne. Hvis nogle detaljer er forkerte, når som helst under sessionen, er det muligt at vende tilbage til opgaven Sessionsopsætning , ændre/opdatere detaljerne og klikke på Anvend igen for at opdatere sessionen.
  9. Vælg opgaven Square Selection i venstre panel for at få vist det indsamlede atlas over gitteret.
  10. Dobbeltklik eventuelt på en hvilken som helst flise i atlaset for at se et billede af højere kvalitet for bedre at bedømme iskvaliteten i gitterfirkanterne. Dobbeltklik igen på billedet for at vende tilbage til gitteratlaset.
  11. Identificer gitterfirkanter med følgende egenskaber (figur 4): (i) Støttefolien i gitterfirkanten er intakt uden skader, (ii) Glasagtig tynd is i foliehuller (hullerne ser lysere ud end støttekulstoffolien), (iii) Så lidt krystallinsk isforurening (sorte pletter) i gitterkvadreret som muligt, iv) Minimal lysstyrkegradient over gitterkvadreret og inden for individuelle foliehuller.
    BEMÆRK: Med de valgte forudindstillinger og med et godt gitter kan 200 kV cryo TEM, der anvendes i denne undersøgelse, afbilde med en hastighed på ~ 200-300 film / t. Med det i tankerne skal du vælge så mange firkanter som nødvendigt eller tilføje flere senere ved at vende tilbage til den firkantede markeringsopgave i henhold til mængden af mikroskoptid, der er tilgængelig. Til reference blev der indsamlet 3000 film for at opnå 1,6 Å opløsning af apo-ferritin.
  12. Vælg gitterfirkanter til dataindsamling enten i det fulde atlas eller flisebilleder i høj kvalitet
    1. Højreklik på en gitterkvadrkant af interesse, og vælg indstillingen Vælg i genvejsmenuen
    2. Alternativt kan du holde Ctrl-tasten nede på tastaturet og venstreklike på de ønskede gitterfirkanter
    3. Omvendt skal du højreklikke og fravælge eller holde Skift-tasten nede og venstreklik for at fjerne firkanter
    BEMÆRK: De næste trin er afgørende for at sikre, at dataindsamling resulterer i en rekonstruktion i høj opløsning. Start valg af huller i gitterfirkanten med et tyndt islag. Højreklik på denne gitterfirkant, og vælg indstillingen Vælg huller for at starte opgaven Valg af hul.
  13. Vælg opgaven Valg af hul i venstre panel for at vælge huller i de valgte gitterfirkanter.
  14. Klik på knappen Auto-Eucentric for automatisk at flytte til den første valgte gitterfirkant, justere den eucentriske højde og få et gitterfirkantet billede til at finde foliehuller.
  15. Klik på knappen Find huller for at finde foliehuller i billedet.
    BEMÆRK: Hvis hulsøgning ikke fungerede godt (dvs. der enten er sprunget huller over eller huller i forkert størrelse i billedet), skal du kontrollere, at der blev indtastet korrekte værdier i kvantifoiltypeposten i sessionsopsætningsopgaven og finde huller igen. Hvis huller stadig ikke findes korrekt, skal du klikke på knappen Mål hulstørrelse for at indstille huldiameteren og afstanden manuelt og finde huller igen.
  16. Klik på knappen Fjern huller tæt på gitterbjælkeknappen for at fravælge huller i nærheden af gitterstænger.
  17. Juster grænserne i isfilterets lysstyrkehistogram (nederst til højre i softwarevinduet) for at fjerne alle huller med for tyk is (ved hjælp af venstre grænselinje) samt alle tomme huller (ved hjælp af højre grænselinje) som vist i figur 4.
    BEMÆRK: For at forfine kan specifikke intensitetsværdier også indtastes i de tilsvarende tekstfelter ved siden af knappen Anvend .
  18. Du kan også bruge markeringspenslen til at finjustere valget af huller manuelt: Venstreklik og træk penslen for at fravælge uønskede huller. Hold Ctrl-tasten nede, og venstreklik for at kunne vælge foliehuller igen. Hold Skift-tasten nede, og rul med musehjulet for at justere penselstørrelsen.
  19. Vælg et hul til indstilling og test af en dataindsamlingsskabelon, der skal bruges gentagne gange under dataindsamlingen: Højreklik på et hul i gitterets firkantede billede, og vælg indstillingen Flyt fase til placering.
  20. Vælg opgaven Skabelondefinition i panelet til venstre.
  21. Vælg hullet / eucentrisk forudindstilling, og klik på knappen Erhverv for at få et billede.
  22. Klik på knappen Find og centrer hul for at centrere et hul i billedet.
  23. Indstil værdier for Delay After Image Shift til 0,5 s (standard) og Delay After Stage Shift til 20 s.
    BEMÆRK: Da den parallelle strålediameter er fastgjort på 200 kV cryo-TEM-systemet, der anvendes i denne undersøgelse, og typisk svarer til 1,6-1,7 μm med en 50-μm blænde, kan der kun opnås 1 billede pr. hul ved hjælp af R-1,2/1,3-gitterene og 2 billeder pr. hul (nær modsatte kanter) ved hjælp af R-2/1- eller R-2/2-gitterene. Bemærk, at størrelsen på de indstillede anskaffelsesområder på skærmen ikke svarer til den faktiske strålediameter. Billedskalalinjen kan bruges til at estimere en passende placeringsafstand.
  24. Vælg knappen Tilføj anskaffelsesområde , og klik på billedet for at vælge placeringen i det centrerede hul, hvor billedoptagelse med høj forstørrelse vil blive taget fra.
  25. Vælg knappen Tilføj autofokusområde, og klik på billedet for at vælge placeringen på støttefolien ved siden af det centrerede hul, hvor billedautofokus udføres.
    BEMÆRK: Strålestørrelsen til fokusering er 1,6-1,7 μm og skal placeres lige langt fra nabohuller på kulstof.
  26. Klik på det grønne anskaffelsesområde for at indstille en sekvens af defokusværdier i defokuslisten i den øverste del af softwarevinduet. Angiv den højeste defokusering som den første for at forbedre visualiseringen af partikler i en testkørsel af følgende skabelonudførelsesopgave .
  27. Klik på det blå autofokusområde for at indstille de autofokusspecifikke indstillinger i samme område:
    1. Vælg indstillingen Efter centrering for at autofokusere i starten af hver AFIS-klynge.
    2. Vælg indstillingen Objektivobjektiv for hurtigere autofokusering og reduceret trinafdrift.
  28. Vælg opgaven Skabelonudførelse, og klik på knappen Udfør.
    1. Overhold individuelle trin i dataindsamlingsproceduren (centrer hullet, autofokus i det valgte område og billedoptagelse i de indstillede områder) og kontroller kvaliteten af afbildede partikler i det endelige billede med høj forstørrelse.
    2. Klik på FFT-knappen nederst til højre i billedvinduet med høj forstørrelse for at kontrollere FFT-billedet og visuelt vurdere, om Thon-ringe viser flere svingninger og udvides til høj opløsning i FFT-billedet.
  29. Hvis skabelonudførelsen er fuldført, skal du klikke på knappen Forbered alle firkanter i opgaven Hulvalg for at få dataindsamlingen indstillet automatisk i alle andre valgte gitterfirkanter i henhold til de anvendte indstillinger i denne første gitterfirkant.

