Summary
O presente protocolo descreve modificações do microscópio eletrônico de transmissão (MET) com um sistema de iluminação de luz, a fabricação de células líquidas e observações in situ de TEM de interações induzidas pela luz entre células bacterianas e um fotossensibilizador. Os métodos de preparação da amostra, os danos causados pelo feixe de elétrons e as imagens também são discutidos.
Abstract
O protocolo atual descreve as modificações da configuração do microscópio eletrônico de transmissão (MET) para observações induzidas pela luz in situ . Uma fibra óptica de vidro inserida na coluna de elétrons acima do polo da lente objetiva e um laser, uma fonte de luz ajustável, foram usados para fabricar o dispositivo. Depois que o iluminador foi calibrado usando um sistema de medição externo, ele permite ajustar a intensidade da iluminação às necessidades do processo observado. Este sistema de iluminação foi utilizado para visualizar fenômenos de terapia fotodinâmica antimicrobiana, que atualmente são objeto de intensa pesquisa. A amostra foi preparada detectando uma suspensão de bactérias em um substrato de carbono, grafeno ou nitreto de silício, borrando o excesso de solução, detectando a solução fotossensibilizadora, borrando o excesso de líquido novamente e, em seguida, montando a célula líquida com um segundo substrato ou filme de grafeno. O processo do experimento de imagem em si inclui a escolha do local certo para a observação com o uso de baixa ampliação e uma dose mínima de elétrons e, em seguida, a ativação cíclica da fonte de luz para capturar imagens subsequentes em intervalos especificados com a quantidade mínima de elétrons necessária. A dose de elétrons de cada exposição e o tempo e a intensidade da iluminação usada precisam ser cuidadosamente registrados devido à complexidade dos fenômenos observados, pois, ao mesmo tempo, o processo é impulsionado pela luz e pelo elétron. Depois que o experimento real é realizado, observações de controle adicionais devem ser feitas, nas quais as mesmas doses de elétrons são usadas, mas sem influência adicional da luz e doses menores de elétrons são usadas para doses mais altas de luz. Isso torna possível distinguir os efeitos microestruturais induzidos pela luz daqueles causados por elétrons nos campos da vida e da ciência dos materiais.
Introduction
Fenômenos induzidos pela luz em alta resolução são interessantes em muitos campos, como nanoengenharia 1,2,3, catálise 4,5 e biofotônica6. Alguns desenhos originais que permitem tais experimentos podem ser encontrados na literatura, incluindo modificações dos suportes amostrais 1,4,7,8,9 e da fibra óptica acoplada ao microscópio 10,11.
A combinação de iluminação de luz, um ambiente líquido e microscopia eletrônica de transmissão (MET) oferece uma grande oportunidade para estudos detalhados e dinâmicos de processos fotoinduzidos. No entanto, a condição de alto vácuo dentro do microscópio é bastante desfavorável para muitos líquidos, especialmente soluções de água. O encapsulamento líquido, que o protege do meio ambiente, pode ser alcançado usando algumas técnicas baseadas principalmente em substratos de grafeno 12, nitreto de silício13 ou carbono14. Além das pesquisas em ciência dos materiais2, as chamadas células líquidas oferecem possibilidades para a realização de observações microscópicas não convencionais em espécimes biológicos próximos às suas condições nativas15. Tais observações são extremamente exigentes, especialmente para microrganismos vivos, como células bacterianas. O feixe de elétrons como radiação ionizante causa danos irreversíveis aos corpos de prova hidratados, de modo que a dose de elétrons deve ser especificada16. Isso é necessário para minimizar os efeitos desfavoráveis, controlar os danos e evitar artefatos confusos. A dose máxima ideal de elétrons que permite observações de células vivas ainda é um tópico questionável16, mas a dose de 30 e−/nm2 parece ser o valor limiar, pelo menos para as bactérias17.
Alguns dos assuntos de interesse para tais estudos microscópicos são processos durante a terapia fotodinâmica antimicrobiana (TAPA)18. Em suma, a terapia prossegue da seguinte forma. As células bacterianas são cercadas pelo líquido fotossensível chamado fotossensibilizador. Quando a iluminação da luz é dada em um comprimento de onda específico, as espécies citotóxicas reativas de oxigênio (ROS) são geradas a partir da transferência de energia ou carga das moléculas fotossensibilizadoras excitadas para o oxigênio naturalmente presente na solução. Patógenos expostos a ERO são rapidamente inativados com altíssima eficiência, sem efeitos colaterais19. A resposta à terapia varia para micróbios distintos – por exemplo, o impacto do mesmo fotossensibilizador pode ser bastante diferente para bactérias Gram-positivas e Gram-negativas20. Em geral, estabeleceu-se que o principal alvo das ERO são as estruturas externas das células, onde o dano resulta em distúrbios funcionais da membrana celular e, consequentemente, leva à morte de bactérias21,22. No entanto, danos aos ácidos nucleicos e proteínas também podem ser considerados uma causa de inativação18, por isso ainda não se sabe quais estruturas celulares são os principais alvos durante esse processo19. Uma compreensão mais profunda dos processos prejudiciais poderia ajudar a melhorar esta terapia definitiva. Em comparação com os métodos de microscopia de luz utilizados na pesquisa de APDT23, as técnicas de MET dão mais possibilidades de olhar para o mecanismo de APDT com maior resolução e ampliação24. O ETEM já foi utilizado com sucesso para observação celular durante a terapia em curso, o que nos permitiu estudar os danos bacterianos Gram-positivos e descrever detalhadamente as alterações ocorridas dentro da parede celular 6,25.
O protocolo atual apresenta uma configuração experimental adequada para imagens de alta resolução de inativação de bactérias induzidas por luz usando TEM, que requer um sistema adequado de iluminação de luz, o encapsulamento de células com um líquido e um rigoroso controle de dose de elétrons. A bactéria utilizada para a observação foi Staphylococcus aureus, e uma solução de azul de metileno foi utilizada como fotossensibilizador. A configuração especial de iluminação de luz compreende um laser semicondutor ajustável conectado diretamente à coluna do microscópio usando a fibra de luz. Este projeto fornece irradiação uniforme em toda a amostra devido à colocação quase paralela da fibra óptica ao eixo do microscópio. A luz monocromática de alta intensidade gerada pelo laser pode então ser usada para estudar vários efeitos fotoquímicos. A luz utilizada no experimento apresentou comprimento de onda igual a 660 nm, pois, na região visível, o azul de metileno apresenta picos de absorção de 613 nm e 664 nm26. O protocolo para encapsulamento de líquidos é baseado em substratos de carbono, o que torna o procedimento rápido e descomplicado. Finalmente, um método para observação de TEM in situ de baixa dose de células em líquido é apresentado. As dificuldades em relação à preparação da amostra, os efeitos da dose de elétrons sobre a amostra sensível e a interpretação razoável da imagem são discutidos.
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Protocol
1. Modificação do microscópio eletrônico de transmissão
- Modifique o microscópio eletrônico de transmissão conectando a fibra óptica (consulte Tabela de materiais) à coluna do microscópio na parte superior da lente objetiva. Permita alguns centímetros de espaço entre a lente objetiva e a lente condensadora, além de um slot livre para acessórios.
NOTA: Um suporte de amostra dedicado4 ou um suporte para observações catodoluminescentes em configuração inversa1 também pode ser empregado. - Verifique se há vazamentos no sistema usando bombas de vácuo ásperas. Se o sistema não mostrar um vazamento de vácuo, teste o sistema sob um alto vácuo.
- Verifique se a atuação do sistema de vácuo não se desvia do início padrão do microscópio ventilado. Em caso de problemas com a execução, montagem ou comissionamento do módulo, entre em contato com o pessoal de serviço autorizado ou com o fabricante do dispositivo.
NOTA: O iluminador corretamente feito e montado não obscurecerá o feixe de elétrons. Se o feixe se deslocar sucessivamente durante a operação do microscópio, a fibra óptica não condutora não será suficientemente coberta com um escudo de metal e acumulará uma carga elétrica. Nesse caso, deslize a fibra óptica profundamente na jaqueta condutora.
- Verifique se a atuação do sistema de vácuo não se desvia do início padrão do microscópio ventilado. Em caso de problemas com a execução, montagem ou comissionamento do módulo, entre em contato com o pessoal de serviço autorizado ou com o fabricante do dispositivo.
- Meça a intensidade da luz usando o sensor de energia do fotodiodo (consulte Tabela de materiais). Se o espaço entre as peças do polo da lente objetiva não permitir a medição dentro do microscópio, meça a geometria da amostra e do iluminador e reproduza essas condições em uma configuração de medição externa.
- Se o microscópio não estiver equipado com um sistema de medição de dose eletrônica, execute a calibração medindo a corrente do feixe com um copo de Faraday (ver Tabela de Materiais) e calculando numericamente a densidade de elétrons que atingem a amostra27.
2. Encapsulamento de bactérias com o fotossensibilizador
- Coloque duas grades TEM não tratadas cobertas com carbono amorfo entre duas pinças cruzadas voltadas para o lado revestido de carbono até o topo. Mantenha as grades o mais próximo possível da borda.
NOTA: Para certas combinações de substrato, solução e amostra, pode ser benéfico usar a descarga de brilho em uma ou ambas as malhas para remover as impurezas de fábrica e obter uma superfície hidrofílica máxima28. Utilizando o exemplo da bactéria S. aureus e da solução de azul de metileno, determinou-se que os melhores e mais reprodutíveis resultados foram obtidos em carbono novo, não tratado, em grades de cobre sem descarga adicional de brilho ou limpeza a plasma6. - Coloque 4 μL de solução bacteriana em uma das grades. A densidade óptica da amostra deve situar-se no intervalo de 5-10.
NOTA: As bactérias utilizadas no estudo foram purificadas da cultura e dispersas em tampão PBS. É altamente recomendável verificar a concentração de bactérias na amostra fresca a cada vez que a utiliza, por exemplo, usando métodos de coloração negativa, seguindo os protocolos estabelecidos disponíveis 29,30,31. - Aguarde 60 s e limpe cuidadosamente o líquido usando papel de filtro. Tente espalhar o líquido por toda a superfície da grade durante este processo.
- Coloque 4 μL de fotossensibilizador na mesma grade.
NOTA: O azul de metileno na concentração de 2 μg/mL foi utilizado como fotossensibilizador para o presente estudo. - Após 5 s, apague o líquido. Deixe uma camada muito fina de líquido sobre o substrato.
- Coloque rapidamente a grade seca em cima da coberta com líquido.
- Mova suavemente a grade superior para a borda da segunda e esprema os substratos nas bordas usando uma pinça.
NOTA: Algum líquido pode fluir para fora da amostra nesta fase, o que significa que não foi drenado o suficiente. No entanto, isso não significa necessariamente que a formação da célula líquida não terá sucesso. - Repita cuidadosamente o aperto.
NOTA: É mais fácil realizar este passo girando as pinças em 90° para que fiquem perpendiculares à mesa e ambas as pontas das pinças permaneçam na mesma altura, não dependendo da posição de abrir/fechar. - Deixe a célula líquida entre as pinças por 1 min.
- Inserir a amostra no suporte TEM logo após o término da preparação.
NOTA: A tensão da placa/anel de montagem do suporte ajudará os substratos a aderir e manter o líquido no interior.- Se possível, bombeie o suporte da amostra para uma estação de bombeamento externa para reduzir a contaminação do microscópio por evaporação do líquido.
3. Observações TEM in situ de células bacterianas no efeito da dose líquido-elétron
- Insira a amostra no microscópio.
- Inicie as observações em modo de baixa ampliação para encontrar uma área de observação adequada.
NOTA: Áreas mais escuras são mais propensas a serem líquidas devido ao espalhamento do feixe de elétrons.- Durante as observações, mantenha a dose de elétrons o mais baixa possível. Expanda o tempo de exposição (até 2 s para uma tensão de aceleração de 150 kV e uma ampliação de 5.000x). A ampliação de 5.000x para a câmera de montagem inferior (o campo de visão aproximado é de 10 μm) é suficiente para a imagem de bactérias com um diâmetro de ~ 1 μm.
NOTA: Às vezes, não é fácil distinguir o líquido, então, no início das observações, é útil focar o feixe de elétrons onde é provável que seja líquido. O líquido deve se mover sobre um feixe de elétrons focado e as bolhas aparecerão. Após essa verificação, é necessário encontrar outra área para novas observações.
- Durante as observações, mantenha a dose de elétrons o mais baixa possível. Expanda o tempo de exposição (até 2 s para uma tensão de aceleração de 150 kV e uma ampliação de 5.000x). A ampliação de 5.000x para a câmera de montagem inferior (o campo de visão aproximado é de 10 μm) é suficiente para a imagem de bactérias com um diâmetro de ~ 1 μm.
- Encontre as células cercadas por líquido na ampliação apropriada com tempo de exposição prolongado e capture a primeira imagem imediatamente. Mantenha a dose de elétrons constante e colete imagens a cada 30 s para observar as mudanças.
- Examine cuidadosamente as imagens e calcule a dose total de elétrons27 que corresponde às primeiras mudanças visíveis nas células.
4. Observações in situ de MET de processos induzidos pela luz entre células bacterianas e fotossensibilizador
- Antes de iniciar o experimento, defina a intensidade da luz laser ajustando o valor atual. Escolha o comprimento de onda apropriado de acordo com o espectro de absorção do fotossensibilizador. De acordo com o gráfico de calibração anterior (passo 1.4.), escolha o valor de corrente correspondente à menor intensidade de luz.
NOTA: O comprimento de onda da luz utilizado neste estudo foi de 660 nm. - Inserir a amostra no microscópio e encontrar a área de observação seguindo o passo 3.2. na seção anterior.
- Capture a primeira imagem da célula antes de iniciar a iluminação da amostra e use o feixe de luz em branco para desligar o feixe de elétrons para evitar os efeitos da irradiação de elétrons.
- Ligue o laser. Comece com um curto tempo de iluminação (aqui 30 s), pois a luz do laser tem intensidade relativamente alta. Após esse tempo, desligue a fonte de luz.
- Desligue o feixe em branco e capture a imagem imediatamente. Se possível, use um algoritmo automático para expor a amostra apenas pelo tempo necessário para tirar a imagem. Meça cuidadosamente o tempo de irradiação de elétrons para calcular a dose de elétrons27 usada para imagens.
- Repita a etapa 4.4. e passo 4.5. para obter o tempo de iluminação de luz esperado.
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Representative Results
A configuração experimental foi projetada para observar os processos induzidos pela luz que ocorrem em um líquido com alta resolução. A análise competitiva das imagens permitiu distinguir os danos causados pelo feixe de elétrons das mudanças relacionadas à reação fotoquímica. O efeito do feixe de elétrons sobre a amostra sensível (neste caso, as células encapsuladas com líquido) foi visível em toda a área irradiada à medida que os elétrons penetravam através dela uniformemente. Naturalmente, o efeito depende da dose de elétrons, de modo que mudanças mais significativas na morfologia da amostra podem ser observadas mais rapidamente para um feixe mais focado. Em comparação com este dano grave, os efeitos destrutivos reais da inativação fotodinâmica ocorreram em partes específicas das células apenas em áreas cercadas pelo fotossensibilizador iluminado.
No exemplo da imagem de bactérias, e de acordo com a literatura, a dose de 30 e−/nm2 parece ser o valor limiar letal para as bactérias17, o que foi altamente superado nos estudos anteriores dos autores 6,25. No entanto, as mudanças visíveis na célula não foram notadas antes de atingir a dose de elétrons de 6000 e−/nm2. Os resultados mostraram uma notável degradação da camada externa da célula causada pelas espécies reativas de oxigênio geradas pela irradiação luminosa do fotossensibilizador após 1 min (Figura 1). Uma iluminação adicional de luz tornou as alterações mais visíveis (Figura 1D,G).
O encapsulamento das células entre os substratos de carbono foi suficiente para realizar observações constantes por pelo menos 1 h. Pontos de observação adequados com líquido suficiente podem ser facilmente encontrados em baixa ampliação, pois essas áreas parecem mais escuras e borradas (indicadas pelos quadros da Figura 2A). As bactérias cobertas de líquido são menos visíveis do que as secas, mas ainda podem ser distinguidas (Figura 2B). É útil observar o limite do líquido durante a imagem, e seu movimento pode ser facilmente detectado, o que implica que a área escolhida pode ser inadequada e instável (Figura 3). Outra questão durante as observações é a evaporação da água e a precipitação da solução, que pode ocorrer em áreas aleatórias da amostra, incluindo as áreas ao redor da bactéria (Figura 3B,C).
Figura 1: Resultados exemplares do tratamento fotodinâmico de bactérias. (A) O esquema da célula líquida contendo células bacterianas e azul de metileno. (B) A célula antes da iluminação da luz. (C) A célula após a iluminação por 1 min. (D) A célula após a iluminação por 10 min. (E-G) As áreas ampliadas de (B-D). A dose de elétrons foi igual a 1600 e−/nm 2, 2500 e−/nm 2 e 6000 e−/nm 2, respectivamente. A figura é reproduzida de Żak et al.25. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Imagens MET de S. aureus encapsuladas com azul de metileno entre dois filmes de carbono . (A) Imagem de baixa ampliação apresenta ambas as áreas com alta quantidade de líquido (indicado pelos quadros amarelos) e manchas secas. Um exame rápido da amostra nesta ampliação fornece informações sobre se o encapsulamento foi bem sucedido ou não. (B) O limite do líquido é claramente visível na área ampliada, e as bactérias cobertas com o fotossensibilizador podem ser distinguidas. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Imagens MET de efeitos desfavoráveis que podem ocorrer durante a imagem . (A) No início, a célula era uniformemente cercada pelo líquido, que cobria a maior parte da área de observação. (B) Com base na constante irradiação do feixe de elétrons, o movimento e a evaporação do líquido e o início da precipitação da solução podem ser notados. (C) A continuação dos processos leva a um movimento irreversível, formação de espuma e desintegração do fotossensibilizador, tornando impossíveis novas observações. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Os efeitos desfavoráveis que levam a conclusões erradas . (A) O líquido cristalizado. (B) A contaminação se instalou na célula. (C) Espuma causada pelo feixe de elétrons. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A instalação e o comissionamento do iluminador exigem conhecimento básico de serviço e podem danificar o microscópio. A maneira mais simples de introduzir a luz no microscópio é conectar a fibra óptica a partir do topo da lente objetiva, onde geralmente há espaço para as bobinas de deflexão TEM e detectores adicionais. Mais espaço livre também pode ser esperado de dispositivos de entrada superior mais antigos, onde o mesmo local abriga a trava de vácuo da amostra e o mecanismo de instalação da amostra. Essa configuração é amplamente descrita em um relatório anterior25, que contém um design exemplar do iluminador. Se o interior do microscópio não permitir a instalação da fibra óptica acima da lente objetiva, o iluminador pode ser instalado dentro do polo da lente objetiva do lado32. Outras soluções pressupõem a utilização de um suporte de amostra dedicado4 ou a utilização inversa do suporte para observações catodoluminescentes1.
