Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

Ljusinducerad in situ-transmissionselektronmikroskopi för observation av interaktionen mellan vätska och mjuk materia

Published: July 26, 2022 doi: 10.3791/63742
Automatic Translation
1, 2
1Electron Microscopy Laboratory, Faculty of Mechanical Engineering, Wroclaw University of Science and Technology, 2Advanced Materials Engineering and Modelling Group, Faculty of Chemistry, Wroclaw University of Science and Technology

Summary

Detta protokoll beskriver transmissionselektronmikroskop (TEM) modifieringar med ett ljusbelysningssystem, tillverkning av flytande celler och in situ TEM-observationer av ljusinducerade interaktioner mellan bakterieceller och en fotosensibiliserare. Provberedningsmetoderna, elektronstråleskador och avbildning diskuteras också.

Abstract

Det nuvarande protokollet beskriver modifieringarna av transmissionselektronmikroskopet (TEM) för in situ ljusinducerade observationer. En optisk glasfiber införd i elektronkolonnen ovanför objektivlinspolstycket och en laser, en justerbar ljuskälla, användes för att tillverka enheten. Efter att belysningen har kalibrerats med hjälp av ett externt mätsystem tillåter det en att justera belysningens intensitet till behoven hos den observerade processen. Detta belysningssystem användes för att avbilda antimikrobiella fotodynamiska terapifenomen, som för närvarande är föremål för intensiv forskning. Provet framställdes genom att upptäcka en suspension av bakterier på ett kol-, grafen- eller kiselnitridsubstrat, blotta överskottslösningen, upptäcka fotosensibiliseringslösningen, blotta överskottsvätskan igen och sedan montera vätskecellen med ett andra substrat eller grafenfilm. Processen med själva avbildningsexperimentet innefattar att välja rätt plats för observation med användning av låg förstoring och en minsta dos elektroner och sedan cyklisk aktivering av ljuskällan för att fånga efterföljande bilder med angivna intervall med den minsta mängd elektroner som behövs. Elektrondosen för varje exponering och tiden och intensiteten för belysning som används måste registreras noggrant på grund av komplexiteten hos de observerade fenomenen eftersom processen samtidigt är både ljus- och elektrondriven. Efter att själva experimentet har utförts måste ytterligare kontrollobservationer göras, där samma doser elektroner används men utan ytterligare ljuspåverkan och mindre doser elektroner används för högre doser ljus. Detta gör det möjligt att skilja ljusinducerade mikrostrukturella effekter från de som orsakas av elektroner inom både livs- och materialvetenskap.

Introduction

Ljusinducerade fenomen i hög upplösning är intressanta inom många områden som nanoengineering 1,2,3, katalys 4,5 och biofotonik6. Några ursprungliga mönster som tillåter sådana experiment finns i litteraturen, inklusive modifieringar av provhållarna 1,4,7,8,9 och den optiska fibern fäst vid mikroskopet 10,11.

Kombinationen av ljusbelysning, en flytande miljö och transmissionselektronmikroskopi (TEM) ger en stor möjlighet till detaljerade, dynamiska studier av fotoinducerade processer. Högvakuumtillståndet inuti mikroskopet är emellertid ganska ogynnsamt för många vätskor, särskilt vattenlösningar. Vätskeinkapsling, som skyddar den från miljön, kan uppnås med hjälp av några tekniker baserade huvudsakligen på grafen12, kiselnitrid13 ellerkol 14 substrat. Förutom forskning inom materialvetenskap2 erbjuder så kallade flytande celler möjligheter att genomföra okonventionella mikroskopiska observationer på biologiska prover nära deras ursprungliga förhållanden15. Sådana observationer är extremt krävande, särskilt för levande mikroorganismer som bakterieceller. Elektronstrålen som joniserande strålning orsakar irreversibel skada på de hydratiserade proverna, så elektrondosen måste specificeras16. Detta är nödvändigt för att minimera ogynnsamma effekter, kontrollera skadorna och undvika förvirrande artefakter. Den optimala maximala elektrondosen som tillåter observationer av levande celler är fortfarande ett tveksamt ämne16, men dosen på 30 e−/nm2 verkar vara tröskelvärdet, åtminstone för bakterier17.