6. Endelige mikroskopjusteringer, inden dataindsamling påbegyndes

BEMÆRK: For at opnå de bedste resultater i høj opløsning skal de mest følsomme justeringer udføres nøjagtigt ved de samme indstillinger som dataindsamlingstilstanden i dataindsamlingssoftwaren og lige før den faktiske dataindsamling påbegyndes. Disse justeringer skal udføres på en position med tyndt støttekulstof i nettet, tilstrækkeligt fjernt fra eventuelle gitterstænger og justeret i eucentrisk højde.

  1. Vælg opgaven Skabelonudførelse , hent et nyt billede, og flyt med scenen til et rent område på kulfolie ved at højreklikke, og vælg menupunktet Flyt fase her.
  2. Vælg fanen Autofunktioner, og indstil den ønskede defokusering til 0 μm og Iterate til -2 μm. Skift til Autofokus-forudindstillingen , og klik på Start-knappen for at køre Autofokusfunktionen.
  3. Sæt den fluorescerende skærm ned, og åbn menuen med Direkte justeringer i TEM-brugergrænsefladen.
  4. For at opnå de bedste resultater kan erfarne brugere kontrollere pivotpunktjusteringer: Vælg nP Beam Tilt pp X-opgaven i menuen Direkte justeringer , og overlap maksimalt de hoppende stråler ved hjælp af multifunktionsknapperne på kontrolpanelerne. Gentag for np Beam Tilt pp Y-opgaven .
  5. Klik på EF-knappen i fluorescerende skærmkameramenu for at få vist en grøn cirkel, der angiver energifilterets indgangsåbning og centrerer strålen over den grønne cirkel.
    BEMÆRK: Sørg for, at Turbo-pumpen er stoppet, før du fortsætter; vibrationer fra det reducerer antallet af synlige thon ringe og får ofte de automatiske funktioner til at mislykkes.
  6. Gå tilbage til softwarevinduet, og vælg fanen Autofunktioner i menulinjen.
  7. Vælg Autostigmate-opgaven , skift til Thon Ring-forudindstillingen , og tryk på Start-knappen . Overhold processen for at sikre, at (i) de billeder, der tages, er på kulstof, (ii) Thon-ringene er tydeligt synlige, og (iii) den beregnede CTF-pasform (prikkede linjer) er godt placeret ved Thon-ringminima (supplerende figur 2).
  8. Vælg Autocoma-opgaven , og tryk på Start-knappen . Overhold processen for at sikre, at de billeder, der tages, er på kulstof, og at Thon-ringene er tydeligt synlige, og at de beregnede pasformer (prikkede linjer) er godt placeret ved Thon-ringminimaen. Zoom ind på hvert Thon-ringbillede ved hjælp af musens rullehjul (supplerende figur 3).
    BEMÆRK: Hvis mikroskopet er udstyret med et energifilter, skal justering af energifilter udføres som en del af justeringssekvensen for at centrere filterspalten til nultabstoppen og for at korrigere eventuelle forvrængninger i energifilterets prisme (trin 6.9-6.14). Disse justeringer skal udføres på et tomt område af gitteret, såsom inde i en brudt gitterfirkant.
  9. Åbn Sherpa UI, og vælg applikationen Energifilter (supplerende figur 4).
  10. Indstil kameraet til EF-Falcon, bin 4x, eksponeringstid 0,2 s i vinduet Indstillinger .
  11. Klik på knappen Center i indstillingen Nul tab for at centrere nul-tab energifilterspalten.
  12. Klik på knappen Tune i indstillingen Isochromaticity (supplerende figur 4).
  13. Klik på Melodiforstørrelse og Melodiforvrængninger i muligheden for Geometriske og kromatiske forvrængninger (supplerende figur 5, supplerende figur 6)
  14. Hvis resultaterne ikke er inden for de angivne specifikationer og vises med rød farve i outputrapporten, gentages justeringerne fra trin 6.11 igen.
    BEMÆRK: Selvom referencen til direkte elektrondetektorforstærkning kan være stabil over måneder, skal der tages en ny forstærkningsreference ved hjælp af Falcon 4 Reference Image Manager , hvis billeder af tomme områder ikke viser ensartet intensitet, men udviser striber eller andre forskellige træk. Alternativt kan du beregne en Fast Fourier Transform (FFT) af et sådant billede og sikre, at ingen linjer er synlige.
  15. I softwarevinduet skal du vælge fanen Forberedelse og skifte til forudindstillingen Dataindsamling .
  16. Indstil dosisindstillingen til 40 e-/Å2 , og klik på knappen Mål dosishastigheden .
  17. Gå til fanen EPU , vælg opgaven Automatiseret anskaffelse , og kontroller eventuelt funktionen Auto Zero Loss ; klik på knappen Start kør for at starte fuldautomatisk dataindsamling.

7. Overvågning og optimering af datakvalitet under dataindsamling

BEMÆRK: Mens dataindsamlingen er i gang, kan indsamlede data overvåges ved hjælp af EQM via datastyringsportalen. EQM udfører bevægelseskorrektion og CTF-bestemmelse undervejs og viser resultaterne på portalen. Brugeren er derefter i stand til at bedømme kvaliteten af de enkelte erhvervelser, se grafer på forskellige kvalitetsindikatorer, filtrere uønskede erhvervelser ud og eksportere dataene til deres endelige lager enten i farten eller som et batchjob.

