Summary
Hier stellen wir ein Protokoll zum Nachweis der bakteriellen Motilität anhand einer Farbreaktion vor. Die Hauptvorteile dieser Methode sind, dass sie einfacher auszuwerten und genauer ist und keine spezielle Ausrüstung erfordert.
Abstract
Die bakterielle Motilität ist entscheidend für die bakterielle Pathogenität, die Biofilmbildung und die Arzneimittelresistenz. Die bakterielle Motilität ist entscheidend für die Invasion und/oder Verbreitung vieler pathogener Spezies. Daher ist es wichtig, die bakterielle Motilität nachzuweisen. Bakterienwachstumsbedingungen wie Sauerstoff, pH-Wert und Temperatur können das Bakterienwachstum und die Expression von bakteriellen Flagellen beeinflussen. Dies kann zu einer verminderten Motilität oder sogar zu einem Verlust der Motilität führen, was zu einer ungenauen Bewertung der bakteriellen Motilität führt. Basierend auf der Farbreaktion von 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) durch intrazelluläre Dehydrogenasen lebender Bakterien wurde TTC zu herkömmlichem halbfestem Agar zum Nachweis der bakteriellen Motilität hinzugefügt. Die Ergebnisse zeigten, dass diese TTC-Methode mit halbfestem Agar zum Nachweis der bakteriellen Motilität einfach und leicht zu bedienen ist und keine großen und teuren Instrumente erfordert. Die Ergebnisse zeigten auch, dass die höchste Motilität in halbfestem Medium beobachtet wurde, das mit 0,3%igem Agar hergestellt wurde. Im Vergleich zum herkömmlichen halbfesten Medium sind die Ergebnisse einfacher auszuwerten und genauer.
Introduction
Die bakterielle Motilität spielt eine entscheidende Rolle bei der bakteriellen Pathogenität, der Biofilmbildung und der Arzneimittelresistenz1. Die bakterielle Motilität ist eng mit der Pathogenität verbunden und ist für die bakterielle Besiedlung während der frühen Infektion von Wirtszellen notwendig2. Die Bildung von Biofilmen steht in engem Zusammenhang mit der bakteriellen Motilität, bei der Bakterien durch Motilität an der Oberfläche fester Medien haften. Es wurde lange angenommen, dass die bakterielle Motilität positiv mit der Biofilmbildung korreliert. Ein hohes Maß an bakterieller Arzneimittelresistenz aufgrund von Biofilmen kann zu anhaltenden Infektionen führen, die eine Bedrohung für die menschliche Gesundheit darstellen 3,4,5. Daher ist es wichtig, die bakterielle Motilität nachzuweisen. Der bakterielle Motilitätstest wird hauptsächlich verwendet, um die Motilität verschiedener Bakterienformen im lebenden Zustand zu untersuchen, die indirekt das Vorhandensein oder Fehlen von Flagellen bestimmen können und somit eine wichtige Rolle bei der Identifizierung von Bakterien spielen.
Es gibt direkte und indirekte Methoden zum Nachweis der bakteriellen Motilität6. Da Bakterien mit Geißeln Motilität aufweisen, ist es möglich, indirekt festzustellen, ob Bakterien beweglich sind, indem das Vorhandensein oder Fehlen von Geißeln nachgewiesen wird. So ist es beispielsweise möglich, die Motilität indirekt durch Elektronenmikroskopie und Flagellenfärbung nachzuweisen, um anzuzeigen, dass Bakterien beweglich sind. Es ist auch möglich, durch direkte Methoden zu detektieren, wie z. B. Suspensionstropfen und halbfeste Punktionsmethoden.
Die halbfeste Punktionsmethode, die üblicherweise in mikrobiologischen Labors verwendet wird, um die bakterielle Motilität nachzuweisen, impft die Bakterien in das Einstichmedium des halbfesten Agars, das 0,4-0,8 % Agar enthält, je nach Richtung des Bakterienwachstums. Wenn die Bakterien entlang der Einstichlinie wachsen, um sich auszubreiten, erscheinen wolkenartige (bürstenartige) Wachstumsspuren, die auf das Vorhandensein von Geißeln und damit auf Motilität hinweisen. Wenn keine Wachstumsspuren an der Einstichlinie vorhanden sind, ist das Bakterium weder gegeißelt noch beweglich.
Diese Methode hat jedoch ihre Nachteile: Die Bakterien sind farblos und durchsichtig, die Flagellenaktivität wird durch die physiologischen Eigenschaften der lebenden Bakterien und andere Faktoren sowie die Konzentration des Agars und den geringen Durchmesser des Reagenzglases beeinflusst. Darüber hinaus sind aerobe Bakterien nur für das Wachstum auf der Agaroberfläche geeignet, was die Beobachtung der bakteriellen Motilität beeinträchtigt. Um dieses Experiment zu verbessern, wurde dem Medium daher 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) (farblos) zugesetzt, um eine zuverlässigere und intuitivere Methode zur Bestimmung der bakteriellen Motilität zu etablieren als die derzeitige direkte Punktionsmethode, bei der intrazelluläre Dehydrogenasen verwendet werden, um die Bildung eines roten Produkts von TTC 7,8,9,10 zu katalysieren.
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Protocol
1. Aufbereitung des halbfesten Mediums
- Traditioneller halbfester Agar
- Bereiten Sie den traditionellen halbfesten Agar gemäß der Rezeptur des bakteriellen Motilitätstestmediums unter Verwendung der Grundzutaten11 zu. 10 g Tryptose, 15 g NaCl, 4 g Agar in ausreichend destilliertem Wasser auflösen, den pH-Wert auf 7,2 ± 0,2 einstellen und das Endvolumen auf 1.000 ml auffüllen.
- Autoklavieren Sie den Agar bei 121 °C für 20 min und dosieren Sie ihn als 3 cm hohes halbfestes Medium in 10-ml-Reagenzgläser.
- Traditioneller halbfester Agar mit TTC
- Nach dem Autoklavieren des herkömmlichen halbfesten Mediums wird es auf 50 °C abgekühlt, 5 ml sterile 1%ige TTC-Lösung zu 100 ml Medium gegeben, gemischt und in 10 ml-Reagenzgläser dosiert, um ein 3 cm hohes halbfestes Medium zu bilden.
2. Bakterienstämme
ANMERKUNG: Achtzig Stämme wurden aus der aquatischen Umwelt isoliert und mit einem automatisierten Bakterienidentifikationsinstrument identifiziert (siehe Materialtabelle), darunter Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella spp., Vibrio spp., Klebsiella pneumoniae und Aeromonas hydrophila (Tabelle 1). Staphylococcus aureus (siehe Materialtabelle) wurde als negative unbewegliche Kontrolle verwendet; Als Positivkontrollstämme wurden Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa und Salmonella typhimurium ( siehe Materialtabelle) verwendet.
- Identifizieren Sie Testbakterienstämme, die für die Motilitätsanalyse verwendet werden sollen.
- Negative unbewegliche Kontrollen und bewegliche Positivkontrollstämme einschließen.
3. TTC-verstärkte Beobachtung der bakteriellen Motilität
- Einzelne Kolonien von Testbakterien werden von Agarplatten entnommen und mit Impfnadeln in die beiden oben genannten halbfesten Medien (Schritte 1.1.2 und 1.2.1) geimpft.
- Kultivieren Sie die Röhrchen bei 37 °C im Inkubator für 24-48 h, um die Ergebnisse zu beobachten.
- Beobachten Sie den Wachstumszustand: Charakterisieren Sie die Bakterien als unbeweglich (-), wenn nur die Einstichlinie rot ist. Charakterisieren Sie die Bakterien als beweglich (+), wenn sich die rote Farbe entlang der Einstichlinie12 leicht nach außen ausbreitet.
4. Einfluss unterschiedlicher Agarkonzentrationen auf die bakterielle Motilität
- Bereiten Sie halbfeste Medien mit 0,3 %, 0,5 % und 0,8 % Agar vor und beimpfen Sie sie wie oben beschrieben durch Punktion. Beobachten Sie die Ergebnisse nach 24-48 h Inkubation.
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Representative Results
Sowohl Standardstämme als auch isolierte Stämme wurden zur Motilitätsdetektion verglichen, und die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. Aufgrund des Fehlens von Flagellen wuchsen Staphylococcus aureus und Klebsiella pneumoniae nur entlang der inokulierten Linie sowohl auf traditionellen als auch auf halbfesten TTC-Medien. Im Gegensatz dazu zeigten Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli und Salmonella typhimurium nach 24-stündiger Kultivierung auf halbfestem TTC-Medium ein Wachstum in alle Richtungen um die inokulierte Linie herum. Dies war nach 48-stündiger Kultur noch deutlicher (Abbildung 1). Obwohl die Bakterien im traditionellen halbfesten Medium in alle Richtungen wuchsen, war es aufgrund der geringen Anzahl von Bakterien an der Außenseite der inokulierten Linie viel schwieriger zu visualisieren als im TTC-Medium.
Abbildung 1: Ergebnisse des Motilitätstests mit halbfestem TTC-Medium. links Staphylococcus aureus, rechts Escherichia coli. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Dehnung | Halbfestes Medium mit 0,4 % Agar | Halbfestes Medium mit 0,4 % Agar und 0,005 % TTC | |||
| 24 h | 48 h | 24 h | 48 h | ||
| P. aeruginosa ATCC27853 | + | + | + | + | |
| E. coli ATCC25922 | + | + | + | + | |
| S. typhimurium ATCC14028 | + | + | + | + | |
| S. aureus ATCC25923 | - | - | - | - | |
| E. coli (15) | 12 | 14 | 13 | 14 | |
| Salmonella spp. (8) | 7 | 8 | 8 | 8 | |
| A. hydrophila (20) | 18 | 20 | 20 | 20 | |
| Vibrio spp. (8) | 7 | 8 | 8 | 8 | |
| P. aeruginosa (24) | 18 | 20 | 22 | 23 | |
| K. pneumoniae (5) | -5 | -5 | -5 | -5 | |
| Die Zahlen geben die Anzahl der positiven Stämme (+) und der negativen Flecken (-) an. | |||||
Tabelle 1: Vergleich der bakteriellen Motilität.
Abbildung 2: Beobachtung der Motilitätsaktivität von Escherichia coli bei unterschiedlichen Agarkonzentrationen. Von links nach rechts: 0,3 %, 0,5 %, 0,8 % Agar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Der Einfluss der Agarkonzentration auf die bakterielle Motilität ist in Abbildung 2 dargestellt. Wir fanden heraus, dass die höchste Motilität in halbfestem Medium beobachtet wurde, das mit 0,3% Agar hergestellt wurde. Die mittlere Farbe in der Röhre färbte sich fast vollständig rot. Im Gegensatz dazu verringerte sich der Bereich der roten Diffusion und die Diffusion verlängerte sich mit zunehmender Agarkonzentration.
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Discussion
Der Nachweis der bakteriellen Motilität durch die Methode des halbfesten Mediums wird von vielen Faktoren beeinflusst13,14. Bakterielle Wachstumsbedingungen, wie z. B. Sauerstoff (aerob auf der Agaroberfläche, nicht aerob am Boden des Röhrchens mit dem halbfesten Medium), pH-Wert und Temperatur, können die Lebensfähigkeit bakterieller Flagellen beeinträchtigen, was zu einer verminderten Motilität oder sogar zu einem Verlust der Motilität führen kann15. Darüber hinaus können einige schleimartige Bakterien als Motilität durch die Produktion von Podokonjugaten beeinträchtigt werden.
Die Zugabe von TTC zum halbfesten Medium hilft bei der Beobachtung der Motilität. Die fermentativen Bakterien mit Antriebskraft können nach der Inkubation entlang der Einstichlinie in alle Richtungen wachsen. Daher wird das Medium um die Einstichlinie herum rot. Die nichtfermentativen Bakterien mit Antriebskraft haben einen niedrigen Sauerstoffgehalt im unteren Teil des Mediums. Daher wachsen diese Bakterien schlecht, so dass nur die obere Schicht des Mediums rot ist. Bakterien ohne Antriebskraft können nur an der Impflinie wachsen, und nur die Einstichlinie erscheint rot.
Beim Nachweis der bakteriellen Motilität mit TTC-halbfestem Medium sind die Ergebnisse umso offensichtlicher, je länger die Kulturzeit ist, insbesondere bei niedrigeren Agarkonzentrationen. Wenn das Ergebnis schwer zu interpretieren ist, sollte die Kulturzeit entsprechend verlängert werden. Dies kann mit der Agarkonzentration des halbfesten Mediums, der Anzahl der Bakterien und ihrer Motilitätzusammenhängen 16. Darüber hinaus zeigte diese Methode, dass einige Stämme von E. coli und P. aeruginosa auf herkömmlichem halbfestem Agarmedium nicht wachsen konnten und nur eine schwache rote Farbe auf der Oberfläche des Mediums auf halbfestem TTC-Agarmedium zeigten. Dies kann auf die Produktion von Kapseln durch solche Stämme zurückzuführen sein, die ihre Motilität beeinflusst17. Dieses Phänomen tritt aufgrund seiner Kapsel auch bei Neisseria meningitidis18 auf. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der Nachweis der bakteriellen Motilität mit einem chromogenen halbfesten Medium, das TTC enthält, den Einfluss bakterieller Faktoren auf die Testergebnisse reduziert und die Ergebnisse mit bloßem Auge leichter zu beobachten macht. Der Vorteil einer hohen Nachweisrate macht diese Methode zu einer effektiven Methode, die das herkömmliche halbfeste Medium zum Nachweis der bakteriellen Motilität ersetzen kann.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Studie wurde durch das Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions (PAPD) und das Teaching Reform Research Project der China Pharmaceutical University (2019XJYB18) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Agar | Difco | ||
| Escherichia coli | ATCC | ATCC25922 | Positive control |
| Pseudomonas aeruginosa | ATCC | ATCC27853 | Positive control |
| Salmonella typhimurium | ATCC | ATCC14028 | Positive control |
| Staphylococcus aureus | ATCC | ATCC25923 | Negative nonmotile control |
| Tryptose | OXOID | ||
| TTC | Sigma | 298-96-4 | |
| VITEK 2 automated microbial identification system | Bio Mérieux |
References
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