Em geral, a preparação de amostras líquidas para MET é complicada e requer experiência e habilidades manuais. A etapa crítica na preparação de células líquidas é a etapa 2.6. do protocolo. É importante colocar a segunda grade rapidamente para evitar a evaporação do líquido. O método aqui apresentado é simples e não requer materiais incomuns; no entanto, pode não se adequar a todos os líquidos. Em alguns casos, é benéfico limpar o substrato com plasma para aumentar sua hidrofilicidade. Para amostras líquidas, especialmente soluções de água, que não contêm partículas e/ou células que possam servir como um espaçador entre os filmes de carbono, o encapsulamento pode não ter sucesso, pois todo o líquido pode fluir entre as superfícies planas. O uso de uma célula líquida de grafeno preparada com um substrato holey, que cria pequenos "bolsos" para líquido, pode ser mais adequado33.
As observações de ETM realizadas em líquido podem ser perturbadas por alguns fatores relacionados ao preparo da amostra e aos efeitos desfavoráveis causados pelo feixe de elétrons. O primeiro inclui o desprendimento dos substratos e o movimento do líquido, muitas vezes seguido pela quebra do filme de carbono, que ocorre para altos volumes de líquido na área e / ou após a irradiação de elétrons. Isso pode ser evitado minimizando o volume de líquido na etapa 2.5. do protocolo.
A irradiação com elétrons altamente energéticos leva à transferência de energia, resultando em aquecimento ou radiólise. Após a interação com a radiação, a água se decompõe em radicais (H· e OH·), H2 e elétrons solúveis. Essas espécies participam de novas reações, gerando diferentes produtos e causando danos à amostra34. Portanto, é muito importante manter a dose de elétrons baixa durante as observações (etapa 3.2.), especialmente para espécimes sensíveis como células. Outros efeitos causados pelo feixe de elétrons são a precipitação da solução (Figura 4A) e a formação de espuma do líquido (Figura 4C). Diminuir a dose de elétrons ajuda a evitar esses dois efeitos negativos, mas às vezes não é possível eliminá-los. Também pode haver alguma contaminação sensível à radiação na solução, que se instala na célula (Figura 4B) e muda com a influência do feixe de elétrons. Isso é desfavorável, pois a impureza pode ser tomada como parte da célula, que é danificada pela irradiação da luz, levando a conclusões erradas. A melhor maneira de obter imagens confiáveis é encontrar uma área não contaminada e manter a dose de elétrons o mais baixa possível.
Estudos confiáveis de MET in situ de fotorreações requerem uma boa comparação entre os processos induzidos pela luz com aqueles causados pelo feixe de elétrons. Exceto para reduzir a dose de elétrons descrita na etapa 3.2., é útil desligar a fonte de elétrons durante o tempo de iluminação da luz, de modo que os resultados não perturbados possam ser observados, conforme enfatizado na etapa 4.3. do protocolo.
O presente protocolo pode ser usado para observar reações induzidas pela luz (especialmente em líquido), por exemplo, luz em nanoaglomerados metálicos2, processos de catálise induzidos por luz1 e a influência da luz em espécimes biológicos (por exemplo, células com um fotossensibilizador, cloroplastos).
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
A pesquisa foi apoiada pela bolsa Miniatura (2019/03/X/NZ3/02100, Centro Nacional de Ciências, Polônia).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carbon film on 200 mesh copper grid | Agar Scientific | AGS160 | The standard TEM grids for observations and liquid cell preparation |
| Crossover Tweezers | Dumont | N5 | The tweezers are neecesarry for liquid cell preparation |
| Photodiode Power Sensor | ThorLabs | S130C | The sensor used for light intensity measurement |
| Polyimide-Coated Multimode Fiber | Thorlabs | FG400UEP | Must be built into the microscope using the on-site built adapter, according to the 10.1016/j.ultramic.2021.113388 |
| Transmission Electron Microscope | Hitachi | H-800 | Can be replaced with any side-entry microscope, available for modification |
| Tuneable Diode Laser | CNI | MRL-III-660D | The light wavelength must be chosen basing on photosensitizer's absorption spectrum |
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