  1. Naviger til det datasæt, som analysesoftwaren placerer dataene i ved hjælp af en webbrowser.
  2. I datasætoversigten viser anskaffelseskort oplysningerne om bevægelseskorrektion og CTF-bestemmelse i et grafisk format. Klik på de enkelte kort for at få flere oplysninger.
  3. Aktivér dataViz-panelet for at vise aggregerede grafer fra det fulde datasæt, der viser defokuserings-, bygningsfejl- og CTF-konfidensområdet pr. anskaffelse (supplerende figur 7).
  4. Brug filtrene øverst i panelet til kun at vælge de data, der er inden for det ønskede defokusområde, har bygningsfejl tæt på nul, og CTF kan bestemmes op til den angivne (mål) opløsning. Når filtrene er konfigureret, skal du trykke på knappen Anvend for kun at få vist de valgte data i vinduet oversigt over datasæt.
  5. Når de fleste af de erhvervede billeder er inden for de indstillede kriterier, skal du lade dataindsamlingssessionen fortsætte med at blive afsluttet. Hvis kun en meget lille brøkdel af de erhvervede billeder opfylder de indstillede kriterier, skal du enten omkonfigurere analysesoftwareindstillingerne, flytte til et andet område på prøven (tryk på knappen Næste gitterfirkant i analysesoftwaren) eller stoppe dataindsamlingen.

Representative Results

Datastyringsportalen giver effektiv, struktureret lagring af indsamlede billeder, data og metadata fra flere eksperimentelle arbejdsgange i en enkelt softwareplatform. Hvert defineret eksperiment i et oprettet projekt består af en arbejdsgang med kundedefinerede trin til at registrere eksempeloplysninger, indsamlede data og relaterede metadata uden nogen begrænsninger for at give maksimal fleksibilitet og brugervenlighed til eventuelle eksperimenter og alle brugssager (figur 1, figur 2). Datastyringsportalen har også en lab note-funktionalitet til at illustrere arbejdsgangstrin, herunder billedbehandling med mellemliggende resultater, der alle sammen kan knyttes til et projekt og give en så komplet post som muligt til analyse og oprettelse af rapporter og publikationer.

Figure 1
Figur 1: Eksempel på mulig organisering af data og metadata i datastyringsplatformen. Hvert projekt kan bestå af flere eksperimenter, såsom cryo-EM eller massespektroskopi (dvs. protokoltrin 2.3). Hvert eksperiment kan omfatte flere brugerdefinerede arbejdsgange (dvs. protokoltrin 2.5), der hver består af flere konfigurerbare trin (dvs. protokoltrin 2.7). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Se på en åbnet projektarbejdsgang i datastyringsplatformen. Figuren viser tilknyttede metadata og noter til det åbnede trin i arbejdsgangen. Den venstre bjælke med ikoner giver hurtig adgang til forskellige muligheder og menuer på datastyringsplatformen. Panelet til venstre indeholder en liste over gemte arbejdsgange (der vises kun én gemt arbejdsproces "Exp2_ApoF_EFTEM_Grid7") og en blå knap for at tilføje en ny arbejdsproces. Det centrale panel viser individuelle trin i den åbnede arbejdsgang, som det fremgår af SPA-arbejdsgangen her. Den blå knap øverst til højre kan tilføje et ekstra trin til den åbnede arbejdsgang. Det højre panel indeholder plads til enten optagede metadata eller brugerinput Noter fra arbejdsgangen, som kan omfatte tekst, tabeller og billeder. Forskellige formateringsmuligheder for teksten er tilgængelige. Klik her for at se en større version af denne figur.

Cryo-EM-gitre produceret med traditionelle dykfrysningsanordninger, såsom Vitrobot, vil typisk vise en gradient af istykkelse over gitteroverfladen. Nogle gitre kan også blive beskadiget (bøjet) efter manuel håndtering og/eller klipning i en autogrid-ringbærer. Figur 3 viser eksempler på forskellige gitre som vist i Atlasoversigten. Gitter med tyk is eller skader bør udelukkes fra yderligere undersøgelser.

Figure 3
Figur 3: Galleri af forskellige gitre som det ses i Atlasoversigten. (A) Et dårligt gitter med tyk is, (B) et bøjet gitter med dårlig is og isforurening, (C) et acceptabelt gitter med god isgradient, (D) et typisk gitter med god tynd is og lille isgradient. Klik her for at se en større version af denne figur.

Valget af gitterfirkanter uden skader og optimal istykkelse er afgørende for indsamling af datasæt i høj opløsning. Istykkelsen kan variere selv på niveau med de enkelte gitterkvadr, og det er derfor vigtigt kun at vælge huller med optimalt tynd is fra hver valgt gitterkvadring. Figur 4 viser en passende gitterfirkant med intakt folie og tynd is i midten. Den viste gitterfirkant er god til at indstille et filter til automatisk udvælgelse af huller med tynd is i alle udvalgte gitterkvadrationer, da den indeholder en række forskellige istykkelser samt tomme huller uden is, hvilket er yderst nyttigt til at indstille et passende intensitetsområde i isfilteret i hulvalgsopgaven.

Figure 4
Figur 4: Et eksempel gitter firkantet med en gradient af istykkelse, fra tomme gitterfirkanter i midten og tyk is nær gitterstængerne. Filteret af iskvalitet kan bruges til at vælge intensitetsområdet inde i huller med den ideelle istykkelse, der følgelig vælges i gitterfirkanten (hullerne med grønt overlay). Klik her for at se en større version af denne figur.

Benchmarkresultater ved hjælp af den beskrevne protokol blev opnået ved hjælp af prøven af mus apo-ferritin (apoF) fra Kikkawa gruppe11. ApoF er et meget α-spiralformet protein, der danner et meget stabilt oktaedralt bur. Den høje stabilitet og høje symmetri gør apoF til en optimal prøve til kryo-EM-billeddannelse og billedbehandling i høj opløsning. ApoF er derfor blevet en standardprøve til vurdering af kryo-EM-instrumenternes ydeevne 11,12,13. En frossen alikvot indeholdende 15 mg/ml renset apoF-prøve blev optøet på is og klargjort ved centrifugering ved 10.000 x g i 10 minutter. Supernatanten blev fortyndet til 5 mg/ml med 20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl. 3 μL af den fortyndede prøve blev påført et glødudledt R-1.2/1.3.3. 300 mesh guldgitter i 30 s. Derefter blev gitterene blottet i 5 s, før de faldt i flydende ethan afkølet af flydende nitrogen. Dykfrysning blev udført ved hjælp af et fuldautomatisk forglasningssystem ved 100 % fugtighed og 4 °C. Alle gitre blev klippet i autogrids og indlæst i en 200 kV Cryo-TEM. Omkring 3000 film blev indsamlet ved en gennemstrømning på 300 film / t. Data blev behandlet ved hjælp af metoderne som beskrevet11 med følgende ændringer: i) Relion 4-beta-version blev brugt i stedet for Relion 3.1, ii) automatiseret partikelplukning blev udført ved hjælp af 2D-klassegennemsnit af tidligere apoF-rekonstruktioner som referencer, og iii) den oprindelige 3D-model blev genereret fra den tidligere apoF-rekonstruktion lavt passeret til 15-Å-opløsning. Optikgruppering blev ikke udført for dette datasæt, da den anvendte AFIS-procedure34 har vist sig effektivt og pålideligt at minimere faseskift, der ikke begrænser datakvaliteten til at rekonstruere 3D-kort ved de rapporterede opløsninger. 3D-raffinement efter bayesiansk polering og CTF-forfining førte til 1,68 Å-opløsningskort. Opløsningen blev yderligere forbedret med Ewald-kuglekorrektion, hvilket resulterede i et 1,63 Å-opløsningskort. Oversigten over dataindsamlings- og behandlingsparametre er vist i tabel 2, og det endelige rekonstruerede densitetskort er vist i figur 5 med Fourier Shell Correlation (FSC) kurven vist i supplerende figur 8.

Tabel 2: Dataindsamling og billedbehandlingsparametre, der anvendes til 3D-rekonstruktion af apo-ferritin. Klik her for at downloade denne tabel.

Figure 5
Figur 5: Cryo-EM rekonstruktion af apo-ferritin. (Venstre panel) 3D-gengivelse af det rekonstruerede apoF cryo-EM-kort i 1,6 Å-opløsning. (Højre panel) Detaljeret visning af det rekonstruerede kort på niveau med individuelle aminosyresidekæder. Tætheden af aminosyresidekæder er godt løst, og atommodellen kan entydigt bygges inden for dette kort. Klik her for at se en større version af denne figur.

Effekter og fordele ved at anvende et energifilter i SPA-rekonstruktionerne blev evalueret ved anvendelse af det prokaryote 20S-proteasom isoleret fra T. acidophilum. Det prokaryote 20S-proteasom er også blevet brugt som en standard cryo-EM-prøve, da det repræsenterer den stabile katalytiske kerne i proteasomkomplekset med D7-symmetrien. Gitter blev fremstillet ved at tilsætte 4,5 μL af den rensede T. acidophilum 20S proteasomprøve på et glødudledt 200-mesh R 2/1 kobbergitter. Prøverne blev forglaset i en flydende ethan/propanblanding ved hjælp af et fuldautomatisk forglasningssystem indstillet til 4 °C og 100 % fugtighed med blotkraft på 20 og blottid på 4,5 s.

Tre forskellige datasæt blev indsamlet fra det samme cryo-EM-gitter med lignende gitterkvadrationer ved hjælp af en anden spaltebredde af energifilteret i rækkefølgen: i) spalte helt åben (ingen slids indsat), ii) 20 eV slids og iii) 10 eV slids. Gitterfirkanterne blev valgt ved hjælp af et iskvalitetsfilter i analysesoftwaren. Alle andre parametre for dataindsamling og databehandling blev holdt de samme. Datasæt blev indsamlet i 15 timer med i alt 4000 film og behandlet ved hjælp af metoderne som beskrevet11 ved hjælp af Relion 3.1 med den modifikation, at Laplacian-of-Gaussian partikelplukningsalgoritme blev brugt til at producere indledende 2D-klassegennemsnit til referencebaseret partikelplukning fra de fulde datasæt. Det samme antal (102.200) tilfældigt udvalgte partikler blev valgt og brugt til den endelige iteration og 3D-rekonstruktion af hvert datasæt. Databehandlingsvariabler er beskrevet i tabellen (tabel 3) nedenfor for at opnå det endelige rekonstruerede EM-densitetskort vist i figur 6 med FSC-kurven vist i supplerende figur 9. Optikgruppering og Ewald-kuglekorrektion blev heller ikke udført for disse datasæt.

Tabel 3: Dataindsamling og billedbehandlingsparametre, der anvendes til 3D-rekonstruktion af T. acidophilum 20S-proteasomet. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 4: Oversigt over opnået opløsning og B-faktor for cryo-EM-rekonstruktioner af T. acidophilum 20S-proteasomet ved hjælp af datasæt med forskellig energispaltebredde. Klik her for at downloade denne tabel.

Figure 6
Figur 6: Effekt af energifiltrering på cryo-EM-billeder. (A) Cryo-EM-billeder ved forskellige defokusværdier indsamlet med eller uden 10 eV-spalter. (B) Oversigt over 20S proteasom cryo-EM-kortet med segmenterede underenheder. (C) Zoom-visning på 20S-proteasomkortet med en monteret atommodel. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende figur 1: Kalibrering af billedforskydningsopgave (gul ellipse) for at justere billedforskydninger mellem forskellige optiske forudindstillinger (røde ellipser) i analysesoftwaren ved hjælp af en krystal af sekskantet is, der er synlig i det fulde forstørrelsesområde mellem 100x og 165.000x. (Øverst) Kalibrering mellem forudindstillingerne Data Acquisition og Hole/Eucentric Height, (midterste) kalibrering mellem forudindstillingerne Hole/Eucentric Height og Grid Square, (nederst) kalibrering mellem Grid Square og Atlas-forudindstillingerne. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 2: Autostigmatefunktion i analysesoftware (gul ellipse). (Venstre billede) Erhvervet billede. (Højre billede) Fourier-overførsel af det erhvervede billede, der viser koncentriske Thon-ringe og deres CTF-pasform vist i radiale bjælker. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 3: Brugergrænseflade for Autocoma-funktionen i analysesoftware (gul ellipse) til komajustering. Billedpanelet viser Fourier-overførselsbilleder erhvervet ved forskellige strålehældninger og deres CTF-tilpasninger, der bruges til beregning af koma. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 4: Brugergrænseflade til justering af energifilter. Eksempel på en god indstillingsrapport over energifilterets okkakomitet med alle parametre (vist med grøn tekst) inden for specifikationerne. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 5: Brugergrænseflade til justering af energifilter. Eksempel på god indstillingsrapport for energifilterforstørrelsesforvrængninger med alle parametre (vist med grøn tekst) inden for specifikationerne. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 6: Brugergrænseflade til justering af energifilter. Eksempel på god indstilling af energifilterets kromatiske forvrængninger med alle parametre (vist med grøn tekst) inden for specifikationerne. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 7: DataViz-panelet i EPU-kvalitetsmonitoren med en oversigt over datakvaliteten i et indsamlet cryo-EM-datasæt. Graferne med aggregerede data fra alle indsamlede billeder/film viser værdier (prikdiagrammer) og fordeling (stregdiagrammer) af udvalgte kritiske kvalitetsindikatorer, såsom CTF-tilpasningstillid (blå), defokusering (orange) og bygningsfejl (grøn). En delmængde af de indsamlede billeder/film kan vælges ved at indstille parameterfiltre øverst i DataViz-panelet. Efter anvendelse af filtrene kan udvalgte billeder/film eksporteres til videre behandling i en anden billedbehandlingspakke, f.eks. Relion eller CryoSpark. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 8: FSC-kurve for den endelige rekonstruktion af apoF til 1,6 Å-opløsning, som rapporteret af Relion 4-beta. Den blå kurve viser FSC af maskerede 3D-kort fra to uafhængigt raffinerede 3D-rekonstruktioner fra to gensidigt eksklusive halvdatasæt. Ifølge guldstandarden FSC på 0,143 svarer opløsningen af det endelige 3D-kort rekonstrueret ud fra det fulde datasæt til 1,6 Å. Den orange kurve viser FSC for de maskerede 3D-rekonstruktioner med randomiserede faser. Det hurtige fald i FSC-kurven indikerer, at den anvendte maske ikke bidrog til den observerede FSC på de oprindelige rekonstruerede kort (blå kurve) ud over ~2 Å-opløsning. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 9: FSC-kurver for den endelige rekonstruktion af T. acidophilum 20S-proteasom ved hjælp af forskellige spaltebredder på energifilteret som rapporteret af Relion 3.1. De blå kurver viser FSC af maskerede 3D-kort fra to uafhængigt raffinerede rekonstruktioner fra henholdsvis to halve datasæt af hvert datasæt. Guldstandarden FSC på 0,143 angiver de opnåede opløsninger af de endelige 3D-kort, der er rekonstrueret ud fra de respektive fulde datasæt (henholdsvis 2,3 Å, 2,2 Å og 2,1 Å-opløsning). De røde kurver viser FSC af maskerede kort med randomiserede faser. Det hurtige fald i de røde FSC-kurver indikerer, at den anvendte maske ikke bidrog til FSC på de oprindelige rekonstruerede kort ud over ~3 Å-opløsning. De grønne kurver viser FSC af umaskerede 3D-kort, som påvirkes af støj i hele det rekonstruerede 3D-volumen og derfor falder hurtigere end FSC på de maskerede 3D-kort. Klik her for at downloade denne fil.

Tilgængelighed af data: Cryo-EM-tæthedskortene er deponeret i EM Data Bank under tiltrædelsesnumre: apoferritin: EMD 14173, EMPIAR-10973. 20S proteasom: EMD 14467, EMPIAR-10976.

Discussion

Den beskrevne protokol forudsætter, at optikken i det anvendte TEM-mikroskop er i en veljusteret tilstand. For den 200 kV TEM, der anvendes i denne protokol, udføres, verificeres og gemmes sådanne kolonnejusteringer af en erfaren servicetekniker efter mikroskopinstallation eller enhver væsentlig serviceintervention. Disse justeringsindstillinger kan huskes når som helst i mikroskopets brugergrænseflade. Brugere kan bruge procedurerne for direkte justering i mikroskopets brugergrænseflade til at finjustere kritiske parametre igen. Nogle justeringer, såsom pistolhældning og pistolskift, er stabile og behøver ikke at blive justeret af brugerne dagligt. Kontrol og justering (hvis nødvendigt) af pistolhældning og -skift af mikroskopvejlederen anbefales to gange om året. På den anden side er nogle justeringer kritiske og skal justeres før hver dataindsamling som beskrevet i protokollen ovenfor (såsom objektiv bygningsfejl og komafri justering). Hvis Autocoma-funktionen i analysesoftwaren ikke konvergerer, skal justeringen af strålehældningsomdrejningspunkter og/eller rotationscenter verificeres og justeres, og den korrekte centrering af C2-blænden skal bekræftes. Bagefter skal Autostigmate-funktionen køres, da objektive stigmatatorer også bruges til komakorrektion. Disse justeringer skal itereres, indtil både Autostigmate og Autocomafunctions lykkes ved deres første iteration. Om nødvendigt kan der vælges et andet område (f.eks. understøtte kulfolie uden is), justeret billeddefokusering eller billedoptagelsestiden øges for at optimere signal-støj-forholdet i erhvervede billeder og synligheden af flere Thon-ringe i Fourier-transformationen af de erhvervede billeder.

Moderne cryo-EM-mikroskoper genererer store mængder data, der ofte overstiger 1 TB pr. datasæt for at opnå 3D-rekonstruktioner i høj opløsning, især for proteiner med lav symmetri. Cryo-EM data og resultater suppleres også typisk med data og resultater fra ortogonale metoder for fuldt ud at forstå struktur-funktionsrelationer i hvert videnskabeligt projekt. Organisering af indsamlede data, deres overførsel til en billedbehandlingspipeline og deling af en resulterende cryo-EM-rekonstruktion blandt samarbejdspartnere stiller yderligere krav til nye adoptere af cryo-EM-metoden til at oprette deres lokale it-infrastruktur. Datastyringssoftware, såsom Athena, letter centraliseret lagring af data erhvervet af ethvert tilsluttet instrument eller software, der drives af en registreret bruger. Lagrede data og metadata er tilgængelige ved hjælp af en simpel webbrowsergrænseflade for flere brugere, som kan have forskellige roller i projektet med forskellige adgangsrettigheder (enten som ejer, samarbejdspartner eller seer) baseret på deres loginoplysninger og datadelingsdefinition i eksperimentopsætningen. Denne digitalisering af eksperimentelle arbejdsgange giver mulighed for data- og metadatadeling mellem samarbejdspartnere uden unødvendig overlapning og øger produktiviteten og sporbarheden af brugte arbejdsgange. Implementering af en generel og tilpasselig struktur af projekter, eksperimenter og arbejdsgange i datastyringssoftware er universel og giver mulighed for tilpasning og integration af ortogonale eksperimenter ved hjælp af komplementære metoder i en enkelt projektdatabase.

Udvælgelsen af områder til dataindsamling på et cryo-EM-net er afgørende for en vellykket erhvervelse af datasæt i høj opløsning. Cryo-EM-gitre produceret med traditionelle dykfrysningsanordninger, såsom Vitrobot (et fuldautomatisk forglasningssystem), vil typisk vise en gradient af istykkelse over gitteroverfladen (figur 4). Dette kan være en fordel, da gitteret indeholder områder med forskellige istykkelser; Områder med den ideelle istykkelse til dataindsamling skal dog identificeres som beskrevet i protokollen ovenfor. Et optimalt cryo-EM-gitter skal indeholde så lidt overførselsisforurening som muligt og indeholde nok gitterfirkanter med intakt hullet støttefolie. Indsamling af data om gitterfirkanter, der har revner eller ødelagte områder, anbefales ikke, da indsamlede billeder vil blive påvirket af betydeligt stærkere samlet afdrift ved belysning af en elektronstråle sammenlignet med gitterfirkanterne med intakt støttefolie. Overskud af krystallinsk is kan okkludere størstedelen af foliehullerne og/eller forstyrre autofokusering, og sådanne gitterfirkanter bør også undgås. Gitterfirkanter med tynd is udviser normalt store glasagtige områder og mange lyse foliehuller, der er synlige på et billede taget ved hjælp af Atlas-forudindstillingen. Forekomsten af tykkere is tæt på gitterstænger må forventes og er ukritisk, da foliehuller i disse områder af gitterkvadreret er udelukket under huludvælgelsesproceduren. Tilstedeværelsen af flere tomme huller i en gitterfirkant kan betyde, at glasagtig is i de omgivende huller er ekstremt tynd og kan indeholde beskadigede partikler eller slet ingen partikler. Generelt er det klogt at vælge gitterkvadrater med en række istykkelser i forskellige regioner på nettet til indledende screening og vurdering for at forstå, hvilke områder der har de bedste betingelser for dataindsamling i høj opløsning og udvise den ideelle partikeltæthed og orienteringsfordeling. For apoF- og 20S-proteasomprøverne, der anvendes i denne undersøgelse, indeholder områder med den tyndeste observerbare is de bedste betingelser for billeddannelse i høj opløsning af disse prøver.

Når du vælger huller automatisk i alle valgte gitterfirkanter ved hjælp af dataindsamlingssoftwaren, anbefales det at udføre skabelonudførelsesopgaven på et repræsentativt hul i hver gitterfirkant for at kontrollere og sikre, at der hverken blev valgt alt for tykke eller alt for tynde eller uventet ikke-glasagtige firkanter til dataindsamling. Under dataindsamling kan nøglekvalitetsindikatorer for indsamlede billeder, såsom billeddrift og CTF-tilpasning, overvåges ved hjælp af EQM. Dataindsamling kan derefter optimeres ved at springe over områder, der giver billeder af dårlig kvalitet. Billeder med CTF-tilpasninger i høj opløsning kan dog stadig indeholde billeder med partikler i nogle få foretrukne retninger eller partikler denatureret i et for tyndt islag. Partikelplukning i realtid og 2D-klassificering fra indsamlede billeder ville give yderligere oplysninger om kvaliteten af strukturelle data i afbildede partikler og afsløre både foretrukne orienteringer af intakte partikler i is eller inkonsekvent struktur af (delvist) denaturerede partikler. Beregning af klassegennemsnit kan derfor bidrage til yderligere at forfine passende regioner til dataindsamling, som det allerede er blevet implementeret og vist i andre softwarepakker23,28.

Udvælgelsen af billeddannelsesindstillingerne for dataindsamling, såsom forstørrelse, elektrondosishastighed og defokusområde, afhænger af flere kriterier, såsom målopløsning, proteinets størrelse, prøvekoncentration, ønsket mikroskopgennemstrømning osv. For det direkte elektrondetektorkamera, der blev anvendt i disse eksperimenter, blev elektrondosishastigheden valgt i området 4-5 e-/pix/s ved at vælge en passende SPOT-størrelse og intensitet for at opretholde parallel belysning. Som vist i tabel 1 kan der anvendes en anden SPOT-størrelse i forudindstillingen Hole/Eucentric Height for at sikre et tilstrækkeligt signal-støj-forhold i billedet til centrering af huller under dataindsamling. Forstørrelsen skal vælges således, at pixelstørrelsen er mindst 2-3x mindre end målopløsningen for cryo-EM-rekonstruktionen. Den højere forstørrelse (dvs. mindre pixelstørrelse) bruges imidlertid, det mindre synsfelt fanges i billeder, og der er færre partikler pr. Billede, hvilket i sidste ende fører til længere dataindsamlingstid til at indsamle billeder med nok partikler til at rekonstruere 3D-kort til en høj opløsning. Til apoF-prøven brugte vi pixelstørrelsen på 0,43 Å, da vi havde tilstrækkelig prøvekoncentration til høj densitet af partikler i billeder og sigtede mod sub-2 Å-opløsning af rekonstruktionen. Til 20S-proteasomprøven brugte vi pixelstørrelsen på 0,68 Å til at dække et større synsfelt på erhvervede billeder. Typisk for 200 kV TEM-mikroskoper erhverves cryo-EM-billeder i defokusområdet fra 0,8 til 2,0 μm. Men med det forbedrede kontrast- og signal-støj-forhold ved hjælp af energifilteret kan dataindsamlinger udføres meget tættere på fokus for bedre at bevare information i høj opløsning i erhvervede billeder på grund af mindre afvigelser og tilsvarende reduceret henfald af CTF-konvolutfunktionen. Vi bruger heller ikke en objektiv blændeåbning, da blænden kan introducere yderligere billedaberrationer, mens billedkontrasten allerede er tilstrækkeligt forbedret ved hjælp af energifilteret. Til apoF- og 20S-proteasomprøverne brugte vi defokuseringsindstillingerne på 0,5 μm, 0,7 μm og 0,9 μm. For mindre proteiner (<200 kDa) brugte vi defokuseringsindstillinger på -0,5 μm, -0,7 μm og -0,9 μm for at forbedre partiklernes kontrast og lette partikelplukning og indledende grov justering i 3D-forfiningstrinnet i 3D-rekonstruktion, hvilket førte til ~ 2,5 Å-opløsning 3D-kort (upublicerede resultater).

Vi har allerede vist, at billeddannelse med et energifilter forbedrer signal-støj-forholdet (SNR) i cryo-EM-billeder indsamlet på de avancerede 300-kV TEM-mikroskoper11. Faktisk, når elektroner passerer gennem en prøve, forekommer der to hovedtyper af interaktioner: i) Elastisk spredte elektroner opretholder deres energi og bidrager til billeddannelse ved interferens med den ikke-spredte indfaldende stråle via fasekontrastmekanismen ii) uelastisk spredte elektroner mister noget energi i prøven og bidrager hovedsageligt til støj i billeder. Derfor kan SNR forbedres betydeligt ved at filtrere de uelastisk spredte elektroner, som har lavere energi end den indfaldende stråle og elastisk spredte elektroner ved hjælp af en smal energispalte. Det er imidlertid afgørende at bruge et tilstrækkeligt stabilt energifilter, såsom Selectris eller Selectris-X, til at kunne bruge meget smalle (10 eV eller mindre) slidser over lange (12+ timer) automatiseret dataindsamling af kryoEM-datasæt med høj opløsning.

Cryo-EM-billeder erhvervet med 200 kV TEM-mikroskoper under de samme betingelser som med 300 kV TEM-mikroskoper udviser mindre SNR ved høj opløsning (især <4 Å) på grund af hurtigere henfald af CTF-konvolutfunktionerne. Derfor kræves et højere antal partikler (og derfor et højere antal indsamlede billeder) for at opnå en vis opløsning, når der anvendes 200 kV TEM'er. Derudover er dybdeskadslen (10-25 nm i opløsningsområdet 2-3 Å) også ca. 20% mindre i 200 kV-billeder35, hvilket betyder, at færre partikler i islaget (typisk 20-50 nm tykke) vil være fuldt i fokus og konstruktivt bidrage til alle højopløsningsfunktioner i en beregnet 3D-rekonstruktion, medmindre defokusværdier raffineres for hver partikel uafhængigt i de senere stadier af 3D-rekonstruktionsproceduren. For større partikler (såsom icosahedral virioner eller andre makromolekylære samlinger) kan partikelstørrelsen overstige dybdeskadslen ved høje opløsninger og indføre fasefejl på grund af plan tilnærmelse af Ewald-kuglen i standard 3D-rekonstruktionsalgoritmerne36. Disse fejl kan raffineres af avancerede algoritmer, der allerede er implementeret i almindelige cryo-EM-billedbehandlingspakker 37,28,39. Da Ewald-kuglen har større krumning i 200 kV-data end 300 kV-data, er Ewald-kuglekorrektionen nødvendig ved relativt lavere opløsninger og/eller for relativt mindre makromolekylære enheder, når der anvendes 200 kV TEM'er. På den anden side udviser 200 kV-billeder højere kontrast af partikler i tynd is (20-50 nm), der er betydeligt tyndere end den 200-300 keV elektron gennemsnitlige frie vej (220-280 nm). Den højere kontrast hjælper med at forbedre den korrekte globale justering af individuelle partikler, især for svagt spredende mindre proteiner, hvis struktur endnu ikke er kendt, og 3D-referencemodellen er endnu ikke veletableret.

Her demonstrerede vi på eksemplet med et 20S proteasom, at billedkontrast og kvalitet på samme måde kunne forbedres med et energifilter, når man bruger et 200 kV TEM-mikroskop. Ved hjælp af det samme antal partikler blev data indsamlet ved hjælp af 20 eV-spalten rekonstrueret til 2,26 Å-opløsning sammenlignet med data indsamlet med den fuldt åbnede energispalte, der kun blev rekonstrueret til 2,34 Å-opløsning. Den bedste rekonstruktion blev opnået ud fra data indsamlet ved hjælp af 10 eV-spalten, der blev rekonstrueret til 2,14 Å-opløsning. Disse resultater er i overensstemmelse med den teoretiske forudsigelse om, at filtrering af de uelastisk spredte elektroner øger SNR i indsamlede billeder og letter højere opløsning i cryo-EM-rekonstruktioner fra det givne antal partikler, som opsummeret i tabel 4. Disse resultater blev yderligere bekræftet af B-faktorerne beregnet ud fra disse datasæt, der indikerer højere kvalitet af billeder i de energifiltrerede datasæt.

Vi kan derfor konkludere, at mens 300 kV TEM-mikroskoper leverer den højeste gennemstrømning og den højest mulige opløsning i cryo-EM-rekonstruktioner, leverer 200 kV TEM-mikroskoperne også datasæt af høj kvalitet til kryo-EM-rekonstruktioner i høj opløsning. Vi viste her, at kvaliteten af erhvervede billeder, og dermed den overordnede tid-til-struktur, kan forbedres yderligere ved at bruge 200 kV TEM udstyret med et energifilter og en direkte elektrondetektor. Den præsenterede protokol beskriver alle nødvendige trin til, hvordan man rutinemæssigt opnår kryo-EM-data i høj opløsning ved hjælp af denne opsætning og afslører fine strukturelle detaljer om makromolekylære 3D-strukturer, som er afgørende for at forstå de vigtigste struktur-funktionsforhold i strukturel biologi og strukturbaseret lægemiddeldesign.

Disclosures

Sagar Khavnekar melder ikke om interessekonflikter. De øvrige forfattere er ansatte i Thermo Fisher Scientific, MSD-EM-divisionen.

Acknowledgments

Ingen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AutoGrid rings Thermo Fisher Scientific 1036173 Package of 100x AutoGrid rings for the standard EM grids.
C-Clip Thermo Fisher Scientific 1036171 Package of 100 clips that secure
the standard EM grids inside the AutoGrid rings.
Data Management Platform Thermo Fisher Scientific 1160939 Part of the Glacios base configuraiton; includes Athena Software
EPU Quality Monitor Thermo Fisher Scientific 1179770
EPU Software Thermo Fisher Scientific 1025080 Part of the Glacios base configuration
Ethane 3.5 Westfalen A06010110 Ethane gas used for making liquid ethane (puritiy at least N35, i.e. 99.95% vol)
Falcon 4 200kV Thermo Fisher Scientific 1166936 Direct electron detector
Glacios Thermo Fisher Scientific 1149551 200 kV TEM
GloQube Plus Glow Discharge System for TEM Grids and surface modification Quorum N/A also available via Thermo Fisher Scientific (PN 1160602)
QuantiFoil grids Quantifoil N/A R-2/1, 300 mesh; carbon foil grid
Relion MRC Laboratory of Molecular Biology N/A open source software:
https://relion.readthedocs.io/en/release-3.1/
Selectris with Falcon
4 for 200 kV		 Thermo Fisher Scientific 1191753 Energy filter
Selectris X with Falcon
4 for 200 kV		 Thermo Fisher Scientific 1191755 Energy filter
UltrAuFoil grids Quantifoil N/A R-1.2/1.2, 300 mesh; gold foil grids
Vitrobot Mk. IV Thermo Fisher Scientific 1086439 Automated vitrification system
Whatman 595 filter paper Thermo Fisher Scientific AA00420S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, J., Hua, T., Liu, Z. -J. Structural features of activated GPCR signaling complexes. Current Opinions in Structural Biology. 63, 82-89 (2020).
  2. Chen, S., Gouaux, E. Structure and mechanism of AMPA receptor - auxiliary protein complexes. Current Opinions in Structural Biology. 54, 104-111 (2019).
  3. Kühlbrandt, W. Structure and mechanisms of F-Type ATP synthases. Annual Review of Biochemistry. 88, 515-549 (2019).
  4. Laverty, D., et al. Cryo-EM structure of the human α1β3γ2 GABA A receptor in a lipid bilayer. Nature. 565 (7740), 516-520 (2019).
  5. Liu, F., Zhang, Z., Csanády, L., Gadsby, D. C., Chen, J. Molecular structure of the Human CFTR ion channel. Cell. 169 (1), 85-95 (2017).
  6. Wrapp, D., et al. Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation. Science. 367 (6483), 1260-1263 (2020).
  7. Ke, Z., et al. Structures and distributions of SARS-CoV-2 spike proteins on intact virions. Nature. 588, 498-502 (2020).
  8. Yan, R., Zhang, Y., Li, Y., Xia, L., Guo, Y., Zhou, Q. Structural basis for the recognition of SARS-CoV-2 by full-length human ACE2. Science. 367 (6485), 1444-1448 (2020).
  9. Walls, A. C., Park, Y. -J., Tortorici, M. A., Wall, A., McGuire, A. T., Veesler, D. Structure, function, and antigenicity of the SARS-CoV-2 spike glycoprotein. Cell. 180, 281-292 (2020).
  10. Chiba, S., et al. Multivalent nanoparticle-based vaccines protect hamsters against SARS-CoV-2 after a single immunization. Communications Biology. 4 (1), 597 (2021).
  11. Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587, 152-156 (2020).
  12. Bai, X. C. Seeing atoms by single-particle Cryo-EM. Trends in Biochemical Sciences. 46 (4), 253-254 (2021).
  13. Koh, A., et al. High-resolution cryo-EM at 200kV enabled by Selectris-X and Falcon 4. Microscience Microscopy Congress 2021. , Abstract 212 (2021).
  14. Herzik, M. A., Wu, M., Lander, G. C. Achieving better-than-3-Å resolution by single-particle cryo-EM at 200 keV. Nature Methods. 14 (11), 1075-1078 (2017).
  15. Herzik, M. A., Wu, M., Lander, G. C. High-resolution structure determination of sub-100 kDa complexes using conventional cryo-EM. Nature Communications. 10 (1), 1032 (2019).
  16. Wu, M., Lander, G. C., Herzik, M. A. Sub-2 Angstrom resolution structure determination using single-particle cryo-EM at 200 keV. Journal of Structural Biology X. 4, 100020-100029 (2020).
  17. Mori, T., et al. C-Glycoside metabolism in the gut and in nature: Identification, characterization, structural analyses and distribution of C-C bond-cleaving enzymes. Nature Communications. 12 (1), 6294 (2021).
  18. Hamdi, F., et al. 2.7 Å cryo-EM structure of vitrified M. musculus H-chain apoferritin from a compact 200 keV cryo-microscope. PLoS One. 15 (5), 0232540 (2020).
  19. Abbott, S., et al. EMDB web resources. Current Protocols in Bioinformatics. 61 (1), 1-12 (2018).
  20. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  21. Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  22. Gómez-Blanco, J., et al. Using Scipion for stream image processing at Cryo-EM facilities. Journal of Structural Biology. 204 (3), 457-463 (2018).
  23. Tegunov, D., Cramer, P. Real-time cryo-electron microscopy data preprocessing with Warp. Nature Methods. 16 (11), 1146-1152 (2019).
  24. Lander, G. C., et al. Appion: an integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing. Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).
  25. Carragher, B., et al. Current outcomes when optimizing 'standard' sample preparation for single-particle cryo-EM. Journal of Microscopy. 276 (1), 39-45 (2019).
  26. Drulyte, I., et al. Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation. Acta Crystallographica. Section D, Structural Biology. 74 (6), 560-571 (2018).
  27. Bloch, M., Santiveri, M., Taylor, N. M. I. Membrane protein Cryo-EM: Cryo-grid optimization and data collection with protein in detergent. Methods in Molecular Biology. 2127, 227-244 (2020).
  28. Cheng, A., et al. Leginon: New features and applications. Protein Science. 30 (1), 136-150 (2021).
  29. Schorb, M., et al. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).
  30. Li, X., et al. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nature Methods. 10 (6), 584-590 (2013).
  31. Alewijnse, B., et al. Best practices for managing large CryoEM facilities. Journal of Structural Biology. 199, 225-236 (2017).
  32. Baldwin, P. R., et al. Big data in cryoEM: automated collection, processing and accessibility of EM data. Current Opinion in Microbiology. 43, 1-8 (2018).
  33. Guo, H., et al. Electron-event representation data enable efficient cryoEM file storage with full preservation of spatial and temporal resolution. International Union of Crystallography Journal. 7, 860-869 (2020).
  34. Weis, F., Hagen, W. J. H. Combining high throughput and high quality for cryo-electron microscopy data collection. Acta Crystallographica. Section D, Structural Biology. 76 (8), 724-728 (2020).
  35. Zhou, H., Chiu, W. Determination of icosahedral virus structures by electron cryomicroscopy at subnanometer resolution. Advances in Protein Chemistry. 64, 93-124 (2005).
  36. DeRosier, D. J. Correction of high-resolution data for curvature of the Ewald sphere. Ultramicroscopy. 81 (2), 83-98 (2000).
  37. Wolf, M., DeRosier, D. J., Grigorieff, N. Ewald sphere correction for single-particle electron microscopy. Ultramicroscopy. 106 (4-5), 376-382 (2006).
  38. Leong, P. A., Yu, X., Hong Zhou, Z., Jensen, G. J. Correcting for the ewald sphere in high-resolution single-particle reconstructions. Methods in Enzymology. 482, 369-380 (2010).
  39. Zivanov, J., et al. New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3. eLife. 7, 42166 (2018).

Tags

Biokemi Udgave 181 cryo-EM høj opløsning struktur justeringer dataindsamling datastyring Glacios EPU energifilter
Rutinemæssig indsamling af kryo-EM-datasæt i høj opløsning ved hjælp af 200 KV transmissionselektronmikroskop
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Koh, A., Khavnekar, S., Yang, W.,… More

Koh, A., Khavnekar, S., Yang, W., Karia, D., Cats, D., van der Ploeg, R., Grollios, F., Raschdorf, O., Kotecha, A., Němeček, D. Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope. J. Vis. Exp. (181), e63519, doi:10.3791/63519 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter