Summary
Denne artikkelen presenterer integrasjonen av en spektralfokuseringsmodul og en dual-output pulslaser, som muliggjør rask hyperspektral avbildning av gull nanopartikler og kreftceller. Dette arbeidet tar sikte på å demonstrere detaljene i multimodale ikke-lineære optiske teknikker på et standard laserskanningsmikroskop.
Abstract
Sondering av gull nanopartikler (AuNPs) i levende systemer er viktig for å avsløre samspillet mellom AuNPs og biologiske vev. Videre, ved å integrere ikke-lineære optiske signaler som stimulert Raman-spredning (SRS), to-foton eksitert fluorescens (TPEF) og forbigående absorpsjon (TA) i en bildeplattform, kan den brukes til å avsløre biomolekylær kontrast av cellulære strukturer og AuNPs på en multimodal måte. Denne artikkelen presenterer en multimodal ikke-lineær optisk mikroskopi og bruker den til å utføre kjemisk spesifikk avbildning av AuNPs i kreftceller. Denne bildebehandlingsplattformen gir en ny tilnærming for å utvikle mer effektive funksjonaliserte AuNPs og avgjøre om de er innenfor vaskulaturer som omgir svulsten, pericellulære eller cellulære rom.
Introduction
Gull nanopartikler (AuNPs) har vist stort potensial som biokompatible bildebehandlingsprober, for eksempel som effektive overflateforbedrede Raman-spektroskopi (SERS) substrater i ulike biomedisinske applikasjoner. Store applikasjoner inkluderer felt som biosensing, bioimaging, overflateforbedrede spektroskopier og fototermisk terapi for kreftbehandling1. Videre er sondering av AuNPs i levende systemer avgjørende for å vurdere og forstå samspillet mellom AuNPs og biologiske systemer. Det finnes ulike analytiske teknikker, inkludert Fourier transform infrared (FTIR) spektroskopi2, laserablasjon induktivt koblet massespektrometri (LA-ICP-MS) 3, og magnetisk resonansavbildning (MR) 4 som har blitt brukt til å undersøke fordelingen av AuNPs i vev. Likevel lider disse metodene av flere ulemper, for eksempel å være tidkrevende og involvere kompleks prøvepreparering3, som krever lange anskaffelsestider, eller mangelen på sub-mikron romlig oppløsning 2,4.
Sammenlignet med konvensjonelle bildebehandlingsteknikker, gir ikke-lineær optisk mikroskopi flere fordeler for sondering av levende celler og AuNPs: Den ikke-lineære optiske mikroskopien oppnår dypere bildedybde og gir egen 3D optisk seksjoneringskapasitet ved bruk av nær-IR ultrafaste lasere. Med den betydelige forbedringen av bildehastighet og deteksjonsfølsomhet har to-foton eksitert fluorescens (TPEF) 5,6,7 og andre harmoniske generasjon (SHG) 8,9,10 mikroskopi vist seg å ytterligere forbedre ikke-invasiv avbildning av endogene biomolekyler i levende celler og vev. Videre er det mulig å utlede etikettfri biokjemisk kontrast av cellulære strukturer og AuNP-er ved å bruke nye ikke-lineære optiske teknikker som forbigående absorpsjon (TA)11,12,13,14 og stimulert Raman-spredning (SRS)15,16,17,18. Visualisering av AuNPs uten bruk av ekstrinsiske etiketter er av stor betydning siden kjemiske forstyrrelser av nanopartiklene vil endre deres fysiske egenskaper og dermed deres opptak i celler.
Denne protokollen presenterer implementeringen av en Spectral Focusing Timing and Recombination Unit (SF-TRU) modul for en dual-bølgelengde pulslaser, noe som muliggjør rask multimodal avbildning av AuNPs og kreftceller. Dette arbeidet tar sikte på å demonstrere detaljene i integrerte TPEF-, TA- og SRS-teknikker på et laserskanningsmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Slå på lasersystemet
- Slå på låsesystemet og velg armlaser før du starter systemet.
- Slå på PC-en med programvaren for å kontrollere femtosekundlaseren med dobbel utgang.
- Last inn programvaren for femtosekundlaseren med dobbel utgang; Denne programvaren gjør det mulig å slå laseren på og av og styrer bølgelengden til pumpestrålen direkte.
- Slå på laserutslippet ved å holde nede på strømikonet for en telling på 3.
- Vent til laseren har varmet opp og det laserklare lyset lyser grønt i programvaren.
- Bølgelengden til pumpestrålen styres direkte gjennom programvaren; Dette kan variere fra 680-1,300 NM. For cellulær avbildning i C-H Raman vibrasjonsområde, velg 802 nm.
- Åpne skodder på den justerbare pumpestrålen og 1,045 nm Stokes-strålen ved å holde nede på blenderbildene i 3 s.
FORSIKTIG: Laser sikkerhetsveiledning Femtosekundlaseren med dobbel utgang er en klasse IV infrarød pulslaser og kan forårsake permanent skade på synet. Derfor må alle lokale regler for lasersikkerhet følges under utførelsen av denne prosedyren: (i) Bare autoriserte brukere som har mottatt lasersikkerhetsopplæring kan utføre prosedyren. (ii) Inngang til laboratoriet er via sveipekorttilgang med en lås på romdøren. (iii) For det meste av operasjonen er laserstrålene helt lukket. (iv) Når laserstrålen eksponeres, må laserbeskyttelsesbriller brukes (bruk LG9 lasersikkerhetsbriller, som gir OD 7+ blokkering av både pumpen og Stokes-strålene).
2. Slå på Spectral Focusing Timing and Recombination Unit (SF-TRU)
- Last inn ATM-programvaren på samme PC med laserprogramvaren, som styrer forsinkelsestrinnene og laserdemperne i SF-TRU-enheten.
MERK: Denne enheten er ansvarlig for å sørge for at pumpen og Stokes-bjelkene overlappes romlig, kontrollere spredningen i pumpen og Stokes-bjelkene, og kontrollere tidsforsinkelsen mellom pumpen og Stokes-bjelkene. Polariseringen av både pumpe- og Stokes-bjelker er vertikal. Merk at hver stråle er utstyrt med en halvbølgeplate for uavhengig å kontrollere polarisasjoner før du går ut av SF-TRU. - Sørg for at både pumpen og Stokes-laserne er dempet til <10 % (pumpe) og <15 % (Stokes-stråler). Hvis strålene ikke dempes, kan lasereffekten forårsake skade på systemet og vil brenne biologiske prøver.
- For cellulær avbildning, sett de optimale laserinnstillingene til 6% (pumpe) og 10% (Stokes), tilsvarende 12 mW og 30 mW ved prøven.
- SF-TRU har to innstillinger: femtosekundmodus (fs) og picosekundmodus (ps).
- For fs-modus, trykk inn knottene på hver side av boksen (dette fjerner spredningsgitterene fra strålebanen).
- For ps-modus, trekk ut knottene på hver side av boksen (dette plasserer spredningsgitterene i strålebanen).
- For hyperspektral avbildning, velg ps-modus.
- Forsikre deg om at forsinkelsestrinnet er i riktig posisjon for at pumpen og Stokes-bjelkene skal overlappes midlertidig for C-H-avbildning på dette systemet.
- Forsikre deg om at spredningsinnstillingene til pumpen og Stokes-strålen er riktige; for en 802 nm pumpe er dette 5 mm for pumpebjelken og 30 mm for Stokes-bjelken.
3. Modulering av Stokes-strålen for SRS-avbildning
- For SRS-deteksjon, moduler intensiteten til Stokes-strålen.
- Slå på signalgeneratoren for strålemodulasjonen.
- Husk tidligere innstillinger, som er som følger:
UTGANG 1: Kvadratbølge: Frekvens = 19,5 MHz, Amplitude = 1,4 V.
UTGANG 2: Firkantbølge: Frekvens = 19,5 MHz, Amplitude = 300 mV. - Slå på utgang 1 og 2.
- Koble utgang 1 til en forsterker for EOM i SF-TRU-boksen via en BNC-kabel.
- Koble utgang 2 til låseforsterkeren som brukes til SRS-deteksjon via en BNC-kabel.
- Slå på strømforsyningen til forsterkeren på portalen.
4. Slå på innlåsingsforsterkeren
- For SRS-avbildning, bruk SRS-deteksjonsmodulen som består av en fotodiode med stort område og en spesialbygd innlåsingsforsterker.
- Slå på strømforsyningen til den låste forsterkeren på portalen.
- Last inn programvaren for den innebygde forsterkeren "SRS detection Module" på PCen.
- I programvaren velger du følgende innstillinger: Phase = 0°, Offset = -80 mW, Gain = 58 dB.
- Velg tidskonstanten for innlåsingsforsterkeren i programvaren: for celleavbildning gir tidskonstanten på 2 μs bilder av god kvalitet.
5. Drift på laserskanningsmikroskopet
- Slå på pluggene til alt utstyret unntatt fjernkontrollboksen. Vent til standby lyser på kontrollboksen på toppen av portalen.
- Slå på fjernkontrollboksen på portalen og slå på baksiden av boksen. Vent til fjernlyset blir blått (på kontrollboksen), og trykk på Start operasjon.
- Slå på PCen til laserskanningsmikroskopet.
- Kjør programvaren for konfokalmikroskop.
- Kontroller mikroskopets lysbane via dataprogramvaren.
MERK: Noen modifikasjoner er gjort i mikroskopet for å gjøre det egnet for SRS-avbildning: (i) I strålebanen er det lagt til et 775 nm kortpass til filterhjulet der laserstrålene kommer inn i skanneenheten, dette kan velges i Lightpath-fanen i dataprogramvaren. (ii) I stedet for å bruke konfokalmikroskopets innebygde PMT-er for deteksjon, er det lagt til en skreddersydd detektor til den overførte lysbanen, som tillater både SRS- og CARS-deteksjon. (iii) Utgangene fra disse detektorene er koblet til den analoge boksen på portalen. CARS-signalet fra PMT kobles via en BNC-kabel til CD1, og SRS-signal fra innlåsingsforsterkeren kobles til CD2 via en BNC-kabel. - Kontroller fokus gjennom berøringsskjermen eller fjernkontrollknappene eller dataprogramvaren.
- Velg de ønskede bildeinnstillingene i programvaren; Dette inkluderer zoom, bildestørrelsen i piksler og pikseloppholdstid.
- Kontroller at bildehastigheten (pikseloppholdstiden) er høyere enn integreringstiden som er angitt i programvaren for innlåsingsforsterker.
MERK: ET NA 1.2 vann nedsenkningsmål ble brukt til avbildning.
6. Montering av en prøve i mikroskopstadiet
- Forbered celleprøvene for avbildning som følger.
- Kultur 4T1 mus brystkarsinom celler i RPMI-1640 supplert med 10% Fetal Bovine Serum (FBS). Bytt medium hver 2. dag og passasje cellene ved 70% -80% sammenløp.
MERK: Avsnitt 8-10 ble brukt i løpet av eksperimentene beskrevet her. - For avbildningseksperimenter, inkuberer 1 x 10 5 celler på firkantede deksler i 24 timer ved 37 ° C,5 % CO2. Vask deretter cellene med forvarmet fosfatbufret saltvann (PBS) og inkuber med gull nanopartikler (1:100 fortynning i cellekulturmedium, lagerkonsentrasjon: 2,3 x 10 10 partikler / ml, diameter:60 nm) i 4 timer.
- Før avbildning, vask cellene med iskald PBS og fest dem med 4% paraformaldehyd i PBS i 15 minutter ved romtemperatur (RT). Vask cellene med PBS 3x, og monter deretter mellom to deksler for avbildning.
- Kultur 4T1 mus brystkarsinom celler i RPMI-1640 supplert med 10% Fetal Bovine Serum (FBS). Bytt medium hver 2. dag og passasje cellene ved 70% -80% sammenløp.
- Plasser en dråpe destillert vann på toppen av vannet nedsenking mål som fokuserer laserstrålene inn i prøven mellom målet og prøven. Plasser deretter prøven på mikroskopstadiet.
- En kondensator med NA 1.4 samler det fremre forplantede lyset. Påfør en dråpe vann mellom kondensatoren og prøven for avbildning. Juster kondensatorens høyde til ca. 1 mm over prøven for å samle opp maksimal mengde lys.
- SRS-detektoren er på et bevegelig feste, som gjør at den kan skyves inn og ut fra samlingens optiske vei. For å fokusere på prøven ved hjelp av hvitt lys, flytt SRS-detektoren ut av strålebanen.
- Plasser detektoren tilbake i strålebanen, klar for SRS-avbildning.
7. Endre Raman-skiftet og samle en hyperspektral datastabel
MERK: Raman-skiftet der avbildningen finner sted, er avhengig av forsinkelsestrinnposisjonen i SF-TRU-boksen og bølgelengden til pumpestrålen fra lasersystemet.
- For store endringer i Raman-skiftet, endre laserbølgelengden. For eksempel, for avbildning av CH-vibrasjoner mellom 2,800–3,100 cm-1, velg 802 nm, mens for avbildning rundt 1,600 cm-1 for den amide I-toppen , velg pumpestrålen ved 898 nm. Juster dette via programvaren.
- For å oppnå små justeringer i Raman-skiftet, skann forsinkelsestrinnet i SF-TRU-enheten.
- SF-TRU gir forsinkelsestrinnposisjoner i millimeter (mm). For å konvertere forsinkelsestrinnposisjonen fra mm til cm-1, utfør kalibreringshyperspektral skanning ved hjelp av en prøve av polystyrenperler og sammenlign toppposisjonene som ble funnet i kalibreringsskanningen med de som ble tatt på et spontant Raman-oppsett. Dette vil gi en lineær ligning, som konverterer forsinkelsestrinnposisjonen i mm til Raman-skift i cm-1.
- For å generere en hyperspektral skanning, ta en tidsserie med bilder på forskjellige forsinkelsestrinnposisjoner.
- For å synkronisere bildeinnhenting og bevegelse av forsinkelsestrinnet, bruk den analoge enheten til å sende og motta TTL-signaler til og fra SF-TRU-systemet.
MERK: For å gjøre dette har den analoge boksen følgende tilkoblinger: (i) TRIG OUT VD1 - dette er koblet til SF-TRU via en BNC og sender et TTL-signal for å fortelle forsinkelsestrinnet å flytte +1 trinn. (ii) TRIG I 1 - her mottas et signal via BNC når forsinkelsestrinnet er ferdig med bevegelsen, og dette brukes til å utløse neste bilde i tidsserien. - For det hyperspektrale datasettet velger du følgende innstillinger i programvaren for konfokalmikroskop:
- I kategorien Utløser velger du Start etter TTL-utløser (PÅ) og Utløser (hver delbilde).
- I kategorien Serie angir du tidsserien PÅ og z-serien AV.
- Angi antall bilder i tidsserien slik at det samsvarer med antall trinn i ATM-programvaren (101 trinn brukes her).
- I ATM-programvaren går du til Kjør-fanen .
- Still forsinkelsestrinnposisjonene i millimeter for start og stopp av hyperspektral skanning. For CH høybølgetallsområde, bruk startposisjonen = 90,25 mm og stoppposisjonen = 92,25 mm.
- Forsikre deg om at antall trinn samsvarer med antall bilder i programvaren for konfokalmikroskop.
- Etter å ha sjekket de riktige innstillingene, start hyperspektralstakken i den konfokale mikroskopprogramvaren først. Gå til Erverv og klikk på Start skanning. Deretter klikker du på Start i minibankprogramvaren. Dette initierer samlingen av en serie bilder, med inkrementelle økninger i forsinkelsestrinnposisjonen mellom de valgte start- og stoppposisjonene.
- Eksporter den hyperspektrale bildeserien som en .tif-fil med flere bilder, og bruk en passende programvarepakke for å utføre kalibreringen.
- Når kalibreringen er fullført, bruker du den lineære kalibreringsligningen til å konvertere forsinkelsestrinnposisjonen til Raman-skiftene.
- For å bytte mellom avbildning i CH-vibrasjonsområdet (2,800-3,100 cm-1) til amid I-vibrasjonsområdet 1,500-1,700 cm-1), gjør du følgende.
- Endre pumpebølgelengden i laserprogramvaren fra 802 nm til 898 nm.
- Endre Stokes-spredningsinnstillingen i minibankprogramvaren fra 30 mm til 5 mm.
- Gjør en liten justering av speilet i pumpestrålespredningsveien inne i SF-TRU-boksen. Dette gjøres ved å justere den nedre knappen på speilfestet, som endrer speilvinkelen med en inkrementell mengde.
- Når du utfører en hyperspektral skanning over amid I-regionen, setter du start- og stoppposisjonene i minibankprogramvaren til henholdsvis 89 og 91 mm
FORSIKTIG: Laserbeskyttelsesbriller må brukes for dette trinnet, da laserstrålen vil bli utsatt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Spectral Focusing Timing and Recombination Unit (SF-TRU)-modulen introduseres mellom femtosekundlaseren med dobbel utgang og det modifiserte laserskanningsmikroskopet. Det justerbare ultraraske lasersystemet som brukes i denne studien har to utgangsporter som leverer en stråle ved en fast 1,045 nm bølgelengde og den andre strålen som er justerbar i området 680-1,300 nm. Et detaljert skjema av SF-TRU-modulen og multimodal bildebehandlingsplattform er avbildet i figur 1. SF-TRU brukes til å kvitre to femtosekund laserstråler til picosekundpulser og overlapper to bjelker romlig og temporalt. Hyperspektral stimulert Raman-spredning (SRS) -avbildning utføres ved å skanne forsinkelsen mellom picosekundpumpen og Stokes-pulser.
Alle prøvene er opplyst av pulserende lasere gjennom en høy numerisk blenderåpning (NA) mål på en modifisert invertert mikroskop. SRS- og TPEF-signalene samles i fremoverretningen med en høy NA-kondensator. For SRS-mikroskopi brukes de justerbare (680-1,300 nm) og faste (1,045 nm) laserutgangene som henholdsvis pumpe og Stokes-bjelker. Kombinasjonen av en fotodiode med stort område og innelåsingsforsterker brukes til å utføre SRS-avbildning, mens Stokes-strålen er blokkert med to filtre (890/210 båndpass og 950 nm kortpassfiltre). En viktig fordel med den spektralfokuserte SRS-tilnærmingen over de picosekund laserbaserte systemene er muligheten til å justere Raman-skiftet av interesse ved ganske enkelt å kontrollere tidsforsinkelsen mellom den kvitrende pumpen og Stokes-pulser. Denne tilnærmingen tillater rask sondering av Raman-skift innenfor et område på flere hundre bølgetall uten å bytte pumpe og Stokes-bølgelengder, noe som gir mye raskere hyperspektral avbildning.
For å validere ytelsen til spektral oppløsning og kjemisk selektivitet, avbildes prøven av polystyren (PS) mikrosfærer først (figur 2). Laserkreftene ved prøven (etter 60x NA 1.2 vanndypningsmål) er 10 mW for 1,045 nm Stokes-strålen og 20 mW for 802 nm pumpestrålen. SRS-spekteret kan trekkes ut ved hver piksel i rammene. Figur 2B viser det hyperspektrale SRS-spekteret av PS-perler. Til sammenligning er det spontane Raman-spekteret av PS-perler vist i figur 2A. SRS- og spontane Raman-spektra av PS-mikrosfærer er nesten identiske bortsett fra relative intensitetsforskjeller på sidene. Disse spektroskopiske målingene tillater konvertering av optisk forsinkelseslinjetrinn (mm) til Raman-bølgetall (cm-1) for SRS-avbildning.
Siden Raman-spektrene til store biomolekyler i karbon-hydrogen-strekkvibrasjonsbåndet ligger i området 2,800-3,050 cm-1, utføres SRS-avbildningen av 4T1 kreftceller ved 2,852 cm-1 (lipid), 2,930 cm-1 (protein), 2,968 cm-1 (DNA) og overleggsbildene som vist i figur 3. SRS-bilder av forskjellige Raman-bånd er anskaffet med en pikseloppholdstid på 4 μs ved en rammestørrelse på 512 x 512 piksler.
Endelig har denne metoden videre utvidet til multimodal avbildning av 4T1 kreftceller dosert med gull nanopartikler (AuNPs), slik at vi kan avbilde AuNPs fordelinger i kreftceller mer presist. De ervervede SRS-bildene (CH2- ogCH3-kanaler), TPEF (LysoTracker-fluorescerende sonder) og TA-bilder (off-resonans SRS-kanal) er avbildet i figur 4.
Figur 1: Skjematisk av den hyperspektrale multimodale bildeplattformen. Illustrasjon av multimodal ikke-lineær optisk mikroskopi. DM, dikroisk speil; DS, forsinkelse scenen; EOM, elektrooptisk modulator; FG, funksjon generator; FL, filter; G, gitter; LIA, innlåsingsforsterker; M, speil; OBJ, mål; PD, fotodiode; PMT, fotomultiplikator rør; SF-TRU, spektral fokuseringstiming og rekombinasjonsenhet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Spektra av polystyren (PS) mikrosfærer. Det spontane (A) Raman-spekteret av PS-mikrosfærer viser god samsvar med (B) hyperspektralt SRS-spektrum. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Spektroskopisk SRS-avbildning av 4T1 kreftceller. SRS-bilder ved 2 852 cm−1, 2 930 cm−1, 2 968 cm−1 og overleggsbilde. Skala bar: 10 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Multimodal avbildning av gull nanopartikler opptak av 4T1 kreftceller. Hyperspektrale SRS-bilder ved 2 852 cm−1 (CH2), 2 928 cm−1 (CH3), 3 080 cm−1 (off-resonans, bare TA-signal igjen), TPEF og overleggsbilde. Skala bar: 10 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne studien har presentert kombinasjonen av SF-TRU-modul og ultrafast dual-output lasersystem demonstrerte sine applikasjoner for multimodal mikrospektroskopi. Med sin evne til å undersøke gull nanopartikler '(AuNPs) opptak av kreftceller, kan den multimodale bildebehandlingsplattformen visualisere cellulære responser på hypertermiske kreftbehandlinger når laserstråler absorberes av AuNPs.
Videre oppnås rask kjemisk spesifikk avbildning og høy spektral oppløsning ved å bruke spektralfokuseringsteknikken, ved hjelp av to sett med gitterpar for å kontrollere kvitringene i hver laserstråle. Sammenlignet med bruken av glassstenger med fast lengde for kvitring, gjør gitterpar det mulig å matche spektraloppløsningen og linjebreddene til Raman-linjeneav interesse 19.
Videre kan dette systemet enkelt byttes fra femtosekund til kvitret picosekundregimer ved å bruke spesialdesignede manuelle glidebrytere for å fjerne gitterene fra strålebanene uten å påvirke justeringen inne i mikroskopet. For å oppnå høy følsomhet og spektral oppløsning, implementeres SRS vanligvis ved hjelp av smalbånds picosekundpumpen og Stokes-pulser. Picosekundlasere er imidlertid ikke tilstrekkelige for multifotoneksitasjon som krever høyere toppeffektnivåer, som er oppnåelige med femtosekundlasere. De multimodale egenskapene tillater bruk av metoden for en rekke applikasjoner som multiphoton imaging20, sammenhengende Raman-spredning21 og pumpesondespektroskopi.
Det er flere strategier som kan brukes til å forbedre ytelsen til den demonstrerte enheten ytterligere. For eksempel tilbyr et raskere motorisert forsinkelseslinjestadium og datainnsamlingsprogramvare en høyere bildefrekvens, noe som kan øke gjennomstrømningen til den multimodale bildebehandlingsplattformen. I tillegg dekket det nåværende oppsettet ~300 cm−1 spektralområde med en spektraloppløsning på opptil 5 cm−1. For ytterligere å forstørre spektralområdet, har et modifisert lasersystem med en bredere spektral båndbredde blitt brukt for hyperspektral SRS-mikroskopi22.
Samlet gir denne multimodale og ikke-invasive bildebehandlingsplattformen ny innsikt i nanomedisin og åpner en ny vei til multimodal molekylær avbildning av celler, biologisk vev og nanopartikler23,24,25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av EPSRC Grants: Raman Nanotheranostics (EP / R020965 / 1) og CONTRAST facility (EP / S009957 / 1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APE SRS Detection Unit | APE (Angewandte Physik & Elektronik GmbH) | APE Lock-in Module | Combined system containing a large area Si photo-diode for detecting the pump beam along with a Lock-In amplifier for detecting the beam modulations |
| Confocal Scanning Unit | Olympus | FV 3000 | Confocal scanning unit used for imaging |
| CML Latex Beads, 4% w/v, 1.0 µm | Invitrogen | C37483 | Polystyrene microspheres |
| Coverslips | Thorlabs | CG15CH2 | 22 mm x 22 mm coverslips for seeding cells |
| FBS | Gibco | 10500-064 | Foetal Bovine Serum (Heat Inactivated) |
| Flouview | Olympus | FV31S-SW | Laser scanning microscope control software |
| Function Generator | BX precision | 40543 | Used to generate square wave function which is fed to EOM in SF-TRU to produce modulations in the stokes beam |
| Gold Nanoparticles | Nanopartz | A11-60 | Spherical gold nanoparticles, 60 nm diameter |
| Input Output Interface | Olympus | FV30 ANALOG | This unit allows voltage readouts from PMT and LockIn to be fed into the confocal scanning software and allows timing pulses to be sent between the olympus microscope and the SF-TRU unit. |
| InSight X3 | Newport | Spectra-Physics | Dual-output femtosecond pulsed laser. Tunable (680–1300 nm) and fixed (1045 nm) laser outputs with the repetition rate of 80 MHz. |
| Microscope Frame | Olympus | IX83 | Inverted microscope |
| Mouse 4T1 cells | ATCC | CRL-2539 | Mouse breast cancer cells |
| NA 1.2 Water Immersion Objective | Olympus | UPLSAPO60XW/IR | The multiphoton 60x Objective has a 0.28 mm working distance. Other similar objectives can be used. |
| NA 1.4 Condenser | Nikon | CSC1003 | Other condensers with NA higher than the excitation objective can also be used. |
| PMT | Hamamatsu | R3896 | PMT used for detecting anti-stokes photos for CARS micrsocopy |
| PMT Connector | Hamamatsu | C13654-01-Y002 | Connector for PMT |
| Power Supply | RS | RSPD-3303 C | Programmable power supply which is used for providing the correct voltage to the PMT |
| RPMI-1640 | Gibco | A10491-01 | Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium has since been found suitable for a variety of mammalian cells. |
| SF-TRU | Newport Spectra Physics | SF-TRU | System designed for controlling the time delay and dispersion of the 2 laser outputs and for performing the beam modulations required for SRS |
References
- Tabish, T. A., et al. Smart gold nanostructures for light mediated cancer theranostics: Combining optical diagnostics with photothermal therapy. Advanced Science. 7 (15), Weinheim, Baden-Württemberg, Germany. 1903441 (2020).
- Tian, F., et al. Gold nanostars for efficient in vitro and in vivo real-time SERS detection and drug delivery via plasmonic-tunable Raman/FTIR imaging. Biomaterials. 106, 87-97 (2016).
- Jenkins, S. V., et al. Enhanced photothermal treatment efficacy and normal tissue protection via vascular targeted gold nanocages. Nanotheranostics. 3 (2), 145-155 (2019).
- Huang, J., et al. Rational design and synthesis of gammaFe2 O3 @Au magnetic gold nanoflowers for efficient cancer theranostics. Advanced Materials. 27 (34), Deerfield Beach, Fla. 5049-5056 (2015).
- Dilipkumar, A., et al. Label-free multiphoton endomicroscopy for minimally invasive in vivo imaging. Advanced science. 6 (8), Weinheim, Baden-Württemberg, Germany. 1801735 (2019).
- Wang, C. -C., et al. Differentiation of normal and cancerous lung tissues by multiphoton imaging. Journal of Biomedical Optics. 14 (4), 044034 (2009).
- Chrabaszcz, K., et al. Comparison of standard and HD FT-IR with multimodal CARS/TPEF/SHG/FLIMS imaging in the detection of the early stage of pulmonary metastasis of murine breast cancer. The Analyst. 145 (14), 4982-4990 (2020).
- Tsai, T. H., et al. Visualizing radiofrequency-skin interaction using multiphoton microscopy in vivo. Journal of Dermatological Science. 65 (2), 95-101 (2012).
- Wang, C. -C., et al. Early development of cutaneous cancer revealed by intravital nonlinear optical microscopy. Applied Physics Letters. 97 (11), 113702 (2010).
- Li, F. -C., et al. Dorsal skin fold chamber for high resolution multiphoton imaging. Optical and Quantum Electronics. 37 (13), 1439-1445 (2005).
- Tong, L., et al. Label-free imaging of semiconducting and metallic carbon nanotubes in cells and mice using transient absorption microscopy. Nature Nanotechnology. 7 (1), 56-61 (2011).
- Chong, S., Min, W., Xie, X. S. Ground-state depletion microscopy: Detection sensitivity of single-molecule optical absorption at room temperature. The Journal of Physical Chemistry Letters. 1 (23), 3316-3322 (2010).
- Chen, T., et al. Transient absorption microscopy of gold nanorods as spectrally orthogonal labels in live cells. Nanoscale. 6 (18), 10536-10539 (2014).
- Liu, J., Irudayaraj, J. M. Non-fluorescent quantification of single mRNA with transient absorption microscopy. Nanoscale. 8 (46), 19242-19248 (2016).
- Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
- Wang, C. -C., et al. In situ chemically specific mapping of agrochemical seed coatings using stimulated Raman scattering microscopy. Journal of Biophotonics. 11 (11), 201800108 (2018).
- Wang, C. -C., Yoong, F. -Y., Penfield, S., Moger, J. Visualization of active ingredients uptake in seed coats with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings SPIE 10069, Multiphoton Microscopy the Biomedical Sciences XVII. , 1006928 (2017).
- Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
- Zeytunyan, A., Baldacchini, T., Zadoyan, R. Module for multiphoton high-resolution hyperspectral imaging and spectroscopy. Proceedings SPIE 10498, Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences XVIII. , 104980 (2018).
- Wang, C. -C., Wu, R. -J., Lin, S. -J., Chen, Y. -F., Dong, C. -Y. Label-free discrimination of normal and pulmonary cancer tissues using multiphoton fluorescence ratiometric microscopy. Applied Physics Letters. 97 (4), 043706 (2010).
- Wang, C. -C., Chandrappa, D., Smirnoff, N., Moger, J. Monitoring lipid accumulation in the green microalga botryococcus braunii with frequency-modulated stimulated Raman scattering. Proceedings SPIE 9329, Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences XV. , 9329 (2015).
- Figueroa, B., et al. Broadband hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy with a parabolic fiber amplifier source. Biomedical Optics Express. 9 (12), 6116-6131 (2018).
- Cui, L., et al. In situ plasmon-enhanced CARS and TPEF for Gram staining identification of non-fluorescent bacteria. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 264, 120283 (2022).
- Ma, J., Sun, M. Nonlinear optical microscopies (NOMs) and plasmon-enhanced NOMs for biology and 2D materials. Nanophotonics. 9 (6), 1341-1358 (2020).
- Sun, L., Chen, Y., Sun, M. Exploring nonemissive excited-state intramolecular proton transfer by plasmon-enhanced hyper-Raman scattering and two-photon excitation fluorescence. The Journal of Physical Chemistry C. 126 (1), 487-492 (2022).
