Summary
Het huidige protocol beschrijft transmissie-elektronenmicroscoop (TEM) modificaties met een lichtverlichtingssysteem, de fabricage van vloeibare cellen en in situ TEM-waarnemingen van door licht geïnduceerde interacties tussen bacteriële cellen en een fotosensitizer. De monstervoorbereidingsmethoden, elektronenbundelschade en beeldvorming worden ook besproken.
Abstract
Het huidige protocol beschrijft de modificaties van de transmissie-elektronenmicroscoop (TEM) opstelling voor in situ licht-geïnduceerde waarnemingen. Een glasvezel die in de elektronenkolom boven het objectieflenspaalstuk werd gestoken en een laser, een instelbare lichtbron, werd gebruikt om het apparaat te fabriceren. Nadat de illuminator is gekalibreerd met behulp van een extern meetsysteem, kan men de intensiteit van de verlichting aanpassen aan de behoeften van het waargenomen proces. Dit verlichtingssysteem werd gebruikt om antimicrobiële fotodynamische therapieverschijnselen in beeld te brengen, die momenteel het onderwerp zijn van intensief onderzoek. Het monster werd bereid door een suspensie van bacteriën op een koolstof-, grafeen- of siliciumnitridesubstraat te spotten, de overtollige oplossing te deppen, de fotosensitizeroplossing te spotten, de overtollige vloeistof opnieuw te deppen en vervolgens de vloeibare cel samen te stellen met een tweede substraat of grafeenfilm. Het proces van het beeldvormingsexperiment zelf omvat het kiezen van de juiste plaats voor observatie met behulp van een lage vergroting en een minimale dosis elektronen, en vervolgens cyclische activering van de lichtbron om volgende beelden met gespecificeerde intervallen vast te leggen met de minimale hoeveelheid elektronen die nodig is. De elektronendosis van elke blootstelling en de tijd en intensiteit van de gebruikte verlichting moeten zorgvuldig worden geregistreerd vanwege de complexiteit van de waargenomen verschijnselen, omdat het proces tegelijkertijd zowel licht- als elektronengestuurd is. Nadat het eigenlijke experiment is uitgevoerd, moeten aanvullende controlewaarnemingen worden gedaan, waarbij dezelfde doses elektronen worden gebruikt, maar zonder extra lichtinvloed en kleinere doses elektronen worden gebruikt voor hogere doses licht. Dit maakt het mogelijk om door licht geïnduceerde microstructurele effecten te onderscheiden van die veroorzaakt door elektronen op zowel het gebied van het leven als de materiaalkunde.
Introduction
Lichtgeïnduceerde verschijnselen in hoge resolutie zijn interessant op vele gebieden, zoals nano-engineering 1,2,3, katalyse 4,5 en biofotonica6. Enkele originele ontwerpen die dergelijke experimenten mogelijk maken, zijn te vinden in de literatuur, inclusief modificaties van de monsterhouders 1,4,7,8,9 en de optische vezel bevestigd aan de microscoop10,11.
De combinatie van lichtverlichting, een vloeibare omgeving en transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) biedt een geweldige kans voor gedetailleerde, dynamische studies van foto-geïnduceerde processen. De hoogvacuümconditie in de microscoop is echter nogal ongunstig voor veel vloeistoffen, vooral wateroplossingen. Vloeibare inkapseling, die het beschermt tegen de omgeving, kan worden bereikt met behulp van een paar technieken die voornamelijk zijn gebaseerd op grafeen12, siliciumnitride13 of koolstof14 substraten. Naast onderzoek in materiaalkunde2 bieden zogenaamde vloeibare cellen mogelijkheden voor het uitvoeren van onconventionele microscopische waarnemingen op biologische specimens in de buurt van hun oorspronkelijke omstandigheden15. Dergelijke waarnemingen zijn uiterst veeleisend, vooral voor levende micro-organismen zoals bacteriële cellen. De elektronenbundel als ioniserende straling veroorzaakt onomkeerbare schade aan de gehydrateerde monsters, dus de elektronendosis moet wordengespecificeerd 16. Dit is nodig om ongunstige effecten te minimaliseren, de schade te beheersen en verwarrende artefacten te voorkomen. De optimale maximale elektronendosis die waarnemingen van levende cellen mogelijk maakt is nog een twijfelachtig onderwerp16, maar de dosis van 30 e−/nm2 lijkt de drempelwaarde te zijn, althans voor bacteriën17.
Enkele van de onderwerpen die van belang zijn voor dergelijke microscopische studies zijn processen tijdens antimicrobiële fotodynamische therapie (APDT)18. Kortom, de therapie verloopt als volgt. De bacteriële cellen worden omringd door de lichtgevoelige vloeistof genaamd photosensitizer. Wanneer lichtverlichting wordt gegeven op een specifieke golflengte, worden de cytotoxische reactieve zuurstofsoorten (ROS) gegenereerd uit energie- of ladingsoverdracht van de geëxciteerde fotosensitizermoleculen naar de zuurstof die van nature in de oplossing aanwezig is. Pathogenen blootgesteld aan ROS worden snel geïnactiveerd met een zeer hoge efficiëntie, zonder bijwerkingen19. De respons op de therapie varieert voor verschillende microben - de impact van dezelfde fotosensitizer kan bijvoorbeeld heel anders zijn voor Gram-positieve en Gram-negatieve bacteriën20. In het algemeen is vastgesteld dat het belangrijkste doelwit van ROS de buitenste structuren van cellen zijn, waar schade resulteert in functionele stoornissen van het celmembraan en bijgevolg leidt tot de dood van bacteriën21,22. Schade aan nucleïnezuren en eiwitten kan echter ook worden beschouwd als een oorzaak van inactivatie18, dus het is nog onbekend welke celstructuren de belangrijkste doelwitten zijn tijdens dit proces19. Een dieper inzicht in de schadelijke processen zou kunnen helpen om deze definitieve therapie te verbeteren. Vergeleken met de lichtmicroscopiemethoden die in APDT-onderzoek23 worden gebruikt, geven TEM-technieken meer mogelijkheden om naar het APDT-mechanisme te kijken met een hogere resolutie en vergroting24. TEM is al met succes gebruikt voor celobservatie tijdens de lopende therapie, waardoor we Gram-positieve bacterieschade konden bestuderen en de veranderingen in de celwand in detail konden beschrijven 6,25.
Het huidige protocol presenteert een geschikte experimentele opstelling voor beeldvorming met hoge resolutie van door licht geïnduceerde bacteriën inactivatie met behulp van TEM, wat een goed lichtverlichtingssysteem, de inkapseling van cellen met een vloeistof en strikte elektronendosiscontrole vereist. De bacteriën die voor de observatie werden gebruikt , waren Staphylococcus aureus en een methyleenblauwoplossing werd gebruikt als fotosensitizer. De speciale lichtverlichtingsopstelling bestaat uit een instelbare halfgeleiderlaser die rechtstreeks op de microscoopkolom is aangesloten met behulp van de lichtvezel. Dit ontwerp biedt een uniforme bestraling in het hele monster vanwege de bijna parallelle plaatsing van de optische vezel op de microscoopas. Monochroom licht van hoge intensiteit gegenereerd door de laser kan vervolgens worden gebruikt om verschillende fotochemische effecten te bestuderen. Het licht dat in het experiment werd gebruikt, had een golflengte gelijk aan 660 nm omdat methyleenblauw in het zichtbare gebied absorptiepieken heeft bij 613 nm en 664 nm26. Het protocol voor vloeibare inkapseling is gebaseerd op koolstofsubstraten, waardoor de procedure snel en ongecompliceerd is. Ten slotte wordt een methode voor lage dosis in situ TEM-observatie van cellen in vloeistof gepresenteerd. De moeilijkheden met betrekking tot de monstervoorbereiding, de elektronendosiseffecten op het gevoelige monster en een redelijke beeldinterpretatie worden besproken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Transmissie elektronenmicroscoop modificatie
- Wijzig de transmissie-elektronenmicroscoop door de optische vezel (zie tabel met materialen) aan te sluiten op de microscoopkolom bovenaan de objectieflens. Houd rekening met een paar centimeter ruimte tussen de objectieflens en de condensorlens, plus een vrije sleuf voor accessoires.
OPMERKING: Een speciale monsterhouder4 of een houder voor cathodoluminescente waarnemingen in omgekeerde configuratie1 kan ook worden gebruikt. - Controleer het systeem op lekken met behulp van ruwe vacuümpompen. Als het systeem geen vacuümlek vertoont, test het systeem dan onder een hoog vacuüm.
- Controleer of de bediening van het vacuümsysteem niet afwijkt van de standaard geventileerde microscoopstart. Neem in geval van problemen met de uitvoering, montage of inbedrijfstelling van de module contact op met geautoriseerd servicepersoneel of de fabrikant van het apparaat.
OPMERKING: De correct gemaakte en gemonteerde illuminator zal de elektronenbundel niet verduisteren. Als de bundel tijdens de werking van de microscoop achtereenvolgens verschuift, zal de niet-geleidende optische vezel niet voldoende bedekt zijn met een metalen afscherming en een elektrische lading accumuleren. Schuif in dit geval de optische vezel diep in de geleidende mantel.
- Controleer of de bediening van het vacuümsysteem niet afwijkt van de standaard geventileerde microscoopstart. Neem in geval van problemen met de uitvoering, montage of inbedrijfstelling van de module contact op met geautoriseerd servicepersoneel of de fabrikant van het apparaat.
- Meet de lichtintensiteit met behulp van de fotodiode vermogenssensor (zie Materiaaltabel). Als de ruimte tussen de poolstukken van de objectieflens geen meting in de microscoop mogelijk maakt, meet dan de geometrie van het monster en de illuminator en reproduceer deze omstandigheden in een externe meetopstelling.
- Als de microscoop niet is uitgerust met een elektronendosismeetsysteem, voert u de kalibratie uit door de bundelstroom te meten met een Faraday-beker (zie Materiaaltabel) en numeriek de dichtheid te berekenen van elektronen die het monster raken27.
2. Inkapseling van bacteriën met de fotosensitizer
- Plaats twee onbehandelde TEM-roosters bedekt met amorf koolstof tussen twee gekruiste pincetten die naar de koolstofgecoate kant naar boven zijn gericht. Houd de roosters zo dicht mogelijk bij de rand.
OPMERKING: Voor bepaalde substraat-, oplossings- en monstercombinaties kan het nuttig zijn om gloeiafscheiding op een of beide mazen te gebruiken om fabrieksonzuiverheden te verwijderen en een maximaal hydrofiel oppervlak te verkrijgen28. Aan de hand van het voorbeeld van S. aureus-bacteriën en methyleenblauwoplossing werd vastgesteld dat de beste en meest reproduceerbare resultaten werden verkregen op nieuwe, niet-behandelde koolstof op koperen roosters zonder extra gloetinthoot of plasmareiniging6. - Plaats 4 μL bacterie-oplossing op een van de roosters. De optische dichtheid van het monster moet tussen 5 en 10 liggen.
OPMERKING: De bacteriën die in het onderzoek werden gebruikt, werden gezuiverd uit de cultuur en verspreid in PBS-buffer. Het wordt ten zeerste aanbevolen om de concentratie van bacteriën in het verse monster elke keer te controleren, bijvoorbeeld met behulp van negatieve kleuringsmethoden, volgens de vastgestelde beschikbare protocollen 29,30,31. - Wacht 60 s en dep de vloeistof voorzichtig met filterpapier. Probeer de vloeistof tijdens dit proces over het hele roosteroppervlak te verspreiden.
- Leg 4 μL fotosensitizer op hetzelfde rooster.
OPMERKING: Methyleenblauw in een concentratie van 2 μg/ml werd gebruikt als fotosensitizer voor deze studie. - Na 5 s, veeg de vloeistof uit. Laat een zeer dunne laag vloeistof achter op het substraat.
- Plaats het droge rooster snel bovenop het rooster dat bedekt is met vloeistof.
- Verplaats het bovenste rooster voorzichtig naar de rand van de tweede en knijp de substraten aan de randen met een pincet.
OPMERKING: In dit stadium kan er wat vloeistof uit het monster stromen, wat betekent dat er niet genoeg is afgetapt. Dit betekent echter niet noodzakelijkerwijs dat de vorming van de vloeibare cel niet succesvol zal zijn. - Herhaal voorzichtig het knijpen.
OPMERKING: Het is gemakkelijker om deze stap uit te voeren door het pincet 90 ° te draaien, zodat ze loodrecht op de tafel liggen en de uiteinden van beide pincetten op dezelfde hoogte blijven, niet afhankelijk van de open / sluitpositie. - Laat de vloeistofcel tussen het pincet 1 min staan.
- Steek het monster direct na het voltooien van de bereiding in de TEM-houder.
OPMERKING: De spanning van de montageplaat/ring van de houder helpt de substraten om zich te hechten en de vloeistof binnen te houden.- Pomp indien mogelijk de monsterhouder in een extern pompstation om de vervuiling van de microscoop door vloeistof te verdampen te verminderen.
3. In situ TEM-waarnemingen van bacteriële cellen in vloeistof-elektrondosiseffect
- Plaats het monster in de microscoop.
- Start de waarnemingen in de modus met lage vergroting om een geschikt waarnemingsgebied te vinden.
OPMERKING: Donkere gebieden zijn waarschijnlijk vloeibaar vanwege verstrooiing van elektronenbundels.- Houd tijdens de waarnemingen de elektronendosis zo laag mogelijk. Breid de belichtingstijd uit (tot 2 s voor een versnellende spanning van 150 kV en een vergroting van 5.000x). De vergroting van 5.000x voor de bottom-mount camera (geschatte beeldhoek is 10 μm) is voldoende om bacteriën met een diameter van ~1 μm in beeld te brengen.
OPMERKING: Soms is het niet gemakkelijk om de vloeistof te onderscheiden, dus aan het begin van de waarnemingen is het nuttig om de elektronenbundel te concentreren waar deze waarschijnlijk vloeibaar is. De vloeistof moet bewegen op een gerichte elektronenbundel en de bellen zullen verschijnen. Na deze verificatie is het noodzakelijk om een ander gebied te vinden voor verdere waarnemingen.
- Houd tijdens de waarnemingen de elektronendosis zo laag mogelijk. Breid de belichtingstijd uit (tot 2 s voor een versnellende spanning van 150 kV en een vergroting van 5.000x). De vergroting van 5.000x voor de bottom-mount camera (geschatte beeldhoek is 10 μm) is voldoende om bacteriën met een diameter van ~1 μm in beeld te brengen.
- Zoek de cellen omringd door vloeistof op de juiste vergroting met langere belichtingstijd en leg de eerste afbeelding onmiddellijk vast. Houd de elektronendosis constant en verzamel elke 30 s beelden om de veranderingen waar te nemen.
- Onderzoek de beelden zorgvuldig en bereken de totale elektronendosis27 die overeenkomt met de eerste zichtbare veranderingen in de cellen.
4. In situ TEM-waarnemingen van door licht geïnduceerde processen tussen bacteriële cellen en fotosensitizer
- Voordat u het experiment start, stelt u de intensiteit van het laserlicht in door de huidige waarde aan te passen. Kies de juiste golflengte op basis van het absorptiespectrum van de fotosensitizer. Kies volgens de vorige kalibratieplot (stap 1.4.) de huidige waarde die overeenkomt met de laagste lichtintensiteit.
OPMERKING: De lichtgolflengte die in deze studie werd gebruikt, was 660 nm. - Plaats het monster in de microscoop en zoek het observatiegebied na stap 3.2. in de vorige sectie.
- Leg het eerste beeld van de cel vast voordat u begint met het verlichten van het monster en gebruik de beam blanker om de elektronenbundel uit te schakelen om de effecten van elektronenbestraling te voorkomen.
- Schakel de laser in. Begin met een korte verlichtingstijd (hier 30 s) omdat het laserlicht een relatief hoge intensiteit heeft. Schakel na die tijd de lichtbron uit.
- Schakel de beam blanker uit en leg het beeld onmiddellijk vast. Gebruik indien mogelijk een automatisch algoritme om het monster alleen weer te geven voor de tijd die nodig is voor het maken van de afbeelding. Meet zorgvuldig de elektronenbestralingstijd om de elektronendosis27 te berekenen die wordt gebruikt voor beeldvorming.
- Herhaal stap 4.4. en stap 4.5. om de verwachte lichtverlichtingstijd te verkrijgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De experimentele opstelling is ontworpen om de door licht geïnduceerde processen te observeren die plaatsvinden in een vloeistof met een hoge resolutie. De concurrentieanalyse van de beelden stelde ons in staat om de schade veroorzaakt door de elektronenbundel te onderscheiden van veranderingen die verband houden met de fotochemische reactie. Het effect van de elektronenbundel op het gevoelige monster (in dit geval de cellen ingekapseld met vloeistof) was overal zichtbaar in het bestraalde gebied toen de elektronen er gelijkmatig doorheen drongen. Natuurlijk hangt het effect af van de elektronendosis, dus meer significante veranderingen in de monstermorfologie kunnen sneller worden waargenomen voor een meer gerichte bundel. Vergeleken met deze ernstige schade traden de werkelijke destructieve effecten van fotodynamische inactivatie op in specifieke delen van cellen, alleen in gebieden omringd door de verlichte fotosensitizer.
In het voorbeeld van bacterie beeldvorming, en volgens de literatuur, lijkt de dosis van 30 e−/nm2 de dodelijke drempelwaarde voor bacteriën17 te zijn, die in de eerdere studies van de auteurs sterk werd overschreden 6,25. De zichtbare veranderingen in de cel werden echter niet opgemerkt voordat de elektronendosis van 6000 e−/nm2 werd bereikt. De resultaten toonden een opmerkelijke afbraak van de buitenste laag van de cel veroorzaakt door de reactieve zuurstofsoorten gegenereerd door lichtbestraling van de fotosensitizer na 1 minuut (figuur 1). Verdere lichtverlichting maakte de veranderingen zichtbaarder (figuur 1D,G).
De inkapseling van de cellen tussen de koolstofsubstraten was voldoende om gedurende ten minste 1 uur constante waarnemingen uit te voeren. Goede observatieplekken met voldoende vloeistof zijn gemakkelijk te vinden bij lage vergroting, omdat deze gebieden donkerder en waziger lijken (aangegeven door de frames in figuur 2A). De met vloeistof bedekte bacteriën zijn minder zichtbaar dan de droge, maar kunnen nog steeds worden onderscheiden (figuur 2B). Het is nuttig om tijdens de beeldvorming naar de vloeistofgrens te kijken en de beweging ervan kan gemakkelijk worden gedetecteerd, wat impliceert dat het gekozen gebied ongeschikt en onstabiel kan zijn (figuur 3). Een ander probleem tijdens observaties is de verdamping van het water en de neerslag van de oplossing, die kan optreden in willekeurige delen van het monster, inclusief de gebieden rond de bacteriën (figuur 3B, C).
Figuur 1: Voorbeeldige resultaten van de fotodynamische behandeling van bacteriën. (A) Het schema van de vloeibare cel die bacteriële cellen en methyleenblauw bevat. (B) De cel vóór lichtverlichting. (C) De cel na verlichting gedurende 1 min. (D) De cel na verlichting gedurende 10 min. (E-G) De vergrote gebieden van (B-D). De elektronendosis was gelijk aan respectievelijk 1600 e−/nm2, 2500 e−/nm2 en 6000 e−/nm2. De figuur is gereproduceerd uit Żak et al.25. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: TEM-beelden van S. aureus ingekapseld met methyleenblauw tussen twee koolstoffilms. (A) Een afbeelding met een lage vergroting toont beide gebieden met een hoge hoeveelheid vloeistof (aangegeven door de gele frames) en droge vlekken. Een snel onderzoek van het monster bij deze vergroting geeft informatie over de vraag of de inkapseling succesvol was of niet. (B) De vloeistofgrens is duidelijk zichtbaar in het vergrote gebied en de bacteriën die met de fotosensitizer zijn bedekt, kunnen worden onderscheiden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: TEM-beelden van ongunstige effecten die kunnen optreden tijdens beeldvorming. (A) In het begin was de cel gelijkmatig omringd door de vloeistof, die het grootste deel van het observatiegebied bedekte. (B) Op basis van de constante elektronenbundelbestraling kunnen de beweging en verdamping van de vloeistof en het begin van de precipitatie uit de oplossing worden opgemerkt. (C) De voortzetting van de processen leidt tot onomkeerbare beweging, schuimvorming en desintegratie van de fotosensitizer, waardoor verdere waarnemingen onmogelijk worden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: De ongunstige effecten die tot verkeerde conclusies leiden. (A) De gekristalliseerde vloeistof. (B) De besmetting heeft zich op de cel gevestigd. (C) Schuimvorming veroorzaakt door de elektronenbundel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De installatie en inbedrijfstelling van de verlichting vereisen basiskennis van de service en kunnen de microscoop beschadigen. De eenvoudigste manier om het licht aan de microscoop te introduceren, is door de optische vezel vanaf de bovenkant van de objectieflens aan te sluiten, waar meestal ruimte is voor de TEM-afbuigspoelen en extra detectoren. Meer vrije ruimte kan ook worden verwacht van oudere top-entry-apparaten, waar dezelfde locatie het monstervacuümslot en het monsterinstallatiemechanisme herbergt. Deze configuratie wordt op grote schaal beschreven in een eerder rapport25, dat een voorbeeldig illuminatorontwerp bevat. Als de binnenkant van de microscoop de installatie van de optische vezel boven de objectieflens niet toestaat, kan de illuminator vanaf de zijkant32 in het objectieflenspaalstuk worden geïnstalleerd. Andere oplossingen gaan uit van het gebruik van een speciale monsterhouder4 of het omgekeerde gebruik van de houder voor cathodoluminescente waarnemingen1.
Over het algemeen is de voorbereiding van vloeibare monsters voor TEM ingewikkeld en vereist het ervaring en handmatige vaardigheden. De kritieke stap in de voorbereiding van vloeibare cellen is stap 2.6. van het protocol. Het is belangrijk om het tweede rooster snel te plaatsen om de verdamping van de vloeistof te voorkomen. De hier gepresenteerde methode is eenvoudig en vereist geen ongebruikelijke materialen; het is echter mogelijk dat het niet geschikt is voor alle vloeistoffen. In sommige gevallen is het gunstig om het substraat te reinigen met plasma om de hydrofielheid te vergroten. Voor vloeibare monsters, met name wateroplossingen, die geen deeltjes en/of cellen bevatten die als afstandshouder tussen de koolstoffilms kunnen dienen, kan de inkapseling niet succesvol zijn omdat alle vloeistof tussen de vlakke oppervlakken vandaan kan stromen. Het gebruik van een grafeen vloeibare cel bereid met behulp van een gatachtig substraat, dat kleine "zakken" voor vloeistof creëert, kan geschikter zijn33.
TEM-waarnemingen in vloeistof kunnen worden verstoord door enkele factoren die verband houden met de monstervoorbereiding en de ongunstige effecten die door de elektronenbundel worden veroorzaakt. De eerste omvat het losmaken van substraten en de beweging van de vloeistof, vaak gevolgd door het breken van de koolstoffilm, die optreedt voor hoge vloeistofvolumes in het gebied en / of bij elektronenbestraling. Dit kan worden voorkomen door het vloeistofvolume in stap 2.5 te minimaliseren. van het protocol.
De bestraling met hoogenergetische elektronen leidt tot energieoverdracht, wat resulteert in verhitting of radiolyse. Na interactie met straling ontleedt water in radicalen (H· en OH·), H2 en opgeloste elektronen. Deze soorten nemen deel aan verdere reacties, waardoor verschillende producten worden gegenereerd en schade aan het monster wordt veroorzaakt34. Daarom is het erg belangrijk om de elektronendosis laag te houden tijdens de waarnemingen (stap 3.2.), vooral voor gevoelige monsters zoals cellen. Andere effecten veroorzaakt door de elektronenbundel zijn precipitatie uit de oplossing (figuur 4A) en schuimvorming van de vloeistof (figuur 4C). Het verlagen van de elektronendosis helpt deze twee negatieve effecten te voorkomen, maar soms is het niet mogelijk om ze te elimineren. Er kan ook enige stralingsgevoelige verontreiniging in de oplossing zijn, die zich op de cel nestelt (figuur 4B) en verandert bij invloed van de elektronenbundel. Dit is ongunstig omdat de onzuiverheid kan worden genomen als onderdeel van de cel, die wordt beschadigd bij de lichtbestraling, wat tot verkeerde conclusies leidt. De beste manier om betrouwbare beelden te verkrijgen is door een niet-verontreinigd gebied te vinden en de elektronendosis zo laag mogelijk te houden.
Betrouwbare in situ TEM-studies van fotoreacties vereisen een goede vergelijking tussen de processen die door licht worden geïnduceerd met die veroorzaakt door de elektronenbundel. Met uitzondering van het verlagen van de elektronendosis zoals beschreven in stap 3.2., is het nuttig om de elektronenbron uit te schakelen voor de tijd van lichtverlichting, zodat de ongestoorde resultaten kunnen worden waargenomen, zoals benadrukt in stap 4.3. van het protocol.
Het huidige protocol kan worden gebruikt om lichtgeïnduceerde reacties te observeren (vooral in vloeistof), bijvoorbeeld licht op metalen nanoclusters2, licht-geïnduceerde katalyseprocessen1 en de invloed van licht op biologische monsters (bijv. Cellen met een fotosensitizer, chloroplasten).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Het onderzoek werd ondersteund door de Miniatura-subsidie (2019/03/X/NZ3/02100, National Science Center, Polen).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carbon film on 200 mesh copper grid | Agar Scientific | AGS160 | The standard TEM grids for observations and liquid cell preparation |
| Crossover Tweezers | Dumont | N5 | The tweezers are neecesarry for liquid cell preparation |
| Photodiode Power Sensor | ThorLabs | S130C | The sensor used for light intensity measurement |
| Polyimide-Coated Multimode Fiber | Thorlabs | FG400UEP | Must be built into the microscope using the on-site built adapter, according to the 10.1016/j.ultramic.2021.113388 |
| Transmission Electron Microscope | Hitachi | H-800 | Can be replaced with any side-entry microscope, available for modification |
| Tuneable Diode Laser | CNI | MRL-III-660D | The light wavelength must be chosen basing on photosensitizer's absorption spectrum |
References
- Vadai, M., Angell, D. K., Hayee, F., Sytwu, K., Dionne, J. A. In-situ observation of plasmon-controlled photocatalytic dehydrogenation of individual palladium nanoparticles. Nature Communications. 9 (1), 1-8 (2018).
- Weng, B., et al. Visualizing light-induced dynamic structural transformations of Au clusters-based photocatalyst via in situ TEM. Nano Research. 12 (1), 1-5 (2021).
- Cao, K., et al. In situ TEM investigation on ultrafast reversible lithiation and delithiation cycling of Sn@C yolk-shell nanoparticles as anodes for lithium ion batteries. Nano Energy. 40, 187-194 (2017).
- Cavalca, F., et al. In situ transmission electron microscopy of light-induced photocatalytic reactions. Nanotechnology. 23 (7), 075705 (2012).
- Tung, C. -W., et al. Light-induced activation of adaptive junction for efficient solar-driven oxygen evolution: In situ unraveling the interfacial metal-silicon junction. Advanced Energy Materials. 9 (31), 1901308 (2019).
- Żak, A. M., Kaczmarczyk, O., Piksa, M., Matczyszyn, K. Light-induced in situ transmission electron microscopy: Novel approach for antimicrobial photodynamic therapy imaging. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 35, 102463 (2021).
- Shindo, D., et al. Development of a multifunctional TEM specimen holder equipped with a piezodriving probe and a laser irradiation port. Journal of Electron Microscopy. 58 (4), 245-249 (2009).
- Zhang, C., et al. Photosensing performance of branched CdS/ZnO heterostructures as revealed by in situ TEM and photodetector tests. Nanoscale. 6 (14), 8084-8090 (2014).
- Zhang, C., et al. Statistically analyzed photoresponse of elastically bent CdS nanowires probed by light-compatible in situ high-resolution TEM. Nano Letters. 16 (10), 6008-6013 (2016).
- Yoshida, K., Yamasaki, J., Tanaka, N. In situ high-resolution transmission electron microscopy observation of photodecomposition process of poly-hydrocarbons on catalytic TiO2 films. Applied Physics Letters. 84 (14), 2542-2544 (2004).
- Yoshida, K., Nozaki, T., Hirayama, T., Tanaka, N. In situ high-resolution transmission electron microscopy of photocatalytic reactions by excited electrons in ionic liquid. Journal of Electron Microscopy. 56 (5), 177-180 (2007).
- Textor, M., De Jonge, N. Strategies for preparing graphene liquid cells for transmission electron microscopy. Nano Letters. 18 (6), 3313-3321 (2018).
- Ring, E. A., De Jonge, N. Microfluidic system for transmission electron microscopy. Microscopy and Microanalysis. 16 (5), 622-629 (2010).
- Inayoshi, Y., Minoda, H. A carbon sandwich environmental cell for wet specimens. Journal of Electron Microscopy. 62 (6), 623-628 (2013).
- Koo, K., Dae, K. S., Hahn, Y. K., Yuk, J. M. Live cell electron microscopy using graphene veils. Nano Letters. 20 (6), 4708-4713 (2020).
- De Jonge, N., Peckys, D. B. Live cell electron microscopy is probably impossible. ACS Nano. 10 (10), 9061-9063 (2016).
- Kennedy, E., Nelson, E. M., Damiano, J., Timp, G. Gene expression in electron-beam-irradiated bacteria in reply to "live cell electron microscopy is probably impossible.". ACS Nano. 11 (1), 3-7 (2017).
- Alves, E., et al. An insight on bacterial cellular targets of photodynamic inactivation. Future Medicinal Chemistry. 6 (2), 141-164 (2014).
- Cieplik, F., et al. Antimicrobial photodynamic therapy-What we know and what we don't. Critical Reviews in Microbiology. 44 (5), 571-589 (2018).
- Huang, L., et al. Type I and Type II mechanisms of antimicrobial photodynamic therapy: An in vitro study on gram-negative and gram-positive bacteria. Lasers in Surgery and Medicine. 44 (6), 490-499 (2012).
- Caminos, D. A., Spesia, M. B., Pons, P., Durantini, E. N. Mechanisms of Escherichia coli photodynamic inactivation by an amphiphilic tricationic porphyrin and 5,10,15,20-tetra(4-N,N,N-trimethylammoniumphenyl) porphyrin. Photochemical and Photobiological Sciences. 7 (9), 1071-1078 (2008).
- Chu, J. C. H., Chin, M. L., Wong, C. T. T., Hui, M., Lo, P. C., Ng, D. K. P. One-pot synthesis of a cyclic antimicrobial peptide-conjugated phthalocyanine for synergistic chemo-photodynamic killing of multidrug-resistant bacteria. Advanced Therapeutics. 4 (3), 1-10 (2021).
- Rogers, S., Honma, K., Mang, T. S. Confocal fluorescence imaging to evaluate the effect of antimicrobial photodynamic therapy depth on P. gingivalis and T. denticola biofilms. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 23, 18-24 (2018).
- Maldonado-Carmona, N., et al. Porphyrin-loaded lignin nanoparticles against bacteria: A photodynamic antimicrobial chemotherapy application. Frontiers in Microbiology. 11, 606185 (2020).
- Żak, A. M., Kaczmarczyk, O., Piksa, M., Grzęda, J., Matczyszyn, K. Fiber-optic sample illuminator design for the observation of light induced phenomena with transmission electron microscopy in situ: Antimicrobial photodynamic therapy. Ultramicroscopy. 230, 113388 (2021).
- Dinh, V. P., et al. Insight into the adsorption mechanisms of methylene blue and chromium(III) from aqueous solution onto pomelo fruit peel. RSC Advances. 9 (44), 25847-25860 (2019).
- Żak, A. Guide to controlling the electron dose to improve low-dose imaging of sensitive samples. Micron. 145, 103058 (2021).
- Drulyte, I., et al. Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation. Acta Crystallographica Section D. 74 (6), 560-571 (2018).
- Scarff, C. A., Fuller, M. J. G., Thompson, R. F., Iadaza, M. G. Variations on negative stain electron microscopy methods: Tools for tackling challenging systems. Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).
- Booth, D. S., Avila-Sakar, A., Cheng, Y. Visualizing proteins and macromolecular complexes by negative stain EM: From grid preparation to image acquisition. Journal of Visualized Experiments. (58), (2011).
- Rames, M., Yu, Y., Ren, G. Optimized negative staining: A high-throughput protocol for examining small and asymmetric protein structure by electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (90), e51087 (2014).
- Miller, B. K., Crozier, P. A. System for in situ UV-visible illumination of environmental transmission electron microscopy samples. Microscopy and Microanalysis. 19 (2), 461-469 (2013).
- Yuk, J. M., et al. High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells. Science. 336 (6077), 61-64 (2012).
- Schneider, N. M., et al. Electron-Water interactions and implications for liquid cell electron microscopy. Journal of Physical Chemistry C. 118 (38), 22373-22382 (2014).
