Summary
ここでは、細胞のレオロジー特性を測定するための光ピンセットとデフォーカス顕微鏡に基づく統合プロトコルについて説明します。このプロトコルは、さまざまな生理病理学的条件下での赤血球の粘弾性特性の研究に広く適用できます。
Abstract
赤血球の粘弾性特性は、さまざまな技術によって研究されています。ただし、報告されている実験データはさまざまです。これは、細胞の正常な変動性だけでなく、細胞応答の方法とモデルの違いにも起因します。ここでは、光ピンセットとデフォーカス顕微鏡を使用した統合プロトコルを使用して、1Hz〜35Hzの周波数範囲で赤血球のレオロジー的特徴を取得します。光ピンセットは赤血球複合体弾性定数の測定に使用されますが、デフォーカス顕微鏡は、複雑な弾性定数を複雑なせん断弾性率に変換できるパラメータである細胞の高さプロファイル、体積、およびそのフォームファクターを取得できます。さらに、軟質ガラス状レオロジーモデルを適用すると、両方の弾性率に対するスケーリング指数が得られる。開発された方法論は、いくつかの生理学的および病理学的条件について、明確に定義された実験条件下で得られたそれらの粘弾性パラメータを特徴付ける、赤血球の機械的挙動を探索することを可能にする。
Introduction
赤血球としても知られる成熟赤血球(RBC)は、人体の最も狭い毛細血管を通過するときに、そのサイズが2倍以上伸びることができます1。そのような能力は、外部負荷を受けたときに変形するそれらの独特の能力に起因する。
近年、さまざまな研究がRBC表面2,3でこの特徴を特徴付けています。外部荷重による材料の弾性応答と粘性応答を記述する物理学の分野は、レオロジーと呼ばれます。一般に、外力が加えられると、結果として生じる変形は材料の特性に依存し、エネルギーを蓄える弾性変形とエネルギーを放散する粘性変形に分けることができます4。赤血球を含むすべての細胞は粘弾性挙動を示します。言い換えれば、エネルギーは蓄えられ、散逸されます。したがって、セルの粘弾性応答は、その複素せん断弾性率G*(ω)= G'(ω)+ iG"(ω)によって特徴付けることができ、ここでG'(ω)は弾性挙動に関連する貯蔵弾性率であり、G"(ω)はその粘度4に関連する損失弾性率である。さらに、現象論的モデルは細胞応答を記述するために使用されており、最も使用されているものの1つは、負荷周波数に対する複素せん断弾性率のべき乗則依存性を特徴とする軟質ガラス状レオロジーモデル5と呼ばれる。
単細胞ベースの方法は、力を加え、課せられた荷重の関数として変位を測定することにより、RBCの粘弾性特性を特徴付けるために採用されています2,3。しかし、複素せん断弾性率については、文献にはほとんど結果がありません。動的光散乱を用いて、RBC貯蔵および損失弾性率の値は、1〜100Hzの周波数範囲で0.01〜1Paの範囲で変化して報告された6。光磁気ツイストサイトメトリーを用いることにより、見かけの複素弾性率が得られ7、比較のために、おそらく不一致を明らかにするために乗法係数が主張されました。
最近では、時間依存的な負荷に対するヒト赤血球のせん断弾性率の貯蔵と損失を定量的にマッピングするための統合ツールとして、光ピンセット(OT)とデフォーカス顕微鏡(DM)に基づく新しい方法論が確立されました8,9。さらに、柔らかいガラス状のレオロジーモデルを使用して結果を適合し、赤血球8,9を特徴付けるべき乗則係数を取得しました。
全体として、以下に詳細に説明するプロトコルである開発された方法論8,9は、力と変形をRBC表面の応力とひずみに関連付けるフォームファクターFfの測定値を使用して以前の不一致を明らかにし、異なる血液を持つ個人から得られたRBCの粘弾性パラメータと柔らかいガラスの特徴を定量的に決定できる新しい診断方法として利用できます病理。以下に説明するプロトコルを用いたこのような特性評価は、メカノバイオロジーの観点から赤血球の挙動を理解するための新しい可能性を開く可能性があります。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ヒトの血液サンプルは、リオデジャネイロ連邦大学の研究倫理委員会によって承認されたプロトコル(プロトコル2.889.952)に従って成人男性と女性のボランティアによって提供され、CAAE番号88140418.5.0000.5699でブラジルプラットフォームに登録されました。書面による同意書がすべてのボランティアに発行され、収集されました。ヘモグロビン症および/または管理薬を服用している人は除外されました。.プロセス全体は、研究所の倫理委員会によって承認されたガイドラインに従いました。
1. サンプルホルダーの作製
- サンプルホルダーごとに2枚のカバーガラス(24 mm x 60 mmおよび24 mm x 32 mm、厚さ= 0.13-0.17 mm)と1つのゴムリング(直径= 10 mm、厚さ= 2 mm)を用意します。
- 周囲全体を覆うようにゴムリング表面にシリコングリースを注ぎます。
- グリース側をカバーガラスに向けて、カバーガラスにゴムリングを置きます。適切に取り付けられるまで5分間待つと、サンプルホルダーは細胞培養を受け入れる準備が整います。
注:さらに、前述のように、市販または自家製のガラス底皿も使用できます10。
2. 細胞培養
注:以下の手順では、ヒトの血液から健康な赤血球を採取する方法について説明します。各実験の前にサンプルを新たに調製することが重要です。
- 137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na 2 HPO 4、1.8 mM KH2PO4、10 mM グルコースを含む250 μLの1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)溶液で20 μLの血液を希釈し、1 mg/mLのウシ血清アルブミン(BSA)を添加します。
- 200 x g で室温で2分間遠心分離した後、ピペットを使用して上清を吸引し、細胞ペレットを1 mLの1x PBS/BSA溶液に再懸濁します。バッファー中の細胞を2倍洗浄します。
- 血球計を使用して細胞密度を計算し、ステップ1で調製したサンプルホルダーに50,000〜100,000個の細胞をシードします。カバーガラスへの非特異的細胞の付着を10〜15分待ちます。待機時間はセルに影響しません。
- さらなるOT実験のために、10%v/vポリスチレン球溶液(半径= 1.52 ± 0.02 μm)をサンプル0.2 μLに加えます。顕微鏡でサンプルを見て、適切な混合を確認します。
- 細胞播種後、2枚目のカバーガラスをゴムリングの上に置き(取り付け用にグリースを追加する必要はありません)、セットアップを閉じて、サンプル調製を終了します。サンプルは顕微鏡分析と操作の準備ができています。
3.光学ピンセット顕微鏡のセットアップ
注:OTは、高度に集束されたレーザービームを使用して微細な物体をトラップし、ピコネウトン範囲の力とナノメートルスケールの変位を測定するツールです。使用するOTレーザー(波長1064 nm)は、前述のように適切に位置合わせする必要があります10。
- 簡単に説明すると、数センチメートル(少なくとも10〜20cm)の距離で離れた少なくとも2つのミラーを使用して、直線偏光レーザービームを倒立顕微鏡の後口に向けます。レーザービームを正確に位置合わせして、顕微鏡に直線で入射します(図1)。
- 次に、顕微鏡に設置したダイクロイックミラーを用いてレーザー光を反射させ、対物レンズの軸線と平行に進み、その後方入口の中央付近にレンズを入射させる。これにより、レーザーの焦点が合って光学トラップが作成されます(図1)。
- 次に、OTで力を測定するために、システムを較正してトラップ剛性(κOT)を取得します。OTキャリブレーション手順の詳細については、10を参照してください。κ OTが見つかると、OTシステムはレオロジー実験の準備が整います。
4. DMの設定
注:DMは明視野ベースの光学顕微鏡技術であり、顕微鏡の焦点がわずかにずれている場合に透明な物体が見えるようになります11,12。このような技術が適用され、RBC形状13が得られる。OTシステムに採用されているのと同じ顕微鏡をDMに使用して、3D再構成によって高さプロファイルを取得できます。
- ケーラー照明14 を実行して顕微鏡照明システムを調整し、解像度を上げるためにコンデンサーダイアフラムを完全に開いて実験を実行します。
- 圧電位置決めシステムを使用して、z軸にナノメートル精度ですべての座標でサンプルを変位させます。すべての軸で圧電システムの自動校正を実行します。すべての手順が実行されると、顕微鏡システムはDM実験の準備が整います。
5. OTベースのレオロジー実験と分析
注:レオロジー実験は、さまざまな周波数の小さな振動に対する細胞の応答を観察することで構成されます。
- 実験
- OTシステムを使用して、OTレーザーで球をトラップし、球を上面近く、細胞の端に近い細胞表面に押し付けてRBCに取り付けます。このステップでは顕微鏡を使用します。次に、別の球体をトラップし、同じ取り付け手順を繰り返しますが、セルの近くのカバーガラスに取り付けます。カバーガラスに取り付けられた球は基準ビード(図2)であり、ピエゾ変位を追跡し、RBC球と比較するために必要です。
- 測定を開始する前に、選択したセルがカバーガラスにしっかりと取り付けられていること、およびRBCと参照球がそれぞれRBC表面とカバーガラスに付着していることを確認してください。接着率が高い(約80%〜90%)にもかかわらず、時間の経過とともに移動する非接着細胞を視覚的に識別します。
- 振幅 ξ 0 = 0.500 ± 0.001 μm の正弦波関数と、1 Hz、7 Hz、14 Hz、21 Hz、28 Hz、および 35 Hz の可変周波数と、それぞれの角周波数 ω ω を 6.3 rad/s、169 rad/s、88 rad/s、132 rad/s、176 rad/s、および 220 rad/s の圧電ステージソフトウェアに追加します。 圧電ソフトウェアを使用して、前に示したように8,9。
- 圧電ステージを使用して、スタートボタンを押して圧電変位を可能にし、RBC球をトラップに保持し、以前に設定した正弦波関数を使用してサンプルを動きのサイクルに提出します。790フレーム/秒以上の画像を生成できるカメラを使用して、サンプルの動きを記録します。実験の概略図を 図2に示します。
- サンプルが正弦波運動にサブミットされている間に、OTをアクティブにして、RBC表面に付着した球をトラップします。実験を行うために選択した温度、室温、37°C、またはその他の温度に関係なく、測定中の変動を避けるために温度を注意深く監視してください。OTの作成に使用される赤外線(1064 nm)レーザーは、細胞の損傷や加熱をほとんど引き起こしません。
- 解析
- ImageJを使用して正弦波運動中に得られた画像を解析し、時間の経過に伴う各球の重心位置を見つけます。
注:これらのデータにより、両方の球間の位相と振幅の差を示すことができるプロットを生成できます。このような情報は、赤血球の粘弾性応答を得るために重要です。 - 各球の重心を取得するには、ImageJ ソフトウェアを開きます。正弦波運動中に得られたムービー全体をインポートします。
- [ 画像 ] タブで [ 調整] をクリックし、[ しきい値] を選択します。しきい値ウィンドウが開きます。 [白黒] を選択します。これにより、背景が白くなり、球が黒になります。
- ヒストグラムの下にある両方のスクロールバーでしきい値を調整して、両方の球体が最大ピクセル数で表示されるようにします。
- 参照球を選択するには 、[ファイル]>[長方形]をクリックします。四角形を描画して球を選択します。1つの画像で参照球を選択した後、長方形がムービーの他のすべての画像で同じ球も正しく選択していることを確認してください。
- 次に、[ 分析] タブで、[ 測定値の設定 ]をクリックし、[ 重心 ]オプションを選択します。
- [解析]タブをもう一度クリックし、[パーティクルの解析]を選択します。新しいウィンドウが開きます。サイズと真円度を定義します(球の半径によって異なります)。次の[結果の表示] と [結果のクリア] チェックボックスをオンにします。最後に、[OK]をクリックしてすべての画像を処理します。
- 質量の中心のxy座標を含むテーブルを含む新しいウィンドウが表示されます。これらの座標値を.txtファイルとして保存します。RBC サーフェスに接続されている他の球についても、この手順を繰り返します。
- 両方の球の振幅と位相差を取得するには、解析ソフトウェアを開きます。以前に取得した.txtファイルをインポートします。
- 3 つの列を持つ新しいテーブルを作成します。最初の列(c0)にフレーム数を追加し、2番目の列(c1)に参照球のx座標を追加し、3番目の列(c2)にRBCサーフェスにアタッチされた球のx座標を追加します。
注: この例では、正弦波の動きは x 軸でのみ実行されたため、両方の球に x 座標を使用するだけで済みます。 - 次に、フレームを時間と関連付けます。 クリック ウィンドウ>式エントリ.数式入力と呼ばれる新しいウィンドウが開きます。このウィンドウでは、8つの異なる方程式を設定し、それぞれを特定のキー(F1からF8まで)に設定できます。
- F1 を選択し、次の数式を入力します。
c 3 = c0 / (カメラの fps)
[実行]をクリックします。これにより、テーブル(列4)にしばらくの間新しい列が作成されます。 - 各フレームの x 座標値をそれぞれの平均値で減算します。これを行うには、数式エントリで任意の2つのキーを指定し、キーごとに次の式を入力します。
c 4 = (c 1 - 平均(c 1)) および c 5 = (c 2 - 平均(c2))
[ 実行 ]ボタンをクリックします。結果は、参照球とRBC球の列5と6にそれぞれ表示されます。 - 重心の値をピクセルからマイクロメートルに変換します。このためには、数式エントリで別のキーを使用して、次の式を入力します。
c 4 = c 4 / 変換数
列5についても同じプロセスを繰り返します。
注意: 変換は、マイクロメートルスケール/定規を使用して取得され、測定に使用されたのと同じ顕微鏡セットアップ(同じ対物レンズを含む)で画像を取得します。この手順は、顕微鏡のキャリブレーション中に実行できます。このようにして、ピクセル/マイクロメートルの関係が得られます。 - 両方の球の重心をy軸に、時間をx軸にしたプロットを生成します。このためには、[ ギャラリー]>[線形]と[散布図]をクリックします。新しいウィンドウが開きます。X 軸の時間列を選択し、Y 軸で、参照球と赤血球の両方の重心の列をマイクロメートル単位で選択します。
- プロットで、最初の角周波数(6.3 rad/s)に関連するデータのみを選択します。 図 3 に示すツールを使用します。
- 参照球のデータ曲線を調整する方程式を定義します。このためには、[ 一般]および[Fit1]>[カーブフィット]をクリックし、参照球の位置に関連するデータのボックスを選択して、[ 定義]をクリックします。方程式を定義するための新しいウィンドウが開きます。基準球の位置 ξ(t) は次式で表されます。
ξ(t) = ξ0cos(ωt)
ここで、ξ はサンプルの正弦波運動、ω は角周波数、 t はs単位の時間です。この方程式を解析ソフトウェアに置き換えると、次のようになります。
ここで、m1はξ、m2はf、m0は時間t、m3はt = 0の余弦関数の位相です。 - プロットからm1、m2、およびm3の値を推定します。方程式を定義したら、[ OK]をクリックします。データは方程式に基づいて適合され、曲線と小さな正方形がm1、m2、およびm3の値とともにグラフに表示されます。
- RBC 球のデータ曲線を調整する方程式を定義します。このためには、[ 曲線フィット]>[一般 ]をクリックして、データの曲線を調整する方程式を定義します。RBC 球の位置 ρ(t) は次式で与えられます。
ここで、ξ' は位相振幅の外れ、φ は位相のずれ角です。この式を分析ソフトウェアに置き換えると、次のようになります。
ここで、m1、m2、および m3 は、参照球のカーブフィットで取得された値です。m4 は ξ' であり、m5 は φ です。 - プロットからm4とm5の値を推定します。数式を定義したら、[ OK]をクリックします。データは方程式に基づいて適合され、小さな正方形と一緒に曲線がm4とm5の値でグラフに表示されます。
- 次に、新しいテーブルを作成して、カーブフィットから取得したデータをそれぞれの列に追加します。角周波数、振幅(基準球)、初期時間、振幅(RBC球)、および位相差角の5つの異なる列を定義します。他のすべての周波数についても同じ手順を実行します。
- 次の式を使用して、ストレージ定数(K')と損失定数(K")を求めます。
ここで、κ OTはOT弾性定数、βはストークス抗力係数です。方程式を解析ソフトウェアに転置すると、次のようになります。
そして
ここで、βとκOTは、システムで見つかった値に置き換える必要があります。 - K " のx軸と K' のy軸を使用して、結果をグラフにプロットします(図4)。
- ImageJを使用して正弦波運動中に得られた画像を解析し、時間の経過に伴う各球の重心位置を見つけます。
ここで、m1はξ、m2はf、m0は時間t、m3はt = 0の余弦関数の位相です。 
ここで、m1、m2、および m3 は、参照球のカーブフィットで取得された値です。m4 は ξ' であり、m5 は φ です。
そして
ここで、βとκOTは、システムで見つかった値に置き換える必要があります。6.全体的な細胞フォームファクターを取得するためのDM実験と分析
- ビデオ・アクイジション
- ソフトウェアを使用して圧電ステージをxy方向に動かし、カバーガラスに取り付けられた孤立したセルを検索します。既知の直径のポリスチレン球をトラップしてRBC表面に取り付けます。圧電ステージを使用して、同じくRBC表面に取り付けられているトラップされたビーズをわずかに動かしてセルを変形させ、次にビーズをカバーガラスに取り付けます。
注:OT測定と同じセルを使用することもできます。 - z軸の位置を変更して、フォーカスされた画像を見つけます。フォーカス面は、選択したセルの中央にあります。この画像は、セルの中央のグレーレベルがセルの外側のグレーレベル(背景)に等しいコントラストが小さいことを示しています。
- 位置が固定されたら、カメラソフトを使用して、8bit、256ピクセル×256ピクセルで約5,000枚の画像をフレームレート25fpsでセル全体の動画を作成します。次に、z軸の位置を2μm下または上に移動して、選択したセルの焦点が合っていない画像を取得します。パラメータを繰り返して、この状況のムービーを作成します。
- 最後に、z軸の位置を変更せずに、セルのない領域を検索して同じ手順を繰り返し、画像の背景のムービーを作成します。
- ソフトウェアを使用して圧電ステージをxy方向に動かし、カバーガラスに取り付けられた孤立したセルを検索します。既知の直径のポリスチレン球をトラップしてRBC表面に取り付けます。圧電ステージを使用して、同じくRBC表面に取り付けられているトラップされたビーズをわずかに動かしてセルを変形させ、次にビーズをカバーガラスに取り付けます。
- コントラスト画像取得
- 3つのムービーのそれぞれを3つの平均的な画像に変換します。ImageJを使用して、ムービーの1つを選択し、[ Zプロジェクト>スタック>画像 ]をクリックして、[ 平均強度 ]オプションを選択します。他のムービーに対してこの手順を繰り返して、それぞれの画像を取得します。
- 取得したすべての画像を8ビットから浮動小数点32ビットに変更します。ImageJを使用して、32ビット>画像>タイプをクリックします。次に、[分析]>[測定値の設定]をクリックし、[平均グレー値]オプションを選択します。最後に、[分析>測定]をもう一度クリックします。
- 次に、[ プロセス>画像計算機 ]をクリックして、フォーカスされた画像を背景画像で分割します。この結果に、フォーカス画像のグレーレベルの平均値を掛けます。 [処理>数学]をクリックして平均値を取得し>乗算します。
- 平均値を取得するには、焦点を合わせた画像を選択し、[ 分析>測定]をクリックします。代表的な画像では、グレーレベルの平均値は69,199です。焦点が合っていない画像に対して上記の手順を繰り返します。この場合、グレーレベルの平均値は69,231です。 図5 は、手順の前後で焦点が合った画像と焦点が合っていない画像を示しています。
- 操作中に画像の視覚的なコントラストが失われる場合があります。画像をよりよく視覚化するには、[ 画像]>[明るさ/コントラストの調整]> [ 自動 ]オプションを選択します。
- 次に、画像のコントラストを見つけるには、次の関係を使用します。
ここで、N Img はセルのグレーレベルであり、N0はセル外のグレーレベルであり、カメラに依存するゼロ光強度のグレーレベルに対応する定数パラメータである。 - 値 Bを見つけるには、パワーメーターを使用して光強度を測定します。光の強度の値ごとに、ビデオを録画する必要があります。したがって、異なる強度値を異なるレベルのグレーに関連付けることができます。最後に、線形フィットを取得し、Bをゼロ光強度15に関連付けます。
- N0の値を見つけ、ポリゴン選択アイコンをクリックして、図6のようなポリゴンを描画します。次に、[分析] タブをクリックし、[測定] を選択して、選択した領域の平均グレー レベルを見つけます。各画像はピクセルのセットによって形成され、各ピクセルには特定のグレーレベルがあります。画像を構成するすべてのピクセルによるすべてのグレーレベルのセットは、NImgに対応します。
- コントラスト式を使用してN Img - Noを決定し、処理>数学>減算を選択してこれを実行します。結果をN0 - Bで割ります。最後に、焦点が合った画像(C0)と焦点が合っていない画像(C1)のコントラストを求める。
- 高さプロファイルの取得
- 高さプロファイルを取得するには、すでに説明した方法13を使用します。簡単に言うと、ハートレー変換(FHT)を使用してRBCの厚さを取得します。ImageJ で、[ FFT >プロセス] > [FFT オプション] をクリックし、[FHT] を選択します。
- [プロセス>数学] > [減算] を使用して ImageJ の画像 C0 と C1 を減算し、次の手順 C= C0 - C1 の画像を取得します。
- 画像 C の場合は、[ FFT オプション] > [FFT >処理] をクリックし、[ FHT ] を選択して画像のハートレー変換を実行します。次に、カスタムメイドのプラグインDivideQ2を使用して空間周波数q2 で除算します。 プラグインをクリックして分割Q2>。
注: ファイル DivideQ2.class は、ImageJ がインストールされているプラグイン ディレクトリにコピーする必要があります。プラグインは、ImageJのプラグインフォルダに含まれる.classファイル(補足ファイル1)として提供されています。 - 次に、 FFT>FFT>処理を用いて逆変換FHTを行い、セルの高さに比例したグレーレベルの画像を得る。
- 最後に、[ プロセス>数学]>[乗算 ]をクリックして、次の定数を使用して結果の画像を乗算します。
これは、画像、サンプル、および実験セットアップ13の特性に基づいて定義される。ここで、n=1.51は油屈折率、p=0.0721μmはマイクロメートルと画像の画素との関係、Δn=0.058はRBCと水性媒体屈折率との差、フォーカシング画像とデフォーカス画像の間の距離(Zf1-Zf2)=2μm、画像のサイズ、 N 2 = 256 pxl2。 - 結果の画像を使用して、高さプロファイルを取得します(図7)。結果の画像は、さまざまな高さプロファイルを観察するために ImageJ で使用されます。黄色の垂直線がセル内のどこに配置されているかによって異なりますが、たとえば、 図7 では垂直線によって制限された高さプロファイルが得られ、Ctrl + Kを押してこれを観察します。
- フォームファクター
- 赤血球の高さプロファイルを含む画像を見つけたら、2 μm の焦点の合ったコントラストを使用して、ImageJ で 2 つの画像のセットを作成します。 [画像>スタック]をクリックし、[ スタックする画像]オプションを選択します。フォーム ファクターを見つけるには、ImageJ でカスタマイズされたマクロを使用してスタックを分析します。ImageJ のカスタマイズされたマクロは、 補足ファイル 2 としてダウンロードできます。
メモ: プログラムは、デフォーカス画像を使用してセルの端を決定します。次に、高さプロファイルを含む画像を使用して、水平位置ごとに周囲長を決定します。エッジに加えて、それは周囲と周囲の逆を決定します。逆周長値の合計にピクセルの厚さを掛けたものは、フォーム ファクターの逆数に対応します。 - プログラムにピクセル/マイクロメートルの関係を挿入します。この値は、顕微鏡の対物校正実験から取得します。この例では、値は 13.87 ピクセル/μm です。
- 水平方向の開始位置を選択して、スタックの最初の画像に黄色の線を配置します。セルの先頭の前に線を開始し、セルの垂直方向の制限を超えて描画します。この例では、黄色の線の長さは 153 ピクセルで、初期位置は i = 70、y1 = 80 から i = 70、y2 = 195 の間です。次に、最終位置がf = 245、y1 = 80、f = 245、y2 = 195になるまで黄色の線を水平に移動します。
- 最後に、セルの端、周囲、および周囲の逆を見つけるには、[マクロ]タブを選択し、[マクロの実行]をクリックします。 マクロは、エッジの位置、周囲の周囲と逆、および分析されたセルの画像を含むテーブルを提供します。この画像の端が図 7 の端と似ているかどうかを確認し、そうでない場合は、手順を繰り返します。
- 周囲の逆数の合計を使用して、フォームファクター8を見つけます。
- 赤血球の高さプロファイルを含む画像を見つけたら、2 μm の焦点の合ったコントラストを使用して、ImageJ で 2 つの画像のセットを作成します。 [画像>スタック]をクリックし、[ スタックする画像]オプションを選択します。フォーム ファクターを見つけるには、ImageJ でカスタマイズされたマクロを使用してスタックを分析します。ImageJ のカスタマイズされたマクロは、 補足ファイル 2 としてダウンロードできます。
ここで、N Img はセルのグレーレベルであり、N0はセル外のグレーレベルであり、カメラに依存するゼロ光強度のグレーレベルに対応する定数パラメータである。
7. 軟質ガラスレオロジーモデルと実験解析
- 実験データを表に整理する
- [ ファイル ]タブをクリックして、分析ソフトウェアで新しいテーブルを作成します。次のパラメータに対して10個の異なる列(c0からc9まで)を決定します:使用される角周波数(rad / s):c0;各角周波数について得られた K' (pN/μm)値:c1; ErrK': c2;各角周波数について得られた K" (pN/μm)値:c3; ErrK": c4;各角周波数について得られた G'(Pa)値:c5; エラーG': c6; G" (Pa)各角周波数について得られた値:c7; ErrG": c8 および Ff とそれぞれの誤差: c9 (図 8)。次の数式を使用して、次の列にデータを入力します。
c5 = (3 x c1) / (8 x 1.28 x 0.087)
c6 = (3 / (8 x 0.087 x 1.28)) x sqrt (c2^2 + (c1 x 0.01 / 1.28)^2 + (c1 x 0.008 / 0.087) ^ 2)
c7 = (3 x c3) / (8 x 1.28 x 0.087)
c8 = (3 / (8 x 0.087 x c4)) x sqrt (c4^2 + (c3 x 0.01 / 1.28)^2 + (c3 x 0.008 / 0.087)^2)
- [ ファイル ]タブをクリックして、分析ソフトウェアで新しいテーブルを作成します。次のパラメータに対して10個の異なる列(c0からc9まで)を決定します:使用される角周波数(rad / s):c0;各角周波数について得られた K' (pN/μm)値:c1; ErrK': c2;各角周波数について得られた K" (pN/μm)値:c3; ErrK": c4;各角周波数について得られた G'(Pa)値:c5; エラーG': c6; G" (Pa)各角周波数について得られた値:c7; ErrG": c8 および Ff とそれぞれの誤差: c9 (図 8)。次の数式を使用して、次の列にデータを入力します。
- 曲線 G' (ω) 対 G" (ω) のプロット
- 解析ソフトウェアで曲線G'(ω)対G"(ω)を生成するには、前の表のデータを使用します。[ギャラリー>線形] をクリックし、[散布図] 形式を選択します。
- 新しいウィンドウが開きます。X 軸として G " 列を選択し、Y 軸として G' 列を選択します。最後に、[ プロット ]ボタンをクリックしてグラフを取得します。
- プロットにエラーバーを追加するには、プロットウィンドウをクリックし、プロット>エラーバーをクリックします。 新しいウィンドウが開きます。まず、Y Errオプションをマークします。エラーバー設定と呼ばれる別のウィンドウが開きます。
- [値の%]をクリックし、[データ列]を選択してから、[ErrG']列をクリックします。最後に、[OK]>[プロット]をクリックすると、y値のエラーバーが表示されます。X軸の値に対して同じ手順を繰り返し、Xエラーの正方形とErrGの正しい列を選択します。最終的なプロットは、図9のようになります。
- 柔らかいガラス状レオロジーモデルへのパラメータのフィッティング
注:データ分析は2つの部分に分かれています:1)G'(ω)対G"(ω)プロットをカーブフィッティングして、パラメータΓとGmを取得します。2)カーブフィッティングG'(ω)とG"(ω)を周波数ωの関数として、べき乗則指数αを得る。- G'(ω)対G"(ω)プロットをカーブフィッティングして、パラメータΓとGmを取得します。
- カーブフィットタブをクリックし、フィット1を選択します。新しいウィンドウが開きます。正方形を選択し、[定義]ボタンをクリックします。一般的なカーブフィット定義と呼ばれるウィンドウが表示されます。次の式を入力します。
m1 + m0/m2
ここで、m1 = 61.576;m2 = 1、許容誤差は1 x 10-5です。ここで、m0はG"を表し、m1はGmを表し、m2はΓを表します。
注: m1 と m2 については、カーブフィットの定義中にそれぞれの値を推定する必要があります。上記の推定は、示された実験例に基づいています。実験では、プロットで観察された値に従って数を推定します。 - 両方のウィンドウで [OK ]ボタンをクリックすると、 図10 に示すように、継ぎ手が表示されます-黒い曲線。プロットとともに表示されたカーブフィットテーブルにリストされているm1とm2の正しい値を確認します。
- カーブフィットタブをクリックし、フィット1を選択します。新しいウィンドウが開きます。正方形を選択し、[定義]ボタンをクリックします。一般的なカーブフィット定義と呼ばれるウィンドウが表示されます。次の式を入力します。
- 角周波数ωの関数としてのカーブフィッティングG'およびG"。
- 次に、他の2つのプロット、すなわち、ωの関数としてのG'とωの関数としてのG'を作成します。前に示したように、エラーバーはy軸にのみ配置します。
- カーブフィット手順を繰り返しますが、[ カーブフィットの選択]で [G ]オプションを選択し、[ 一般フィット]>[カーブ定義]で次の式を記述します。
この場合、m1は、ω = 6.3 rad/sのとき、G"(ω)= 23.683 Paの値であると推定されました。m2は0.5と推定されました(m2は指数αであり、0から1の間で変化することに注意してください)。図 10 の m2 の結果に従って、Γ = 2.0293 の値を挿入します。 - [データの重み付け]オプションをマークします。これらすべての手順が終了したら、[OK]をクリックすると、図11のようなカーブフィッティング(青いカーブ)が表示されます。α α = 0.63 ± 0.02 および G 0, G 0 = (3.7 ± 0.3)Pa の値が表示されます。これらの値を使用して、次の曲線 G' (ω) をフィットさせます。
- 次のカーブをクリックし、カーブフィット手順を繰り返しますが、 一般フィットカーブ定義で次の式を記述します。
この場合、m3は、以前に得られた値を確認するためのαの推定値にすぎません。ω = 6.3 rad/s の場合、G 0 = 3.703 および G' (ω) = 23.683 Pa の値を使用します。 - ここでも、許容誤差として1 x 10-5 を追加し、オプションを 重み付けデータとしてマークします。これらすべての手順が終了したら、[ OK]をクリックすると、 図11 のようなカーブフィッティング(緑色のカーブ)が表示されます。
- G'(ω)対G"(ω)プロットをカーブフィッティングして、パラメータΓとGmを取得します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
図1は、レオロジー測定に使用されるOTシステムの概略図を表しています。図2は、両方の球を用いたマイクロレオロジー実験の概略図を示しており、代表的なRBCも示されています。図3は、圧電ステージによって正弦波運動が発生する時間の関数として、両方の球の振幅の典型的な曲線を示しています。基準球(図3-赤い曲線)はステージの移動に追って振動しますが、RBC球(図3-青い曲線)は異なる振幅と位相で振動します。これらのパラメータを測定することにより、サンプル中のさまざまなRBCの複素弾性定数K*(ω)を決定することができます。図4は、損失弾性定数K"(ω)の関数としての貯蔵弾性定数K'(ω)の典型的なプロットを示しています。観察された線形依存性は、RBC表面が柔らかいガラス状材料と見なすことができることを示しています。次に、全体的な細胞形態因子を得るために、Ff、DM手順が必要であり、図5、図6、および図7には、目的に必要なステップのいくつかが含まれる。次に、力と変形を応力とひずみに変換するには、K*(ω)をG*(ω)に変換する必要があります。
複素赤血球弾性定数は、K* (ω) = K' (ω) + iK" (ω) として定義されます。 さらに、K*(ω)は赤血球複素せん断弾性率G*(ω)=G'(ω)+iG"(ω)に関係している。 G' (ω) と G" (ω) は、それぞれ RBC せん断蓄積係数と損失弾性率です。K* (ω) と G* (ω) の関係は次式で与えられます。
ここで、Ffは前述のようにRBC形状に依存するフォームファクタであり、ζはRBC膜の厚さであり、以前はζ = (0.087 ± 0.009)μm 8,15として決定されています。
さらに、貯蔵G'(ω)およびG"(ω)損失せん断弾性率は、式8,9を介して、それぞれ貯蔵K'(ω)および損失K"(ω)弾性定数に関連しています
そして 
G' (ω) と G" (ω)、Err G' と Err G" の標準誤差をそれぞれ求めるには、次の式 8,9 に従って、K' (ω) と K " (ω) の結果を含む不確定方程式の伝播を使用します。
.
軟質ガラス状レオロジー理論によれば、RBCはエマルジョン、ペースト、スラリーなどの粘弾性材料のように振る舞い8,9、それらの貯蔵弾性率と損失弾性率は次の式に従います。
したがって、ここで、Gmは細胞膜せん断弾性率、G0は低周波貯蔵弾性率、
Γは比
、αは軟質ガラスレオロジーモデルのべき乗則指数、ω0 = 1 rad / s 8,9です。
FfおよびRBC表面厚さζについて見出された値を使用した(87 ± 8 nm8,9,15と推定)。結果を図8、図9、および図10に示す。ここでも、G'とG"の間の線形依存性は、RBC表面を柔らかいガラス状材料としてモデル化できるという仮説と一致しています。また、このプロットの線形フィットからGumの値を得ることができ、この値をG"の軟質ガラス状レオロジー曲線フィットに導入することにより、G0とαの値を決定する(図11-青い曲線)。さらに、G0について得られた結果を使用し、それをG'の柔らかいガラス状レオロジー曲線適合に追加した後、指数の同じ値がエラーバー内で導出されます(図11-緑色の曲線)。
図1:OT顕微鏡の概略図。 システム全体は防振テーブル上に構築されています。レーザーは、少なくとも2つの異なるダイクロイックミラー(白色)を使用して位置合わせされ、別のダイクロイックミラー(水色)を使用して顕微鏡対物レンズの後方入口に向けられる。圧電ステージとコンピュータに取り付けられたデジタル科学カメラも必要です。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:マイクロレオロジー実験の概略図。基準球(濃い灰色)はカバーガラスに取り付けられ、RBC球(青)は赤血球表面(赤)に取り付けられ、OTによってトラップされます(レーザーがオンのときは桃の三角形で示されます)。ρはトラップ内のRBC球の平衡位置です。ξはサンプルの正弦波運動、xはセルの変形です。概略図はBiorenderで作成されました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:圧電ステージによって正弦波運動が発生するときの時間経過に伴う両方の球の振幅(μm)を示すプロット。 基準球(赤い曲線)はステージの動きに追って振動し、RBC球(青い曲線)は異なる振幅と位相で振動します。右側の緑色の矢印はデータ選択ツールを示し、黄色の矢印はズーム選択ツールを示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:RBCマイクロレオロジーの結果。 弾性定数を、サンプル内の異なる赤血球の損失弾性定数の関数として格納します(n = 3つの異なるサンプルからの10個の異なるセル)。データポイントは、実験セットアップで使用された各角周波数について得られた 、K' (y軸)と K" (x軸)の両方の平均値を、それぞれのエラーバー(平均の標準誤差)とともに表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:赤血球に適用されたDM 。 (A)焦点が合っていない画像、サイズ= 2μm。 (B)焦点が合っている画像。(C)背景画像。各画像(A)及び(B)を背景画像(C)で除算し、次いで各画像の平均階調値を乗じて、画像(D)及び(E)を得ることができる。スケールバー:5 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:背景グレーレベル N0。 ImageJ(A)で代表画像を開いた後、背景グレーレベルの平均値と結果(B)を取得するために使用する領域(RBCセルの周りの黄色の幾何学的図形)を選択します。Aで黄色の選択を実行するには、画像Jのポリゴン選択ツール(緑色の矢印で表示)を使用します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図7:変形したRBCの高さプロファイル。 画像(右)の黄色の垂直線に沿って表された高さプロファイル(左)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図8:解析ソフトウェアにおける典型的な結果表の代表的なスクリーンショット。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図9:RBC粘弾性パラメータ。 サンプル内の異なる赤血球の損失せん断弾性率の関数としてせん断弾性率を保存します(n = 3つの異なるサンプルからの10個の異なるセル)。データポイントは、 G' (y軸)と G" (x軸)の両方の平均値を表し、実験で使用された各角周波数について得られたそれぞれの誤差バー(平均の標準誤差)を示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図10:G"(Pa)の関数としてのG'(Pa)のカーブフィット。黒い線の線は、データポイントのカーブフィットです。N = 3つの異なるサンプルからの10個の異なる細胞。エラーバーは平均の標準誤差を表します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図11:軟質ガラス状レオロジーモデルを結果に調整する。サンプル内のさまざまなRBCの角周波数ωの関数としての複素せん断弾性率(G*)。プロットの緑色の円はG'の平均値を表し、青い円はG"の平均値を表し、それぞれのエラーバーとともにプロットされます。緑と青の連続線は、軟質ガラス状レオロジーモデルのカーブフィッティングを表します。パラメータm 1、m 2およびm3をプロットに示す。m1はG0であるが、m2およびm3は指数であり、N=3つの異なる試料からの10個の異なる細胞α。 エラーバーは平均の標準誤差を表します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足ファイル1: ImageJプラグインディバイドQ2.class。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル2: ImageJ は、フォーム ファクターを取得するためにマクロをカスタマイズしました。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
このプロトコルでは、赤血球の粘弾性特性を定量的にマッピングするために、光ピンセットとデフォーカス顕微鏡に基づく統合方法が提示されます。 貯蔵および損失せん断弾性率の結果は、RBCの柔らかいガラス状レオロジーを特徴付けるスケーリング指数とともに決定される。生理学的状況8 または 熱帯熱マラリア原虫 赤血球内サイクル9 の各段階に沿ったような異なる実験条件に対するこのプロトコルの適用は既に実施されている。
文献の参考文献は、RBCレオロジーの不一致を指摘しており、部分的には測定中に適切に考慮されていない細胞形態の変化に起因しています6,7。動的光散乱を用いて、RBC貯蔵および損失弾性率の値は、1〜100Hzの周波数範囲で、0.01〜1Paの範囲で報告された6。別の研究では、光磁気ツイストサイトメトリーを使用して、見かけの複素弾性率が決定されました7が、動的光散乱値から分岐しました。したがって、比較目的で84の乗法係数を使用しました。本プロトコルに記載される手順に従い、これらの相違は、非侵襲的デフォーカス顕微鏡技術を用いてRBCフォームファクタを特徴付けることによって明らかにされた81、12、13。細胞表面を特徴付ける複素せん断弾性率は、形状が16,17と見なされ、これが常に適切に実行されたとは限らない場合にのみ得られます。
このプロトコルで提示された統合方法論により、同じ単一細胞に対して両方の方法(OT測定とDM測定)を次々に実行できます。また、集団内の異なる細胞に対してOT測定を実行し、次に同じ細胞集団内の他の細胞に対してDM測定を実行することもできます。最後のオプションは、おそらく両方の結果により多くの変動性をもたらしますが、結果が特定の実験条件に対応する特定の細胞集団における全体的なRBC形態と全体的なRBC粘弾性特性を相関させるような方法で、それに応じて誤差を伝播することができます。
このプロトコルを実行するための主な制限は、光ピンセットとデフォーカス顕微鏡の統合であるため、メソッド自体を実行することの本質的な困難さです。したがって、説明されているすべてのステップを実行するための機器の可用性は困難な場合があります。ただし、OT施設にアクセスできる場合は、最終的に施設を実験を実行するように適応させる方がはるかに実現可能です。これが現在のプロトコルが適合する場所であり、測定と分析を実行するためのすべてのステップを詳述するだけでなく、セットアップを最初から作成するのではなく、人々がこれらのOTシステムを特定して採用するのを支援します。
また、カバーガラスへの赤血球の付着は非接着細胞であり、一部の赤血球が剥離する可能性があるため、このようなステップは測定に困難をもたらす可能性があるため、制限要因になります。したがって、十分に接着されたRBCを選択することが重要です。選択が成功したかどうかを確認する1つの方法は、測定用のサンプルを準備するときに発生する可能性があります。OTトラップされたRBC球を細胞表面に配置した後、サンプルをわずかに動かして、細胞がしっかりと固定され、OTトラップされたビーズに追従して位置が変化していないことを確認します。その場合は、サンプル内の別のセルを探します。デュアルビームOTを使用してRBCを同時にトラップし、レオロジー測定を同時に実行するなどの将来の改善も可能です。
それとは別に、赤血球の単一細胞ベースの定量的粘弾性情報を抽出する可能性は、探求され始めたばかりのさまざまなアプリケーションを可能にします8,9。したがって、提示された方法は、鉄欠乏性貧血および糖尿病のような他の生理学的病理学的条件下で、または例えば鎌状赤血球症およびサラセミアのような遺伝性血液疾患におけるRBC機械的挙動の特性評価に拡張することができる。そのような統合されたツールは、RBC粘弾性特性の変化を異なる病状を有する個体の血流の変化と相関させることができる新規診断方法の開発の基礎を提供し得る。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者は、この原稿に記載されている製品に金銭的利害関係を持たず、他に開示するものはありません。
Acknowledgments
著者らは、CENABIOの高度な顕微鏡施設のすべてのメンバーに、すべての重要な支援に感謝したいと思います。この作業は、ブラジルの機関であるコンセリョ・ナシオナル・デ・デセンボルビメント・シエンティフィコ・エ・テクノロジコ(CNPq)、COORDENAÇÃO de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) - Financial Code 001、Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ)、Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Fluidos Complexos(INCT-FCx)とFundação de Amparo de Pesquisa do Estado de São Paulo(FAPESP)の支援を受けました。B.P.はFAPERJからのJCNE助成金によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35mm culture dishes | Corning | 430165 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Coverslips | Knittel Glass | VD12460Y1A.01 and VD12432Y1A.01 | |
| Glass-bottom dishes | MatTek Life Sciences | P35G-0-10-C | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Immersion oil | Nikon | MXA22165 | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TE300 | |
| KaleidaGraph | Synergy Software | https://www.synergy.com/ | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Microscope camera | Hamamatsu | C11440-10C | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Neubauer chamber | Sigma-Aldrich | BR717805-1EA | |
| Objective lens | Nikon | PLAN APO 100X 1.4 NA DIC H; PLAN APO 60x 1.4 NA DIC H and Plan APO 10x XXNA PH2 | |
| Optical table | Thorlabs | T1020CK | |
| OT laser | IPG Photonics | YLR-5-1064-LP | |
| Polystyrene microspheres | Polysciences | 17134-15 | |
| rubber ring | Forever Seals | NBR O-Ring | |
| Silicone grease | Dow Corning | Z273554 | |
| Stage positioning | PI | P-545.3R8S | |
| Pipette | Gilson | P1000 |
References
- Fowler, V. M. The human erythrocyte plasma membrane: a Rosetta Stone for decoding membrane-cytoskeleton structure. Current Topics in Membranes. 72, 39-88 (2013).
- Tomaiuolo, G. Biomechanical properties of red blood cells in health and disease towards microfluidics. Biomicrofluidics. 8 (5), 051501 (2014).
- Depond, M., Henry, B., Buffet, P., Ndour, P. A. Methods to investigate the deformability of RBC during malaria. Frontiers in Physiology. 10, 1613 (2019).
- Boal, D. Mechanics of the Cell. 2 edn. , Cambridge University Press. (2012).
- Balland, M., et al. Power laws in microrheology experiments on living cells: Comparative analysis and modeling. Physical Review E. 74 (2), 021911 (2006).
- Amin, M. S., et al. Microrheology of red blood cell membranes using dynamic scattering microscopy. Optics Express. 15 (25), 17001-17009 (2007).
- Puig-de-Morales-Marinkovic, M., Turner, K. T., Butler, J. P., Fredberg, J. J., Suresh, S. Viscoelasticity of the human red blood cell. American Journal of Physiology Cell Physiology. 293 (2), 597-605 (2007).
- Gomez, F., et al. Effect of cell geometry in the evaluation of erythrocyte viscoelastic properties. Physical Review E. 101 (6-1), 062403 (2020).
- Gomez, F., et al. Plasmodium falciparum maturation across the intra-erythrocytic cycle shifts the soft glassy viscoelastic properties of red blood cells from a liquid-like towards a solid-like behavior. Experimental Cell Research. 397 (2), 112370 (2020).
- Pompeu, P., et al. Protocol to measure the membrane tension and bending modulus of cells using optical tweezers and scanning electron microscopy. STAR Protocols. 2 (1), 100283 (2021).
- Agero, U., Mesquita, L. G., Neves, B. R., Gazzinelli, R. T., Mesquita, O. N.
- Agero, U., Monken, C. H., Ropert, C., Gazzinelli, R. T., Mesquita, O. N. Cell surface fluctuations studied with defocusing microscopy. Physical Review E. 67 (5), 051904 (2003).
- Roma, P. M. S., Siman, L., Amaral, F. T., Agero, U., Mesquita, O. N. Total three-dimensional imaging of phase objects using defocusing microscopy: Application to red blood cells. Applied Physics Letters. 104 (25), 251107 (2014).
- Köhler, A. New method of illumination for photomicrographical purposes. Journal of the Royal Microscopical Society. 14, 261-262 (1894).
- Nans, A., Mohandas, N., Stokes, D. L. Native ultrastructure of the red cell cytoskeleton by cryo-electron tomography. Biophysical Journal. 101 (10), 2341-2350 (2011).
- Ayala, Y. A., et al. Rheological properties of cells measured by optical tweezers. BMC Biophysics. 9, 5 (2016).
- Ayala, Y. A., et al. Effects of cytoskeletal drugs on actin cortex elasticity. Experimental Cell Research. 351 (2), 173-181 (2017).
