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Cancer Research

केमोसेंसिटिविटी परीक्षण के लिए अग्नाशय के कैंसर से ज़ेबराफिश रोगी-व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट्स की स्थापना

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/63744
Automatic Translation
1, 2, 1, 2, 1
1Department of Biology, University of Pisa, 2General Surgery Unit, Department of Translational Research and New Technologies in Medicine and Surgery, University of Pisa

Summary

प्रीक्लिनिकल मॉडल का उद्देश्य कैंसर जीव विज्ञान के ज्ञान को आगे बढ़ाना और उपचार प्रभावकारिता की भविष्यवाणी करना है। यह पेपर ट्यूमर ऊतक के टुकड़ों के साथ ज़ेबराफिश-आधारित रोगी-व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट्स (जेडपीडीएक्स) की पीढ़ी का वर्णन करता है। जेडपीडीएक्स को कीमोथेरेपी के साथ इलाज किया गया था, जिसके चिकित्सीय प्रभाव का मूल्यांकन प्रत्यारोपित ऊतक के सेल एपोप्टोसिस के संदर्भ में किया गया था।

Abstract

कैंसर दुनिया भर में मौत के मुख्य कारणों में से एक है, और कई प्रकार के कैंसर की घटनाओं में वृद्धि जारी है। स्क्रीनिंग, रोकथाम और उपचार के मामले में बहुत प्रगति हुई है; हालांकि, प्रीक्लिनिकल मॉडल जो कैंसर रोगियों की केमोसेंसिटिविटी प्रोफाइल की भविष्यवाणी करते हैं, अभी भी कमी है। इस अंतर को भरने के लिए, एक विवो रोगी-व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट मॉडल विकसित और मान्य किया गया था। मॉडल निषेचन के 2 दिनों के बाद जेब्राफिश (डेनियो रेरियो) भ्रूण पर आधारित था, जिसका उपयोग रोगी के सर्जिकल नमूने से लिए गए ट्यूमर ऊतक के जेनोग्राफ्ट टुकड़ों के प्राप्तकर्ताओं के रूप में किया गया था।

यह भी ध्यान देने योग्य है कि ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट को बनाए रखने के लिए बायोप्टिक नमूने पचने या अलग-अलग नहीं थे, जो ट्यूमर व्यवहार और चिकित्सा की प्रतिक्रिया का विश्लेषण करने के संदर्भ में महत्वपूर्ण है। प्रोटोकॉल प्राथमिक ठोस ट्यूमर सर्जिकल रिसेक्शन से ज़ेबराफिश-आधारित रोगी-व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट्स (जेडपीडीएक्स) स्थापित करने के लिए एक विधि का विवरण देता है। एनाटोमोपैथोलॉजिस्ट द्वारा स्क्रीनिंग के बाद, नमूना को स्केलपेल ब्लेड का उपयोग करके विच्छेदित किया जाता है। नेक्रोटिक ऊतक, वाहिकाओं, या वसायुक्त ऊतक को हटा दिया जाता है और फिर 0.3 मिमी x 0.3 मिमी x 0.3 मिमी टुकड़ों में काट दिया जाता है।

टुकड़ों को तब फ्लोरोसेंटली लेबल किया जाता है और ज़ेब्राफिश भ्रूण के पेरिविटेलिन स्पेस में एक्सनोट्रांसप्लांट किया जाता है। बड़ी संख्या में भ्रूण को कम लागत पर संसाधित किया जा सकता है, जिससे कई एंटीकैंसर दवाओं के लिए जेडपीडीएक्स की कीमोसेंसिटिविटी के विवो विश्लेषण में उच्च-थ्रूपुट सक्षम हो सकता है। नियंत्रण समूह की तुलना में कीमोथेरेपी उपचार द्वारा प्रेरित एपोप्टोटिक स्तरों का पता लगाने और मात्रा निर्धारित करने के लिए कॉन्फोकल छवियों को नियमित रूप से अधिग्रहित किया जाता है। जेनोग्राफ्ट प्रक्रिया का एक महत्वपूर्ण समय लाभ है, क्योंकि इसे एक ही दिन में पूरा किया जा सकता है, जो सह-नैदानिक परीक्षणों के लिए चिकित्सीय स्क्रीनिंग करने के लिए एक उचित समय खिड़की प्रदान करता है।

Introduction

नैदानिक कैंसर अनुसंधान की समस्याओं में से एक यह है कि कैंसर एक एकल बीमारी नहीं है, बल्कि विभिन्न बीमारियों की एक किस्म है जो समय के साथ विकसित हो सकती है, ट्यूमर की विशेषताओंऔर रोगी 1 के आधार पर विशिष्ट उपचार की आवश्यकता होती है। नतीजतन, चुनौती रोगी-उन्मुख कैंसर अनुसंधान की ओर बढ़ना है, ताकि कैंसरउपचार परिणामों की शुरुआती भविष्यवाणी के लिए नई व्यक्तिगत रणनीतियों की पहचान की जा सके। यह अग्नाशयी डक्टल एडेनोकार्सिनोमा (पीडीएसी) के लिए विशेष रूप से प्रासंगिक है, क्योंकि इसे 11% 3 की 5 साल की जीवित रहने की दर के साथ एक कठिन-से-इलाज कैंसर माना जाता है।

देर से निदान, तेजी से प्रगति, और प्रभावी उपचारों की कमी पीडीएसी की सबसे अधिक दबाव वाली नैदानिक समस्याएं बनी हुई हैं। इसलिए, मुख्य चुनौती रोगी को मॉडल करना और बायोमार्कर की पहचान करना है जिसे व्यक्तिगत चिकित्सा 4,5,6 के अनुरूप सबसे प्रभावी चिकित्सा का चयन करने के लिए क्लिनिक में लागू किया जा सकता है। समय के साथ, कैंसर रोगों को मॉडल करने के लिए नए दृष्टिकोण प्रस्तावित किए गए हैं: रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड्स (पीडीओ) और माउस रोगी-व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट्स (एमपीडीएक्स) मानव ट्यूमर ऊतक के स्रोत से उत्पन्न हुए हैं। उनका उपयोग चिकित्सा की प्रतिक्रिया और प्रतिरोध का अध्ययन करने के लिए रोग को पुन: पेश करने के लिए किया गया है, साथ ही रोग पुनरावृत्ति 7,8,9 भी है।

इसी तरह, ज़ेबराफ़िश-आधारित रोगी-व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट (जेडपीडीएक्स) मॉडल में रुचि बढ़ी है, उनकी अनूठी और आशाजनक विशेषताओं 10 के लिए धन्यवाद, जो कैंसर अनुसंधान11,12 के लिए एक त्वरित और कम लागत वाले उपकरण का प्रतिनिधित्व करते हैं। जेडपीडीएक्स मॉडल को केवल एक छोटे ट्यूमर नमूना आकार की आवश्यकता होती है, जो कीमोथेरेपी की उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग को संभव बनाताहै। जेडपीडीएक्स मॉडल के लिए उपयोग की जाने वाली सबसे आम तकनीक प्राथमिक कोशिका आबादी के पूर्ण नमूना पाचन और आरोपण पर आधारित है, जो आंशिक रूप से ट्यूमर को पुन: उत्पन्न करती है, लेकिन ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट की कमी और घातक औरस्वस्थ कोशिकाओं के बीच क्रॉसटॉक के नुकसान हैं।

यह काम दिखाता है कि अग्नाशय के कैंसर रोगियों की केमोसेंसिटिविटी प्रोफाइल की पहचान करने के लिए जेडपीडीएक्स का उपयोग प्रीक्लिनिकल मॉडल के रूप में कैसे किया जा सकता है। मूल्यवान रणनीति जेनोग्राफ्ट प्रक्रिया की सुविधा प्रदान करती है, क्योंकि सेल विस्तार की कोई आवश्यकता नहीं है, जिससे कीमोथेरेपी स्क्रीनिंग के त्वरण की अनुमति मिलती है। मॉडल की ताकत यह है कि सभी माइक्रोएन्वायरमेंट घटकों को बनाए रखा जाता है क्योंकि वे रोगी कैंसर ऊतक में होते हैं, क्योंकि, जैसा कि यह अच्छी तरह से ज्ञात है, ट्यूमर का व्यवहार उनके अंतःक्रिया15,16 पर निर्भर करता है। यह साहित्य में वैकल्पिक तरीकों पर अत्यधिक अनुकूल है, क्योंकि ट्यूमर विषमता को संरक्षित करना और रोगी-विशिष्ट तरीके से उपचार के परिणाम और रिलैप्स की भविष्यवाणी में सुधार करने में योगदान करना संभव है, इस प्रकार जेडपीडीएक्स मॉडल को सह-नैदानिक परीक्षणों में उपयोग करने में सक्षम बनाता है। यह पांडुलिपि जेडपीडीएक्स मॉडल बनाने में शामिल चरणों का वर्णन करती है, जो रोगी ट्यूमर रिसेक्शन के एक टुकड़े से शुरू होती है और कीमोथेरेपी की प्रतिक्रिया का विश्लेषण करने के लिए इसका इलाज करती है।

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Protocol

इतालवी सार्वजनिक स्वास्थ्य मंत्रालय ने जानवरों के उपयोग और देखभाल पर निर्देश 2010/63 / यूरोपीय संघ के अनुरूप वर्णित सभी पशु प्रयोगों को मंजूरी दी। स्थानीय नैतिक समिति ने पंजीकरण संख्या 70213 के तहत अध्ययन को मंजूरी दी। इसमें शामिल सभी विषयों से सूचित सहमति प्राप्त की गई थी। शुरू करने से पहले, सभी समाधान और उपकरण तैयार किए जाने चाहिए (खंड 1) और मछली को पार किया जाना चाहिए (खंड 2)।

1. समाधान और उपकरणों की तैयारी

नोट: तैयार किए जाने वाले समाधान और मीडिया के लिए तालिका 1 देखें।

  1. Agarose जेल समर्थन
    1. एक माइक्रोवेबल फ्लास्क में अगारोस पाउडर का वजन करें और इसे 1% जेल बनाने के लिए ई 3 जेब्राफिश माध्यम की दी गई मात्रा में घोलें। एक माइक्रोवेव में तब तक गर्म करें जब तक कि अगारोस पूरी तरह से घुल न जाए।
      नोट: घोल को अधिक उबालें नहीं।
    2. पिघले हुए अगारोस को पेट्री डिश में डालें और तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि जेल पूरी तरह से जम न जाए।
    3. नोक काटने के साथ प्लास्टिक पाश्चर पिपेट का उपयोग करके छोटे अगारोस सिलेंडर (~ 5 मिमी ऊंचा) बनाएं। एक बार तैयार होने के बाद, एल्यूमीनियम पन्नी में लपेटकर 4 डिग्री सेल्सियस पर पेट्री डिश में स्टोर करें।
  2. ग्लास माइक्रोनीडल।
    1. ठीक सुइयों को प्राप्त करने के लिए बोरोसिलिकेट ग्लास केशिकाओं को एक पुलर के साथ खींचें (सेटिंग्स: हीट 990, पुल 550)।
      नोट: एक केशिका से, 10 μm के टिप व्यास के साथ दो महीन सुइयों को प्राप्त करना संभव है।

2. मछली पार करना और अंडे का संग्रह

  1. अवधेश एट अल.17 द्वारा वर्णित ऊतक आरोपण से 3 दिन पहले प्रजनन टैंक में वयस्क मछली को स्थानांतरित करें।
  2. नोट: महिलाओं के लिए 1: 1 या 2: 3 पुरुषों के अनुपात की सिफारिश की जाती है। मछली घनत्व प्रति लीटर पानी में अधिकतम पांच मछली होना चाहिए। नर और मादा को रात भर एक बाधा के साथ अलग रखें।
  3. अगले दिन, बाधा को हटा दें और मछली को संभोग करने की अनुमति दें।
  4. प्रजनन टैंक से मछली निकालें और उन्हें अपने आवास टैंक में वापस कर दें।
  5. एक महीन जाल जाल के माध्यम से प्रजनन टैंक से पानी डालें। निषेचित अंडे को ई 3 जेब्राफिश माध्यम के साथ पेट्री डिश में स्थानांतरित करें।
  6. एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के साथ पेट्री डिश की जांच करें और बादल अंडे को छोड़ दें। निषेचित अंडे को ताजा ई 3 जेब्राफिश माध्यम में 28 डिग्री सेल्सियस पर रखें।

3. नमूना संग्रह

नोट: आटोक्लेव फोर्सेस और एक स्केलपेल हैंडल।

  1. तत्काल प्रसंस्करण
    1. 4 डिग्री सेल्सियस (5 मिमी से 10 मिमी व्यास तक के ट्यूमर नमूने) पर ट्यूमर माध्यम के 10 एमएल में ट्यूमर के सर्जिकल नमूने एकत्र करें। तत्काल प्रसंस्करण के लिए वांछित स्थान से 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूना स्थानांतरित करें।
  2. रात भर भंडारण (वैकल्पिक)
    1. ट्यूमर माध्यम के 10 एमएल में सर्जिकल ट्यूमर नमूना एकत्र करें और नमूने को 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर स्टोर करें।
  3. -80 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण (वैकल्पिक, कम से कम अनुशंसित)
    1. 5% डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) के साथ पूरक ट्यूमर माध्यम के साथ क्रायोजेनिक शीशी में -80 डिग्री सेल्सियस पर नमूना स्टोर करें।

