Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

גישת השתלה מדרדרית למיקום צנתר דיאליזה פריטוניאלית בעכברים

Published: July 20, 2022 doi: 10.3791/63689
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 1, 1,3,4
1Renal Section, Department of Medicine, Boston University Aram V. Chobanian & Edward Avedisian School of Medicine, 2Department of Biomedical Science, Kaiser Permanente Bernard J. Tyson School of Medicine, 3Veterans Affairs Boston Healthcare System, 4Institute of Medical Engineering and Sciences, Massachusetts Institute of Technology

ERRATUM NOTICE

Summary

מאמר זה מתאר שינויים בהליך להשתלת צנתר דיאליזה פריטוניאלי במודל מורין כדי למנוע בעיות טכניות גדולות שנצפו בטכניקות הקונבנציונליות.

Abstract

מודלים של מורין משמשים לבדיקת היבטים שונים של דיאליזה פריטוניאלית (PD), כגון דלקת צפק ופיברוזיס. אירועים אלה גורמים לכשל בקרום הצפק בבני אדם, שנותר תחום מחקר אינטנסיבי בשל השלכותיו הקליניות העמוקות בניהול חולים עם מחלת כליות סופנית (ESKD). למרות החשיבות הקלינית של מחלת פרקינסון והסיבוכים הקשורים אליה, המודלים הניסיוניים הנוכחיים סובלים מאתגרים טכניים מרכזיים הפוגעים בביצועי המודלים. אלה כוללים נדידת צנתר PD וקילקול ובדרך כלל מצדיקים הוצאת קטטר מוקדמת יותר. מגבלות אלה גם מניעות את הצורך במספר גדול יותר של בעלי חיים כדי להשלים מחקר. מחקר זה מתייחס לחסרונות אלה, ומציג שיפורים טכניים וניואנסים כירורגיים למניעת סיבוכים נפוצים של צנתר פרקינסון במודל מורין. יתר על כן, מודל שונה זה מאומת על ידי גרימת דלקת הצפק ופיברוזיס באמצעות זריקות lipopolysaccharide. בעיקרו של דבר, מאמר זה מתאר שיטה משופרת ליצירת מודל ניסיוני של מחלת פרקינסון.

Introduction

נטל מחלת כליות סופנית
מחלת כליות כרונית (CKD) היא בעיה בריאותית עולמית1. ההערכות הנוכחיות מצביעות על כך שיותר מ-850 מיליון אנשים ברחבי העולם סובלים ממחלת כליות. השכיחות של מחלת כליות כמעט מכפילה את מספר האנשים עם סוכרת (422 מיליון) והיא יותר מפי 20 מהשכיחות של חולי סרטן (42 מיליון) או HIV / איידס (36.7 מיליון) ברחבי העולם2. בערך אחד מכל שבעה אמריקאים יש CKD, ושניים מתוך 1,000 אמריקאים יש ESKD הדורש השתלת כליה או דיאליזהתמיכה 3. בהתחשב בנטל ההולך וגובר של ESKD ברחבי העולם, אופטימיזציה של טכנולוגיית הדיאליזה היא חיונית3.

דיאליזה פריטוניאלית
PD היא שיטה לא מנוצלת באופן משמעותי לטיפול ב-ESKD בארצות הברית. על פי מערכת נתוני הכליות של ארצות הברית (USRDS), אחוז חולי פרקינסון השכיחים היה רק 11% בשנת 2020 4,5. מחלת פרקינסון מעניקה מספר יתרונות על פני המודיאליזה במרכז (HD), כולל איכות חיים טובה יותר, פחות ביקורים במרפאה וירידה בהוצאות מדיקר 6,7. בנוסף, פרקינסון הוא טיפול ביתי והוא קשור בסיכון נמוך בהרבה לזיהומים חמורים כגון חיידקים ואנדוקרדיטיס הקשורים לעיתים קרובות לצנתרי המודיאליזה. יתר על כן, ניתן להתחיל פרקינסון במהירות עם פרוטוקול התחלה דחופה, מה שמקטין את הצורך בהתחלת דיאליזה עםצנתרי כלי דם 8. מחלת פרקינסון נחשבת לשיטת הדיאליזה המועדפת באוכלוסיית ESKD בילדים9.

פגיעה פריטוניאלית הנגרמת על ידי דיאליזה פריטוניאלית
מחלת פרקינסון כרוכה בהחדרת נוזל פרקינסון (דיאליזה) לצפק, הגורם לדלקת ולעיצוב מחדש של קרום הצפק לאורך זמן. דלקת צפק מעוררת פיברוזיס, ששיאה באובדן פוטנציאלי של יכולות אולטרה-סינון של הממברנה לאורך זמן. שימור קרום הצפק הוא אתגר משמעותי בפרקינסון, ומחקר נוסף חשוב באופן קריטי כדי להבטיח שהפרקטיקות הקליניות הטובות ביותר יהיו זמינות למטפלים. ישנם מודלים מבוססים היטב של מורין המסייעים לקדם את ההבנה של מנגנונים פתופיזיולוגיים של זיהום ודלקת בצפק, מומסים, קינטיקה של הובלת מים וכשל ממברנה; עם זאת, בעיות טכניות עם הצנתר לעתים קרובות להגביל מודלים אלה10.