Några av de ämnen som är av intresse för sådana mikroskopiska studier är processer under antimikrobiell fotodynamisk terapi (APDT)18. Kort sagt, terapin fortsätter enligt följande. Bakteriecellerna är omgivna av den ljuskänsliga vätskan som kallas fotosensibiliserare. När ljusbelysning ges vid en specifik våglängd genereras de cytotoxiska reaktiva syrearterna (ROS) från energi- eller laddningsöverföring från de exciterade fotosensibiliserande molekylerna till syret som finns naturligt i lösningen. Patogener som utsätts för ROS inaktiveras snabbt med mycket hög effektivitet, utan biverkningar19. Svaret på terapin varierar för distinkta mikrober - till exempel kan effekten av samma fotosensibiliserare vara helt annorlunda för grampositiva och gramnegativa bakterier20. I allmänhet har det fastställts att huvudmålet för ROS är cellernas yttre strukturer, där skador resulterar i funktionella störningar i cellmembranet och följaktligen leder till bakteriedöd21,22. Skador på nukleinsyror och proteinerkan emellertid också betraktas som en orsak till inaktivering18, så det är fortfarande okänt vilka cellstrukturer som är huvudmålen under denna process19. En djupare förståelse för de skadliga processerna kan bidra till att förbättra denna definitiva terapi. Jämfört med de ljusmikroskopimetoder som används i APDT-forskning23 ger TEM-tekniker fler möjligheter att titta på APDT-mekanismen med högre upplösning och förstoring24. TEM har redan framgångsrikt använts för cellobservation under pågående behandling, vilket gjorde det möjligt för oss att studera grampositiva bakterieskador och beskriva de förändringar som sker i cellväggen i detalj 6,25.

Det nuvarande protokollet presenterar en lämplig experimentell inställning för högupplöst avbildning av ljusinducerad bakterieinaktivering med TEM, vilket kräver ett ordentligt ljusbelysningssystem, inkapsling av celler med en vätska och strikt elektrondoskontroll. Bakterierna som användes för observationen var Staphylococcus aureus, och en metylenblå lösning användes som fotosensibiliserare. Den speciella ljusbelysningsinställningen består av en avstämbar halvledarlaser ansluten direkt till mikroskopkolonnen med hjälp av ljusfibern. Denna design ger enhetlig bestrålning genom hela provet på grund av den nästan parallella placeringen av den optiska fibern till mikroskopaxeln. Monokromatiskt ljus med hög intensitet som genereras av lasern kan sedan användas för att studera olika fotokemiska effekter. Ljuset som användes i experimentet hade en våglängd lika med 660 nm eftersom metylenblått i det synliga området har absorptionstoppar vid 613 nm och 664 nm26. Protokollet för vätskeinkapsling är baserat på kolsubstrat, vilket gör proceduren snabb och okomplicerad. Slutligen presenteras en metod för lågdos in situ TEM-observation av celler i vätska. Svårigheterna med provberedning, elektrondoseffekter på det känsliga provet och rimlig bildtolkning diskuteras.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Modifiering av transmissionselektronmikroskop

  1. Ändra överföringselektronmikroskopet genom att ansluta den optiska fibern (se materialtabell) till mikroskopkolonnen högst upp på objektivlinsen. Tillåt några centimeter utrymme mellan objektivlinsen och kondensorlinsen, plus en gratis plats för tillbehör.
    OBS: En dedikerad provhållare4 eller en hållare för katodoluminescerande observationer i omvänd konfiguration1 kan också användas.
  2. Kontrollera systemet för läckage med grova vakuumpumpar. Om systemet inte visar en vakuumläcka, testa systemet under högt vakuum.
    1. Kontrollera att vakuumsystemets aktivering inte avviker från den vanliga ventilerade mikroskopstarten. Vid problem med utförande, montering eller idrifttagning av modulen, kontakta auktoriserad servicepersonal eller enhetstillverkaren.
      OBS: Den korrekt tillverkade och monterade belysningen döljer inte elektronstrålen. Om strålen skiftar successivt under mikroskopets drift kommer den icke-ledande optiska fibern inte att täckas tillräckligt med en metallsköld och ackumulera en elektrisk laddning. Skjut i så fall den optiska fibern djupt in i ledarmanteln.
  3. Mät ljusintensiteten med hjälp av fotodiodens effektsensor (se materialförteckning). Om utrymmet mellan polstyckena i objektivlinsen inte tillåter mätning inuti mikroskopet, mät geometrin hos provet och belysningen och reproducera dessa förhållanden i en extern mätinställning.
  4. Om mikroskopet inte är utrustat med ett elektrondosmätningssystem, utför kalibreringen genom att mäta strålströmmen med en Faraday-kopp (se materialförteckning) och numeriskt beräkna densiteten hos elektroner som träffar provet27.

2. Inkapsling av bakterier med fotosensibiliseraren

  1. Placera två obehandlade TEM-galler täckta med amorft kol mellan två korsade pincetter som vetter mot den kolbelagda sidan till toppen. Håll gallren så nära kanten som möjligt.
    OBS: För vissa substrat-, lösnings- och provkombinationer kan det vara fördelaktigt att använda glödurladdning på ett eller båda maskorna för att avlägsna fabriksföroreningar och få en maximal hydrofil yta28. Med hjälp av exemplet med S. aureus-bakterier och metylenblå lösning bestämdes att de bästa och mest reproducerbara resultaten erhölls på nytt, icke-behandlat kol på kopparnät utan ytterligare glödutsläpp eller plasmarengöring6.
  2. Sätt 4 μL bakterielösning på ett av gallren. Provets optiska densitet måste ligga i intervallet 5-10.
    OBS: Bakterierna som användes i studien renades från kulturen och spriddes i PBS-buffert. Det rekommenderas starkt att kontrollera koncentrationen av bakterier i det färska provet varje gång det används, t.ex. med hjälp av negativa färgningsmetoder, enligt de fastställda protokollensom finns tillgängliga 29,30,31.
  3. Vänta i 60 s och torka försiktigt vätskan med filterpapper. Försök att sprida vätskan över hela gallerytan under denna process.
  4. Sätt 4 μL fotosensibiliserare på samma galler.
    OBS: Metylenblått i en koncentration av 2 μg/ml användes som fotosensibiliserare för denna studie.
  5. Efter 5 s, torka ut vätskan. Lämna ett mycket tunt lager vätska på substratet.
  6. Placera snabbt det torra gallret ovanpå det som är täckt med vätska.
  7. Flytta försiktigt det övre gallret till kanten av det andra och pressa underlagen vid kanterna med pincett.
    OBS: En del vätska kan rinna ut ur provet i detta skede, vilket innebär att inte tillräckligt dränerades bort. Detta betyder emellertid inte nödvändigtvis att bildandet av vätskecellen kommer att misslyckas.
  8. Upprepa försiktigt pressningen.
    OBS: Det är lättare att utföra detta steg genom att vrida pincetten 90 ° så att de ligger vinkelrätt mot bordet och båda pincettspetsarna förblir i samma höjd, inte beroende på öppet / nära läge.
  9. Lämna vätskecellen mellan pincetten i 1 min.
  10. Sätt in provet i TEM-hållaren direkt efter avslutad beredning.
    OBS: Spänningen på hållarens monteringsplatta / ring hjälper underlagen att fästa och hålla vätskan inuti.
    1. Pumpa om möjligt provhållaren i en extern pumpstation för att minska föroreningen av mikroskopet genom att förånga vätska.

3. In situ TEM-observationer av bakterieceller i flytande elektrondoseffekt

  1. Sätt in provet i mikroskopet.
  2. Starta observationerna i läge med låg förstoring för att hitta ett lämpligt observationsområde.
    OBS: Mörkare områden är mest benägna att vara flytande på grund av elektronstrålespridning.
    1. Håll elektrondosen så låg som möjligt under observationerna. Utöka exponeringstiden (upp till 2 s för en accelerationsspänning på 150 kV och en förstoring på 5 000x). Förstoringen på 5 000x för den nedre monterade kameran (ungefärligt synfält är 10 μm) är tillräcklig för att avbilda bakterier med en diameter på ~ 1 μm.
      OBS: Ibland är det inte lätt att skilja vätskan, så i början av observationerna är det bra att fokusera elektronstrålen där den sannolikt är flytande. Vätskan ska röra sig på en fokuserad elektronstråle, och bubblorna kommer att dyka upp. Efter denna verifiering är det nödvändigt att hitta ett annat område för ytterligare observationer.
  3. Hitta cellerna omgivna av vätska vid lämplig förstoring med förlängd exponeringstid och fånga den första bilden omedelbart. Håll elektrondosen konstant och samla in bilder var 30: e s för att observera förändringarna.
  4. Undersök bilderna noggrant och beräkna den totala elektrondosen27 som motsvarar de första synliga förändringarna i cellerna.

4. In situ TEM-observationer av ljusinducerade processer mellan bakterieceller och fotosensibiliserare

  1. Innan du börjar experimentet, ställ in laserljusintensiteten genom att justera det aktuella värdet. Välj lämplig våglängd enligt fotosensibiliserarens absorptionsspektrum. Enligt föregående kalibreringsdiagram (steg 1.4.) väljer du det aktuella värdet som motsvarar den lägsta ljusintensiteten.
    OBS: Ljusvåglängden som användes i denna studie var 660 nm.
  2. Sätt in provet i mikroskopet och hitta observationsområdet efter steg 3.2. i föregående avsnitt.
  3. Ta den första bilden av cellen innan du börjar belysa provet och använd strålblankaren för att stänga av elektronstrålen för att undvika effekterna av elektronbestrålning.
  4. Slå på lasern. Börja med en kort belysningstid (här 30 s) eftersom laserljuset har relativt hög intensitet. Efter den tiden stänger du av ljuskällan.
  5. Stäng av strålen blankare och ta bilden omedelbart. Om möjligt, använd en automatisk algoritm för att exponera provet endast under den tid som behövs för att ta bilden. Mät noggrant elektronbestrålningstiden för att beräkna elektrondosen27 som används för avbildning.
  6. Upprepa steg 4.4. och steg 4.5. för att erhålla den förväntade ljusbelysningstiden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den experimentella installationen var utformad för att observera de ljusinducerade processerna som förekommer i en vätska med hög upplösning. Konkurrensanalysen av bilderna gjorde det möjligt för oss att skilja skadorna orsakade av elektronstrålen från förändringar relaterade till den fotokemiska reaktionen. Effekten av elektronstrålen på det känsliga provet (i detta fall cellerna inkapslade med vätska) var synliga över hela det bestrålade området när elektronerna trängde igenom det likformigt. Naturligtvis beror effekten på elektrondosen, så mer signifikanta förändringar i provmorfologin kan observeras snabbare för en mer fokuserad stråle. Jämfört med denna allvarliga skada inträffade de faktiska destruktiva effekterna av fotodynamisk inaktivering i specifika delar av celler endast i områden omgivna av den upplysta fotosensibiliseraren.

I exemplet med bakterieavbildning, och enligt litteraturen, verkar dosen 30 e−/nm2 vara det dödliga tröskelvärdet för bakterier17, vilket överskreds kraftigt i författarnas tidigare studier 6,25. De synliga förändringarna i cellen märktes dock inte innan de nådde elektrondosen 6000 e−/nm2. Resultaten visade en anmärkningsvärd nedbrytning av det yttre skiktet i cellen orsakad av de reaktiva syrearterna som genereras av ljusbestrålning av fotosensibiliseraren efter 1 min (figur 1). Ytterligare ljusbelysning gjorde förändringarna mer synliga (figur 1D,G).

Inkapslingen av cellerna mellan kolsubstraten var tillräcklig för att utföra konstanta observationer i minst 1 timme. Korrekta observationsfläckar med tillräckligt med vätska kan lätt hittas vid låg förstoring, eftersom dessa områden verkar mörkare och suddiga (indikeras av ramarna i figur 2A). De vätsketäckta bakterierna är mindre synliga än de torra men kan fortfarande urskiljas (figur 2B). Det är användbart att titta på vätskegränsen under avbildningen, och dess rörelse kan lätt detekteras, vilket innebär att det valda området kan vara olämpligt och instabilt (figur 3). En annan fråga under observationer är avdunstningen av vattnet och utfällningen av lösningen, som kan förekomma i slumpmässiga områden av provet, inklusive områdena kring bakterierna (figur 3B,C).

Figure 1
Figur 1: Exemplifierande resultat av den fotodynamiska behandlingen av bakterier. (A) Schemat för den flytande cellen som innehåller bakterieceller och metylenblått. B) Cellen före ljusbelysning. (C) Cellen efter belysning i 1 min. (D) Cellen efter belysning i 10 minuter (E-G) De förstorade områdena från (B-D). Elektrondosen var lika med 1600 e−/nm 2, 2500 e−/nm 2 respektive 6000 e−/nm 2. Figuren återges från Żak et al.25. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: TEM-bilder av S. aureus inkapslade med metylenblått mellan två kolfilmer . (A) Bild med låg förstoring visar både områden med en hög mängd vätska (indikeras av de gula ramarna) och torra fläckar. En snabb undersökning av provet vid denna förstoring ger information om huruvida inkapslingen lyckades eller inte. (B) Vätskegränsen är tydligt synlig i det förstorade området, och bakterierna som är täckta med fotosensibiliseraren kan särskiljas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: TEM-bilder av ogynnsamma effekter som kan uppstå under avbildning . (A) I början var cellen jämnt omgiven av vätskan, som täckte större delen av observationsområdet. (B) Baserat på den konstanta bestrålningen av elektronstrålen kan vätskans rörelse och avdunstning och början av utfällningen från lösningen märkas. (C) Fortsättningen av processerna leder till irreversibel rörelse, skumning och sönderdelning av fotosensibiliseraren, vilket gör ytterligare observationer omöjliga. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: De ogynnsamma effekterna som leder till felaktiga slutsatser . (A) Den kristalliserade vätskan. (B) Föroreningen bosatte sig på cellen. (C) Skumning orsakad av elektronstrålen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Installation och idrifttagning av belysningen kräver grundläggande servicekunskap och kan skada mikroskopet. Det enklaste sättet att introducera ljuset till mikroskopet är att ansluta den optiska fibern från toppen av objektivlinsen, där det vanligtvis finns plats för TEM-avböjningsspolar och ytterligare detektorer. Mer ledigt utrymme kan också förväntas från äldre toppinmatningsenheter, där samma plats rymmer provvakuumlåset och provinstallationsmekanismen. Denna konfiguration beskrivs allmänt i en tidigare rapport25, som innehåller en exemplarisk belysningsdesign. Om mikroskopets inre inte tillåter installation av den optiska fibern ovanför objektivlinsen, kan belysningen installeras inuti objektivlinsens polstycke från sidan32. Andra lösningar förutsätter användning av en särskild provhållare4 eller omvänd användning av hållaren för katodoluminescerande observationer1.

I allmänhet är beredningen av vätskeprover för TEM komplicerad och kräver erfarenhet och manuella färdigheter. Det kritiska steget i flytande cellberedning är steg 2.6. i protokollet. Det är viktigt att placera det andra gallret snabbt för att undvika avdunstning av vätskan. Metoden som presenteras här är enkel och kräver inte ovanliga material; det kanske dock inte passar alla vätskor. I vissa fall är det fördelaktigt att rengöra substratet med plasma för att öka dess hydrofilicitet. För vätskeprover, särskilt vattenlösningar, som inte innehåller några partiklar och / eller celler som kan fungera som en distans mellan kolfilmerna, kan inkapslingen misslyckas eftersom all vätska kan strömma ut mellan de plana ytorna. Att använda en grafenvätskecell framställd med ett håligt substrat, vilket skapar små "fickor" för vätska, kan vara mer lämpligt33.

TEM-observationer som utförs i vätska kan störas av några faktorer relaterade till provberedningen och de ogynnsamma effekterna som orsakas av elektronstrålen. Den första inkluderar avlägsnande av substrat och vätskans rörelse, ofta följt av brytning av kolfilmen, vilket sker för höga vätskevolymer i området och / eller vid elektronbestrålning. Detta kan undvikas genom att minimera vätskevolymen i steg 2.5. i protokollet.

Bestrålningen med mycket energiska elektroner leder till energiöverföring, vilket resulterar i uppvärmning eller radiolys. Efter interaktion med strålning sönderdelas vatten i radikaler (H· och OH·),H2 och lösta elektroner. Dessa arter deltar i ytterligare reaktioner, vilket genererar olika produkter och orsakar skador på provet34. Därför är det mycket viktigt att hålla elektrondosen låg under observationerna (steg 3.2.), särskilt för känsliga prover som celler. Andra effekter som orsakas av elektronstrålen är utfällning från lösningen (figur 4A) och skumning av vätskan (figur 4C). Att sänka elektrondosen hjälper till att undvika dessa två negativa effekter, men ibland är det inte möjligt att eliminera dem. Det kan också finnas viss strålningskänslig förorening i lösningen, som sätter sig på cellen (figur 4B) och förändras vid elektronstrålens påverkan. Detta är ogynnsamt eftersom orenheten kan tas som en del av cellen, som skadas vid ljusbestrålningen, vilket leder till felaktiga slutsatser. Det bästa sättet att få tillförlitliga bilder är att hitta ett oförorenat område och hålla elektrondosen så låg som möjligt.

Tillförlitliga in situ TEM-studier av fotoreaktioner kräver en bra jämförelse mellan de processer som induceras av ljus med de som orsakas av elektronstrålen. Förutom att sänka elektrondosen som beskrivs i steg 3.2 är det bra att stänga av elektronkällan under ljusbelysningstiden så att de ostörda resultaten kan observeras, vilket betonas i steg 4.3. i protokollet.

Det nuvarande protokollet kan användas för att observera ljusinducerade reaktioner (särskilt i vätska), till exempel ljus på metallnanokluster2, ljusinducerade katalysprocesser1 och ljusets påverkan på biologiska prover (t.ex. celler med fotosensibiliserare, kloroplaster).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Forskningen stöddes av Miniatura-bidraget (2019/03/X/NZ3/02100, National Science Center, Polen).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Carbon film on 200 mesh copper grid Agar Scientific AGS160 The standard TEM grids for observations and liquid cell preparation
Crossover Tweezers Dumont N5 The tweezers are neecesarry for liquid cell preparation
Photodiode Power Sensor ThorLabs S130C The sensor used for light intensity measurement
Polyimide-Coated Multimode Fiber Thorlabs FG400UEP Must be built into the microscope using the on-site built adapter, according to the 10.1016/j.ultramic.2021.113388
Transmission Electron Microscope Hitachi H-800 Can be replaced with any side-entry microscope, available for modification
Tuneable Diode Laser CNI MRL-III-660D The light wavelength must be chosen basing on photosensitizer's absorption spectrum

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vadai, M., Angell, D. K., Hayee, F., Sytwu, K., Dionne, J. A. In-situ observation of plasmon-controlled photocatalytic dehydrogenation of individual palladium nanoparticles. Nature Communications. 9 (1), 1-8 (2018).
  2. Weng, B., et al. Visualizing light-induced dynamic structural transformations of Au clusters-based photocatalyst via in situ TEM. Nano Research. 12 (1), 1-5 (2021).
  3. Cao, K., et al. In situ TEM investigation on ultrafast reversible lithiation and delithiation cycling of Sn@C yolk-shell nanoparticles as anodes for lithium ion batteries. Nano Energy. 40, 187-194 (2017).
  4. Cavalca, F., et al. In situ transmission electron microscopy of light-induced photocatalytic reactions. Nanotechnology. 23 (7), 075705 (2012).
  5. Tung, C. -W., et al. Light-induced activation of adaptive junction for efficient solar-driven oxygen evolution: In situ unraveling the interfacial metal-silicon junction. Advanced Energy Materials. 9 (31), 1901308 (2019).
  6. Żak, A. M., Kaczmarczyk, O., Piksa, M., Matczyszyn, K. Light-induced in situ transmission electron microscopy: Novel approach for antimicrobial photodynamic therapy imaging. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 35, 102463 (2021).
  7. Shindo, D., et al. Development of a multifunctional TEM specimen holder equipped with a piezodriving probe and a laser irradiation port. Journal of Electron Microscopy. 58 (4), 245-249 (2009).
  8. Zhang, C., et al. Photosensing performance of branched CdS/ZnO heterostructures as revealed by in situ TEM and photodetector tests. Nanoscale. 6 (14), 8084-8090 (2014).
  9. Zhang, C., et al. Statistically analyzed photoresponse of elastically bent CdS nanowires probed by light-compatible in situ high-resolution TEM. Nano Letters. 16 (10), 6008-6013 (2016).
  10. Yoshida, K., Yamasaki, J., Tanaka, N. In situ high-resolution transmission electron microscopy observation of photodecomposition process of poly-hydrocarbons on catalytic TiO2 films. Applied Physics Letters. 84 (14), 2542-2544 (2004).
  11. Yoshida, K., Nozaki, T., Hirayama, T., Tanaka, N. In situ high-resolution transmission electron microscopy of photocatalytic reactions by excited electrons in ionic liquid. Journal of Electron Microscopy. 56 (5), 177-180 (2007).
  12. Textor, M., De Jonge, N. Strategies for preparing graphene liquid cells for transmission electron microscopy. Nano Letters. 18 (6), 3313-3321 (2018).
  13. Ring, E. A., De Jonge, N. Microfluidic system for transmission electron microscopy. Microscopy and Microanalysis. 16 (5), 622-629 (2010).
  14. Inayoshi, Y., Minoda, H. A carbon sandwich environmental cell for wet specimens. Journal of Electron Microscopy. 62 (6), 623-628 (2013).
  15. Koo, K., Dae, K. S., Hahn, Y. K., Yuk, J. M. Live cell electron microscopy using graphene veils. Nano Letters. 20 (6), 4708-4713 (2020).
  16. De Jonge, N., Peckys, D. B. Live cell electron microscopy is probably impossible. ACS Nano. 10 (10), 9061-9063 (2016).
  17. Kennedy, E., Nelson, E. M., Damiano, J., Timp, G. Gene expression in electron-beam-irradiated bacteria in reply to "live cell electron microscopy is probably impossible.". ACS Nano. 11 (1), 3-7 (2017).
  18. Alves, E., et al. An insight on bacterial cellular targets of photodynamic inactivation. Future Medicinal Chemistry. 6 (2), 141-164 (2014).
  19. Cieplik, F., et al. Antimicrobial photodynamic therapy-What we know and what we don't. Critical Reviews in Microbiology. 44 (5), 571-589 (2018).
  20. Huang, L., et al. Type I and Type II mechanisms of antimicrobial photodynamic therapy: An in vitro study on gram-negative and gram-positive bacteria. Lasers in Surgery and Medicine. 44 (6), 490-499 (2012).
  21. Caminos, D. A., Spesia, M. B., Pons, P., Durantini, E. N. Mechanisms of Escherichia coli photodynamic inactivation by an amphiphilic tricationic porphyrin and 5,10,15,20-tetra(4-N,N,N-trimethylammoniumphenyl) porphyrin. Photochemical and Photobiological Sciences. 7 (9), 1071-1078 (2008).
  22. Chu, J. C. H., Chin, M. L., Wong, C. T. T., Hui, M., Lo, P. C., Ng, D. K. P. One-pot synthesis of a cyclic antimicrobial peptide-conjugated phthalocyanine for synergistic chemo-photodynamic killing of multidrug-resistant bacteria. Advanced Therapeutics. 4 (3), 1-10 (2021).
  23. Rogers, S., Honma, K., Mang, T. S. Confocal fluorescence imaging to evaluate the effect of antimicrobial photodynamic therapy depth on P. gingivalis and T. denticola biofilms. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 23, 18-24 (2018).
  24. Maldonado-Carmona, N., et al. Porphyrin-loaded lignin nanoparticles against bacteria: A photodynamic antimicrobial chemotherapy application. Frontiers in Microbiology. 11, 606185 (2020).
  25. Żak, A. M., Kaczmarczyk, O., Piksa, M., Grzęda, J., Matczyszyn, K. Fiber-optic sample illuminator design for the observation of light induced phenomena with transmission electron microscopy in situ: Antimicrobial photodynamic therapy. Ultramicroscopy. 230, 113388 (2021).
  26. Dinh, V. P., et al. Insight into the adsorption mechanisms of methylene blue and chromium(III) from aqueous solution onto pomelo fruit peel. RSC Advances. 9 (44), 25847-25860 (2019).
  27. Żak, A. Guide to controlling the electron dose to improve low-dose imaging of sensitive samples. Micron. 145, 103058 (2021).
  28. Drulyte, I., et al. Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation. Acta Crystallographica Section D. 74 (6), 560-571 (2018).
  29. Scarff, C. A., Fuller, M. J. G., Thompson, R. F., Iadaza, M. G. Variations on negative stain electron microscopy methods: Tools for tackling challenging systems. Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).
  30. Booth, D. S., Avila-Sakar, A., Cheng, Y. Visualizing proteins and macromolecular complexes by negative stain EM: From grid preparation to image acquisition. Journal of Visualized Experiments. (58), (2011).
  31. Rames, M., Yu, Y., Ren, G. Optimized negative staining: A high-throughput protocol for examining small and asymmetric protein structure by electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (90), e51087 (2014).
  32. Miller, B. K., Crozier, P. A. System for in situ UV-visible illumination of environmental transmission electron microscopy samples. Microscopy and Microanalysis. 19 (2), 461-469 (2013).
  33. Yuk, J. M., et al. High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells. Science. 336 (6077), 61-64 (2012).
  34. Schneider, N. M., et al. Electron-Water interactions and implications for liquid cell electron microscopy. Journal of Physical Chemistry C. 118 (38), 22373-22382 (2014).

Tags

Teknik utgåva 185
Ljusinducerad in <em>situ-transmissionselektronmikroskopi</em> för observation av interaktionen mellan vätska och mjuk materia
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Żak, A., Kaczmarczyk, O.… More

Żak, A., Kaczmarczyk, O. Light-Induced In Situ Transmission Electron Microscopy for Observation of the Liquid-Soft Matter Interaction. J. Vis. Exp. (185), e63742, doi:10.3791/63742 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter