Summary
Denne protokol beskriver en brugervenlig metode til at undersøge substratoxidation ved at spore 14CO2 -produktion in vitro.
Abstract
Mitokondrier er vært for maskineriet til tricarboxylsyre (TCA) cyklus og elektrontransportkæde (ETC), som genererer adenosintrifosfat (ATP) for at opretholde energihomeostase. Glukose, fedtsyrer og aminosyrer er de vigtigste energisubstrater, der brænder mitokondriel respiration i de fleste somatiske celler. Beviser viser, at forskellige celletyper kan have en særskilt præference for visse substrater. Imidlertid er substratudnyttelse af forskellige celler i skelettet ikke blevet undersøgt i detaljer. Da cellulær metabolisme er tilpasset fysiologiske og patofysiologiske ændringer, kan direkte vurderinger af substratafhængighed i skeletceller desuden give vigtig indsigt i patogenesen af knoglesygdomme.
Følgende protokol er baseret på princippet om frigivelse af kuldioxid fra substratmolekyler efter oxidativ phosphorylering. Ved at anvende substrater, der indeholder radioaktivt mærkede carbonatomer (14C), tilvejebringer metoden et følsomt og brugervenligt assay for hastigheden af substratoxidation i cellekultur. Et casestudie med primære kalvariale preosteoblaster versus knoglemarvsafledte makrofager (BMM'er) viser forskellig udnyttelse af hovedsubstraterne mellem de to celletyper.
Introduction
Oxidativ fosforylering (OXPHOS) i eukaryoter er den proces, hvorved næringsstoffer nedbrydes inde i mitokondrier for at frigive kemisk energi i form af ATP gennem forbrug af ilt. Katabolisme af forskellige substrater inde i mitokondrier gennem tricarboxylsyre (TCA) cyklus genererer få ATP molekyler direkte, men lagrer snarere energi gennem reduktion af elektronbærerne nicotinamid adenin dinukleotid (NAD +) og flavinadenin dinukleotid (FAD +). De reducerede bærere oxideres derefter af ETC placeret på mitokondriernes indre membran for at generere en protonkoncentrationsgradient over membranen. Protonerne strømmer til sidst ned ad deres gradient tilbage i mitokondrielle matrix gennem ATP-syntase for at producere ATP. OXPHOS er det mest effektive middel til ATP-produktion fra energisubstrater og foretrækkes generelt i aerobe miljøer. Tidligere blev aerob glykolyse - produktion af laktat fra glukose, mens ilt er til stede - anset for at være patofysiologisk, ofte et kendetegn for kræftceller. Mere og mere opdages det, at nogle normale celletyper bruger aerob glykolyse af grunde, der endnu ikke er fuldt dechiffreret.
Metabolisk fleksibilitet er cellers eller organismers evne til at tilpasse sig skiftende energibehov og tilgængelige brændstofkilder. For eksempel imødekommes den energiske efterspørgsel efter skeletmuskulatur hovedsageligt af OXPHOS ved steady state, men af anaerob glykolyse under træning med høj intensitet1. Efterhånden som træningsvarigheden øges, bidrager glukose og fedtsyreoxidation mere til den samlede energiproduktion2. Imidlertid er substratbrug ikke kun afhængig af tilgængelighed, da substrater antagonistisk konkurrerer under oxidation. Mest bemærkelsesværdigt har fedtsyreoxidation vist sig at hæmme glukoseudnyttelsen af skeletmuskulaturen i et fænomen kendt som Randle-effekten3. En gensidig effekt blev påvist ved efterfølgende undersøgelser 4,5. Derudover er mange sygdomme forbundet med en ændring i substratpræference og udviklingen af metabolisk ufleksibilitet i celler. For eksempel reduceres fedtsyreoxidation i skeletmuskulaturen hos type II-diabetespatienter sammenlignet med normale kontrolpersoner6. De metaboliske ændringer i sygdomsindstillinger er genstand for intens undersøgelse, da de kan bidrage til patogenese.
Energimetabolisme i skeletcelletyper er relativt underundersøgt, men har fået opmærksomhed i de senere år7. Tidligere arbejde har vist, at aerob glykolyse er den dominerende energivej i kalvariale osteoblaster, mens glukoseoxidation gennem TCA-cyklussen spiller en rolle i osteoklastdannelse 8,9. Andre har fremlagt beviser for fedtsyrer som energikilde til osteoblaster10. Glutaminkatabolisme har også vist sig at understøtte osteoblastdifferentiering fra forfædrene11,12. Imidlertid mangler der stadig en omfattende forståelse af substratudnyttelse af forskellige skeletcelletyper. Derudover forventes ændringer i cellulær metabolisme under celledifferentiering eller som reaktion på patologiske signaler at ændre udnyttelsen af brændstofsubstratet. Beskrevet nedenfor er en brugervenlig protokol til analyse af substratoxidation in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Anvendelsen af radioaktive materialer (RAM) kræver forudgående godkendelse fra et udpeget sikkerhedsudvalg ved hver institution. RAM'er, der anvendes i denne protokol, er blevet godkendt af Environmental Health & Radiation Safety (EHRS) ved University of Pennsylvania. Anvendelsen af dyr kræver forudgående godkendelse fra Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) på hjemmeinstitutionen. Følgende undersøgelse blev godkendt af IACUC på The Children's Hospital of Philadelphia.
1. Fremstilling af stamopløsninger til 14C-mærkede substrater
- Der fremstilles 4 mM bovin serumalbumin (BSA) stamopløsning ved at blande 11 g BSA og 33,1 ml Dulbeccos fosfatbufrede saltvand (DPBS) og omrysse det forsigtigt ved stuetemperatur i ~3 timer, indtil BSA er helt opløst. BSA-stamopløsningen opvarmes i et 70 °C vandbad inden brug.
- Lufttør 50 μCi 14C-oleat (50 μCi/pmol i ethanol) i hætteglasset med låget slukket i 8 timer i en udpeget RAM-arbejdshætte. Der tilsættes 312,5 μLH20og derefter 3,5 mg (11,5 μmol) natriumoleat. Bland grundigt.
- Den resulterende opløsning opvarmes til 70 °C i et vandbad. Tilsæt 0,9375 ml af den forvarmede BSA-stamopløsning for at give 10 mM varm oleatstændelopløsning (indeholdende et 1:11,5-forhold på 14C-oleat og umærket oleat). Aliquot stamopløsningen og opbevar den ved -20 °C til langvarig brug.
- Brug 14C-glucose og 14C-glutamin direkte efter optøning.
2. Fremstilling af medium indeholdende 14C-mærkede substrater
BEMÆRK: For at sikre pålidelige koncentrationer af energisubstrater i medierne skal der anvendes specialfremstillede medier med friske substrater tilsat kort før brug. Her anvendes et specialfremstillet Minimum Essential Medium (MEMα) uden glucose, pyruvat, glutamin, phenolrød eller natriumbicarbonat. Der bør dog bestemmes et optimalt medium for hver celletype.
- Rekonstituere 8,67 g af mediumpulveret i 1 liter renset vand. Tilsæt 2,2 g natriumbicarbonat for at opnå en pH på 7,4 og filtrer opløsningen ved hjælp af 0,22 μm vakuumfiltrering.
- Tilsæt friske ingredienser for at opnå det komplette medium (cMEMα) med endelige koncentrationer på 5,5 mM glucose, 2 mM glutamin, 1 mM pyruvat og 10% føtalt kvægserum (FBS). Yderligere supplement cMEMα med 100 mM L-carnitin og 10 μM HEPES for at lette fedtsyreoxidation.
- Umiddelbart før brug tilsættes 14C-mærkede substrater til frisklavet cMEMα for at lave varme medier. For at gøre oleatet varmt medium tilsættes 10 mM varm oleatstændeopløsning til cMEMα for en endelig koncentration på 100 μM oleat (1:100 fortynding, endelig radioaktivitet 0,4 μCi/ml).
BEMÆRK: Den 10 mM varme oleatbestand, der indeholder et 1:11,5-forhold mellem varmt:koldt oleat (se trin 1.3), bruges til at opnå et fysiologisk niveau på 100 μM total oleat i medierne, samtidig med at mængden af radioaktivt materiale minimeres. - Der fremstilles 10 mM umærket oleat ved at tilsætte 24,36 mg natriumoleat til 2 mlH20i et vandbad ved 70 °C i ~20 minutter, indtil det er helt opløst, inden det blandes hurtigt med 6 ml af BSA-stamopløsningen på 4 mM, der er forvarmet til 70 °C. Overfør til et 37 °C vandbad i 1 time og filtrer gennem et 0,22 μm filter. Aliquot og opbevar ved -20 °C til langvarig brug.
- For at gøre glukose varmt medium tilsættes 14C-glucose til en endelig koncentration på 1,333 μM (1:4,125 fortynding, endelig radioaktivitet 0,4 μCi/ml). For at gøre glutamin varmt medium tilsættes 14C-glutamin til den endelige koncentration på 2 μM (1:1.000 fortynding, endelig radioaktivitet 0,4 μCi/ml).
- Suppler det varme glucose- og glutaminmedium med en 10 mM stamopløsning af umærket oleat fra trin 2.4 for at opnå den endelige koncentration på 100 μM oleat, det samme som i det oleat varme medium.
3. Forberedelse af celler
BEMÆRK: Calvariale preosteoblaster og knoglemarvsmakrofager bruges som eksempler her. Brugere bør forberede deres celletype valg i henhold til passende protokoller. Optimer koncentrationen af collagenase II, der skal bruges til fordøjelse i pilotforsøg, da den enzymatiske aktivitet kan variere mellem forskellige partier.
- Isolering og kultur af kalvariale preosteoblaster
- Ofre postnatal dag 3-5 (P3-5) hvalpe ved halshugning og overføre dem til iskold DPBS indeholdende Penicillin-Streptomycin (P/S).
- Udsæt calvaria ved at fjerne huden og blødt væv. Saml det midterste område ved at skære det omgivende væv væk fra ryg til front i DPBS (figur 1A). Rids de indre og ydre overflader af calvaria forsigtigt ved hjælp af pincet for at hjælpe med at frigive cellerne ved efterfølgende fordøjelse.
- Der fremstilles en 2 mg/ml og en 4 mg/ml opløsning af collagenase type II i DPBS, og hver opløsning filtreres med et nyt 0,22 μm filter. Den rensede calvaria fordøjes først med 2 mg/ml kollagenaseopløsningen i 15 minutter, og fordøjelsesopløsningen kasseres. Fordøje de rensede prøver i 4 mg/ml kollagenaseopløsning 3 gange i 15 minutter hver gang, samle og gemme fordøjelsesopløsningen.
- Fordøjelsesopløsningen filtreres gennem 70 μm cellesiler og centrifugeres filtratet ved 300 × g i 5 minutter. Resuspend cellepillen i cMEMα (se trin 2.2) indeholdende 10% FBS og P/S.
- Tæl og frø cellerne ved 4 × 104 celler/cm2 i 10 cm plader. Cellerne dyrkes i en 37 °C inkubator med 5 % CO2 i 3 dage.
- Dissociere cellerne ved 37 °C med 0,25 % trypsin-EDTA. Tæl og frø cellerne i cellekulturplader med 24 brønde med cMEMα indeholdende 10 % FBS og P/S ved 7,5 × 105/cm2. Frø mindst 4 brønde pr. celletype pr. substrat og mindst tre ekstra brønde for hver celletype til celletælling før analysen.
- Cellerne dyrkes ved 37 °C natten over, før substrateoxidationsanalyserne analyseres.
- Isolering og kultur af BMM'er
BEMÆRK: Kultur af BMM'er kræver makrofagkolonistimulerende faktor (M-CSF), som kan købes kommercielt som et rekombinant protein. Konditioneret medium fra cellelinjen CMG14-12 konstrueret til at udtrykke M-CSF er et økonomisk alternativ, der anvendes her13.- Saml lårben og skinneben fra 8 uger gamle mus efter fjernelse af muskel- og bindevæv. Skær og kassér begge ender af knoglerne med en skarp saks.
- Skyl knoglemarven ud fra et lårben og et skinneben i en 10 cm petriskål med en sprøjte udstyret med en 23 G nål indeholdende 15 ml cMEMα med 10% FBS, P/S og 10% CMG14-12 konditioneret medium (BMM medium). Dyrkning af cellerne i petriskålen i en 37 °C inkubator med 5 % CO2.
- Efter 3 dage kasseres kulturmediet og skylles med DPBS. Dissociere de vedhæftede celler ved 37 °C med 0,25 % trypsin-EDTA i 5 minutter. Centrifugering og resuspend cellepillen i BMM-mediet.
- Tæl og frø cellerne i cellekulturplader med 24 brønde ved 7,5 × 105/cm2 på samme måde som beskrevet i 3.1.6. Kultur ved 37 °C natten over i BMM-mediet, inden analyserne påbegyndes.
4. Substratoxidationsassay med CO2 - fælde
BEMÆRK: Der skal bestemmes en passende såningstæthed for hver celletype for at opnå 80-90% sammenløb inden assayets start. Bemærk, at celletæthed kan påvirke cellernes metaboliske tilstand.
- Vask cellerne i de ekstra brønde to gange med DPBS. Dissociere cellerne med 0,25% trypsin-EDTA og blandede 20 μL celler resuspended i DPBS med 20 μL acridin orange / propidiumiodid (AO / PI) klar til brug kommerciel farvestofopløsning. Bestem antallet af levende celler med en automatiseret celletæller, og registrer nummeret til endelige beregninger.
- Vask cellerne i analysebrøndene to gange med DPBS. Tilsæt 500 μL varmt medium til hvert assay godt i den RAM-udpegede vævskulturhætte. Forsegl pladerne med parafilm og inkuber cellerne i en RAM-udpeget inkubator ved 37 °C i 4 timer.
- Under inkubation skæres filterpapir i cirkulære stykker, der er lidt større end området inde i hætten på 1,5 ml mikrocentrifugerør, og papiret sættes tæt ind i hætten (figur 1B). Der tilsættes 200 μL 1 M perchlorsyre til hvert rør og 20 μL natriumhydroxid til filterpapiret, der er monteret inde i hætten.
- Efter inkubation af cellerne overføres 400 μL dyrkningsmedium fra hver brønd til de forberedte rør og lukkes straks hætterne. Lad rørene stå i et rørstativ ved stuetemperatur i 1 time.
- Under inkubation skal du oprette et hætteglas med scintillation for hvert rør og fylde det med 4 ml scintillationsvæske. Overfør hvert stykke filterpapir til et hætteglas med scintillation og inkuber ved stuetemperatur i 30 minutter.
- Udfør aftørringstest på vævskulturhætten, vandbadet (bruges til 14C-oleatpræparat), køleskab, inkubator, vask, jord og ethvert andet arbejdsområde for potentiel RAM-forurening. Sæt papirservietterne i hætteglas med scintillation, der indeholder scintillationsvæske.
- Mål 14C-radioaktivitet i hætteglassene til scintillation med en scintillationstæller. Optag læseresultaterne. Dekontaminere arbejdsmiljøet i henhold til retningslinjer for strålingssikkerhed, hvis det er nødvendigt.
5. Analyse af data
BEMÆRK: Forudsat at hvert substrat er fuldt oxideret for at frigive CO2, kan substratoxidationshastigheden beregnes ud fra den fangede CO2 - radioaktivitet.
- Beregn substrateoxidationshastigheden ved hjælp af Eq (1) og X-, Y- og Z-værdierne i tabel 1 for forskellige substrater.
Substratoxidationshastighed (pmol/celle/h) =
(1)- Beregn de samlede disintegrationer pr. minut (DPM) for hver reaktionsbrønde. For X anvendes DPM-værdien (scintillationstællæsning) fra 0,4 ml af det reaktionsmedium, der anvendes til CO2-fangst ud af 0,5 ml af det samlede reaktionsmedium. Derfor er den samlede DPM fra hver reaktionsbrønde X × 1,25.
- Del den samlede DPM med en faktor på 2,220,000 for at konvertere til μCi.
- Konverter radioaktiviteten i μCi til antallet af 14C-mærkede molekyler. Del μCi-værdien med den specifikke aktivitet (Y) for hvert mærket substrat. Anvend følgende Y-værdier (tabel 1): 14C-glucose: 300 mCi/mmol; 14 C-glutamin: 200 mCi/mmol; 14 C-oleat: 50 mCi/mmol.
- Beregn det samlede antal oxiderede molekyler fra de oxiderede 14C-mærkede molekyler ved at multiplicere sidstnævnte med den varme til totale fortyndingsfaktor (Z). Anvend følgende Z-værdier (tabel 1): Glucose: 4,125; glutamin: 1.000; oleat: 12,5.
- Del det resulterende produkt med cellenummer (celle #) og 4 (for reaktionstiden på 4 timer) for at bestemme substratoxidationshastigheden pr. Celle. Brug cellen # bestemt i de parallelle brønde i begyndelsen af assayet.
(1)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I dette eksempel anvendes CO2 - fangstmetoden til at sammenligne substratoxidation ved primære kalvariale preosteoblaster versus BMM'er, som ofte anvendes til henholdsvis in vitro osteoblast eller osteoklastdifferentiering. Efter at de primære celler er passeret og dyrket i cMEMα natten over, når de typisk 80-90% af sammenløbet og udviser deres karakteristiske morfologi. De kalvariale preosteoblaster er især større end BMM'er (figur 2). Hver celletype udsættes for oxidationsassays for glucose, glutamin og oleat ved at følge trin 4.1 til 4.7. Resultaterne analyseres ved hjælp af Eq (1).
Resultaterne viser, at oxidationshastigheden for hvert substrat er signifikant højere i kalvariale preosteoblaster end BMM'er, hvilket sandsynligvis indikerer større energiproduktion af OXPHOS i preosteoblasterne (figur 3). Tidligere undersøgelser med Seahorse-teknologi har vist, at OXPHOS tegner sig for ~60% af ATP-produktionen i preosteoblaster, men markant falder i modne osteoblaster, hvor aerob glykolyse er ansvarlig for ~80% af energien9. De nuværende resultater viser, at alle tre store substrater bidrager til OXPHOS i preosteoblaster. Yderligere undersøgelser er imidlertid nødvendige for at afgøre, om udnyttelsen af et eller alle substraterne reduceres i de modne osteoblaster.
Figur 1: Diagrammer for CO2 - fangstassay og kalgatadissektion. (A) Det midterste område af calvaria, angivet med den orange stiplede trekant, høstes for celle isolaton. B) Der anvendes 1,5 ml mikrocentrifugerør til CO2 -fangst (trin 1). Filterpapir (blåt papir til illustrationsformål) skæres, så det passer ind i rørhætter (trin 2). Der tilsættes 200 μL 1 M perchlorsyre til 400 μL varme medier fra cellekulturen i hvert rør og 20 μL NaOH til filterpapiret (trin 3), inden låget lukkes (trin 4). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Typisk morfologi af BMM'er og kalvariale preosteoblaster. (A, B) Repræsentative billeder ved lavere forstørrelse. (C, D) Repræsentative billeder ved højere forstørrelse. Skalastænger = 400 μm (A, B), 100 μm (C, D). Forkortelser: BMM'er = knoglemarvsafledte makrofager; preOB'er = preosteoblaster. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Substratoxidationshastigheder i kalvariale preosteoblaster og BMM'er. a) glukose. (B) Glutamin. (C) Oleat. Beregningerne antager, at hvert substratmolekyle er fuldt oxideret. Forkortelser: BMM = knoglemarvsafledt makrofag; preOB = preosteoblast. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Substrat | Radioaktivitet (X) | Specifik aktivitet (Y), mCi/mmol | Fortyndingsfaktor (Z) |
| Glukose | DPM1 | 300 | 4,125 |
| Glutamin | DPM2 | 200 | 1,000 |
| Oleate | DPM3 | 50 | 12.5 |
Tabel 1: Parametre anvendt i dataanalyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen giver en brugervenlig metode til at bestemme oxidationshastigheden for større energisubstrater. Det er et enklere alternativ til andre protokoller, der bruger kolber, der indeholder en central brønd og er dækket af gummipropper 14,15,16. Selvom eksempelstudiet her udføres med cellekultur, kan metoden let tilpasses vævseksplanter eller vævshomogenater indeholdende intakte mitokondrier, som tidligere beskrevet17.
Nogle vigtige trin, der skal overvejes i denne protokol, involverer forberedelse af reagenserne og opsætning af rørene til 14CO2 - fangst. At sikre passende konjugering af oleat til BSA er afgørende for at forhindre frie fedtsyrer (FFA'er) i at beskadige cellemembranerne og muliggøre effektiv optagelse af cellen til metabolisme. Inkuber BSA-opløsningen lige længe nok til fuldstændig opløsning, da lange inkubationer med BSA ved 70 °C fører til irreversibel størkning.
Der skal fremstilles frisk cMEMα for hver forsøgsopstilling på grund af den korte halveringstid for substrater såsom L-glutamin. Endelig skal filterpapiret være stort nok til at passe sikkert i hætten for at undgå fejlagtige aflæsninger. Et utilsigtet fald af filterpapiret i reaktionsvæsken vil føre til unormalt høje DPM-værdier, som bør udelades fra yderligere analyse. Fire til fem replikerede brønde kan indstilles i tilfælde af potentiel forurening. Hvis de endelige DPM-værdier er for lave, for eksempel mindre end 100, kan det være nyttigt at øge mængden af radioaktivt substrat eller inkubationstiden.
Der er forbehold for at bruge oleat som surrogatsubstrat til fedtsyreoxidation. Oleat er den mest rigelige enumættede, langkædede fedtsyre, der udgør 32% af alle fedtsyrer i omløb og væv. Imidlertid er andre langkædede fedtsyrer, såsom palmitat (28%) og linoleat (14%), også vigtige substrater in vivo18,19. Derfor kan tilskud af cellekulturmediet med oleat alene muligvis ikke nøjagtigt afspejle oxidationshastigheden af fedtsyrer, når andre arter også er til stede. Når analysen udføres, kan denne bekymring forbedres ved at inkludere de andre fedtsyrer i kulturmedierne.
Det skal bemærkes, at cellemetabolisme er meget kontekstafhængig og kan udvise stor plasticitet afhængigt af substrattilgængelighed og iltspænding, blandt andre faktorer. Det er derfor vigtigt at evaluere in vitro-resultater i forbindelse med fysiologiske tilstande. Ikke desto mindre er det mere og mere klart, at celler har tendens til at opretholde i det mindste nogle aspekter af deres metaboliske egenskaber in vitro, sandsynligvis på grund af den cellespecifikke metaboliske programmering og hukommelse. Således tilbyder enkle in vitro-metoder , som denne, et vigtigt redskab til at få indsigt i ikke kun den metaboliske mangfoldighed blandt celletyper, men også potentiel dysregulering under sygdomstilstande.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Arbejdet blev delvist støttet af NIH-bevilling R01 AR060456 (FL). Vi takker Dr. Michael Robinson og Elizabeth Krizman (The Children's Hospital of Philadelphia) for deres generøse hjælp med scintillationstælleren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm filters | Sigma-Aldrich | SLGVM33RS | Used to filter BSA solution |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | Dissociate cells from cell culture plates |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | PR1MA | PR MCT17 RB | Used for reaction incubation |
| 10 cm plates | TPP | 93100 | Used for cell culture |
| 10 mL syringe | BD | 302995 | Used to flush marrow from long bones |
| 10% FBS | Atlanta biologicals | S11550 | For Cell culture medium preparation |
| 14C-Glucose | PerkinElmer | NEC042X050UC | Used to make hot media |
| 14C-glutamine | PerkinElmer | NEC451050UC | Used to make hot media |
| 14C-oleate | PerkinElmer | NEC317050UC | Used to make hot media |
| 23 G needle | BD | 305120 | Used to flush marrow from long bones |
| 24-well plates | TPP | 92024 | Used for cell culture |
| 70 μm cell strainers | MIDSCI | 70CELL | Used to filter supernatant during cavarial digestion |
| Acridine Orange/Propidium Iodide (AO/PI) dye | Nexcelom Biosciences | CS2-0106 | Stains live cells to determine seed density |
| Bovine Serum Ablumin | Proliant Biologicals | 68700 | Used for fatty acid conjugation |
| Cellometer Auto 2000 | Nexcelom Biosciences | Determine the number of viable cells | |
| Centrifuge | Thermo Fisher | Legend Micro 21R | Used to pellet cells |
| Collagenase type II | Worthington | LS004176 | Dissociate cells from tissue |
| Custom MEM alpha | GIBCO | SKU: ME 18459P1 | Used to create custom hot media |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 10010023 | Used to dissolve and dilute reagents, and wash culture dishes |
| Filter Paper | Millipore-Sigma | WHA1001090 | Traps CO2 with sodium hydroxide |
| Glucose | Sigma-Aldrich | g7528 | Used to make custom media |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Traps CO2 during cell culture |
| L-carnitine | Sigma-Aldrich | C0283 | Supplemented for fatty acid oxidation |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | g3126 | Used to make custom media |
| MEM alpha | Thermo | A10490 | Cell culture medium |
| Parafilm | Pecheney Plastic Packaging | PM998 | Used to seal cell culture dishes |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | Prevents contamination in cell culture |
| Perchloric Acid | Sigma-Aldrich | 244252 | Releases CO2 during metabolic assay |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | p5280 | Used to make custom media |
| Scintillation Counter | Beckman Coulter | LS6500 | Determines radioactivity from the filter paper |
| Scintillation Fluid | MP Biomedicals | 882453 | Absorb the energy emitted by RAMs and re-emit it as flashes of light |
| Scintillation Vial | Fisher Scientific | 03-337-1 | Reaction containers for scintillation fluid |
| Sodium carbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | Balance buffer for medium |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 58045 | Traps CO2 during metaboilc assay |
| Sodium oleate | SANTA CRUZ | SC-215879 | BSA conjugated fatty acid preparation |
| Vaccum filtration 1000 | TPP | 99950 | Filter cMEMα |
References
- Hargreaves, M., Spriet, L. L. Skeletal muscle energy metabolism during exercise. Nature Metabolism. 2 (9), 817-828 (2020).
- Jeukendrup, A. E. Regulation of fat metabolism in skeletal muscle. Annals of the New York Academy of Sciences. 967, 217-235 (2002).
- Randle, P. J., Garland, P. B., Hales, C. N., Newsholme, E. A. The glucose fatty-acid cycle. Its role in insulin sensitivity and the metabolic disturbances of diabetes mellitus. Lancet. 1 (7285), 785-789 (1963).
- Randle, P. J., Newsholme, E. A., Garland, P. B. Regulation of glucose uptake by muscle. 8. Effects of fatty acids, ketone bodies and pyruvate, and of alloxan-diabetes and starvation, on the uptake and metabolic fate of glucose in rat heart and diaphragm muscles. Biochemical Journal. 93 (3), 652-665 (1964).
- Taegtmeyer, H., Hems, R., Krebs, H. A. Utilization of energy-providing substrates in the isolated working rat heart. Biochemical Journal. 186 (3), 701-711 (1980).
- Cha, B. S., et al. Impaired fatty acid metabolism in type 2 diabetic skeletal muscle cells is reversed by PPARgamma agonists. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 289 (1), 151-159 (2005).
- Lee, W. C., Guntur, A. R., Long, F., Rosen, C. J. Energy metabolism of the osteoblast: implications for osteoporosis. Endocrine Reviews. 38 (3), 255-266 (2017).
- Li, B., et al. Both aerobic glycolysis and mitochondrial respiration are required for osteoclast differentiation. FASEB Journal. 34 (8), 11058-11067 (2020).
- Lee, W. C., Ji, X., Nissim, I., Long, F. Malic enzyme couples mitochondria with aerobic glycolysis in osteoblasts. Cell Reports. 32 (10), 108108 (2020).
- Kim, S. P., et al. Fatty acid oxidation by the osteoblast is required for normal bone acquisition in a sex- and diet-dependent manner. JCI Insight. 2 (16), 92704 (2017).
- Yu, Y., et al. Glutamine metabolism regulates proliferation and lineage allocation in skeletal stem cells. Cell Metabolism. 29 (4), 966-978 (2019).
- Karner, C. M., Esen, E., Okunade, A. L., Patterson, B. W., Long, F. Increased glutamine catabolism mediates bone anabolism in response to WNT signaling. The Journal of Clinical Investigation. 125 (2), 551-562 (2015).
- Takeshita, S., Kaji, K., Kudo, A. Identification and characterization of the new osteoclast progenitor with macrophage phenotypes being able to differentiate into mature osteoclasts. Journal of Bone and Mineral Research. 15 (8), 1477-1488 (2000).
- Itoh, Y., et al. Dichloroacetate effects on glucose and lactate oxidation by neurons and astroglia in vitro and on glucose utilization by brain in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (8), 4879-4884 (2003).
- Oba, M., Baldwin, R. L. 4th, Bequette, B. J. Oxidation of glucose, glutamate, and glutamine by isolated ovine enterocytes in vitro is decreased by the presence of other metabolic fuels. Journal of Animal Science. 82 (2), 479-486 (2004).
- Esen, E., Lee, S. Y., Wice, B. M., Long, F. PTH promotes bone anabolism by stimulating aerobic glycolysis via IGF signaling. Journal of Bone and Mineral Research. 30 (11), 1959-1968 (2015).
- Huynh, F. K., Green, M. F., Koves, T. R., Hirschey, M. D. Measurement of fatty acid oxidation rates in animal tissues and cell lines. Methods in Enzymology. 542, 391-405 (2014).
- Hodson, L., Skeaff, C. M., Fielding, B. A. Fatty acid composition of adipose tissue and blood in humans and its use as a biomarker of dietary intake. Progress in Lipid Research. 47 (5), 348-380 (2008).
- Abdelmagid, S. A., et al. Comprehensive profiling of plasma fatty acid concentrations in young healthy Canadian adults. PLoS One. 10 (2), 0116195 (2015).