4. नमूना प्रसंस्करण

नोट: एक बाँझ ऊतक संस्कृति लामिनर प्रवाह हुड के तहत चरणों का पालन करें।

  1. प्लास्टिक पाश्चर पिपेट का उपयोग करके 10 x ऊपर और नीचे 10x ऊपर और नीचे 5 मिलीलीटर ताजा ट्यूमर माध्यम के साथ पूरे ट्यूमर ऊतक को धोएं। धोने के माध्यम को एस्पिरेट करें और छोड़ दें। इस चरण को 3x दोहराएँ।
    नोट: ट्यूमर ऊतक की आकांक्षा से बचें क्योंकि यह प्लास्टिक पाश्चर पिपेट से जुड़ा रह सकता है।
  2. नमूने को पेट्री डिश में स्थानांतरित करें और इसे ताजा ट्यूमर माध्यम के 1-2 एमएल में मिलाएं। स्केलपेल ब्लेड का उपयोग करके ट्यूमर के नमूने को छोटे टुकड़ों (1-2 मिमी3) में काटें और उन्हें ट्यूमर माध्यम के साथ बाँझ 5 एमएल प्लास्टिक ट्यूब में रखें।
  3. मैकइलवैन ऊतक चॉपर को 100 μm मोटाई पर सेट करें। नमूने के टुकड़ों को चॉपर की गोलाकार प्लास्टिक टेबल पर रखें और उन्हें काट लें। टेबल को 90° से घुमाएं और चॉपिंग दोहराएं।
  4. 3 मिनट के लिए 300 × ग्राम पर टुकड़ों को सेंट्रीफ्यूज करें। फिर, सतह पर तैरनेवाले को ध्यान से घुमाएं और इसे छोड़ दें।
  5. 30 मिनट के लिए एक फ्लोरोसेंट सेल ट्रैकर, सीएम-डीआईआई (डलबेकको के फॉस्फेट बफर्ड सेलाइन [डीपीबीएस] में 10 μg / mL की अंतिम एकाग्रता), डीप रेड (DPBS में 1 μL / mL की अंतिम एकाग्रता), या सेलट्रेस (DPBS में 5 μM की अंतिम एकाग्रता) के साथ टुकड़ों को इनक्यूबेट करें, ट्यूब को 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में रखें।
  6. हर 10 मिनट में धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पाइप करके टुकड़ों को फिर से निलंबित करें।
    नोट: सेलट्रेस के मामले में, निर्माता के निर्देशों के अनुसार, इनक्यूबेशन के अंत में कम से कम 1% प्रोटीन युक्त माध्यम जोड़ें।
  7. 3 मिनट के लिए 300 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें और सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें। अनिगमित डाई को हटाने के लिए डीपीबीएस के 1 एमएल के साथ इस चरण 3x को दोहराएं।
  8. 60 मिमी पेट्री डिश में डीपीबीएस के 5 एमएल में टुकड़ों को निलंबित करें।
    नोट: सुनिश्चित करें कि ऊतक सूख नहीं जाता है।

5. जेडपीडीएक्स की स्थापना

नोट: एक बाँझ ऊतक संस्कृति लामिनर प्रवाह हुड के तहत चरणों का पालन करें।

  1. ई 3 जेब्राफिश माध्यम में 0.16 मिलीग्राम / एमएल ट्राइकेन के साथ निषेचन (डीपीएफ) भ्रूण के 2 दिनों के बाद एनेस्थेटाइज करें।
  2. एक पेट्री डिश में तीन अगारोस सिलेंडर (चरण 1.1.3) डालें और एक तरफ उजागर करते हुए एक सिलेंडर पर जेब्राफिश भ्रूण बिछाएं। भ्रूण को सिर्फ एक पतली फिल्म में रखने के लिए अतिरिक्त घोल को हटा दें।
  3. पेट्री डिश से बाँझ बल के साथ दाग वाले ऊतक के टुकड़े को 1% अगारोस समर्थन में स्थानांतरित करें जहां भ्रूण पड़ा है। ऊतक को उठाएं, इसे भ्रूण की जर्दी के ऊपर रखें, और फिर इसे गर्मी से खींचे गए ग्लास माइक्रोनीडल (चरण 1.2.1) का उपयोग करके पेरिविटेलिन स्पेस में धक्का दें।
  4. धीरे से ई 3 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (पेन-स्ट्रेप) की कुछ बूंदें भ्रूण को तरल में वापस लाने के लिए जोड़ें।
  5. सभी भ्रूणों के लिए चरण 5.2-5.4 दोहराएं, और अंत में, पेट्री डिश से अगारोस समर्थन को हटा दें और भ्रूण को 35 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  6. फ्लोरोसेंट स्टीरियोमाइक्रोस्कोप का उपयोग करके प्रत्यारोपण के 2 घंटे बाद सही जेनोग्राफ्ट्स (सकारात्मक धुंधलापन) के लिए भ्रूण की जांच करें। ट्यूमर के टुकड़ों के साथ भ्रूण को छोड़ दें जो पूरी तरह से पेरिविटेलिन स्पेस के अंदर नहीं हैं, साथ ही मृत भ्रूण भी। यादृच्छिक रूप से भ्रूण को छह बहु-वेल प्लेटों (अधिकतम एन = 20 भ्रूण / वेल) में वितरित करें, प्रयोगात्मक योजना (जैसे, नियंत्रण और फोल्फोक्सिरी) के अनुसार समूहों में समान रूप से विभाजित हैं।

6. उपचार

  1. दवा (जैसे, 5-फ्लूरोउरासिल, ऑक्सालिप्लेटिन, इरिनोटेकन) को ई 3 1% पेन-स्ट्रेप में पतला करें, कई बार ऊपर और नीचे पाइप करके अच्छी तरह से मिलाएं। जैसा कि उसाई एट अल .12 द्वारा प्रस्तावित किया गया है, समकक्ष प्लाज्मा एकाग्रता (ईपीसी) के संबंध में मछली के पानी में दवा के पांच गुना कमजोर पड़ने का उपयोग करें।
  2. कॉकटेल तैयार करने के लिए दवाओं को मिलाएं (उदाहरण के लिए, फोल्फोक्सिरी)।
  3. प्रत्येक कुएं से मीडिया को हटा दें और आरोपण के 2 घंटे बाद दवा कॉकटेल जोड़ें।
  4. 3 दिनों के लिए भ्रूण का इलाज करें। हर दिन दवा कॉकटेल को नवीनीकृत करें।

7. होल-माउंट इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला

नोट: शुरू करने से पहले, एसीटोन को -20 डिग्री सेल्सियस पर रखें और तालिका 1 में सूचीबद्ध समाधान तैयार करें।

  1. दिन 1:
    1. रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर कांच की शीशियों में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के 1 मिलीलीटर के साथ लार्वा को ठीक करें।
  2. दूसरा दिन:
    1. लार्वा को 1 एमएल पीबीएस के साथ 3 x 5 मिनट धोएं, धीरे से एक प्रयोगशाला प्लेटफॉर्म रॉकर (400 आरपीएम) पर आंदोलन करें।
    2. रात भर (या दीर्घकालिक भंडारण के लिए) -20 डिग्री सेल्सियस पर 100% मेथनॉल के 1 एमएल में स्टोर करें।
    3. 1 एमएल पीटीडब्ल्यू (पीबीएस में 0.1% ट्वीन) के साथ 3 x 10 मिनट को रीहाइड्रेट करें, धीरे से एक प्रयोगशाला प्लेटफॉर्म रॉकर (400 आरपीएम) पर आंदोलन करें।
    4. आरटी पर 5 मिनट के लिए पीएच 8.8 पर 150 एमएम ट्रिस-एचसीएल के 1 मिलीलीटर के साथ परमेबिलाइज करें, इसके बाद 70 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए हीटिंग करें।
    5. 2 x 10 मिनट को 1 मिलीलीटर पीटीडब्ल्यू के साथ धोएं, धीरे से एक प्रयोगशाला मंच रॉकर (400 आरपीएम) पर आंदोलन करें।
    6. 2 x 5 मिनट को 1 एमएल डीएच2ओ के साथ धोएं, धीरे से एक प्रयोगशाला प्लेटफॉर्म रॉकर (400 आरपीएम) पर आंदोलन करें।
    7. -20 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 1 मिलीलीटर बर्फ-ठंडे एसीटोन के साथ परमेबिलाइज करें।
    8. 2 x 5 मिनट को 1 एमएल डीएच2ओ के साथ धोएं, धीरे से एक प्रयोगशाला प्लेटफॉर्म रॉकर (400 आरपीएम) पर आंदोलन करें।
    9. 1 एमएल पीटीडब्ल्यू के साथ 2 x 5 मिनट धोएं, धीरे से एक प्रयोगशाला प्लेटफॉर्म रॉकर (400 आरपीएम) पर आंदोलन करें।
    10. लार्वा को 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए बफर को अवरुद्ध करने के 1 एमएल में इनक्यूबेट करें, धीरे से एक प्रयोगशाला प्लेटफॉर्म रॉकर (400 आरपीएम) पर आंदोलन करें।
    11. लार्वा को प्रति समूह विभाजित अच्छी प्लेटों में निम्नानुसार रखें: 96-वेल प्लेट में 50 μL मात्रा / कुएं में 10 लार्वा या 48-वेल प्लेट में 100 μL मात्रा / कुएं में 20 लार्वा।
    12. ब्लॉकिंग बफर को छोड़ दें, लार्वा को प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान (जैसे, खरगोश एंटी-ह्यूमन क्लीवर कैसपेज़ -3, 1: 250) के साथ इनक्यूबेट करें जो अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेशन बफर में पतला होता है, और धीरे से शेकर प्लेट (400 आरपीएम) पर चट्टान होता है। अनुशंसित वॉल्यूम के लिए चरण 7.2.11 देखें।
  3. दिन 3:
    1. लार्वा को क्रमिक रूप से 3 x 1 घंटे पीबीएस-टीएस के 1 एमएल (10% बकरी सीरम, पीबीएस में 1% ट्राइटन एक्स -100) के साथ धोएं और फिर, पीबीएस-टी के 1 एमएल (पीबीएस में 1% ट्राइटन एक्स -100) के साथ 2 x 10 मिनट और पीबीएस-टीएस के 1 एमएल के साथ 2 x 1 घंटे के साथ। प्रत्येक धोने में, धीरे से एक शेकर प्लेट (400 आरपीएम) पर लार्वा युक्त प्लेटों को हिलाएं।
    2. लार्वा को फ्लोरोसेंट-डाई संयुग्मित द्वितीयक एंटीबॉडी (जैसे, बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी [एच + एल] क्रॉस-अधिशोषित माध्यमिक एंटीबॉडी, एलेक्सा फ्लुर 647, 1:500) और 100 μg / mL Hoechst 33258 के साथ रात भर अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन बफर में पतला किया जाता है, जिसमें शेकर प्लेट (400 आरपीएम) पर कोमल आंदोलन होता है। द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान की अनुशंसित मात्रा के लिए चरण 7.2.11 देखें।
  4. चौथा दिन:
    1. 3 x 1 घंटे को 1 मिलीलीटर पीबीएस-टीएस के साथ और 2 x 1 घंटे को 1 मिलीलीटर पीटीडब्ल्यू के साथ धोएं, शेकर प्लेट (400 आरपीएम) पर कोमल आंदोलन के साथ।
    2. माइक्रोस्कोप स्लाइड पर तामचीनी (~ 0.5-1 मिमी की मोटाई) के साथ एक गोलाकार परत बनाएं। तामचीनी को सूखने दें और लार्वा को गोलाकार परत के केंद्र में रखें, जिससे जेनोग्राफ्ट के किनारे को उजागर किया जा सके।
    3. अतिरिक्त घोल को सुखाएं और ग्लास कवरस्लिप को पानी में घुलनशील, गैर-फ्लोरेसिंग माउंटिंग माध्यम से माउंट करें।

8. इमेजिंग

  1. 40x उद्देश्य के साथ कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के तहत छवियों को कैप्चर करें। निम्न अधिग्रहण पैरामीटर का उपयोग करें: 5 μm की Z-रिक्ति के साथ 1024 x 512 पिक्सेल का रिज़ॉल्यूशन।

9. इमेजजे द्वारा एपोप्टोसिस का विश्लेषण

  1. लोड करें (फिजी जस्ट) इमेजजे सॉफ्टवेयर (https://imagej.net/Fiji/Downloads) और जेड-स्टैक फ़ाइल छवि खोलें (फ़ाइल क्लिक करें | खुला)। पॉप-अप विंडो में, स्टैक व्यूइंग/हाइपरस्टैक का चयन करें और ओके पर क्लिक करें।
  2. छवि का चयन करके विभिन्न चैनलों को ओवरले करें | रंग | कम्पोजिट बनाओ।
  3. जेड-स्टैक छवि के माध्यम से ब्राउज़ करने के लिए छवि के निचले भाग में जेड बार खींचें और जेनोग्राफ्ट क्षेत्र (कोशिकाएं जो फ्लोरोसेंट सेल ट्रैकर पॉजिटिव हैं) की पहचान करें। चरण 4.5) जेब्राफिश पेरिविटेलिन स्पेस में देखें।
  4. पॉइंट टूल का चयन करें और एपोप्टोटिक मानव कोशिकाओं की संख्या (फ्लोरोसेंट सेल ट्रैकर और क्लीवर कैसपेज़ -3 के लिए सकारात्मक) की गणना करें, जैसा कि पूरक वीडियो एस 1 में दिखाया गया है।
  5. पॉइंट टूल आइकन पर डबल क्लिक करें, काउंटर बदलें, और मानव सेल नाभिक (सीएम-डीआईआई पॉजिटिव कोशिकाओं के नाभिक) की कुल संख्या की गणना करें।

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Representative Results

यह प्रोटोकॉल प्राथमिक मानव अग्नाशयी एडेनोकार्सिनोमा से जेडपीडीएक्स स्थापित करने के लिए प्रयोगात्मक दृष्टिकोण का वर्णन करता है। प्रोटोकॉल अनुभाग 4 में वर्णित फ्लोरोसेंट डाई का उपयोग करके एक ट्यूमर का नमूना एकत्र, कीमा और दाग दिया गया था। जेडपीडीएक्स को तब 2 डीपीएफ जेब्राफिश भ्रूण के पेरिविटेलिन स्पेस में ट्यूमर के एक टुकड़े के आरोपण द्वारा सफलतापूर्वक स्थापित किया गया था, जैसा कि प्रोटोकॉल खंड 5 में वर्णित है। जैसा कि प्रोटोकॉल खंड 6 में वर्णित है, रोगी-व्युत्पन्न कैंसर कोशिकाओं की कीमोथेरेपी संवेदनशीलता प्रोफाइल की पहचान करने के लिए जेडपीडीएक्स की आगे जांच की गई थी। उदाहरण के लिए, कीमोथेरेपी संयोजन फोल्फोक्सिरी (5-फ्लूरोउरासिल, फोलिक एसिड, ऑक्सालिप्लेटिन और इरिनोटेकन) का परीक्षण किया गया था, क्योंकि इसका उपयोग उन्नत अग्नाशयी डक्टल एडेनोकार्सिनोमा और मेटास्टैटिक कोलोरेक्टल कैंसर के लिए पहली पंक्ति के कीमोथेरेपी के रूप में किया जाता है। जेडपीडीएक्स की पूरी-माउंट छवियों को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर जेड-स्टैक के रूप में अधिग्रहित किया गया था, और एपोप्टोसिस प्रेरण का विश्लेषण प्रोटोकॉल अनुभाग 8 और 9 में वर्णित के रूप में किया गया था। जैसा कि चित्रा 1 ए, बी में दिखाया गया है, संयुक्त चिकित्सा ने नियंत्रण समूह की तुलना में सेल एपोप्टोसिस में वृद्धि की। यहां रिपोर्ट किए गए मामले के अध्ययन में, नियंत्रण समूह (चित्रा 1 सी) की तुलना में फोल्फोक्सिरी-उपचारित समूह के लिए प्रत्यारोपित जेनोग्राफ्ट्स में एपोप्टोटिक कोशिकाओं के अंश में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण वृद्धि की पहचान की गई थी।

Figure 1

चित्रा 1: फोल्फॉक्सआईआरआई उपचार के 3 दिन बाद मानव अग्नाशयी डक्टल एडेनोकार्सिनोमा से जेडपीडीएक्स। कोशिका झिल्ली को सीएम-डीआईआई (लाल) से दाग दिया गया था और ऊतक को 2 डीपीएफ एबी जंगली-प्रकार की ज़ेबराफिश के पेरिविटेलिन स्पेस में जेनोग्राफ्ट किया गया था। लार्वा को फोल्फोक्सिरी संयोजन (0.216 मिलीग्राम/एमएल 5-फ्लोरोउरासिल, 0.013 मिलीग्राम/एमएल फोलिक एसिड, 0.006 मिलीग्राम/एमएल ऑक्सालिप्लेटिन, 0.011 मिलीग्राम/एमएल इरिनोटेकन) के संपर्क में लाया गया या 3 दिनों के लिए उजागर नहीं किया गया (सीटीआरएल) के संपर्क में लाया गया। ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड में एक्वा पॉली-माउंट के साथ लार्वा लगाया गया था। (A1-3) एक नियंत्रण लार्वा का प्रतिनिधि उदाहरण (कीमोथेरेपी के संपर्क में नहीं)। कोई क्लीवर कैसपेज़ -3-पॉजिटिव कोशिकाएं नहीं देखी गईं। (B1-3) फोल्फोक्सिरी उपचार के 3 दिन बाद एक जेनोग्राफ्ड लार्वा का प्रतिनिधि उदाहरण, क्लीवर कैसपेज़ -3 के लगातार सक्रियण को दर्शाता है। पूरे माउंट छवियों को एक डिजिटल कैमरे के साथ निकोन ए 1 कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर कैप्चर किया गया था। धराशायी रेखाएं जेनोग्राफ्ट क्षेत्रों को दिखाती हैं। (ग) सीटीआरएल की तुलना में फोल्फोक्सिरी के साथ उपचारित जेनोग्राफ्ड लार्वा में क्लीवर कैसपेज़-3 और सीएम-डीआईआई डबल पॉजिटिव कोशिकाओं का परिमाणीकरण, जिसे एसईएम (एन ≥ 12) ± रूप में प्लॉट किया गया है; पी < 0.001, मैन-व्हिटनी यू परीक्षण। स्केल सलाखों = 100 μm. संक्षेप: जेडपीडीएक्स = ज़ेबराफिश रोगी-व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट; डीपीएफ = निषेचन के बाद के दिन; फोल्फोक्सिरी = 5-फ्लोरोउरासिल, फोलिक एसिड, ऑक्सालिप्लेटिन, और इरिनोटेकन; CTRL = नियंत्रण. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
समाधान/माध्यम रचना, टिप्पणियाँ लक्ष्य
ट्यूमर माध्यम (1x) आरपीएमआई -1640 माध्यम में, पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (अंतिम एकाग्रता 100 यू / एमएल) और एम्फोटेरिसिन (अंतिम एकाग्रता 2.50 μg / mL) जोड़ें।
E3 जेब्राफिश माध्यम (1x) विआयनीकृत पानी में 60x E3 भ्रूण माध्यम (NaCl 3M, KCl 0.1M, CaCl 2 0.2 M, MgSO4 0.2 M) को 1x की अंतिम कार्यशील सांद्रता तक पतला करें।
E3 1% पेन-स्ट्रेप ई 3 ज़ेब्राफिश माध्यम के 99 एमएल में पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के 1 मिलीलीटर जोड़ें। व्युत्क्रम द्वारा मिश्रण करें। घोल को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें
PTw पीबीएस में 0.1% ट्वीन। होल-माउंट इम्यूनोस्टेनिंग।
बफर ब्लॉक करना पीटीडब्ल्यू में 10% बकरी सीरम, 1% डीएमएसओ, 1% बीएसए, 0.8% ट्राइटन एक्स -100 होल-माउंट इम्यूनोस्टेनिंग।
इनक्यूबेशन बफर पीटीडब्ल्यू में 1% बकरी सीरम, 1% डीएमएसओ, 1% बीएसए, 0.8% ट्राइटन एक्स -100 होल-माउंट इम्यूनोस्टेनिंग।
पीबीएस-टीएस पीबीएस में 10% बकरी सीरम, 1% ट्राइटन एक्स -100 होल-माउंट इम्यूनोस्टेनिंग।
पीबीएस-टी पीबीएस में 1% ट्राइटन एक्स -100। होल-माउंट इम्यूनोस्टेनिंग।

तालिका 1: प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले समाधान और मीडिया।

पूरक चित्रा एस 1: पीडीएसी ट्यूमर का नमूना डीआईओ सना हुआ (हरा) था और 2 डीपीएफ जेब्राफिश भ्रूण के पेरिविटेलिन स्पेस में जेनोग्राफ्ट किया गया था । 3 दिन के इनक्यूबेशन समय के बाद, जेडपीडीएक्स को 2 μg / mL प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई; लाल) के साथ इंजेक्ट किया गया और फिर 3 डी कॉन्फोकल इमेजिंग के अधीन किया गया। मानव कोशिकाओं (डीआईओ पॉजिटिव) की कुल संख्या में से पीआई-पॉजिटिव कोशिकाओं को मापकर सेल व्यवहार्यता की जांच की गई थी। स्केल बार = 100 μm। संक्षेप: पीडीएसी = अग्नाशयी डक्टल एडेनोकार्सिनोमा; डीपीएफ = निषेचन के बाद के दिन; जेडपीडीएक्स = ज़ेबराफिश रोगी-व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक वीडियो एस 1: इमेजजे के बहु-बिंदु उपकरण का उपयोग करके एपोप्टोटिक मानव सेल गिनती का उदाहरण। यह वीडियो प्रत्यारोपण के 3 दिन बाद जेडपीडीएक्स का जेड-स्टैक है, जिसे कैसपेज़ -3 और होचस्ट 33258 इम्यूनोस्टेनिंग के बाद अधिग्रहित किया गया है। संक्षेप: zPDX = ज़ेबराफ़िश रोगी-व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

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Discussion

कैंसर अनुसंधान में विवो मॉडल कैंसर जीव विज्ञान को समझने और कैंसर उपचार प्रतिक्रिया की भविष्यवाणी करने के लिए अमूल्य उपकरण प्रदान करते हैं। वर्तमान में, विवो मॉडल में अलग-अलग उपलब्ध हैं, उदाहरण के लिए, आनुवंशिक रूप से संशोधित जानवर (ट्रांसजेनिक और नॉकआउट चूहों) या मानव प्राथमिक कोशिकाओं से रोगी-व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट। कई इष्टतम विशेषताओं के बावजूद, प्रत्येक की विभिन्न सीमाएं हैं। विशेष रूप से, उपर्युक्त मॉडल में रोगी ट्यूमर ऊतक माइक्रोएन्वायरमेंट की नकल करने के लिए एक विश्वसनीय तरीके की कमी है।

यह सुझाव दिया गया है कि ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट दवा प्रतिक्रिया18 में कई महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकता है। इसलिए, ट्यूमर ऊतक माइक्रोएन्वायरमेंट को बनाए रखने वाले एक उपयुक्त पशु मॉडल को खोजने के लिए, एक वैकल्पिक पीडीएक्स मॉडल विकसित किया गया था, जिसमें 2 डीपीएफ जेब्राफिश भ्रूण में ट्यूमर ऊतक के टुकड़ों का उपयोग किया गया था। प्रोटोकॉल बताता है कि बड़ी संख्या में भ्रूणों में जेनोग्राफ्ट्स कैसे किया जाए, जिससे दवाओं की उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग की अनुमति मिलती है, दोनों एकल एजेंटों के रूप में और संयोजन में।

इस अभिनव दृष्टिकोण का मुख्य बिंदु यह है कि यह एकल-सेल निलंबन के साथ आमतौर पर किए जाने वाले जेडपीडीएक्स की तुलना में सेल-सेल इंटरैक्शन और ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट दोनों को संरक्षित करता है। एक सर्जिकल नमूने से पीडीएसी को तुरंत ताजा और ठंडे ट्यूमर मीडिया में डाल दिया जाता है, और ट्यूमर को छोटे टुकड़ों में काट दिया जाता है। जेडपीडीएक्स मॉडल उत्पन्न करने के लिए उपयोग की जाने वाली समग्र प्रक्रिया एक रोगी के ट्यूमर से 2 डीपीएफ जेब्राफिश भ्रूण के पेरिविटेलिन स्पेस में एक टुकड़े के प्रत्यक्ष आरोपण पर आधारित है।

प्रस्तावित मॉडल रोगी-व्युत्पन्न ट्यूमर ऊतक के नमूने के पाचन के आधार पर पीडीएक्स मॉडल के विकल्प के रूप में काम कर सकता है, इसके बाद जर्दी थैली में या पेरिविटेलिन स्पेस में सीधे इंजेक्शन दिया जा सकता है। जैसा कि फियोर एट अल द्वारा किए गए काम से स्पष्ट है, शल्य चिकित्सा से बचाए गए अग्नाशय ी कैंसर के एंजाइमेटिक विच्छेदन से एक जेडअवतार मॉडल स्थापित करना संभव है। ट्यूमर अग्नाशय के नमूने की विशिष्ट कम सेलुलरता और प्रतिकूल घने डेस्मोप्लास्टिक स्ट्रोमा19 के कारण आरोपण दर 44% और 64% के बीच थी।

हालांकि, सेल निलंबन केवल आंशिक रूप से मूल ट्यूमर14 को पुन: पेश करता है। इसके विपरीत, इम्यूनोडेफिशिएंट चूहों में ट्यूमर ऊतक को सीधे प्रत्यारोपण करके निर्मित एमपीडीएक्स, मूल ट्यूमर जैसा दिखता है, जो चिकित्सकों को ट्यूमर व्यवहार को समझने और उपचारसे पहले व्यक्तिगत प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन करने में बेहतर मदद कर सकता है। वास्तव में, छोटा, संलग्न टुकड़ा ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट को बनाए रखता है और मूल ट्यूमर21 के समान घातक और स्वस्थ कोशिकाओं के बीच क्रॉसस्टॉक को संरक्षित करता है। ट्रांसलेशनल ऑन्कोलॉजी14 के क्षेत्र में जेडपीडीएक्स तकनीक के प्रत्यक्ष प्रभाव के साथ, केमोसेंसिटिविटी या केमोरेसिस्टेंस को बेहतर पुन: पेश किया जाता है। जेडपीडीएक्स दृष्टिकोण प्रत्येक रोगी को एक जीवित प्रणाली में विकसित अपने स्वयं के ट्यूमर को विकसित करने में सक्षम बनाता है। इस प्रकार, यह एमपीडीएक्स के उपयोग के लिए एक अच्छा विकल्प का प्रतिनिधित्व करता है, जहां ट्यूमर ऊतक कोशिकाओं में ऑर्थोग्राफ्ट बरकरार या अलग-अलग होता है, जिसे बाद में माउस प्राप्तकर्ता मॉडल13 में जेनोग्राफ्ट किया जाता है।

यह प्रोटोकॉल पैथोलॉजिस्ट के सहयोग से विकसित किया गया था जो प्रत्यारोपण के लिए सबसे उपयुक्त ट्यूमर टुकड़ों का चयन करने के लिए जिम्मेदार हैं। जैविक ऊतक के नमूने हमेशा सर्जिकल नमूने से लिए गए हैं और बायोप्सी से कभी नहीं, क्योंकि बाद में आमतौर पर ऊतक की कमी की विशेषता होती है और इसलिए इसे केवल नैदानिक उद्देश्यों के लिए नियत किया जाता है। ऊतक नमूने के लिए मानदंड आमतौर पर सीमांत बनाम कोर नहीं होता है, बल्कि एक ट्यूमर क्षेत्र होता है जो रक्तस्राव और परिगलन से रहित होता है। इस कारण से, सामग्री के तत्काल गुणवत्ता नियंत्रण के लिए नमूने के आधे हिस्से पर हमेशा एक क्रायोस्टेट हिस्टोलॉजिकल सेक्शन किया गया था। वर्तमान अध्ययन प्राथमिक ट्यूमर कोशिकाओं की क्षमता से सीमित हो सकता है जो जेब्राफिश भ्रूण के पेरिविटेलिन स्पेस में प्रवेश कर सकते हैं। हालांकि, प्रत्यारोपण के 3 दिन बाद व्यवहार्य ऊतक की 80% एन्ग्राफमेंट दर देखी गई, दोनों 4 डिग्री सेल्सियस (12/15 मामलों) पर भंडारण के बाद और -80 डिग्री सेल्सियस (10/12 मामलों) से डीफ्रॉस्ट किया गया, यह सुझाव देते हुए कि ट्यूमर को 74% ± 2% की सेल व्यवहार्यता के साथ प्रभावी रूप से क्रायोप्रिजर्व किया जा सकता है (पूरक चित्रा एस 1)। इसके बावजूद, ऊतक एन्ग्राफमेंट की सफलता दर विभिन्न पीडीएसी रोगी ट्यूमर के बीच भिन्न होती है; नतीजतन, सर्जिकल रिसेक्शन के तुरंत बाद ऊतक का तेजी से प्रसंस्करण, साथ ही ठंड को रोकना, दक्षता को बढ़ा सकता है।

सफल जेनोग्राफ्ट्स के लिए प्रोटोकॉल में कुछ तकनीकी समीचीन भी सुझाए गए हैं। उदाहरण के लिए, हेलिकॉप्टर के उपयोग ने जेनोग्राफ्ड टुकड़ों के आयामों को मानकीकृत किया। यह जांचने के लिए कि काटने के बाद ट्यूमर ऊतकों के टुकड़े आयाम में बराबर हैं, एक संभावित समाधान क्सीनट्रांसप्लांटेशन से पहले टुकड़ों के व्यास को मापने के लिए अंशांकन ग्लास का उपयोग करना है।

1% एगारोस सिलेंडर समर्थन का उपयोग भ्रूण को एक तरफ बिछाने और बस ट्यूमर के एक टुकड़े को प्रत्यारोपित करने के साथ-साथ माइक्रोनीडल को तोड़ने से रोकने के लिए आवश्यक है। क्योंकि ट्यूमर एक उच्च परिवर्तनशीलता प्रदर्शित करते हैं, विधि की एक और सीमा यह है कि सेलुलर निलंबन की तुलना में एक टुकड़े में इंट्राट्यूमरल विषमता का कम प्रतिनिधित्व किया जाता है। वास्तव में, छोटे ऊतक के टुकड़े सौम्य कोशिका आबादी और ट्यूमर सबक्लोन के संदर्भ में भिन्न हो सकते हैं। इस आलोचना को दूर करने के लिए, ट्यूमर विषमता को पुन: उत्पन्न करने और विश्लेषण में परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए इंजेक्शन भ्रूण की एक उच्च संख्या का उपयोग किया जाना चाहिए। सांख्यिकीय विश्लेषण के अनुसार, प्रत्येक समूह को डी = 2 के प्रभाव आकार और 80% और 95% सांख्यिकीय महत्व की शक्ति पर विचार करते हुए 15 से अधिक नमूना आकार की आवश्यकता होती है। यह संख्या उचित है, क्योंकि एक विशेषज्ञ ऑपरेटर प्रति घंटे लगभग 40 भ्रूण संसाधित कर सकता है।

जेडपीडीएक्स मॉडल उत्पन्न करने के लिए उपयोग की जाने वाली पद्धति के अलावा, यहां यह भी प्रमाणित किया गया था कि एक फोल्फॉक्सिरी संयोजन जेडपीडीएक्स मॉडल में रोगी-व्युत्पन्न कोशिकाओं के एपोप्टोसिस को प्रेरित करता है। फोल्फोक्सिरी के साथ, अन्य कीमोथेरेपी योजनाओं के लिए जेडपीडीएक्स केमोसेंसिटिविटी का परीक्षण करना संभव है, जैसे कि उसाई एट अल .11 द्वारा सफलतापूर्वक परीक्षण किया गया।

इसके अलावा, रुचि की विशेषता की मात्रा प्रदान करने के लिए होल-माउंट इम्यूनोस्टेनिंग और इमेजिंग की तकनीक प्रस्तुत की गई है। कुछ समस्याओं को दूर करने और सफल होल-माउंट इम्यूनोस्टेनिंग का नेतृत्व करने के लिए, ऊतकों को स्थिर करने के लिए 5% डीएमएसओ समाधान की सिफारिश की जाती है। कॉन्फोकल इमेजिंग के संबंध में, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप की रिज़ॉल्यूशन सीमाएं जेनोग्राफ्ड लार्वा के गहरे ढेर के अधिग्रहण को बाधित कर सकती हैं। हालांकि, अध्ययन में, एपोप्टोटिक कोशिकाओं को रोगी कोशिकाओं की कुल संख्या में से गिना जाता है। 5 μm के चरण आकार के साथ प्रत्यारोपित ट्यूमर द्रव्यमान के आधार से शीर्ष तक एक त्रि-आयामी पुनर्निर्माण, सभी मानव नाभिक ों की पहचान करने में सक्षम बनाता है, इस संभावना को देखते हुए कि एक ही नाभिक पिछले या अगले जेड-प्लेन के भीतर फैल सकता है। नतीजतन, इमेजजे मल्टी-पॉइंट टूल काउंटर का उपयोग एक ही सेल को दो बार गिनने को नियंत्रित करने और रोकने के लिए किया जा सकता है और एक ही जेड-स्टैक्स (कुल मानव कोशिकाओं में से एपोप्टोटिक) में डबल काउंटिंग चलाने के लिए किया जा सकता है और आसानी से एकल-सेल स्तर पर एपोप्टोसिस का पता लगा सकता है।

इसकी सीमाओं के बावजूद, जेडपीडीएक्स मॉडल में विवो मॉडल की तुलना में कई फायदे हैं: ज़ेबराफिश का बेहद तेज़ जीवन चक्र, कम समय में बड़ी संख्या में जानवरों को प्राप्त करने में सक्षम होना; विकास चरणों में ऑप्टिकल स्पष्टता; और, सबसे ऊपर, निषेचन समय विंडो22 के बाद 0-120 घंटे में बेहद कम नैतिक प्रभाव। आज, जेडपीडीएक्स का उपयोग करके एक सह-नैदानिक परीक्षण माउस-आधारित पीडीएक्स के साथ आयोजित की तुलना में सस्ता है, क्योंकि इम्यूनोडेफिशिएंट होस्ट उपभेदों को रखरखाव की उच्च लागत के साथ-साथ ट्यूमरके विकास की निगरानी के लिए जटिल इमेजिंग विधियों की आवश्यकता होती है। अंत में, ये सभी कारक कैंसर रोगियों की कीमोथेरेपी संवेदनशीलता प्रोफाइल की भविष्यवाणी करने और दवा स्क्रीनिंग के लिए नए मॉडल में रुचि रखने वाले शोधकर्ताओं द्वारा उपयोग के लिए सह-नैदानिक परीक्षणों में उपयोग के लिए जेडपीडीएक्स मॉडल की क्षमता को उजागर करते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को फोंडाज़ियोन पीसा (परियोजना 114/16) द्वारा वित्त पोषित किया गया था। लेखक रोगी के नमूने के चयन और पैथोलॉजी समर्थन के लिए एज़िएन्डा ओस्पेडालीरा पिसाना की हिस्टोपैथोलॉजी यूनिट से राफेल गेटा को धन्यवाद देना चाहते हैं। हम प्रयोगों में तकनीकी सहायता के लिए एलेसिया गैलेंटे को भी धन्यवाद देते हैं। यह लेख कॉस्ट एक्शन ट्रांसपैन, CA21116 से काम पर आधारित है, जो कॉस्ट (विज्ञान और प्रौद्योगिकी में यूरोपीय सहयोग) द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-fluorouracil Teva Pharma AG SMP 1532755
48 multiwell plate Sarstedt 83 3923
96 multiwell plate Sarstedt 82.1581.001
Acetone Merck 179124
Agarose powder  Merck A9539
Amphotericin Thermo Fisher Scientific 15290018
Anti-Nuclei Antibody, clone 235-1 Merck MAB1281  1:200 dilution
Aquarium net QN6 Penn-plax 0-30172-23006-6
BSA Merck A9418
CellTrace Thermo Fisher Scientific C34567
CellTracker CM-DiI  Thermo Fisher Scientific C7001
CellTracker Deep Red  Thermo Fisher Scientific C34565
Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb Cell Signaling Technology 9661S 1:250 dilution
Dimethyl sulfoxide (DMSO)  PanReac AppliChem ITW Reagents A3672,0250
Dumont #5 forceps World Precision Instruments 501985
Folinic acid -  Lederfolin Pfizer
Glass capillaries, 3.5" Drummond Scientific Company 3-000-203-G/X Outer diameter = 1.14 mm. Inner diameter = 0.53 mm. 
Glass vials  VWR International WHEAW224581
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 Thermo Fisher Scientific A-21244   1:500 dilution
Goat serum Thermo Fisher Scientific 31872
Hoechst 33342 Thermo Fisher Scientific H3570
Irinotecan Hospira
Low Temperature Freezer Vials VWR International 479-1220
McIlwain Tissue Chopper World Precision Instruments
Microplate Mixer SCILOGEX 822000049999
Oxaliplatin Teva
Paraformaldehyde Merck P6148-500G
PBS Thermo Fisher Scientific 14190094
Penicillin-streptomycin  Thermo Fisher Scientific 15140122
Petri dish 100 mm Sarstedt 83 3902500
Petri dish 60 mm Sarstedt 83 3901
Plastic Pasteur pipette Sarstedt 86.1171.010
Poly-Mount Tebu-bio 18606-5
Propidium iodide Merck P4170
RPMI-1640 medium Thermo Fisher Scientific 11875093
Scalpel blade No 10 Sterile Stainless Steel VWR International SWAN3001
Scalpel handle #3 World Precision Instruments 500236
Tricaine Merck E10521
Triton X-100  Merck T8787
Tween 20 Merck P9416
Vertical Micropipette Puller Shutter instrument P-30 

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References

  1. Rubin, H. Understanding cancer. Science. 219 (4589), 1170-1172 (1983).
  2. Krzyszczyk, P., et al. The growing role of precision and personalized medicine for cancer treatment. Technology. 6 (3-4), 79-100 (2018).
  3. Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. Cancer statistics, 2022. CA Cancer Journal for Clinicians. 72 (1), 7-33 (2022).
  4. Trunk, A., et al. Emerging treatment strategies in pancreatic cancer. Pancreas. 50 (6), 773-787 (2021).
  5. Moffat, G. T., Epstein, A. S., O'Reilly, E. M. Pancreatic cancer-A disease in need: Optimizing and integrating supportive care. Cancer. 125 (22), 3927-3935 (2019).
  6. Sarantis, P., Koustas, E., Papadimitropoulou, A., Papavassiliou, A. G., Karamouzis, M. V. Pancreatic ductal adenocarcinoma: Treatment hurdles, tumor microenvironment and immunotherapy. World Journal of Gastrointestinal Oncology. 12 (2), 173-181 (2020).
  7. Marshall, L. J., Triunfol, M., Seidle, T. Patient-derived xenograft vs. organoids: a preliminary analysis of cancer research output, funding and human health impact in 2014-2019. Animals. 10 (10), 1923 (2020).
  8. Li, Y., Tang, P., Cai, S., Peng, J., Hua, G. Organoid based personalized medicine: from bench to bedside. Cell Regeneration. 9 (1), 21 (2020).
  9. Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. The generation and application of patient-derived xenograft model for cancer research. Cancer Research and Treatment. 50 (1), 1-10 (2018).
  10. Rizzo, G., Bertotti, A., Leto, S. M., Vetrano, S. Patient-derived tumor models: a more suitable tool for pre-clinical studies in colorectal cancer. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 40 (1), 178 (2021).
  11. Usai, A., et al. Zebrafish patient-derived xenografts identify chemo-response in pancreatic ductal adenocarcinoma patients. Cancers. 13 (16), 4131 (2021).
  12. Usai, A., et al. A model of a zebrafish avatar for co-clinical trials. Cancers. 12 (3), 677 (2020).
  13. Chen, X., Li, Y., Yao, T., Jia, R. Benefits of zebrafish xenograft models in cancer research. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 616551 (2021).
  14. Miserocchi, G., et al. Management and potentialities of primary cancer cultures in preclinical and translational studies. Journal of Translational Medicine. 15 (1), 229 (2017).
  15. Baghban, R., et al. Tumor microenvironment complexity and therapeutic implications at a glance. Cell Communication and Signaling. 18 (1), 59 (2020).
  16. Albini, A., et al. Cancer stem cells and the tumor microenvironment: interplay in tumor heterogeneity. Connective Tissue Research. 56 (5), 414-425 (2015).
  17. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).
  18. Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).
  19. Tavares Barroso, M., et al. Establishment of pancreatobiliary cancer zebrafish avatars for chemotherapy screening. Cells. 10 (8), 2077 (2021).
  20. Kopetz, S., Lemos, R., Powis, G. The promise of patient-derived xenografts: the best laid plans of mice and men. Clinical Cancer Research. 18 (19), 5160-5162 (2012).
  21. Xing, F., Saidou, J., Watabe, K. Cancer associated fibroblasts (CAFs) in tumor microenvironment. Frontiers in Bioscience. 15 (1), 166-179 (2010).
  22. Strähle, U., et al. Zebrafish embryos as an alternative to animal experiments-a commentary on the definition of the onset of protected life stages in animal welfare regulations. Reproductive Toxicology. 33 (2), 128-132 (2012).
  23. Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).

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कैंसर रिसर्च अंक 195 जेब्राफिश अवतार प्रीक्लिनिकल मॉडल सह-नैदानिक परीक्षण ट्यूमर प्रत्यारोपण केमोसेंसिटिविटी होल-माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस
केमोसेंसिटिविटी परीक्षण के लिए अग्नाशय के कैंसर से ज़ेबराफिश रोगी-व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट्स की स्थापना
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Usai, A., Di Franco, G., Gabellini, C., Morelli, L., Raffa, V. Establishment of Zebrafish Patient-Derived Xenografts from Pancreatic Cancer for Chemosensitivity Testing. J. Vis. Exp. (195), e63744, doi:10.3791/63744 (2023).

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