ניתוח השינויים בקרום הצפק
בחולי ESKD, דיאליזה מוחדרת באופן מסורתי לחלל הצפק באמצעות קטטר טנקהוף עם שרוול עמוק ושטחי. החולים עלולים לחוות סיבוכים הקשורים לצנתר, כולל נדידת קטטר, כאבי עירוי וניקוז לקוי של הדיאליזה11,12,13. שני סוגים עיקריים של צנתרי הצפק הוכנסו לבני אדם, מפותל או ישר, כדי למזער סיבוכים אלה12. מספר שינויים, כולל שרוול נוסף לצנתרים הקונבנציונליים בעלי שני אזיקים, נוספו לצנתרים המקוריים כדי להאריך את הישרדות צנתר פרקינסון11. טכניקת ההחדרה משתנה בהתאם למספר גורמים על ידי מניעת נדידת קטטר להוספה לאחר ההישרדות, כולל זמינות המשאבים ורמת המומחיות14.

לעומת זאת, למודלים של דיאליזה פריטוניאלית יש הבדלים מהותיים בטכניקות ובמטרה בהשוואה לצנתרים פריטוניאליים אנושיים. לדוגמה, צנתרים פריטוניאליים במודלים של מורין משמשים בעיקר לחקר שינויים בממברנות ומיועדים פחות לתפקודי ניקוז דו-כיווניים. הטכניקה הנוכחית סובלת מעקירת נמלים פוטנציאלית ומנדידת צנתרים עקב הטיפול בבעלי החיים. בדגמי מורין הקונבנציונליים, יציאות הגישה לא היו מקובעות לעור. היבט זה יצר פתח גישה לא יציב, אשר בבעלי חיים ערים עלול להיעקר ממקומו, וכתוצאה מכך נדידת קטטר. בהתחשב בחשיבות של מודלים murine במחקר קרום הצפק, זה הכרחי ליצור טכניקות כירורגיות יעילות כדי ליצור מודלים אמינים. לכן, יצאנו לייעל את המודל המקובל של מיקום צנתר PD. חשוב לציין כי הצנתר עצמו גורם לשינויים היסטופתולוגיים בקרום הצפק, ולכן יש לפרש כל מסקנה לגבי השפעת תמיסות פרקינסון במחקרים בבעלי חיים בהקשר של צנתר פרקינסון כגוף זר15,16,17.

היסטופתולוגיה של קרום הצפק
כשל PD קשור בעיקר לפיברוזיס ולאנגיוגנזה עודפת וכתוצאה מכך לאובדן שיפוע ריכוז אוסמולרי. בנוסף, יכולת סינון קרום הצפק עשויה להיות מושפעת מדלקת הצפק. בנוסף, דלקת צפק זיהומית היא סיבה מבוססת היטב לשינוי בשיטת הדיאליזה מדיאליזה פריטוניאלית להמודיאליזה. 18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

במחקר זה נעשה שימוש בשמונה נקבות עכברי C57BL/6J, בגילאי 8-12 שבועות ובמשקל ממוצע של 20 גרם. העכברים שוכנו בתנאים סטנדרטיים והוזנו בצ'או ובמים אד ליביטום. מחקר זה בוצע באישור הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC), המרכז הרפואי של אוניברסיטת בוסטון (AN-1549). ההליכים המתוארים כאן בוצעו בתנאים סטריליים.

1. להרדים את העכבר בחדר Isoflurane, ולהזריק את משכך כאבים תת עורית

  1. החזיקו את החיה מבסיס הזנב. שמור את החיה על פני השטח הגבי של היד הלא דומיננטית.
  2. מעבירים את בעל החיים לתא השראת הרדמה רציפה מלא באיזופלורן 3%-4%. ודא הרדמה כללית נאותה על ידי היעדר רפלקס צביטת בוהן בגפיים האחוריות הימנית והשמאלית. שמור על תחזוקת ההרדמה הכללית עם איזופלורן 1%-3%.
  3. יש למרוח משחה אופתלמית על שתי העיניים.
  4. מתן הזרקה תת עורית של Buprenorphine.
    1. להמיס את מלאי Buprenorphine בריכוז של 0.3 מ"ג / מ"ל נתרן כלורי (NaCl) 0.9% כדי להשיג את הריכוז הסופי של 0.03 מ"ג / מ"ל.
    2. יש להזריק מינון של 0.05-0.1 מ"ג/ק"ג של 0.03 מ"ג/מ"ל בופרנורפין, יחד עם 500 מיקרוליטר NaCl סטרילי 0.9%, 20 דקות לפני הניתוח בעכבר של 20 גרם (2 מיקרוגרם או 66 מיקרוליטר של 0.03 מ"ג/מ"ל בופרנורפין לעכבר).

2. הכנת העור

  1. הניחו את העכבר מורדם לחלוטין במצב צדדי שמאלי, וחשפו את צידו הימני לשמיכת החימום. יש לגלח את הצד הימני של הבטן, ממש קרוב לקו האמצע לאזור הפרא-ספינלי, ועד לזנב החיה.
  2. יש לחטא את האזור המגולח שלוש פעמים באמצעות צמר גפן עם יישום חלופי של תמיסת החיטוי או הפילינג ו-70% אלכוהול או מי מלח סטריליים בתנועה מעגלית, החל מאתר החתך הכירורגי ויציאה החוצה. יש להשליך את צמר גפן לאחר כל שימוש. היזהר לא להרטיב יתר על המידה אזורים שאינם כירורגיים של החיה עם אלכוהול או חיטוי כמו זה יכול להחמיר היפותרמיה.
    הערה: חשוב לדלל כראוי תמיסות חיטוי ולא להשאיר קרצוף כירורגי על העור במהלך הניתוח, שכן הם יכולים להיות מגרים ויש צורך לשטוף. לעתים קרובות לבדוק את הטמפרטורה של שמיכת חימום במהלך ההליך כדי להבטיח כי הטמפרטורה לא נופל.

3. למדוד את אורך הצנתר ולסמן את נקודת ההחדרה בתוך הבטן ומערכת הצינור מעל העור המוכן

  1. הקצו את כיס יציאת הגישה 1 ס"מ מעל זנב החיה. החזק את מקטע ההתקנה עם האינדקס הלא דומיננטי ואצבע האגודל מעל האזור שהוקצה ליד הזנב.
  2. מניחים את הצנתר מעל העור ומעריכים את המקום להחדרת צינור הצנתר בתוך חלל הבטן. סמן את המקום שהוקצה להחדרת הצינור, תוך כיבוד הכיפוף המינימלי של הצינור ליד קו האמצע הקדמי.
    הערה: כל הפרוצדורות חייבות להתבצע עם כפפות סטריליות, ויש לשמור על הקטטר סטרילי במהלך המדידה. כלי ניתוח חייב להיות autoclaved ב 121 ° C לפני השימוש. עיין באיור משלים S1 עבור המכשירים הדרושים להליך.

4. התאמה אישית של מקטע מאגר הצנתר הצפק

  1. נקבו חור צדדי מעל מסגרת אזור המאגר באמצעות תג אוזני העכבר (איור 1 ואיור 2). יש לציין כי אגרוף האוזן הוא כלי כירורגי, והוא צריך להיות סטרילי.

5. מניחים את פתח ההחדרה

  1. בצע חתך עור אופקי ברוחב 1 ס"מ 1 ס"מ מעל הזנב. נתחו בבוטות את המישור התת עורי מהשכבה השרירית שמתחתיה כדי ליצור פאוץ' למיקום הצנתר כדי להבטיח שפתח ההחדרה שוכן בכיס היציאה האידיאלי בחופשיות.
  2. שמרו על קצה המספריים של הקשתית לכיוון קו האמצע כדי ליצור תעלה אלכסונית למיקום הצינור (איור 3A).
  3. מעבירים את התפר 3.0 מהחור הצדדי המותאם אישית. תקן את יציאת הגישה למיטה השרירית על ידי הידוק התפר שעבר, תוך שמירה על מסלול הצינור.

6. בצעו את החתך באתר החדרת קצה הצנתר

  1. בצע חתך של 1 ס"מ מעל האזור שסומן בעבר ליד קו האמצע. אשרו את המערכת המפותחת היטב על ידי העברת מספריים דרך הקטע.
  2. בחר את קצה הצנתר בעדינות עם מלקחיים כדי להכניס את הצנתר למסלול מדרדר.
    הערה: הימנע מצביטה של החורים הצדדיים של הצינור.
  3. העבירו את צינור הצנתר דרך מערכת העיכול המוכנה (איור 3B). בצע חתך של 1 ס"מ מעל השכבה השרירית קרוב לקו האמצע הימני.

7. לאשר את תפקוד הצנתר

  1. לפני סגירת כל החתכים, יש לוודא שהקטטר שהונח תקין. בדוק את הפונקציה עם מזרק 1 מ"ל מחובר למחט הובר הספציפית עבור היציאה.
  2. הזריקו 200 מיקרוליטר של מי מלח רגילים ליציאת ההחדרה. חפש זרימה חלקה עם אפס סובלנות להתנגדות.
  3. יש לשטוף את היציאה והצנתר ב-10% הפרין כדי לשמור על הפטנט.

8. סגור את חתכי העור

  1. סגרו את חתכי העור סביב מאגר היציאה (איור 3C) בעזרת 3-0 תפרים נספגים.

9. תקנו את קצה הצנתר בתוך חלל הבטן

  1. מניחים תפר מיתר ארנק רופף עם תפר נספג 4-0 עגול סביב שריר דופן הבטן החתוך. מעבירים את הלבד הפרוקסימלי של הצנתר בתוך החתך.
  2. הדקו את תפר חוט הארנק המוכן סביב הצינור תוך שמירה על הלבד השני מחוץ לחוט הארנק, מעל השכבה השרירית (איור 3D), וסגרו את העור עם 3-0 תפרים נספגים (איור 2).

10. לפקח על בעלי החיים לאחר הניתוח ומדי יום, לנהל משככי כאבים לאחר הניתוח ונוזלים, ולשמור רשומות יומיות לאחר הניתוח במשך מינימום של 7 ימים ועד התאוששות מלאה

  1. שמור על תפקוד הצנתר עם הזרקה יומית של 200 μL של מי מלח רגילים דרך הצנתר.

11. זריקות נוזלים

  1. אשר את התהליך שלאחר האירוע על ידי בדיקה קפדנית של חתך העור.
  2. הכן LPS 2 מ"ג / ק"ג משקל גוף לזריקות intraperitoneal (i.p.) על ידי דילול 40 מיקרוגרם של LPS עם מלוחים סטריליים פוספט חוצץ (PBS) לריכוז עבודה של 0.2 מיקרוגרם / μL (למעשה, 10 μL עבור 2 מיקרוגרם / גרם משקל גוף ו 200 μL של LPS עבור 20 גרם עכברים).
  3. התחל את הזריקות בשבוע השני לאחר השתלת הצנתר.
    1. החזיקו את בעל החיים בעדינות עם היד הלא דומיננטית וריסנו את פתח ההחדרה תוך הזזת האצבע המורה והאגודל לכיוון הצפלדה.
    2. יש לחטא את העור שמעל המאגר עם 70% אלכוהול איזופרופיל. השתמש במזרק המחובר למחט הובר כדי להזריק את LPS.
      1. לאחר הכניסה לנמל עם מחט הובר, הזריקו 100 מיקרוליטר של מלח רגיל לתוך היציאה כדי לאשר את מסלול הפטנט.
      2. הזריקו את 200 μL המוכנים של LPS, ולאחר מכן את 100 μL של מלוחים רגילים להשקיית צינורות, וודאו שאין התנגדות.

12. מרדימים את העכברים לפני קצירת הצפק ואוספים את נוזל הצפק

  1. לאחר 7 ימים של זריקות LPS ושבועיים של השתלת קטטר, יש לתכנן את ביופסיית הצפק.
  2. תוכנית להרדמה כללית.
    1. מרדימים את העכבר בחדר איזופלורן ומזריקים את משכך הכאבים תת עורית.
    2. החזיקו את בעל החיים מבסיס הזנב, והחזיקו אותו על פני השטח הגבי של היד.
    3. מעבירים את בעל החיים לתא השראת הרדמה רציפה מלא באיזופלורן 3%-4%. ודא הרדמה כללית נאותה על ידי היעדר רפלקס צביטת בוהן בגפיים האחוריות הימנית והשמאלית. שמור על תחזוקה של הרדמה כללית עם isoflurane 1%-3%.

13. ביופסיה פריטוניאלית

  1. הניחו את בעל החיים על השמיכה המחוממת במצב שכיבה. בצע חתך עור בקו האמצע מהתת-קסיפואיד לשלפוחית השתן.
  2. לחורר את המישור התת-פשיאלי עם PBS קר (איור 3E).
  3. ודא שהמטוס מנותח לחלוטין מבלי להפריע לשלמות הצפק. התחילו לנתח את הצפק מההשתקפות הצפקית הצידית ברביע התחתון השמאלי, החל מההילום ועד לאגף השמאלי, ושלפוחית השתן באספקט התחתון כדי לשמור על עקביות הדגימות בין החיות (איור 3F).
  4. לאחר קציר הצפק, להרדים את החיה על ידי נקע צוואר הרחם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כל הצנתרים המושתלים היו תקינים עד סוף המחקר, והוצאת הצנתר או הקימוט לא סיבכו אף אחד מהצנתרים המושתלים. הטכניקה הנוכחית, ששונתה, אומתה עוד יותר עם מודל המושרה על ידי דלקת הצפק באמצעות LPS. עכברי הביקורת קיבלו 200 μL של זריקות מלח רגילות יומיות, ואילו לעכברי הניסוי הוזרקו 200 μL של LPS, כפי שנדון בפרוטוקול שלב 11, למשך 7 ימים בסך הכל לאחר השתלת הצנתר.

קרום הצפק הוערך עבור מאפיינים היסטופתולוגיים על ידי hematoxylin ו eosin (H&E) ו Masson Trichrome צביעה. ניתוח החתכים המוכתמים ב-H&E הראה עלייה משמעותית במטריצה החוץ-תאית (ECM) בחלל התת-צפקי (איור 4A, מסומן בכוכבית), שנמדדה באמצעות ImageJ. הממוצע + SD של ECM במרחב התת-צפקי של עכברי הביקורת היה 87.10 + 24.66 מיקרומטר והכפיל את עצמו בעכברים שנחשפו ל-LPS (148.9 + 60.85 מיקרומטר, P = 0.008) (איור 4B).

כתם הטריכרום מזהה פיברוזיס (כתם כחול באיור 5 ובאיור 6), אשר הוערך כצפיפות עוצמה מנורמלת לשטח הפנים (מיקרומטר). צפיפות עוצמה משלבת את מספר הפיקסלים ואת עוצמתם באזור עניין והיא שיטה מתוקפת לתכונות היסטולוגיות כמותיות של עניין19,20.

לאחר מכן, הנחנו כי דלקת הנגרמת על ידי LPS עלולה לגרום לשינוי בכלי הדם ולהרחבת החלל התת-פריטוניאלי. CD31 שימש כסמן לתאי אנדותל (איור 7) וכומת כצפיפות משולבת בתמונות שדה בהספק גבוה (HPF) שנבחרו באופן אקראי בכל עכבר בשתי הקבוצות (איור 8B,C). עכברים שקיבלו LPS הראו עלייה של פי שלושה בפיברוזיס תת-צפקי (איור 8A, P = 0.015). כל השינויים הללו בקרום הצפק עולים בקנה אחד עם אלה שנצפו בחולים שנחשפו לדיאליזה ארוכת טווח21. התוצאות הראו עלייה של ~פי 8-9 בכלי הדם (P = 0.0168) (איור 7 ואיור 8B) ועלייה של ~פי 2 בחלל התת-צפקי המסומן כ-SP (P = 0.008) (איור 7 ואיור 8C). תוצאות אלה תואמות את הניאו-וסקולריזציה שנצפתה בחולים עם פרקינסון לאחר חשיפה ארוכת טווח לקרום הצפק לדיאליזה 18,22,23.

Figure 1
איור 1: צנתר PD והחור הצדדי המותאם אישית. קיצור: PD = דיאליזה פריטוניאלית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: שיטות קונבנציונליות לעומת שיטות מותאמות. השיטה הקונבנציונלית למיקום צנתר פרקינסון (מימין) מתחילה באבטחת הטבעת הפנימית בצפק הקודקוד, ואילו בשיטה מדרדרית שונה זו (משמאל), ההליך מתחיל בתפירת פתח הגישה המותאם אישית מעל המיטה השרירית על גבי העכברים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: החדרת צנתר הצפק. (A) מעבירים את התפר 3.0 מהחור הצדדי המותאם אישית ותופרים את המיטה השרירית לחור הצדדי, תוך שמירה על מהלך הצינור. (B) לעשות את התעלה של צינור PD עם דיסקציה קפדנית של השכבה השרירית מן העור שמעל ולהעביר את הצינור בצורה מדרדרת. (C) סגור את חתכי העור סביב מאגר הנמל. (D) הדקו את תפר חוט הארנק המוכן סביב הצינור תוך שמירה על הלבד השני מחוץ לחוט הארנק, מעל שכבת השרירים. (E) השקו את חלל הצפק ב-2 מ"ל של PBS קר תוך שמירה על שיפוע המחט. (F) התחילו לנתח את הצפק מההשתקפות הצפקית הצידית ברביע התחתון השמאלי (חץ כחול). קיצורים: PD = דיאליזה פריטוניאלית; PBS = מלח חוצץ פוספט. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: צביעת H&E. תמונות מייצגות (100x) של קרומי הצפק של שני עכברי C57BL6 בודדים שנחשפו ל-LPS בקבוצת הניסוי כפי שצוין (N = 4/group). ראש חץ שחור מצביע על הצפק, וכוכבית מתארת את המרחב התת-פריטוניאלי. פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר. קיצורים: H&E = hematoxylin ו eosin; M = שריר; LPS = lipopolysaccharide. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: צביעת H&E ו-Masson Trichrome. תמונות מייצגות (100x) של קרומי הצפק של שני עכברי C57BL6, אחד בקבוצת ביקורת (A) ואחד שנחשף ל-LPS בקבוצת הניסוי (B). פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר. קיצורים: SP = מרחב תת-פריטוניאלי; P = מרחב פריטוניאלי; M = שריר; H&E = hematoxylin ו eosin; LPS = lipopolysaccharide. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
תמונה 6: צביעת Masson Trichrome. תמונות מייצגות (100x) של קרומי הצפק של שני עכברי C57BL6, האחד חשוף ל-LPS והשני בקרה בהזרקת מלח. ראש חץ שחור מצביע על הצפק, וכוכבית כתומה מתארת את המרחב התת-פריטוניאלי, N = 4/group. מוטות קנה מידה = 100 מיקרומטר. קיצורים: M = שריר; LPS = lipopolysaccharide. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
איור 7: שינויים בכלי הדם בחלל התת-צפקי בהקשר של דלקת. חלקים משובצים פרפין הוכתמו ב-CD31 וב-DAPI. מוצגות תמונות אקראיות המתקבלות בהגדלה של 400x. פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר. קיצורים: SP= מרחב תת-פריטוניאלי; P = מרחב פריטוניאלי; כוכבית לבנה = כלי תת-פריטוניאלי; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 8
איור 8: חשיפה ל-LPS שיפרה את הניאו-וסקולריזציה, פיברוזיס בצפק והתרחבות החלל התת-פריטוניאלי . (A) צפיפות משולבת של פיברוזיס. (B) צפיפות משולבת של CD31. (C) נמדד מרחב תת-צפקי. מבחן t של התלמיד בוצע עבור כל המדדים. כוכביות שחורות מתארות את רמת המשמעות. קווי שגיאה = SEM. קיצור: LPS = lipopolysaccharide. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור משלים S1: כלי ניתוח הדרושים לביצוע ההליך. 1. תיוג אוזן, 2. יציאת עכבר דקה, 3. מחט נקודת הובר, 4. תפר נספג באיחור, 5. מהדק ישר זווית, 6. מלקחיים עם קצה ישר, 7. מלקחיים מעוקלים, 8. המספריים של איריס. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מתוארים שלושה מודלים מורינים של PD. זה כולל נקב עיוור של משטח הצפק, מערכת פתוחה-קבועה, ומערכת סגורה10. הניקוב העיוור של משטח הצפק כרוך בגישה צפקית ישירה בדומה להזרקות תוך פריטוניאליות אך אינו מאפשר ניקוז של דיאליזה. בהיותה הליך עיוור, שיטה זו יכולה לפגוע באיברי הקרביים של הבטן. מודל המערכת הפתוחה-קבועה שומר על צנתר הדיאליזה ופתח ההחדרה מחוץ לגוף. עם זאת, טכניקה זו בעכברים קשורה לסיבוכים, כגון שקיות מנותקות עקב תנועת בעלי חיים, זיהום וחוסר יכולת לבצע ניסויים ארוכי טווח. צנתרי צפק סגורים הוכנסו לשימוש בשנת 2009. במערכת זו מושתלים הן יציאת הגישה והן הצינור בגופם של בעלי החיים. החדרת נוזל מלעורית ישירה הופכת לאפשרית. בבני אדם, שקיות הדיאליזה הצפקיות ממוקמות מחוץ לגוף, אך הדבר אינו אפשרי בעכברים בשל ניידותם. בנוסף, לעיתים קרובות קיימת חסימה מכנית של הצנתר הקשורה לסתימת חורי הצד וכיפוף הצינור20. המאגר במערכת סגורה הוא נייד ויכול להתהפך, ואירוע זה יכול לעקם את צומת צינור המאגר.

מספר גישות יושמו כדי להתגבר על המגבלות הנ"ל של מערכות פרקינסון סגורות, כולל omentectomy ועירוי הפרין כדי למנוע סתימת קטטר PD. למרות שפתרונות אלה עשויים להיות שימושיים במחקרים קצרי טווח, האתגרים להצלת הצנתר לניסויים ארוכים יותר במודלים מורינים נמשכים. יתר על כן, omentum בעכברים הוא קטן, בניגוד לבני אדם, מה שמסביר את חוסר ההצלחה עם omentectomy כדי להציל את הביצועים קטטר הצפק בעכברים24,25.

במחקר זה, שני צעדים קריטיים יושמו על מערכת הצנתרים הסגורה של PD כדי לשפר את המגבלות של הטכניקות הנוכחיות. אלה כללו (א) ניקוב חור צדדי בצנתר ו-(ב) צינור מדרדר העובר דרך מנהרה טרומית. (איור 3B) ניקוב חור צדדי בפתח ההחדרה סייע בקיבוע הצנתר היטב למיטה השרירית וסיפק ניידות במהלך הזריקות. תוך התייחסות למגבלות הנ"ל, שינוי זה הפחית את משיכת הצינור ואת המאמץ של העור של עכברים.

באופן מסורתי, קצה צנתר PD נכנס לחלל הצפק תחילה בזמן ההשתלה (השתלה קדמית). הצגנו גישה של השתלה מדרדרת, שבה פתח ההחדרה היה מקובע תחילה על העור, ולאחר מכן הצנתר הוכנס לחלל הצפק. מכיוון שהשתלת הצנתר בוצעה לאחר מיקום המאגר, היא נחשבת להשתלת צנתר מדרדר. שיטת השתלה זו הביאה למהלך ישר של הצינור ולביטול סלילת הצינור.

מגבלה פוטנציאלית של הטכניקה יכולה להיות מאמץ של עור עכברים מהתפר. חשיבותה של הטכניקה המתוקנת מודגשת על ידי העובדה ששינויים מוצעים אלה מונעים נדידת צנתרים ומשיכה של הצינור. הוא מאפשר החדרה מדויקת של נוזל הפרקינסון בזמן שהעכבר ער. צמצום הבעיות הנ"ל מאפשר ניסויים ארוכי טווח ומונע כישלונות, ובכך מונע שימוש במספר רב של עכברים. בנוסף ליישום במחקר פרקינסון, ניתן למנף שינויים אלה בהקשרים אחרים כגון מודלים של סרטן השחלות, קרצינומטוזיס פריטוניאלי או דלקת צפק כרונית כדי לספק במדויק סוכני ניסוי.

הזרקת LPS נבחרה לאימות שיטת השתלה שונה זו. הממצאים היו עקביים עם אלה שנצפו בתגובה ל- icodextrin ונוזל דיאליזה פריטוניאלימבוסס גלוקוז 26. יתר על כן, השימוש ב- LPS רלוונטי מבחינה קלינית מכיוון שדלקת הצפק PD בבני אדם יכולה להיות מחיידקים גראם-שליליים והיא נצפית לעתים קרובות בסביבה של דיברטיקוליטיס או ניקוב ויסקוס. חיידקים גראם-שליליים מפרישים LPS התורם לדלקת הצפק והוא מודל ניסיוני מקובל של דלקת הצפק26,27. המאפיינים הפתולוגיים של כשל פרקינסון בבני אדם כוללים פיברוזיס פריטוניאלי ועלייה במיקרו-כלי הדם התת-פריטוניאליים, מה שגורם לאובדן שיפוע מומס הצפק בחולי פרקינסון27,28,29. תכונות אלה שוחזרו במודל דלקת הצפק הנגרמת על ידי LPS. מחקרים עתידיים ימשיכו לבחון טכניקה זו במודלים שבהם נוזל הדיאליזה הצפק יופעל במשך חודש אחד לפחות בעכברים כדי לגרום לפיברוזיס פריטוניאלי. מחקר ארוך טווח זה יאפשר גם מעקב אחר סיבוכים, כולל סליל של צנתרי פרקינסון.

לסיכום, השתלת צנתר הצפק הקונבנציונלי במערכת סגורה במודל מורין שונתה במחקר הנוכחי. השינויים הנוכחיים עשויים לסלול את הדרך ליצירת מודלים חזקים ואמינים של מורין לחקור את ההשלכות ארוכות הטווח של כשל בקרום הצפק בחולי ESKD אנושיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי NIH 1R01HL132325 ו- R21 DK119740-01 (VCC) ו- AHA Cardio-oncology SFRN CAT-HD CENTER GRANT 857078 (VCC ו- SL).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% heparin  Canada Inc., Boucherville, QC, Canada) Pharmaceutical product
     Buprenorphine 0.3 mg/mL      PAR Pharmaceutical            NDC 42023-179-05
C57BL/6J mice The Jackson Lab IMSR_JAX:000664
CD31 Abcam Ab9498
            Clamp      Fine Science Tools                13002-10
            Forceps      Fine Science Tools                11002-12
Dumont #5SF Forceps Fine Science Tools 11252-00
Dumont Vessel Cannulation Forceps Fine Science Tools 11282-11
Fine Scissors - Large Loops Fine Science Tools 14040-10
Fisherbrand Animal Ear-Punch Fisher Scientific 13-812-201
Hill Hemostat Fine Science Tools 13111-12
Huber point needle  Access  technologies  PG25-500 Needle for injections
            Isoflurane, USP             Covetrus             NDC 11695-6777-2
       Lipopolysaccharide from E.coli             SIGMA               L4391
Microscope Nikon Eclipse Inverted Microscope TE2000
Minute Mouse Port 4French with retention beads and cross holes     Access  technologies         MMP-4S-061108A
 Posi-Grip Huber point needles 25 G x 1/2´´    Access  technologies                PG25-500
            Scissors      Fine Science Tools                14079-10
Vicryl Suture AD-Surgical #L-G330R24

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Saran, R., et al. US Renal Data System 2019 Annual Data Report: Epidemiology of Kidney Disease in the United States. American Journal of Kidney Diseases. 75, 1 Suppl 1 6-7 (2020).
  2. ESRD, U.S.R.D.S.M. 2017 USRDS Annual Data Report: Epidemiology of Kidney Disease in the United States, Bethesda, MD, National Institutes of Health, National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases. USRD. , (2017).
  3. Center of Disease Control, U.S.D.o.H.a.H.S. Chronic Kidney Disease in the United States, 2019. CDC Publications and Resources. , (2019).
  4. Cho, Y., et al. Peritoneal dialysis use and practice patterns: An international survey study. American Journal of Kidney Diseases. 77 (3), 315-325 (2021).
  5. Xieyi, G., Xiaohong, T., Xiaofang, W., Zi, L. Urgent-start peritoneal dialysis in chronic kidney disease patients: A systematic review and meta-analysis compared with planned peritoneal dialysis and with urgent-start hemodialysis. Peritoneal Dialysis International. 41 (2), 179-193 (2021).
  6. Gokal, R., Figueras, M., Olle, A., Rovira, J., Badia, X. Outcomes in peritoneal dialysis and haemodialysis--a comparative assessment of survival and quality of life. Nephrology Dialysis Transplantation. 14, Suppl 6 24-30 (1999).
  7. Gardezi, A. I., Sequeira, A., Narayan, R. Going home: Access for home modalities. Advances in Chronic Kidney Disease. 27 (3), 253-262 (2020).
  8. van de Luijtgaarden, M. W., et al. Trends in dialysis modality choice and related patient survival in the ERA-EDTA Registry over a 20-year period. Nephrology Dialysis Transplantation. 31 (1), 120-128 (2016).
  9. Schaefer, F., Warady, B. A. Peritoneal dialysis in children with end-stage renal disease. Nature Reviews. Nephrology. 7 (11), 659-668 (2011).
  10. Gonzalez-Mateo, G. T., Pascual-Anton, L., Sandoval, P., Aguilera Peralta, A., Lopez-Cabrera, M. Surgical techniques for catheter placement and 5/6 nephrectomy in murine Models of Peritoneal Dialysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (137), e56746 (2018).
  11. Chow, K. M., et al. Straight versus coiled peritoneal dialysis catheters: A randomized controlled trial. American Journal of Kidney Diseases. 75 (1), 39-44 (2020).
  12. LaPlant, M. B., et al. Peritoneal dialysis catheter placement, outcomes and complications. Pediatric Surgery International. 34 (11), 1239-1244 (2018).
  13. Al-Hwiesh, A. K. A modified peritoneal dialysis catheter with a new technique: Farewell to catheter migration. Saudi Journal of Kidney Diseases and Transplantation. 27 (2), 281-289 (2016).
  14. Crabtree, J. H., Chow, K. M. Peritoneal dialysis catheter insertion. Seminars Nephrology. 37 (1), 17-29 (2017).
  15. Flessner, M. F., et al. Peritoneal changes after exposure to sterile solutions by catheter. Journal of the American Society of Nephrology. 18 (8), 2294-2302 (2007).
  16. Kowalewska, P. M., Margetts, P. J., Fox-Robichaud, A. E. Peritoneal dialysis catheter increases leukocyte recruitment in the mouse parietal peritoneum microcirculation and causes Fibrosis. Peritonial Dialysis International: Journal of the International Society for Peritonial Dialysis. 36 (1), 7-15 (2016).
  17. Kowalewska, P. M., Patrick, A. L., Fox-Robichaud, A. E. Syndecan-1 in the mouse parietal peritoneum microcirculation in inflammation. PLoS One. 9 (9), 104537 (2014).
  18. Yanez-Mo, M., et al. Peritoneal dialysis and epithelial-to-mesenchymal transition of mesothelial cells. The New England Journal of Medicine. 348 (5), 403-413 (2003).
  19. Arinze, N. V., et al. Tryptophan metabolites suppress Wnt pathway and promote adverse limb events in CKD patients. The Journal of Clinical Investigation. 132 (1), (2021).
  20. Belghasem, M., et al. Metabolites in a mouse cancer model enhance venous thrombogenicity through the aryl hydrocarbon receptor-tissue factor axis. Blood. 134 (26), 2399-2413 (2019).
  21. Krediet, R. T. The peritoneal membrane in chronic peritoneal dialysis. Kidney International. 55 (1), 341-356 (1999).
  22. Gonzalez-Mateo, G. T., et al. Chronic exposure of mouse peritoneum to peritoneal dialysis fluid: structural and functional alterations of the peritoneal membrane. Peritonial Dialysis International: Journal of the International Society for Peritonial Dialysis. 29 (2), 227-230 (2009).
  23. Sukul, N., et al. Patient-reported advantages and disadvantages of peritoneal dialysis: results from the PDOPPS. BMC Nephrology. 20 (1), 116 (2019).
  24. Lu, Y., et al. A method for islet transplantation to the omentum in mouse. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e57160 (2019).
  25. Gotloib, L., Wajsbrot, V., Shostak, A. A short review of experimental peritoneal sclerosis: from mice to men. The International Journal of Artificial Organs. 28 (2), 97-104 (2005).
  26. Tateda, K., Matsumoto, T., Miyazaki, S., Yamaguchi, K. Lipopolysaccharide-induced lethality and cytokine production in aged mice. Infection and Immunity. 64 (3), 769-774 (1996).
  27. Vila Cuenca, M., et al. Differences in peritoneal response after exposure to low-GDP bicarbonate/lactate-buffered dialysis solution compared to conventional dialysis solution in a uremic mouse model. International Urology and Nephrology. 50 (6), 1151-1161 (2018).
  28. Penar, J., et al. Selected indices of peritoneal fibrosis in patients undergoing peritoneal dialysis. Postepy Higieny Medycyny Doswiadczalnej (Online). 63, 200-204 (2009).
  29. Yung, S., Chan, T. M. Pathophysiological changes to the peritoneal membrane during PD-related peritonitis: the role of mesothelial cells. Mediators of Inflammation. 2012, 484167 (2012).

Tags

רפואה גיליון 185 קטטר פריטוניאלי כיס מורין דיאליזה פריטוניאלית lipopolysaccharide פריטונאום

Erratum

Formal Correction: Erratum: A Retrograde Implantation Approach for Peritoneal Dialysis Catheter Placement in Mice
Posted by JoVE Editors on 03/22/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: A Retrograde Implantation Approach for Peritoneal Dialysis Catheter Placement in Mice. The Authors section was updated from:

Saran Lotfollahzadeh1
Mengwei Zhang1
Marc Arthur Napoleon1
Wenqing Yin1
Josephine Orrick1
Nagla Elzind1
Austin Morrissey1
Isaac E. Sellinger1
Lauren D. Stern1
Mostafa Belghasem2
Jean M. Francis1
Vipul C. Chitalia1,3,4
1Renal Section, Department of Medicine, Boston University School of Medicine
2Department of Biomedical Science, Kaiser Permanente Bernard J. Tyson School of Medicine
3Veterans Affairs Boston Healthcare System
4Institute of Medical Engineering and Sciences, Massachusetts Institute of Technology

to:

Saran Lotfollahzadeh1
Mengwei Zhang1
Marc Arthur Napoleon1
Wenqing Yin1
Josephine Orrick1
Nagla Elzind1
Austin Morrissey1
Isaac E. Sellinger1
Lauren D. Stern1
Mostafa Belghasem2
Jean M. Francis1
Vipul C. Chitalia1,3,4
1Renal Section, Department of Medicine, Boston University Aram V. Chobanian & Edward Avedisian School of Medicine
2Department of Biomedical Science, Kaiser Permanente Bernard J. Tyson School of Medicine
3Veterans Affairs Boston Healthcare System
4Institute of Medical Engineering and Sciences, Massachusetts Institute of Technology

גישת השתלה מדרדרית למיקום צנתר דיאליזה פריטוניאלית בעכברים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lotfollahzadeh, S., Zhang, M.,… More

Lotfollahzadeh, S., Zhang, M., Napoleon, M. A., Yin, W., Orrick, J., Elzind, N., Morrissey, A., Sellinger, I. E., Stern, L. D., Belghasem, M., Francis, J. M., Chitalia, V. C. A Retrograde Implantation Approach for Peritoneal Dialysis Catheter Placement in Mice. J. Vis. Exp. (185), e63689, doi:10.3791/63689 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter