Summary
我々は、広帯域刺激ラマン散乱(SRS)顕微鏡で化学画像を取得するためのプロトコルを提示する。差動マルチチャンネルロックイン検出で動作するSRS顕微鏡に基づいて、このプロトコルは、サンプル調製、SRS装置の調整、および化学的に不均一なサンプルの異なる成分を解きほぐすためのケモメトリックスを記述しています。
Abstract
誘導ラマン散乱(SRS)顕微鏡は、ラベルフリーの化学イメージングのための非線形光学技術です。この分析ツールは、薄いサンプルの分子振動を直接調べることで、薄いサンプルの高速かつ高い空間分解能で化学マップを提供します。その標準的な実装では、SRS顕微鏡は狭帯域であり、一度に単一の振動周波数のみを有する画像を形成する。しかし、このアプローチはSRSの化学的特異性を妨げるだけでなく、振動スペクトル内にコード化された豊富な情報を無視します。
これらの制限は、広帯域SRSによって克服することができ、画像のピクセル当たりの振動スペクトルを並列に抽出することができる実装である。これにより、化学測定分析と組み合わせると、検体から取得される情報量を最大化するハイパースペクトルデータが提供されます。したがって、広帯域SRSは、システムの化学的特異性を改善し、試料の異なる構成成分の濃度の定量的決定を可能にする。ここでは、カスタム差動マルチチャンネルロックインアンプ検出で動作する自家製のSRS顕微鏡に基づいて、広帯域SRS顕微鏡による化学イメージングのプロトコルを報告します。サンプル調製、SRS装置の位置合わせ、およびケモメトリック分析について説明します。振動ラマンスペクトルを取得することにより、プロトコルは、混合物内の異なる化学種を同定し、それらの相対濃度を決定する方法を示す。
Introduction
ラマン顕微鏡は、入射光2,3に応答して振動する分子に由来する非弾性放射プロセスであるラマン散乱1を測定することによって、豊富な化学マップを提供する強力なイメージング技術です。ラマンマップの各ピクセルには、サンプルの化学組成と構造に関する直接的な情報を含むスペクトルが含まれており、固有の振動コントラストを持つ画像が得られます。今日まで、ラマン顕微鏡は、他のイメージング技術では高い化学的特異性と高い空間分解能の両方を持つ画像を生成することができないため、分子振動のマイクロ分光法研究の基準的立場です4。その優れた化学的特異性にもかかわらず、ラマン散乱の発生効率は低く、ピクセル滞留時間の延長または高出力励起のいずれかが必要であり、それぞれ低い集録率と敏感なサンプルとの非互換性につながります。
ラマン顕微鏡のこの単一の欠陥により、研究者はコヒーレントなラマン散乱5、6、7、8、9を顕微鏡検査のコントラスト源として適用することになった。これは、振動応答を数桁(最大7桁)高める非線形光学プロセスであり、したがって、高速化学画像化10、11、12、13を可能にする。特に、最も採用されている2つのコヒーレントラマン散乱技術は、コヒーレント抗ストークスラマン散乱(CARS)14および刺激ラマン散乱(SRS)15である。CARSとは対照的に、SRSは共鳴分子の濃度に線形依存性を示す。それは非共鳴背景の影響を受けず、いかなる振動遷移にも無関係であるが、分子振動16,17のラマンスペクトルに特徴的なローレンツ形状に歪曲する非線形効果である。したがって、SRS顕微鏡検査は、直接定量的な画像分析を可能にする本物のラマン情報を生成します。
SRSは、サンプルの化学結合に関する直接情報を提供する3次非線形の光学プロセスです。これは、一般に近赤外スペクトル領域における2つの光学場、すなわち周波数ωpuおよびωSにおけるポンプおよびストークスの時空間重ね合わせに由来し、それぞれ10、11、18である。この重ね合わせは、ポンプストークス周波数デチューンΩ=ωpu-ω Sで拍動を発生させる。Ωが分子振動ΩRと一致すると、分子は共鳴し、光場と分子の間に一貫したエネルギー移動を引き起こす。その結果、分子は振動励起状態に達する。このプロセスは、ポンプ光子の消滅(刺激ラマン損失[SRL]として知られる信号)またはストークス光子の付随する増幅(刺激ラマンゲイン[SRG]として知られるプロセス)のいずれかを測定することによって監視することができる。SRGとSRLは、強烈で変動する背景(I)の上に座る小さな信号(ΔI)です。SRS信号の標準値(ΔI/I)は10-6-10-4の範囲にあるため、レーザーノイズによって容易に不明瞭になる可能性があります。レーザーノイズが信号対雑音比(SNR)に、ひいてはイメージング速度に及ぼす有害な影響を軽減するために、SRS検出は、レーザーノイズが最小値15、19、20に達する高変調周波数(>1MHz)での変調転送技術(ロックインアンプ、共振回路、ボックスカー平均器など)に依存しています。
従来のSRS顕微鏡は、狭帯域(≈10cm-1)ポンプとストークスパルスを用いて単一の振動周波数で化学画像を生成するため、100ns21,22の低画素滞留時間でのビデオレートイメージングが可能で≈。しかしながら、狭帯域SRS顕微鏡は、ほんの数振動周波数で試料を順次走査することによって化学マップを形成するので、その情報は限定的である23。1つまたは2つの振動コントラストを持つSRS画像は、特に異種系内で、ラマンバンドが重なり合う化学種を区別するのに十分ではないかもしれません。したがって、パラダイム的な狭帯域SRS顕微鏡は、一握りの振動周波数を調べることはその化学的特異性を妨げ、振動スペクトル内にコード化された豊富な情報を無視するため、SRSの可能性を最大限に活用しません。さらに、異なる周波数でのサンプルのシーケンシャルスキャンは、光損傷を引き起こし、連続する画像間の厳密な空間的共登録を防ぎ、モーションアーチファクトにつながるピクセル滞留時間を延長する結果をもたらす。
その狭帯域対応物とは対照的に、広帯域SRS顕微鏡は、各サンプルスキャン10、12、24でピクセルごとの振動スペクトルを取得する。したがって、広帯域SRSは、異なる振動コントラストの厳密な空間的共登録を伴うハイパースペクトルイメージングを提供し、厳密なデータ分析を可能にする。これは、ラマンスペクトルを通して試料の化学成分を明らかにするだけでなく、それらの相対濃度を決定するのにも役立ちます。スペクトルの取得方法に応じて、広帯域SRS顕微鏡はハイパースペクトルSRSまたはマルチプレックスSRSのいずれかに分類されます。ハイパースペクトルSRSでは、サンプルの走査点当たりのSRSスペクトルを順次取得し(すなわち、周波数デチューンΩを掃引して取得し)、連続したラマンシフトでSRS信号を積み重ねてSRSスペクトルを構築する。ラマンスペクトルは、マルチプレックスSRSの複数の振動モードで同時に測定されます。したがって、多重SRSアプローチは、変調された狭帯域パルスと広帯域パルスを組み合わせて異なる周波数でSRS信号を駆動し、狭帯域SRSに匹敵する感度を有するマルチチャネル検出器を使用してSRSスペクトルを検出する。
この論文では、多重SRS顕微鏡を使用して異種サンプルの化学マップを作成するためのプロトコルを提示する。このプロトコルで採用されたSRS顕微鏡のスキームを 図1 に示し、他の場所25、26、27で詳細に説明する。簡単に言うと、1040nmを中心とする140fsパルスを生成し、平均電力が10W、繰り返しレートが80MHzの商用モードロックYbファイバレーザが広帯域SRS顕微鏡を駆動します。偏光ビームスプリッタ(PBS)は、基本ビームを2つの分岐に分離します。狭帯域ストークスパルスを生成するために、基本ビームの4Wを有する1つの分岐が狭帯域(≈15cm-1)ビームを生成するエタロンに送られ、次いで音響光学変調器(AOM)を用いて1.6MHzで変調される。基本ビームの6Wを持つ残りのフラクションは、厚さ2.8mmの三ホウ酸リチウム(LBO)結晶で周波数を2倍にし、タイプIの位相マッチング(θ = 90°、φ = 13.8°)のために切断します。その結果、520nmでの第2高調波発生は、厚さ3.0mmのLBO水晶(タイプI位相マッチング、θ = 90°、φ = 9.8°)を活性媒体として使用し、680~910nmのスペクトル領域内で調整可能な広帯域の光放射を提供するデバイスである光パラメトリック発振器(OPO)をポンピングするためにX折り畳みキャビティに移動します(図2)。これらの広帯域パルスは、SRS実験においてポンプとして機能し、プリズムコンプレッサに伝播して顕微鏡対物レンズによって誘導される分散効果を事前に補償する。
圧縮段の後、λ/2波長板をYVO4 複屈折板と組み合わせると、検出面での電子減算によって広帯域ポンプのノイズが相殺される2つの直交偏光レプリカが生成されます。ダイクロイックミラーは、ポンプビームとストークスビームを組み合わせて、直立顕微鏡に送ります。開口数(NA)が1.27の水浸漬対物レンズは光をサンプルに集光し、NAが1.4の油浸対物レンズはサンプルを収集します。検出段の前に、ショートパスフィルタ(SPF)が変調されたストークスを除去し、リットロー構成で動作する回折格子が透過広帯域ポンプを分散させます。2番目のPBS 2がポンプレプリカを分離し、レンズがそれらを2 つのフォトダイオードアレイに集束させます。これらのフォトダイオードアレイからの信号は電子的に減算され、自家製のマルチチャンネルロックインアンプ(M-LIA)に送られます。復調された信号は、フォトダイオードアレイの1つの直流(DC)読み取り値によって正規化され、SRLスペクトルが生成されます。
例示的な実験として、我々は、それぞれが固有のラマンスペクトルを有するいくつかのよく知られているラマン散乱体の混合物を画像化する。したがって、プロトコルは、参照サンプルを準備する方法を説明することから始まります。SRLを検出したら、狭帯域ストークスパルスの取得方法と、広帯域(≈250cm-1)ポンプパルスを供給する光源、すなわち自家製OPOの設定方法について引き続き説明します。このプロトコルは、光ビームのアライメントと最適化を示し、狭帯域ストークスや広帯域ポンプのパワーやスペクトルなどの重要なパラメータを記述します。このプロトコルは、特殊な光学素子を必要とするため、広帯域ポンプの光路を詳細に記述しています。また、ポンプストークスパルス間の時空間的なオーバーラップを見つける方法についても説明し、相対強度ノイズ(RIN)を決定する実用的な方法を示し、SRS実験に最適な変調周波数を定義するのに役立ちます。次に、検出チェーンの動作原理と較正について説明します。最後に、プロトコルは、データ収集プロセス、ケモメトリックス、および画像処理パイプラインを示しています。
Protocol
1. サンプル調製
注:このプロトコルは、化学的に不均一な混合物の濃度マップおよび特性SRSスペクトルの検索を記述する。
- サンプルを調製するには、ポリメチルメタクリレート(PMMA)マイクロビーズの水性懸濁液から2 μLを抽出し( 材料表を参照)、2 μL画分を顕微鏡カバースリップに注ぎます。
- 清潔なピペットチップで、ポリスチレン(PS)マイクロビーズの水性懸濁液から2 μLを抽出し、それをカバースリップ上のPMMA懸濁液と組み合わせる。ピペットチップを使用して、懸濁液を静かに混合し、24時間乾燥させます。
注:サンプル表面上のマイクロビーズの不釣り合いな量を避けるために、マイクロビーズ懸濁液の濃度を慎重に一致させることが重要です。PSビーズとPMMAビーズの直径は、それぞれ10μmと6μmです。これらの寸法は、SRSの生成効率を損なうことなく、顕微鏡の高い空間分解能を実証することを可能にする。
- 清潔なピペットチップで、ポリスチレン(PS)マイクロビーズの水性懸濁液から2 μLを抽出し、それをカバースリップ上のPMMA懸濁液と組み合わせる。ピペットチップを使用して、懸濁液を静かに混合し、24時間乾燥させます。
- 水が乾いたときに現れるビーズの平らな白い層の上に、20μLのジメチルスルホキシド(DMSO)と20μLの純粋なオリーブオイルを加えます。
- 2番目の顕微鏡カバースリップの端にマニキュアを塗ります。マニキュアを下に向けてカバースリップを混合物の上に置き、密封するのに十分な圧力をかけます。乾かしましょう。
注: 図 3 は、これらのステップで得られた例示的な結果を示しています。適切に密封されていれば、このサンプルは最大3ヶ月間持続するはずです。
2. ポンプとストークスビームの最適化
- レーザーの電源を入れ、熱平衡に達します。GDD = -6,000 fs2 の負のグループ遅延分散(GDD)を基本ビームに適用します。
メモ: この GDD 値は、OPO を正常に駆動するために重要であり、この設定に最適ですが、システムによって異なる可能性があります。負のGDDは、空間光変調器28に基づく格子対、プリズム圧縮機、またはパルス整形器を介して導入することができる。 - 偏光ビームスプリッター(PBS1)で基本レーザーを2つの分岐に分割します。狭帯域ストークスパルスを得るには、4Wの1つの分岐をエタロンに導きます。狭いスペクトル線が得られ、パルススペクトルのピークを中心とするまで、エタロンをわずかに回転させます( 図2の赤い曲線を参照)。
注:このエタロンの有効フィネスは29で、自由スペクトル範囲は1,040nmで29.8nmです。 - 変調されたストークスパルスを得るには、狭帯域ビームを音響光学変調器に送ります。
メモ: 図 4A に示すように、1 次回折ビームは 100% の変調を経験しますが、0 次は 50% しか発生しません。したがって、SRS信号を発生させずにサンプルの光損傷を誘発する可能性のある強力な非変調ビームでサンプルを照らすことを避けるために、1次を採用することが好ましい。- 変調効率を最適化するには、レンズf1 とf2 の間の距離を変更します(図4B)。フォトダイオードで変調ビームを測定し、そのプロファイルをオシロスコープで記録します。
- オシロスコープの読み取り値の振幅とベースラインの間に最大のコントラストが得られるまで、f1 とf2 の間の距離を変更します。
注:このレンズのペアはコリメータとして動作しませんが、むしろAOMの結晶に効果的な焦点を作り出します。 - 第3レンズf3 を配置してストークスビームのウエストを微調整し、顕微鏡の焦点面での相互作用体積を変化させ、その結果、SRS信号を最適化する。
メモ: ストークスビームは、このプロトコルでは 1.6 MHz で変調されました。
- 基本ビームの残りの6Wの光パワーを三ホウ酸リチウム(LBO)結晶(LBO 1、θ = 90°、φ = 13.8°)に集束させ、 第2高調波発生(SHG)によって基本ビームの周波数を2倍にします(図5A)。
- SHG効率を最大化するには、水晶振動子をわずかに回転させ、φ角を変化させます(図5B)。LBO1 を最適化して、少なくとも 2.5 W の SHG を取得します。
- LBO2 のφ角を調整して、信号ビームの生成効率を最大化します。
注:レンズf1、f2、およびf3 の焦点距離は、SHGビームとOPOキャビティをモードマッチングするように慎重に選択されました。したがって、これらのレンズの焦点距離は、異なるセットアップで変化します。OPOキャビティ内の残留分散のために、キャビティの長さのわずかな変化は、信号ビームのスペクトルのシフトを誘発する。- キャビティの長さを調整して、1,040 nmの狭帯域ストークスとともに、1,373-5,090 cm-1以内の周波数デチューニングを生成できるポンプスペクトルを取得します。この範囲は、CH伸張スペクトル領域(2,800〜3,050cm−1)の振動をカバーする。 図 2 の青色スペクトルを参照してください。
- 励起顕微鏡の対物レンズによって誘起される分散効果を補償するには、広帯域ポンプをプリズムコンプレッサに送ります。ポンプをプリズムAの頂点からプリズムAに入力し、分散したポンプをプリズムBの頂点に導きます。必要な負の分散量を定義し、それに応じてプリズムの頂点L間の距離を設定します。
注: 図6は 、プリズム29の配置を示す。この場合、補償はGDD≈-12,800 fs2に設定されました。したがって、L = 1.26 m。- ブリュースターカットのプリズムを使用してください。
- ポンプビームの偏光がプリズムの三角形の平面(上/下の研磨されていない面)内にあることを確認します。
- ポンプビームの入 射角θinがブリュースター角と一致することを確認します。
- プリズムAの出口面がプリズムBの入射面と平行であることを確認します。
- 補償される広帯域パルスのGDDを推定するには、単一波長λ1のSRS信号を測定し、最大SRS(λ1)が得られるポンプストークス間の時間遅延τ1を記録する。 この手順を第2の波長λ2に対して繰り返し、SRS(λ2)が最大となる時間遅延τ2を再度登録する。
注:GDDは角周波数に対するグループ遅延の微分として定義されるため、前述の測定により、広帯域ビームのGDDの推定が可能になります(Eq [1])。
(1)
- ブリュースターカットのプリズムを使用してください。
- λ/2波長板を使用して、ポンプビームの偏光を45°に設定します。偏光ポンプを長さ13.3mmのYVO4 プレートに導き、この複屈折結晶の進相軸を垂直に設定します。
注:YVO4 プレートを通過すると、ポンプパルスは2つの直交偏光レプリカに分割され、共線状に伝播しますが、それらの間に遅延Δt≈10psが維持されます。この遅延は、複屈折結晶の厚さと屈折率の関数である。以降、ストークスパルスと同じ分極状態のポンプレプリカを「信号」と呼び、直交状態のものを「基準」と呼ぶ。インライン平衡検出と呼ばれるこの技術の詳細は、以前に30で説明されている。 - ポンプビームとストークスビームをダイクロイックミラーと組み合わせ、一対の蛍光ピンホールを使用して慎重に位置合わせし、両方がコリン状に伝播するようにします。ビームを減衰させ、レンズを使用して高速(少なくとも100MHzの帯域幅)フォトダイオードに集束させます。
- ポンプをブロックし、高帯域幅のデジタルオシロスコープで単一のストークスパルスを測定します。レーザーのトリガ信号をオシロスコープの測定のクロックソースとして使用します。フォトダイオード電圧が最大に達する平均値を求めます。
- ストークスビームをブロックし、ポンプパルスに対してこの手順を繰り返します。ポンプ(ストークス)ビームの光路を、そのパルスがストークス(ポンプ)パルスとほぼ同時に到着するまで増減します。
メモ:これにより、2つのアーム間の光路差のマッチングにおいて、最大で数ミリメートルの精度が保証されます。 - フォトダイオードを取り外し、ポンプストークス光子間の和周波数生成(SFG)に適したカット角度の非線形水晶を配置します。
注:ここで使用した非線形結晶は、タイプI位相整合のために切断され、θ = 90°、φ = 9.8°であった。非線形結晶の光軸は、ストークスおよび信号パルスの偏光に平行でなければならない。 - ポンプ/ストークスビームをわずかに非同一線にし、位相マッチングのためにポンプのSHGとストークスビームの間にある信号であるSFGまで遅延線を動かします。信号が見つからない場合は、水晶上の 2 つのビームの空間的な重なりを確認します。
メモ: SFG は青色にシフトしており、肉眼で簡単に見えるはずです。 - 予期せぬ問題が発生した場合は、ローパスフィルターを配置してポンプとストークス、およびそれぞれのSHGを取り外し、分光計でSFGを測定します(図7A)。SFGが最大強度に達する時間遅延、つまり非線形信号生成に必要な理想的な時空間オーバーラップを決定する値を求め、そこに遅延線を固定します(図7B)。
- 校正されたカメラでビームプロファイルを測定します。または、赤外線カードを使用して、目で直径を推定します。ポンプ用とストークスビーム用の2つの望遠鏡を使用してください。これらの望遠鏡では、ビーム直径を励起対物レンズの背面開口部に合わせるようにしてください。
メモ: この手順により、セットアップの最大空間分解能が保証されます。- SRS信号が得られたら、ポンプビームの望遠鏡を使用して直径を微調整し、レイリー範囲を変化させ、その結果、顕微鏡の焦点での相互作用体積を変化させます。最大SRSに達したら停止します。
- フォトダイオードを使用してポンプ(ストークス)ビームの強度を測定し、フォトダイオードの応答性を使用して、検出器のアクティブ領域に衝突する平均電力
を計算します。- 高帯域幅フォトダイオードを使用する場合は、電子ローパスフィルタを接続して、定数成分またはDC成分のみを取得します。δP(f)を測定するには、高帯域幅フォトダイオードの出力を接続し(ローパスフィルタを取り外します)、ロックインアンプの入力に接続します。ロックイン出力
を異なる復調周波数で保存し、フォトダイオードの応答性を使用してVからWに変換します。
注:市販のロックインアンプには、δP(f)を測定するためのツールが内蔵されています(たとえば、チューリッヒインスツルメンツはLabOneに組み込まれています)。 - ビームのRINを測定した後、レーザーをオフにして電子ノイズを測定します(つまり、検出器に光を当てずに計算されたRINです)。
注:RINがショットノイズではなくレーザー変動によって制限されている場合、この暗い測定は測定に使用される計装の診断に役立ちます。電子ノイズがレーザーのRINと同じくらい高い場合、これを使用してレーザーのRINを測定することはできません。超低ノイズアンプは、電子ノイズを低減するために使用しなければならないかもしれません。 - RINがレーザー変動ではなくショットノイズによって制限されている場合は、検出器により多くの光学パワーを当てます。 図 8 を参照してください。
- 高帯域幅フォトダイオードを使用する場合は、電子ローパスフィルタを接続して、定数成分またはDC成分のみを取得します。δP(f)を測定するには、高帯域幅フォトダイオードの出力を接続し(ローパスフィルタを取り外します)、ロックインアンプの入力に接続します。ロックイン出力
(1)
を異なる復調周波数で保存し、フォトダイオードの応答性を使用してVからWに変換します。3. SRSイメージング用のスペクトル検出の設定
- ポンプとストークスビームを顕微鏡に導きます。
- セクション 1 で説明したサンプルを配置し、ビーズのない領域を見つけて、ポンプ ビームの位置合わせに役立てます。カメラを使用して、ポンプ(ストークス)を遮断しながらストークス(ポンプ)ビームの反射プロファイルを測定します。顕微鏡の直前の鏡でレーザースポットの位置を調整します。
メモ: 最高の SRS 世代を得るには、完全にオーバーラップする必要があります。 図9 は、(A)ポンプ、(B)ストークス、および(C)顕微鏡の焦点面において完全に重なった両方のビームを示す。 - 励起と収集の目的を混同する。
注: 無限補正された対物レンズを使用すると、ポンプをサンプル平面に集束させると、収集目標の後方の開口部に平行ビームが生成されます。- ショートパスフィルターを入れて変調ストークスを取り除き、ポンプビームを格子に導きます。格子の後にレンズを配置して、分散ビームを検出器に集束させます。
注:格子方程式は、線形分散(すなわち、所与の焦点距離f32のレンズを有する検出器平面におけるmm当たり何nm)を決定するのに役立つ。格子式は、格子の溝周期性d、入射角α、回折角β、回折波長λ、回折次数m(Eq[2])に関するものである。
(2)
- ショートパスフィルターを入れて変調ストークスを取り除き、ポンプビームを格子に導きます。格子の後にレンズを配置して、分散ビームを検出器に集束させます。
- バランスの取れた検出のために、リファレンスのスペクトルとポンプビームに沿って伝播する信号レプリカを測定します。
注:格子の後のポンプビームの空間プロファイルは、その長さに沿って広帯域ポンプの異なるスペクトル成分を含む線である。ポンプラインの各スペクトル成分は、球面レンズによって距離 f に集束されます(ステップ3.1〜3.2を参照)。- 分散ポンプのクリッピングを避けるため、球面レンズを格子のできるだけ近くに置きます。球面レンズの直後にPBSを入れて、ポンプレプリカを分離します。
注:ここでは、この種の偏光子がポンプビームの偏光をスクランブルしないため、偏光立方体ビームスプリッタを使用しました。また、異なるポンプレプリカを効果的に分離し、広帯域ポンプのクリッピングを回避するのに十分な大きさにすることができます。PBSは信号レプリカ(s偏波)を反射し、参照レプリカ(p偏波)を送信します。 - 一対のステアリングミラーを使用して、信号とリファレンスをそれぞれの検出器に誘導します(図1)。
メモ: 理想的な平衡構成では、信号レプリカとリファレンスレプリカの光パワーは同じである必要があります。 - ポンプビームのノイズを除去するには、信号を測定するフォトダイオードアレイのチャンネルをリファレンス検出器の対応するチャンネルと相関させます。したがって、信号および基準フォトダイオードアレイのn番目の フォトダイオードが、信号および参照レプリカの同じスペクトル成分の光パワーを測定するようにする。
注: 図8は 、例示的なRINスペクトルを示す。
- 分散ポンプのクリッピングを避けるため、球面レンズを格子のできるだけ近くに置きます。球面レンズの直後にPBSを入れて、ポンプレプリカを分離します。
- 2つのフォトダイオードアレイ間のスペクトルマッチングを保証するには、格子とPBSの間に小さなスリットまたは虹彩を配置して、分散ポンプを空間的にフィルタリングします。ポンプレプリカの1つを除くすべてのスペクトル成分をクリップして、透過光線を基準および信号フォトダイオードアレイのn番目の 検出器に集中させます。前述のステアリングミラーを使用して、異なる検出チャンネルの相関関係を調整します。
- この時点で、SRS顕微鏡検査を開始します。これを行うには、ストークスを変調し、サンプルをラスタースキャンし、ポンプスペクトル(ΔI)の変調転送を対応するDCスペクトル(I)とともに取得して、各ピクセルから正規化されたSRS(ΔI/I)スペクトルを取得します。行 (x) と列 (y) にサンプルのスキャン位置が含まれる 3 次元行列を生成します。x-y 平面に直交する各ベクトル (z) に、SRS スペクトルを格納します。
メモ: 図 12 に、SRS ハイパースペクトル データの構造を示します。- ストークスビームの出力を65mW、広帯域ポンプビームの出力を20mWに設定します。実験の理想的な積分時間を設定します。
注: ここでは、積分時間は 44 μs でした。しかし、ピクセルの滞留時間は、ピエゾスキャナが遅いために1ミリ秒でした。
- ストークスビームの出力を65mW、広帯域ポンプビームの出力を20mWに設定します。実験の理想的な積分時間を設定します。
(2)4. ハイパースペクトルSRSデータのケモメトリックス
- 多変量曲線分解能解析を使用して、サンプルのさまざまな化学成分のもつれを解きます。Tauler, de Juan, and Jaumot33 のリンクから GUI をダウンロードしてください。
注:ここでは、タウラーと同僚によって開発された多変量曲線分解能交互最小二乗法(MCR-ALS)MATLABプログラムが34,35個使用されました。MCR-ALSからSRSデータへの適用については、36,37を参照してください。アルゴリズムに関する詳細な議論については、38を参照してください。 - MATLAB で、SRS ハイパースペクトル データ キューブを、SRS スペクトルを含む行を持つ行列 D に再形成します。展開されたSRLハイパーキューブDが、サンプルの化学成分の濃度CとスペクトルプロファイルSの線形結合であると仮定する(すなわち、D = CS T+ E、ここでEは実験誤差を含む行列であり、上付き文字Tは行列転置を示す)。
- データの主要コンポーネントを取得して、 C と S を分離 します。セクション 1 で説明したサンプルに 4 つの種、つまり DMSO、オリーブ オイル、PMMA、および PS が含まれていることが先験的に知られているように、バックグラウンド ノイズを説明するために 4 つの種と別の種を検索するようにプログラムを構成します。種の数が多い、または少ない別のサンプルがある場合は、それに応じてプログラムを構成します。
注: プログラムは、スペクトル データの特異値分解を行い、 純粋なスペクトル S の初期推測として使用します。- あるいは、既知のスペクトルトレース(例えば、物質の自発的なラマンスペクトル)を含むマトリックスをプログラムに供給する。
注: 純粋なスペクトルの初期推定値を使用して、プログラムは C = DS(S TS)−1 および S T = (CT C)−1 C T D を計算します。 C と S の新しい値は、交互の最小二乗アルゴリズムで最適化されます。
- あるいは、既知のスペクトルトレース(例えば、物質の自発的なラマンスペクトル)を含むマトリックスをプログラムに供給する。
- SRS は負でない信号であるため、正の値だけを返すように交互の最小二乗アルゴリズムを制限します。
注: 最適化された C と S により、新しい行列 D*= CST (プログラムが元のデータ D と比較するデータ セット) を構築できます。プログラムは、 D* と D の差が定義可能な任意のしきい値より小さくなるまで、これらのステップを自動的に反復処理します。 - CとSをプロットして、サンプルの化学成分の化学画像と特性スペクトルを取得します。
Representative Results
図3 は、PS、PMMA、およびオリーブオイルと共にこのプロトコルを用いて得られた例示的な結果を示す。LBO1 のこの回転は、SHG場が経験する屈折率を変化させ、その位相速度を直接変更する。SHG電界の位相速度がLBO1で誘起される非線形分極の位相速度と一致すると、非線形に生成された電界と非線形分極は同相になり、強いSHG放射につながります。つまり、LBO1 のφ角を微調整することで、SHGの理想的な位相マッチング条件を得ることができます。ここではI型位相整合結晶が使用されるため、SHGビームの偏光は基本ビームの偏光と直交します(図5B)。
図8は、このプロトコルで使用される光源のRINと、レーザーノイズに基本的な制限を設定する電子と光子の量子的性質の結果であるショットノイズ制限を示しています。ショットノイズ制限RINは、式(3)に示すように計算されます
。
(3)
ここで 、h はプランク定数、 ν は光周波数です。したがって、ショットノイズは、エレクトロニクス設計に役立つガイドラインを提供します。
図11Aおよび図11Cは、平衡スペクトルおよび不均衡スペクトルの例示的なデータを示す。当然のことながら、バランスのとれた検出の効果は、実験の最終結果、すなわち化学マップに影響を与える。図11Bおよび図11Dは、それぞれ、アンバランスおよびバランス条件下での合成画像を示す。記載されたプロトコルを正常に実装することは、不均一なサンプルの異なる化学成分を同定して局在化し、それらの特徴的なSRSスペクトルを抽出するのに役立ちます。図12のハイパースペクトルデータを化学測定分析に供すると、図13が得られる。図13Aは、試料の異なる化学成分の濃度マップの合成を示し、図13Bは、それらの特徴的なSRSスペクトルを示す。図13Aに示すデータは、サンプルの異なる成分を容易に識別するだけでなく、より定量的な分析を実行することを可能にすることに注意してください。たとえば、濃度マップを使用して、各化学種の分画濃度の平均を計算することができます:38%DMSO、25%PMMA、14%PS、および22%オリーブオイル。
図1:このプロトコルで採用されている広帯域SRS顕微鏡の概略図。 略語: PBSx = 偏光ビームスプリッター;SHG = 第2高調波発生モジュール;OPO = 光学パラメトリック発振器;AOM = 音響光学変調器;SPF = ショートパスフィルタ;M-LIA:マルチチャンネルロックインアンプ;DM = ダイクロイックミラー。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 2: 調整可能な広帯域ポンプ (青) と狭帯域 (赤) のストークス ビームのスペクトル。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:化学的に不均一な試料の明視野画像。 従来の顕微鏡では、異なる成分を区別することができないことに注意してください。スケールバー = 100 μm。略語: PS = ポリスチレン;PMMA = ポリメチルメタクリレート;DMSO = ジメチルスルホキシド。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:狭帯域ストークスパルスの変調。 (A)透明な青色のトレースは0番目の 回折ビームを示し、黒いトレースは対応する1次 を示す。(B)励起対物レンズに到達する前に、1次 回折ビームの変調効率を最適化し、ストークスビームのスポットサイズを微調整するための光学セットアップ。略語: AOM = 音響光学変調器;fx = レンズ X の焦点距離。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:OPOを駆動するために必要な非線形光学プロセス(A)SHG相互作用の幾何学。ω1の2つの基本光子は、物質系を高エネルギー仮想レベルに導き、そこから物質系が基底状態に跳躍し、ωSHGで光子を放出する。(b)SHG実験のスキーム。(C) SHG と OPO のセットアップの概略図。(D) DFG 相互作用のジオメトリ。ωSHG光子は、信号(ω信号)光子とアイドラー光子(ωアイドラー光子)に分割されます。信号ビームのゲインは、信号光子をフィードバックし、それらを空洞内で共振させることによって達成される。(e)DFG実験のスキーム。略語: SMx = 球面ミラー (R = 75 mm);OPO = 光学パラメトリック発振器;SHG = 第2高調波発生モジュール;DFG = 差周波数生成;LBO = トリホウ酸リチウム;OC = オイルコンデンサー;DM = ダイクロイックミラー;fx = レンズ X の焦点距離。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 6: プリズム コンプレッサーのジオメトリ。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図7:時空間オーバーラップを最適化するための合計周波数生成。 (A)ポンプとストークスの間のSFG、およびスクリーン上でのそれぞれのSHGの衝突。ここでは、レンズがポンプとストークスビームを結晶に集束させ、ローパスフィルターがそれらを除去しました。(B)時間遅延の関数としてのポンプとストークスの間のSFGの強度。SRS セットアップの時間を SFG を最大化する位置に設定します。 B における相互相関の非対称性は、ストークスビーム上のエタロンによって引き起こされる時間的プロファイルによるものです。略語: SFG = 合計周波数生成;SHG = 第2高調波発生モジュール;SRS = 誘導ラマン散乱分光法。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図8:RINスペクトル 緑色で強調表示されたバンドは、SRS実験に最適なスペクトル領域を示しています。この帯域内の任意の周波数でストークスビームを変調することで、SRS信号に対するレーザーノイズの影響が可能な限り最小限に抑えられることが保証されます。略語: RIN = 相対強度ノイズ;SRS = 誘導ラマン散乱分光法。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 9: ビーム プロファイル。 (A) ポンプ、(B) ストークス、および (C) ポンプとストークス この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 10: 分散格子とフォトダイオード アレイ検出器の想定ジオメトリ。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図11.バランス検出の効果。 スペクトル(A、C)および化学画像(B、D)への影響。パネル(B)および(D)に示されている複合材料は、実験の最終結果(すなわち、ハイパースペクトルデータのケモメトリック分析後)である。詳細については、プロトコルセクション 4 を参照してください)。スケールバー = 10 μm。略語:SRS=誘導ラマン散乱分光法。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図12:広帯域SRS顕微鏡で取得した代表的なSRSハイパーキューブ。 x-y 平面はスキャンされた位置の座標を格納し、z に沿った各ベクトルは SRS スペクトルを登録します。略語:SRS=誘導ラマン散乱分光法。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図13:ハイパースペクトルSRSデータの化学測定分析 。 (A)サンプルの異なる成分の濃度マップの合成。(b)化学種の特徴的なスペクトル。どちらのパネルでも、黄色:オリーブオイル、青:DMSO、シアン:PS、オレンジ:PMMAです。スケールバー = 20 μm (A)。略語: SRS = 誘導ラマン散乱分光法;PS = ポリスチレン;PMMA = ポリメチルメタクリレート。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
Discussion
広帯域SRS顕微鏡は、不均一なサンプルの化学成分を同定し、解きほぐすために本物の化学的コントラストを提供する強力なイメージング技術です。この分析ツールの可能性は、材料科学から組織病理学に至るまで、いくつかの研究分野にとって有益であり得る。ブロードバンドSRS顕微鏡の欠点は、技術的に要求が厳しいという事実です。実験家は、広帯域レーザー光源に関するノウハウを必要とするだけでなく、レーザーパルスを操作してSRSを効率的に生成する必要があり、その信号は高度な検出方式で測定する必要があります。この論文は、多重広帯域SRS顕微鏡を使用して混合化合物の化学マップを生成するワークフローを記述するプロトコルを提示する。説明されている研究は、一部のレーザー物理学者や非線形顕微鏡学者にとっては些細なことかもしれませんが、科学的知識がこれらの領域外に存在するブロードバンドSRS顕微鏡の利点に興味がある読者にとっては当てはまらないかもしれません。したがって、私たちは、ブロードバンドSRS顕微鏡に興味を持つ幅広い聴衆を導くために、すべてのステップを詳述することを目的としていました。
手元にあるプロトコルは、いくつかの強力で有名なラマン散乱体で構成されるシンプルでありながら分光学的に豊富なサンプルを調製する方法を示すことから始まりました。SRS顕微鏡のセットアップに必要な広帯域ポンプと狭帯域ストークスビームの入手方法について説明しました。図 5C は、SHG セットアップと OPO セットアップのスキームを示しています。レンズf1は基本ビームをLBO1に集束させてSHGを生成し、ダイクロイックミラーはSHG放射を反射して残留基本ビームを透過することに注意してください。第2レンズf2は、SHGビームを平行化する。f 2 > f 1 として、SHG ビームは f2/f1 に等しい係数だけ拡張されます。第3レンズf3は、膨張したSHGビームをθ=90°およびφ=29.0°で切断された第2のI型LBO結晶(LBO2)に集束させる。前述のSGH(520nm)でLBO 2をポンピングすることにより、680〜910nmの範囲内の放射が差分周波数生成(DFG)を介してLBO 2から出現し、信号とアイドラー27の2つのビームを生成する(図5D、E)。後者は廃棄され、前者はOPOキャビティ内で増幅され、SRS実験で使用されたポンプパルスを送達する。520nmにおけるOPOのポンプ、すなわちSHGビームは、SRS実験のポンプ(すなわち、OPOの信号ビーム)と混同してはならない。
SRS顕微鏡におけるコントラストは、顕微鏡の焦点で生成された非線形信号、すなわち所定の時間に試料平面内に多数の光子を閉じ込めることを要求する信号に由来する。この光子閉じ込めは、高開口数(NA)顕微鏡の対物レンズ、系の空間分解能も設定するレンズの配列で達成される:NAが高いほど、空間分解能は高い。しかしながら、高いNA対物レンズはガラスで密に詰め込まれており、これはパルス放射に正のGDDをもたらし、パルス39の時間的プロファイルを最終的に広げる周波数チャープである。したがって、顕微鏡対物レンズによって導入されたGDDは、広帯域ポンプパルスの持続時間を増加させ、ストークス時間エンベロープよりもさらに長くし、ラマン信号の有効でアクセス可能な帯域幅を減少させる可能性がある。さらに、この拡大は、測定されたSRSスペクトルのスペクトルプロファイルの歪みも引き起こす可能性がある。
CARSでは、分光学的に関連する信号は、励起場の波長とは異なる波長で出現します。シンプルな光電子増倍管または電荷結合素子(CCD)カメラを使用して、CARS信号を時間内に統合し、数千パルスを合計してレーザーノイズを平均化することができます。代わりに、SRS信号は、強く変動するレーザー背景に埋め込まれたかすかな変調転送として表示されます。この変調は弱いため、レーザーノイズが容易にそれを圧倒し、SRS顕微鏡のイメージング速度と感度の両方を低下させる可能性があります。したがって、イメージングの前に、相対強度ノイズ(RIN)を測定して、レーザが高速SRSイメージングに適しているかどうかを判断し、ノイズが最も低い変調周波数を選択することが不可欠です。RINは、平均光パワー()40,41で正規化されたレーザーのノイズパワースペクトル密度[δP(
f)、W2/Hz単位]として定義されます。言い換えれば、RINは異なる周波数での正規化されたレーザー変動を記述する(Eq [4])。
(4)
したがって、RINは、実験のための理想的な変調周波数範囲を決定するSRSシステムのパラメータである。たとえば、 図8 のオリーブバーは、SRSイメージングに理想的な変調周波数範囲を示しています。狭帯域SRSの場合、ユーザーはポンプとストークスの両方のRINを測定して、最適な性能を達成するために変調する必要があるビームを選択する必要があります。たとえば、 図8から、ストークスビームのRINはポンプよりもわずかに高いため、SRG測定はSRL測定よりもノイズが多いことが示唆されています。広帯域SRSの場合、変調すべきビームは狭帯域ビームである。
格子の角度分散 D は、回折角を波長の関数として表し、格子方程式の微分として定義される。リットロー配置の場合、角度分散は式(5)で与えられる。
(5)
Eq (5) を得るために、α = βと仮定し、m/d の Eq (2) を解き、その結果を d β/d λ に挿入します。リトロウ構成では、β = sin-1(m λ/2 d) であることに注意してください。小角近似では、スペクトルに沿った位置の変化はfdβ ≈dlです(図10)。したがって、式(5)にdβを挿入することにより、式(6)を使用してnmmm-1の単位を持つ線形分散量を計算できます。
(6)
1,851.85 溝/mmのリットロー構成で動作する回折格子の場合、d = 540 nmです。約789 nmの光の一次回折を使用すると、D = 0.0027 rad nm-1になります。f = 750 mm レンズでは、≈ 0.5 nm mm-1 の線形分散が得られ、≈ 7.8 cm-1 mm-1 に変換されます。したがって、レンズの焦点距離は、検出器平面におけるnm/mmの「密度」を決定する:焦点距離が長いほど、得られるnm/mmは少なくなり、広帯域ポンプのスペクトル線間の空間が増加する。逆に、焦点距離が短いと、検出器平面でmmあたりのnmが多くなり、分散ポンプが占有するスペースが減少します。
バランスの取れた検出により、ノイズの多いセットアップの画質と感度が向上します。 たとえば、図8に示すRINスペクトルに従って、振幅が1 x 10-5の典型的なSRSを考慮すると、不平衡信号対雑音比(SNR)は≈60です。バランスの取れた検出(すなわち、ショットノイズに近い)を使用して、≈145のSNRを達成することができる。図11は、平衡条件下および不均衡条件下でのスペクトルおよび合成画像を示す。当然のことながら、バランスのとれた検出の効果は、実験の最終結果、すなわち化学マップに影響を与える。これらの結果に裏付けられて、我々は、バランスの取れた検出が画質に対するレーザー変動の有害な影響に対抗する強力な技術であることを強調する。 バランスの取れた検出は、ファイバ発振器などのノイズの多いレーザに最も適していることに言及する価値があります。静かな光学光源(例えば、固体レーザー)で動作するSRS顕微鏡は、バランスのとれた検出を必要としないかもしれない。
このプロトコルはまた、これらのビームのパルス間の時空間的重複を見つけるための非線形光学に基づくアプローチも説明する。AOMの0番目の回 折次数の代わりに1st を変調ストークスビームとして使用する利点について説明しました。さらに、SRS生成効率に対する分散の有害な影響は、プリズムコンプレッサを介してそれらを緩和する方法の提案とともに説明されました。さらに、このプロトコルでは、プリズムの位置合わせ方法を説明し、最適な性能を得るために考慮すべき3つの重要な側面を強調しています。SRS顕微鏡に対するRINの関連性について論じるだけでなく、ロックインアンプでRINを測定し、RINスペクトルを使用して最適な変調周波数を定義する方法も示します。このホワイトペーパーでは、具体的な例を挙げて、格子方程式が検出チェーンの設計にどのように役立つかを説明します。最後に、このプロトコルは、実際のSRSデータを使用して、SRSハイパーキューブの構造と、従来使用されてきた科学プログラミング言語で分析する方法を示しています。
このプロトコルには 3 つの小さな制限があります。第一に、この貢献で採用された検出方式は、Sciortino et al.26によって社内で設計および構築された非従来型のマルチチャンネルロックイン検出器で構成されています25で実証したように、この検出器は既製の平衡フォトダイオードに置き換えることができます。この変更は検出器にのみ関係し、プロトコルは実質的に変更されませんが、単一のフォトダイオードでは、検出器上の各スペクトル成分を一度にすべて測定するのではなく、スキャンする必要があります。第2に、このプロトコルはインライン平衡検出を採用しており、ビーム経路にいくつかの光学素子を挿入する必要があります。これらの光学素子は、システムの複雑さを増大させ、光パワーの損失とパルスの広がりにつながります。
インラインバランス検出はまた、2つのポンプレプリカがサンプルを通過することを要求し、生細胞などの光感受性サンプル、または2つのポンプレプリカが異なる光学特性を経験する可能性がある強複屈折サンプルには理想的ではない可能性があり、したがってバランスのとれた検出をキャンセルする。第三に、このプロトコルは自家製のOPOに依存しており、容易には入手できない可能性があるデバイスです。しかし、OPOによって送達される広帯域スペクトルの代替案は、非線形光ファイバまたはバルク結晶からの超連続体である。後者は、低繰り返しレートレーザ(最大5MHz)でのみ採用できた。したがって、すべての実験計画と同様に、手元にあるプロトコルにはいくつかの制限があります。ただし、それらは最小限であり、このアプローチの成功を損なうことはありません。
参照サンプルがここで説明されていますが、このプロトコルは、セルロース、脂質種、タンパク質などの細胞および動植物組織内の化学種をうまく解きほぐし、さまざまな生化学的探求における実用的な用途や組織病理学における診断ツールとして見つけることができます。同様に、このプロトコルは材料科学において貴重なツールとなり得ます。例えば、このプロトコールに従って、ポリマー種42の分子組成および濃度を調べることができる。さらに、この方法論は、ポンププローブ43およびヘテロダインCARS44に基づく広帯域顕微鏡法、SRSと同様に、2つの励起光ビームおよび変調伝達測定も必要とする4波混合プロセスなどの他の非線形顕微鏡技術と互換性がある。最後に、この論文に含まれる情報の一部は、変調伝達技術に依存しないが、従来のCARS45およびSFG顕微鏡46のような2つ以上のパルスレーザビームを位置合わせすることを必要とする非線形画像化技術に適用することができる。
要約すると、このプロトコルは、広帯域SRS顕微鏡に基づく強力な方法論を説明し、化学的に不均一な混合物から化学マップとその特徴的なSRSスペクトルを抽出し、簡単な定量的データ分析を可能にするデータセットを提供する。この方法の汎用性と単純さは、関心のある読者に、それを異なる非線形技術に適応させる可能性も与えます。
Disclosures
G.C.は、ブロードバンドSRS顕微鏡技術の商業化を目指すケンブリッジ・ラマン・イメージング社との関わりを宣言します。他の著者は利益相反を宣言しません。
Acknowledgments
D. P.は、グラント協定第101016923号に基づく欧州連合のプロジェクトCRIMSONおよびグラント契約第号に基づく地域ロンバルディアプロジェクトNEWMEDからの資金提供を認める。POR FESR 2014-2020.G. C.は、欧州連合のプロジェクトGRAPHENE Core3からの助成金契約番号881603の資金提供を認めています。G. C.はまた、キング・アブドラ科学技術大学、助成金賞番号:OSR-2016-CRG5-3017-01からの資金提供を認めています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collection objective | Nikon | CFI Apo Lambda S 60x Oil, NA=1.4, Nikon | Oil immersion objective |
| Coverslips | Thermo Fisher | 043211-KJ | Quartz, cover slip for microscope slide, 25.4 x 25.4 x 0.15 mm |
| Delay line | Physik Instrumente (PI) | M-406.6PD | Precision microtranslation stage, 150 mm travel range |
| DMSO | Merck | D8418-500ML | Methylsulfinylmethane, Molecular Biology Grade DMSO, DMSO, Methyl Sulfoxide |
| Etalon | SLS Optics Ltd | Custom made | Anti reflective coating at 1,040 nm, Mounted in a 38 mm diameter x 35.5 mm long stainless steel cell with protective dust caps, and a 50 mm diameter ‘pinch-clamp’ mounting ring |
| Excitation objective | Nikon | CFI Plan Apo IR 60XC WI, NA=1.27, Nikon | Water immersion objective |
| Grating | LightSmyth | T-1850-800s Series | High Efficiency Transmission Grating T-1850-800s Series |
| Laser | Coherent | Custom made | Fidelity, HP |
| λ/2 | Thorlabs | SAHWP05M-1700 | Mounted superachromatic half-wave plate |
| PBS | Thorlabs | CM5-PBS203/M | 16 mm Cage-Cube-Mounted Polarizing Beamsplitter Cube, |
| PMMA beads | Merck | MFCD00198073 | Micro particles based on polymethacrylate |
| Prisms | Crisel | 320-8218 | LASER DISPERSING PRISMS in SF11 |
| PS beads | Merck | 72986-10ML-F | Micro particles based on polystyrene |
| YVO4 crystal | Dr. Sztatecsny GmbH | Custom made | thickness 8 mm, dia 1.00 cm, 1 689,00 689,00 suitable for 1" mount, coated for 850 - 1,100 nm |
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