Summary
薬剤耐性カン ジダ・アルビカンス の発生率の増加は、世界中で深刻な健康問題です。抗菌光線力学療法(aPDT)は、薬剤耐性真菌感染症と戦うための戦略を提供するかもしれない。本プロトコールは、多剤耐性 C.アルビカン ス株に対するローズベンガル媒介性aPDT有効性を インビトロで記載する。
Abstract
侵襲性 カンジダ・アルビカンス 感染症は、腸、口、膣、および皮膚の最も一般的な植民者の1つであるため、ヒトにおける重要な日和見真菌感染症である。抗真菌薬が利用可能であるにもかかわらず、侵襲性カンジダ症の死亡率は〜50%のままである。残念なことに、薬剤耐性の C.アルビカンの発生 率は世界的に増加しています。抗菌光線力学療法(aPDT)は、 C.アルビカンス バイオフィルム形成を阻害し、薬物耐性を克服するための代替またはアジュバント治療を提供し得る。ローズベンガル(RB)媒介性aPDTは、細菌および C.アルビカンスの効果的な細胞死滅を示している。この研究では、多剤耐性 C.アルビカンス に対するRB−aPDTの有効性が記載されている。自家製の緑色発光ダイオード(LED)光源は、96ウェルプレートのウェルの中心に合わせるように設計されています。酵母を異なる濃度のRBを有するウェルでインキュベートし、様々な緑色の光のフルエンスで照らした。殺傷効果をプレート希釈法により分析した。光とRBの最適な組み合わせにより、3対数の成長阻害が達成された。RB-aPDTは薬剤耐性 のC.アルビカンスを潜在的に阻害する可能性があると結論付けられた。
Introduction
C.アルビカンスは 、健常人の胃腸管および尿生殖路に定着し、個体の約50%において正常な微生物叢として検出され得る1。宿主と病原体との間に不均衡が生じると、 C. albicans は侵入して病気を引き起こす可能性があります。感染は、局所粘膜感染から多臓器不全2までの範囲であり得る。米国の多施設サーベイランス研究では、2009年から2017年の間に侵襲性カンジダ症患者からの分離株の約半分が C. albicans3である。カンジデミアは、高い罹患率、死亡率、長期入院4と関連している可能性がある。米国疾病管理予防センターは、試験されたすべてのカンジダ血液サンプルの約7%が抗真菌薬フルコナゾールに耐性があると報告しました5。薬剤耐性 カンジダ 種の出現は、抗真菌剤に代わるものまたはアジュバント療法を開発する懸念を提起する。
抗菌光線力学療法(aPDT)は、PS6のピーク吸収波長の光で特定の光増感剤(PS)を活性化することを含む。励起後、励起されたPSは、そのエネルギーまたは電子を近くの酸素分子に伝達し、基底状態に戻る。このプロセスの間に、活性酸素種および一重項酸素が形成され、細胞損傷を引き起こす。aPDTは1990年代から微生物を殺すために広く使用されてきた7。aPDTの利点の1つは、照射中に複数の細胞小器官が一重項酸素および/または活性酸素種(ROS)によって細胞内で損傷を受けることである。したがって、aPDTに対する耐性は今日まで見出されていない。さらに、最近の研究では、aPDT後に生き残った細菌が抗生物質に対してより敏感になったことが報告されています8。
aPDTで使用される光源には、レーザー、フィルター付き金属ハロゲンランプ、近赤外光、発光ダイオード(LED)9、10、11、12などがあります。レーザーは、通常0.5 W/cm2より大きい高い光パワーを提供し、非常に短時間で高い光線量を送達することを可能にする。口腔感染症に対するaPDTのように、治療時間が長くなると不便な場合に広く用いられている。レーザーの欠点は、照明のスポットサイズが小さく、ディフューザーで数百マイクロメートルから10mmの範囲であることです。さらに、レーザー装置は高価であり、操作するには特定のトレーニングが必要です。一方、フィルター付き金属ハロゲンランプの照射面積は比較的大きい13。しかし、ランプはあまりにも重くて高価です。LED光源は小型で安価であるため皮膚科学分野でaPDTの主流となっている。照射面積は、LED電球のアレイ配置で比較的大きくすることができる。顔全体を同時に照らすことができる9.それにもかかわらず、すべてではないにしても、今日利用可能なLED光源のほとんどは、臨床使用のために設計されています。スペースを占有し、高価であるため、ラボでの実験には適していない可能性があります。私たちは、非常に小さく、LEDストリップから切断して組み立てることができる安価なLEDアレイを開発しました。LEDは、異なる実験計画のために異なる配置に適合させることができる。aPDTの異なる条件は、1回の実験で96ウェルプレートまたは384ウェルプレートで完了することができる。
ローズベンガル(RB)は、ヒトの目14における角膜損傷の可視化を強化するために広く使用されている着色染料である。RB媒介性aPDTは、黄色ブドウ球菌、大腸菌、およびC.アルビカンスに対して、トルイジンブルーO15のそれとほぼ同等の効率で殺傷効果を示した。この研究は、多剤耐性C.アルビカンスに対するRB-aPDTの効果を検証する方法を実証する。
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Protocol
1. aPDTシステムの準備
- LEDストリップから緑色の発光ダイオード(LED)を4つ切り取り( 材料表を参照)、96ウェルプレートの4ウェルに合わせます(図1)。
メモ: LED は 4 x 3 アレイに配置されました。LEDの背面は、照射時に熱を分散させるためにヒートシンクに接着した。 - 540nmにおけるLEDのフルエンス率11 を光パワーメーターで測定する( 材料表参照)。補足 図1 を参照して、LEDのフルエンス率が510~560nmであることを確認してください。
- 照射中はプレートの横に扇風機を入れて一定温度(25±1°C)11を維持した。照射中に培地の一定の温度が維持されることを確認するために、 補足図2 を参照してください。
2. C. albicansの酵母形態の培養
注:フルコナゾールを含むほとんどの抗真菌剤に耐性のある多剤耐性 C.アルビカン (BCRC 21538/ATCC 10231)が実験16に使用されている。
- 以前に発表された報告17に続くディスク拡散法で抗真菌薬感受性を決定する。
- 酵母、菌糸、および偽菌糸形態において C.アルビカンス を増殖させると、微小生態環境に応じて18。
注:菌糸および偽菌糸の形態は、正確な計算のためには困難である。酵母の形態は、顕微鏡下またはフローサイトメトリーで正確に計算することができる。細胞増殖中の温度は、その形態を決定する。室温(25°C)では、ほとんどすべての細胞が酵母形態である。 C. albicans の30°Cでの4時間の短いインキュベーションは、その酵母形態に影響を及ぼさなかった。
3. プランクトン性C.アルビカンス類のaPDT
- 滅菌ループを有する寒天プレートから C. albicans の単一コロニーを単離し、滅菌ガラス管内の3mL酵母エキスペプトンデキストロース(YPD)培地( 材料表を参照)に加える。
- チューブを25±1°Cで回転数155rpmのインキュベーター内で一晩(14〜16時間)インキュベートして 、C.アルビカンス を膨張させ、正確な定量のために真菌を酵母形態に維持する。
- 培地で一晩培養物を30°Cで約0.5のOD600 値に希釈し、155rpmの速度で4時間回転させて 、C. albicansの対数増殖期を達成する。
- 新鮮なYPD培地で再度対数期培養物をOD600値0.65 (約1 x107 コロニー形成単位、CFU/mL)に希釈する。寒天プレート8上で段階希釈法により終濃度を確認する。
- この粉末を1x PBSに溶解してローズベンガル(RB)の原液(4%)を調製する。0.22μmのフィルターでろ過して滅菌し、暗所で4°Cで保存してください。RBの最終作業濃度は0.2%である。
- 1.5 mL の微量遠心管で 1 mL の対数期 C. アルビカンス に 111 μL の 2% RB を加え、室温で異なる時点 (0、15、および 30 分) で共培養して、細胞内の RB の吸収を理解します (図 2)。
- 共培養物を1mLの1x PBSで3回洗浄し、室温で2.5分間16,100 x g で遠心分離した。
注:aPDTには、絶対制御(光曝露なし、RBなし)、ダークコントロール(光はないがRBと共にインキュベートする)、光制御(RBなしで光に曝露する)、aPDT(RBの存在下で光に曝露する)の4つの異なる条件が含まれる。 - C. albicans を 1 mL の 1x PBS に再懸濁し、各条件ごとに 96 ウェルプレートの 3 つの異なるウェルに割り振ります。洗浄後、ウェルをLEDアレイに合わせます。
- 光が当たるグループでは、扇風機とライトをオンにします。
注:異なるフルエンス(J/cm2)は、井戸をさまざまな期間にさらすことによって達成することができます。たとえば、16.7 分の光露光は、10 mW/cm 2 の LED 電球で 10 J/cm2 になります。 - 照射後、180 μLの1x PBSを含む1.5 mL遠沈管に1ウェルから20 μLの共培養液を加え、10x希釈液を調製した。また、10倍に希釈し、引き続き同様の方法に従う。
- 各段階希釈液の20 μLを3滴ずつYPD寒天プレートの1象限上に滴下し、プレートにカウント可能なコロニーを達成した。CFU/mLを計算するには、コロニーに希釈係数3を掛けます。
4. 統計解析
- 収集されたデータをグラフおよび統計ソフトウェアを使用して分析します( 材料表を参照)。
- 平均±平均の標準誤差でデータを表します。二元配置分散分析8 を実行して、異なる検定条件間の有意差を評価します。
- ペアワイズ比較8のTukeyの多重比較検定を実行します。異なる処置ごとに、少なくとも3つの独立した実験を行う。 p値<0.05は統計的に有意であると考えてください。
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Representative Results
図1は 、本研究で使用されているaPDTシステムを示す。高温は著しい細胞死を引き起こす可能性があるため、LEDアレイを扇風機で冷却し、照射時にはヒートシンクを用いて25±1°Cで一定温度を維持する。 熱効果は割引できます。均一な配光を持つことも、aPDTを成功させるための重要な決定要因です。したがって、照明中にLED電球を井戸に正確に合わせることが重要です。LEDの明るさのため、ライトを点灯する前にサングラスを装備する必要があります。
C.アルビカンスは 、蛍光顕微鏡下で赤色蛍光によって可視化されるようにRBで直ちに染色される( 図2の0分)。RBが時間依存的に細胞に入ることがわかる(図2)。この研究では、15分間のRBインキュベーションを使用し、15分後にほとんどの細胞をRBで染色した。RBのより高い濃度は、より強い蛍光をもたらし、真菌を殺すためにより多くのフリーラジカルを産生する。しかし、それはまた、正常細胞において重大な細胞死を引き起こす可能性がある。したがって、0.2%RB濃度は診療所で一般的に使用されている。したがって、その正確な濃度がこの研究で選択された。
PDTは、光を伴うRBの活性化を伴う。活性化されたRBが基底状態に戻ると、エネルギーと電子を近くの酸素に移してフリーラジカルと一重項酸素を生成し、細胞死をもたらす。 図3は 、RBの無照射又は非存在下の条件下での細胞死を示さない。 C.アルビカンスは、0.2 %RBの存在下で緑色光照射後に光用量依存的に阻害された(図3)。真菌を30J/cm2 の緑色光に曝すことで、細胞増殖の4log(99.99%)阻害がもたらされた。
図1:フォトダイナミックシステム 。(A)緑色のLEDアレイを金属製のヒートシンクに接着し、照射時に熱を分散させた。光源の横に扇風機を置き、温度を25±1°Cで一定に保ちました(B)ライトを点灯させました。(C)96ウェルプレートのウェルをLEDの中心に整列させた。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:C. albicansに入るローズベンガルの時間依存性研究。明視野(A-D)および蛍光画像(E-H)を0.2%ローズベンガル(RB)と共培養して0〜30分後にC.アルビカンスを培養した。(A)及び(E)RBを共培養することなくコントロール。(B)および(F)細胞を直ちに0.2%RBで染色した。(c)及び(G)の15分間の培養後、ほとんどの細胞は赤色蛍光を示し、細胞内部のRBを示す。(D)および(H)RBのより強い蛍光は、30分間のインキュベーションで認められた。スケール バー = 50 μm。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:多剤耐性 C.アルビカンスに対する抗菌光線力学的療法効果。 細胞の増殖阻害は、光フルエンスに依存する。C. albicans を10 J/cm 2のフルエンスに曝露すると、0.2 %ローズベンガルの存在下で、それぞれ1.5対数、20J/cm2の2対数、および30J/cm2 の4対数で細胞増殖が抑制された。- RB、ローズベンガルインキュベーションなし。+RB、ローズベンガルと15分間共培養した。データは、重複して行った3つの別々の実験のSEM±手段である。 p 値は図に示されています(Tukeyの多重比較検定、二元配置分散分析)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足図1:LED出力スペクトル フルエンス率は、パワーメーターで510〜560nmから2nmごとに測定した。データは、3 連の測定による 2 つの独立した実験からプールされます。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図2:照射時の培地の温度。 100 μLのブロスで満たされた96ウェルプレートの各ウェルに熱電対を挿入し、温度を測定した。温度は25±1°Cで一定であった。 データは、3連の井戸を使用した重複した実験からプールされます。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
真菌性角膜炎に対するRB−PDTの臨床応用の有望な結果が最近報告されている19。RBの吸収ピークは450〜650nmにある。aPDTを成功させるためには、光源のフルエンス率を決定することが不可欠です。がん細胞の治療には高いフルエンス(通常>100J/cm2)が必要であり、感染病変の治療には低いフルエンスが必要であると予想される6。高いフルエンスは、臨床現場では実用的ではないかもしれない長い曝露時間を意味する。真菌性角膜炎を治療するために、眼科コミュニティ20 において5.4J/cm2が合意されている。RBの長いインキュベーション時間も、患者がaPDT治療を受けるのに不便である。したがって、15分のインキュベーション時間をさらなる実験のために選択した。
いくつかの手順は、実験を成功させるために重要です。真菌培養に使用した寒天プレートを、表面の水分を減らすためにファンをオンにしたラメラフローキャビンで15〜20分間乾燥させた。湿った表面は、真菌液滴の流れが混ざり合うことを可能にし、単一のコロニーの形成を妨げる。
すべての実験を薄暗い光の中で実行することは、RBがフォトブリーチングから守るために不可欠です。電気回路は並列接続されていたため、回路の1つで断線が発生しても、残りのアプライアンスは影響を受けません。他のアレイの範囲外の結果がある場合は、まずアレイをチェックして、すべてのLED電球が正常に機能していることを確認できます。
LED光源を利用することの1つの制限は、その温度依存性である。LEDでは、LED電球自体によって熱が発生するのではなく、デバイス9内の半導体接合部で発熱する。定格電流を超える過駆動LEDはジャンクション温度の上昇を呼び起こし、最終的には電球の早期故障につながるため、ジャンクションの適切な冷却を提供するために金属ヒートシンクをデバイスに装備する必要があります。LEDアレイの現在の設計のもう1つの制限は、各LED電球によって照らされる制限領域であり、96ウェルプレートの1つのウェルしか収容できません。より大きな照明面積が必要な場合は、均一な照明を達成するために、プレートの上または下の適切な対応する距離を有するLED電球の異なる配置が必要である。
この研究デザインの利点は、aPDT実験のための光力学システムのセットアップの容易さと安価さである。これは、真菌感染症に関する実験に使用することができます.ウイルスと細菌も同じシステムでテストできます。LEDライトストリップは、可視光スペクトルから近赤外光スペクトルまで、異なる光増感剤の吸収ピークと相関するために、異なる色の光から選択することができる。彼らは簡単に市場から購入することができます。ストリップを切断して異なるアレイに組み立て、ハイスループットアッセイ用の96ウェルプレートと整列させることができます。96ウェルプレートを使用することで、異なる試験条件を同時に使用でき、ラボの時間とスペースを節約できます。
結論として、この研究で確立されたシステムは、様々な微生物および細胞に対する異なる光力学的効果を調べるために、単純で、容易で、汎用性がある。
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Disclosures
著者らは利益相反がないと宣言しています。
Acknowledgments
この研究は、文部(MOE)による高等教育スプラウトプロジェクトの枠組みの中で、国立成昆大学応用ナノ医学センター、国立成昆大学から資金提供を受けており、台湾科学技術部[MOST 109-2327-B-006-005]からTW Wongに資金提供を受けています。J.H. Hungは、台湾の国立成昆大学病院[NCKUH-11006018]および[MOST 110-2314-B-006-086-MY3]からの資金提供を認めています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microfuge tube | Neptune, San Diego, USA | #3745.x | |
| 5 mL round-bottom tube with cell strainer cap | Falcon, USA | #352235 | |
| 96-well plate | Alpha plus, Taoyuan Hsien, Taiwan | #16196 | |
| Aluminum foil | sunmei, Tainan, Taiwan | ||
| Aluminum heat sink | Nanyi electronics Co., Ltd., Tainan, Taiwan | BK-T220-0051-01 | Disperses heat from the LED array. |
| Centrifuge | Eppendorf, UK | 5415R | |
| Graph pad prism software | GraphPad 8.0, San Diego, California, USA | graphing and statistics software | |
| Green light emitting diode (LED) strip | Nanyi electronics Co., Ltd., Tainan, Taiwan | 2835 | Emission peak wavelength: 525 nm, Viewing angle: 150°; originated from https://www.aliva.com.tw/product.php?id=63 |
| Incubator | Yihder, Taipei, Taiwan | LM-570D (R) | |
| Light power meter | Ophir, Jerusalem, Israel | PD300-3W-V1-SENSOR, | |
| Millex 0.22 μm filter | Merck, NJ, USA | SLGVR33RS | |
| Multidrug-resistant Candida albicans | Bioresource Collection and Research CenterBioresource, Hsinchu, Taiwan | BCRC 21538/ATCC 10231 | http://catalog.bcrc.firdi.org.tw/BcrcContent?bid=21538 |
| OD600 spectrophotometer | Biochrom, London, UK | Ultrospec 10 | |
| Rose Bengal | Sigma-Aldrich, MO, USA | 330000 | stock concentration 40 mg/mL = 4%, prepare in PBS, stored at 4 °C |
| Sterilized glass tube | Sunmei Co., Ltd., Tainan, Taiwan | AK45048-16100 | |
| Yeast Extract Peptone Dextrose Medium | HIMEDIA, India | M1363 |
References
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