Summary
هنا ، نصف طريقة لتوليد الورم الأرومي الدبقي (GBM) العضوي من عينات المرضى الأولية أو مزارع الخلايا المشتقة من المريض والحفاظ عليها حتى النضج. تحتوي هذه المواد العضوية GBM على مجموعات خلايا متنوعة ظاهريا وتعيد إنشاء بيئات دقيقة للورم خارج الجسم الحي.
Abstract
الورم الأرومي الدبقي (GBM) هو سرطان الدماغ الخبيث الأولي الأكثر شيوعا مع تشخيص ضعيف للغاية. يمكن للتنوع الخلوي والجزيئي داخل الرحم ، بالإضافة إلى التفاعلات المعقدة بين البيئات الدقيقة للورم ، أن يجعل العثور على علاجات فعالة تحديا. ويمكن للطرق التقليدية للاستزراع الالتصاق أو المجال أن تخفي مثل هذه التعقيدات، في حين أن الاستزراع العضوي ثلاثي الأبعاد يمكن أن يلخص التدرجات البيئية الدقيقة الإقليمية. المواد العضوية هي طريقة لثقافة GBM ثلاثية الأبعاد تحاكي بشكل أفضل بنية ورم المريض ، وتحتوي على مجموعات خلايا متنوعة ظاهريا ، ويمكن استخدامها في التجارب متوسطة الإنتاجية. على الرغم من أن الثقافة العضوية ثلاثية الأبعاد أكثر شاقة واستهلاكا للوقت مقارنة بالثقافة التقليدية ، إلا أنها توفر فوائد فريدة ويمكن أن تعمل على سد الفجوة بين الأنظمة الحالية في المختبر وفي الجسم الحي . أثبتت المواد العضوية نفسها كأدوات لا تقدر بثمن في ترسانة علماء الأحياء السرطانية لفهم سلوك الورم وآليات المقاومة بشكل أفضل ، وتستمر تطبيقاتها في النمو. هنا ، يتم توفير تفاصيل حول طرق توليد وصيانة المواد العضوية GBM. كما يتم وصف تعليمات حول كيفية إجراء تضمين وتقسيم العينات العضوية باستخدام كل من تقنيات تضمين المجمدة والبارافين ، بالإضافة إلى توصيات للكيمياء النسيجية المناعية وبروتوكولات التألق المناعي على الأقسام العضوية ، وقياس الجدوى الكلية للخلايا العضوية.
Introduction
الورم الأرومي الدبقي (GBM) هو ورم الدماغ الأولي الأكثر شيوعا مع تشخيص قاتم لمدة 15 شهرا تقريبا من التشخيص1. العلاجات التي تكون فعالة في الدراسات قبل السريرية يمكن أن تكون في كثير من الأحيان ضعيفة الفعالية في المرضى 2,3. تعزى الاستجابة السريرية الضعيفة إلى العديد من العوامل ، بما في ذلك عدم تجانس البيئة الدقيقة ل GBM والتفاعلات المعقدة داخل الرحم. قد يكون من الصعب إعادة إنشائها في بيئة المختبر باستخدام طرق الالتصاق التقليدية أو زراعة المجال4. وجود مجموعة فرعية من الخلايا الجذعية السرطانية ذاتية التجديد (CSCs) داخل GBM قد يساهم أيضا في هذا التعقيد 5,6. تعتبر CSCs حاسمة لانتشار الورم والحفاظ على نمو الورم من خلال تعزيز تولد الأوعية الدموية النشط ، وغزو السرطان ، ومقاومة العلاجات بما في ذلك الإشعاع7،8،9. لا يتم توزيع CSCs بشكل موحد في جميع أنحاء الأورام ولكن يتم إثراؤها داخل بيئات دقيقة محددة ، بما في ذلك المناطق المحيطة بالأوعية الدموية والمناطق المعجانة ، والتي توفر كل منها تنظيما جزيئيا متميزا لحالاتها الخلوية10،11،12،13،14. CSCs ليست متلقين سلبيين لإشارات البيئة الدقيقة ولكن بدلا من ذلك تمتلك القدرة على إعادة تشكيل بيئاتها الدقيقةالخاصة بها 7،15،16. يمكن للبيئة الدقيقة ل CSC تعزيز الحفاظ على حالة الخلايا الجذعية استجابة لضغوط مثل ندرة المغذيات ودرجة الحموضة ونقص الأكسجة17،18،19،20 ، مما يشير إلى أهمية هذه الظروف في نظام نموذجي. لذلك فإن تلخيص البيئة الدقيقة الخلوية المتنوعة داخل الأورام أمر بالغ الأهمية لفهم المقاومة العلاجية وتحديد العلاجات الجديدة.
زادت شعبية الثقافة ثلاثية الأبعاد في السنوات الأخيرة21,22. تم استخدام المواد العضوية في أنواع أخرى من السرطان ، والهدف الأساسي من الحفاظ على الخلايا كعضويات هو السماح بنمو مجموعات الخلايا غير المتجانسة (التي قد يكون الكثير منها عادة متفوقا في ثقافة المجال الأكثر تجانسا) والتنوع المكاني ، الذي ينظر إليه على أنه بيئات دقيقة إقليمية للورم ذات خصوصية وراثية4،23،24،25،26 . هناك العديد من الطرق للزراعة ثلاثية الأبعاد للخلايا السرطانية ، والتي لكل منها مزايا وعيوب27،28،29. لا يقصد من الثقافة العضوية أن تكون بديلا عن الثقافة التقليدية الملتزمة أو الكروية. من الأفضل استخدامه كتقنية مكملة للطرق ثنائية الأبعاد عندما تكون هناك أسئلة محددة يكون فيها التفاعل بين البيئة الدقيقة للخلية واستجابات الخلايا السرطانية أمرا بالغ الأهمية.
توضح هذه المقالة طرقا موثوقة وقابلة للتكرار لإنشاء عضويات GBM من عينات المرضى الأولية أو الثقافات المشتقة من المريض. نحن نعالج هدفين مختلفين للثقافة العضوية ثلاثية الأبعاد: (1) إنشاء عضويات من أنسجة المريض الأولية ، مع أقصى قدر من إمكانات التطعيم بغض النظر عن التوحيد ، أو (2) زراعة عضويات موحدة للاستخدام التجريبي الكمي. عند إنشاء عينة أولية كمواد عضوية ، ليس من الضروري تصفية الخلايا المفردة أو عد الخلايا ، لأن الحفاظ على الحد الأقصى لأعداد الخلايا وأنواعها لإنشاء الثقافة الأولية هو أولوية. ومع ذلك ، عند زراعة المواد العضوية للتجارب المقارنة ، هناك حاجة إلى الترشيح أحادي الخلية وعد الخلايا لضمان أن تكون المواد العضوية المكررة قابلة للمقارنة من أجل الاتساق التجريبي. يوضح هذا البروتوكول بالتفصيل كيفية إنشاء مزارع عضوية وإنشاء عضويات موحدة ، بالإضافة إلى طرق محسنة لتضمين المواد العضوية والحفاظ عليها وتجارب زراعة الخلايا القياسية ، بما في ذلك الكيمياء النسيجية المناعية ، والتألق المناعي ، وتقييم الجدوى الكلية للخلية في المواد العضوية GBM.
Protocol
تم تطوير جميع خطوات البروتوكول (البروتوكولات) المفصلة أدناه وتنفيذها وفقا لبروتوكول مجلس المراجعة المؤسسية في كليفلاند كلينك (IRB) رقم 2559 وموافقة لجنة السلامة البيولوجية المؤسسية (IBC) رقم 1711. يتم استزراع الكرات والمواد العضوية في "اكتمال الوسائط العصبية القاعدية" (NBMc). انظر الجدول 1 للحصول على التعليمات.
1. صنع القوالب العضوية
- أخرج ورقة الشمع من ورقة البارافيلم (بحجم 4 سم × 4 سم تقريبا) وضعها بين لوحين معقمين لتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) بسعة 96 بئرا.
- قم بتنفيذ هذه الخطوات في غطاء محرك السيارة الثقافي واحرص بشكل خاص على الحفاظ على نظافة "الداخل" من البارافيلم (الجانب الذي تغطيه الورقة). يجب أن يجعل هذا الجانب النظيف تقعر المسافات البادئة.
- قم بتطبيق ضغط متساو على لوحة PCR العلوية المكونة من 96 بئرا لتشكيل دمامل صغيرة في البارافيلم. الهدف هو أن تكون الغمازات بعمق 2 مم تقريبا دون إنشاء ثقوب في البارافيلم.
- افصل لوحتي تفاعل البوليميراز المتسلسل 96 جيدا بلطف. سوف يلتصق البارافيلم المدمل باللوحة العلوية. ضع هذا على الثلج الجاف لمدة 30 ثانية.
- بعد أن يكون البارافيلم على الجليد الجاف لمدة 30 ثانية ، استخدم ملقط معقم لسحب البارافيلم من أعلى لوحة PCR 96 بئرا.
- عند إزالة البارافيلم ، استخدم حركة سريعة بدلا من أن تكون "حذرا" للغاية. البارافيلم المجمد أسهل في الإزالة من البارافيلم الدافئ ، والذي يمكن أن يتسبب في انعكاس الغمازات.
- ضع قالب البارافيلم المكتمل في طبق مغطى ومعقم لزراعة الخلايا بحجم 10 سم. يمكن صنع القوالب مسبقا وتخزينها إذا تم الحفاظ على العقم.
2. التشريح الكلي لعينة أنسجة المريض
- في طبق زراعة معقم (ألواح زراعة الخلايا مقاس 10 سم) ، استخدم شفرتي حلاقة معقمتين لتقطيع عينة المريض بدقة مع تطبيق ضغط متساو.
ملاحظة: فرم العينة أسهل مع حوالي 500 ميكرولتر من NBMc على طبق الثقافة. حاول باستخدام شفرات الحلاقة لتقطيع القطع بأكبر قدر ممكن من الدقة ؛ من الناحية المثالية ، القطع الفردية هي 1 مم3 أو أصغر. - انقل قطع الورم المفروم ناعما إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل باستخدام طرف ماصة p1000 مقطوع.
ملاحظة: عند التعامل مع المواد العضوية ، من المهم استخدام نصائح ماصة p1000 المقطوعة فقط. يمكن قطعها باستخدام ماكينة حلاقة حادة إلى حجم الفتحة المطلوب (بين 5 و 8 مم تقريبا) وتعقيمها. - أضف 2 مل من محلول انفصال الخلايا في درجة حرارة الغرفة (RT) (جدول المواد) وضعه في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 لمدة 10 دقائق تقريبا.
ملاحظة: راقب واخلط كل بضع دقائق. قد تحتاج بعض محاليل انفصال الخلايا أو العينات إلى أوقات حضانة مختلفة. إذا ظهر التكتل ، والذي يمكن أن يشير إلى إطلاق الحمض النووي بسبب تحلل الخلايا ، فانتقل إلى الخطوة التالية على الفور. - أضف 8 مل من وسائط NBMc لتحييد محلول انفصال الخلايا ، وقم بالدوران لمدة 3 دقائق عند 65 × جم.
- شفط supernatant وإعادة تعليق الأنسجة في 1-2 مل من NBMc.
3. توليد المواد العضوية من أنسجة المريض الأولية
ملاحظة: الهدف عند صنع المواد العضوية من أنسجة المريض الأولية هو إنشاء ثقافة ثلاثية الأبعاد. لا تقم بالتصفية للخلايا المفردة أو عد الخلايا، ولكن حافظ على تحميل الخلية الأولي موحدا قدر الإمكان باستخدام الفحص البصري. من الطبيعي أن يكون هناك عدم تجانس في نمو وإنشاء المواد العضوية الأولية. سيكون حجم كل عضوي 20 ميكرولتر (16 ميكرولتر من المصفوفة خارج الخلية الغنية باللامينين (lrECM) و 4 ميكرولتر من الأنسجة المعلقة في NBMc ، من الخطوة 2.5). يمكن تعديل التعليمات لعدد المواد العضوية المقصودة ؛ الهدف هو تشكيل عادة حوالي 20-30 عضويا من عينات المرضى الأولية.
- في دلو ثلج أو كتلة باردة ، ضع lrECM وأنبوب طرد مركزي صغير. ضع الكمية المناسبة من lrECM (16 ميكرولتر × X عدد المواد العضوية المقصودة) في أنبوب جهاز الطرد المركزي الصغير.
- أضف الحجم المناسب من تعليق الأنسجة من الخطوة 2.5 (4 ميكرولتر × عدد المواد العضوية المقصودة) إلى أنبوب جهاز الطرد المركزي على الجليد.
- ماصة بعناية 20 ميكرولتر من خليط lrECM / تعليق الخلايا على قوالب بارافيلم. هذا سوف يشكل قطرة تشبه اللؤلؤ.
- تأكد من خلط خليط lrECM / تعليق الخلايا جيدا ؛ تميل الخلايا إلى الاستقرار بسهولة داخل lrECM ، مما يؤدي إلى عضويات غير متجانسة.
- احتفظ بخليط lrECM/تعليق الخلايا على الجليد. إذا ارتفعت درجة حرارة lrECM ، فيمكنها البلمرة والمساس بتكوين العضوي. تأكد من تبريد طرف الماصة كل اثنين إلى ثلاثة عضويات لمنع بلمرة lrECM. لا تقم بإدخال فقاعات الهواء في المواد العضوية (تجنب "الدفع المزدوج" للماصة).
- بمجرد أن يتم ماصة العدد المطلوب من المواد العضوية على قالب بارافيلم في لوحة زراعة الخلايا 10 سم ، قم بتغطيتها بغطاء اللوحة واحتضنها في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO 2 لمدة1-2 ساعة.
- بعد تصلب المواد العضوية ، استخدم وسائط NBMc لطردها بلطف من قالب parafilm وإلى لوحة ثقافة جديدة معقمة مقاس 10 سم مع 20 مل من إجمالي NBMc. استخدام طرف p1000 يعمل بشكل أفضل لطرد المواد العضوية من القالب. سوف ينزلقون بلطف.
ملاحظة: عندما يتم مسح المواد العضوية من القوالب إلى ألواح زراعة الخلايا ، يجب أن تكون مرئية في الوسائط ككرات وردية صغيرة. إذا بدا أن المواد العضوية قد انهارت أو تحطمت في وسائل الإعلام ، فهذا يشير إلى وجود مشكلة سابقة مع lrECM بعد البلمرة ، وقد تستمر المواد العضوية في النمو ولكن من غير المرجح أن تكون موحدة في الحجم. - ضع طبق الاستزراع 10 سم في حاضنة زراعة الخلايا على درجة حرارة 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 (دون اهتزاز) لمدة 4 أيام.
ملاحظة: يمكن أن يؤدي وضع المواد العضوية على شاكر مداري في الأيام الأولى إلى انهيارها. تأكد من أنها لا تهتز حتى اليوم 4. - بعد 4 أيام ، تبادل الوسائط ووضعها على شاكر مداري عند 80 دورة في الدقيقة في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2.
- يعد تبادل الوسائط مع المواد العضوية غير الناضجة أمرا صعبا لأنه يصعب تصورها. إمالة طبق زراعة الخلايا وانتظر ما لا يقل عن 20 ثانية ؛ سوف تستقر المواد العضوية في الأسفل وتسمح بإزالة الوسائط من الأعلى باستخدام ماصة زجاجية أو بلاستيكية 10-20 مل ببطء.
- إيلاء اهتمام دقيق لجمع المواد العضوية في الجزء السفلي ؛ إذا بدا أنها تحركت بقوة إزالة الوسائط ، فمن الأفضل التوقف مؤقتا والسماح لها بإعادة التوطين. عندما تنضج المواد العضوية ويسهل تصورها ، تصبح هذه العملية أقل دقة.
ملاحظة: في بعض الأحيان، يمكن أن يساعد وضع قطعة من الورق الداكن أسفل لوحة زراعة الخلايا في تصور المواد العضوية غير الناضجة. ينصح بعدم استخدام ماصة باستور مع شفط فراغ لإزالة الوسائط لأنه من السهل جدا أن تمتص المواد العضوية وتضيع بهذه الطريقة. - عندما يتم إنشاء المواد العضوية لأول مرة ، فإنها لا تستهلك الوسائط بنفس سرعة المواد العضوية الناضجة. بدءا من 50٪ من عمليات تبادل الوسائط يقلل من استخدام الوسائط غير الضروري ويقلل من فرصة إتلاف أو شفط المواد العضوية الجديدة عن طريق الخطأ أثناء عملية تبادل الوسائط.
4. توليد المواد العضوية من مجال GBM المعمول به ، أو التزم ، أو ثقافة العضوية
ملاحظة: الهدف هنا هو صنع عضويات موحدة في الحجم وكمية الخلية لاستخدامها في التجارب المقارنة ، لذلك استخدم مرشحا أحادي الخلية وعد الخلايا لضمان ذلك.
- إعداد تعليق أحادي الخلية من ثقافة المجال GBM.
ملاحظة: يتم الاحتفاظ بمزارع اسفير لخلايا GBM في وسائط NBMc.- ضع الكرات في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل وقم بالدوران عند 120 × g لمدة 5 دقائق.
- قم بإزالة supernatant وإضافة 2 مل من محلول انفصال خلية RT. ضعيه في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
- أضف 8 مل من وسائط NBMc لتحييد محلول انفصال الخلايا. يصفى من خلال مصفاة خلية واحدة (70 ميكرومتر) ويدور لمدة 5 دقائق عند 120 × جم.
- قم بإزالة supernatant من الأنبوب وأعد تعليق الخلايا المتبقية في ~ 1 مل من NBMc. عد الخلايا (باستخدام بقعة الخلية غير المقصودة) وانتقل إلى الخطوة 4.4.
- إعداد تعليق أحادي الخلية من ثقافة الالتصاق GBM.
- قم بإزالة الوسائط المستخدمة من اللوحة ، وأضف 2 مل من محلول انفصال خلية RT إلى اللوحة ، وضعها في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
- تأكد تحت المجهر من أن الخلايا منفصلة عن اللوحة.
- أضف 8 مل من وسائط NBMc لتحييد محلول انفصال الخلايا. سلالة من خلال مصفاة خلية واحدة (70 ميكرومتر).
ملاحظة: إجهاد الخلية الواحدة اختياري عند العمل مع ثقافة الالتصاق. - تدور لمدة 5 دقائق عند 120 × جم. قم بإزالة supernatant من الأنبوب وأعد تعليق الخلايا المتبقية في ~ 1 مل من NBMc. عد الخلايا (باستخدام بقعة الخلية غير المقصودة) وانتقل إلى الخطوة 4.4.
- إعداد تعليق خلية واحدة من ثقافة GBM العضوية.
- انقل المواد العضوية باستخدام طرف ماصة p1000 مقطوع إلى لوحة ثقافة 10 سم وقم بإزالة أكبر قدر ممكن من الوسائط المتبقية بعناية.
- باستخدام اثنين من شفرات الحلاقة المعقمة ، قم بتقطيع المواد العضوية بعناية إلى الخارج. باستخدام طرف p1000 المقطوع ، انقل المواد العضوية المفرومة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل وأضف ~ 2-3 مل من وسائط NBMc.
- قم بالدوران على 120 × جم لمدة 3 دقائق وقم بإزالة السوبرناتانت (نوصي باستخدام طرف ماصة بدلا من شفط الفراغ لهذا الجزء).
- أضف 2 مل من محلول انفصال الخلايا الباردة لمدة 10 دقائق.
ملاحظة: يجب استخدام محلول فصل الخلايا مباشرة من 4 درجات مئوية ، وليس تسخينه أولا. يبدو أن هذا يخفف من أي ماتريجل متبقية ويساعد في استعادة الخلايا. - ثم انتقل إلى حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 10-20 دقيقة ، مع المراقبة والخلط كل بضع دقائق. إذا ظهر التكتل ، والذي يمكن أن يشير إلى تحلل الخلايا ، فانتقل إلى الخطوة التالية على الفور.
- أضف 8 مل من وسائط NBMc لتخفيف محلول انفصال الخلايا. يصفى من خلال مصفاة أحادية الخلية (70 ميكرومتر) ويدور لمدة 5 دقائق عند 120 × جم.
- قم بإزالة supernatant من الأنبوب وأعد تعليق الخلايا المتبقية في ~ 1 مل من NBMc. عد الخلايا (باستخدام بقعة الخلية غير المقصودة) وانتقل إلى الخطوة 4.4.
- صنع المواد العضوية من تعليق أحادي الخلية
- في دلو ثلج أو كتلة باردة ، ضع lrECM وأنبوب طرد مركزي صغير. ضع الكمية المناسبة من lrECM (16 ميكرولتر × X عدد المواد العضوية المقصودة) في أنبوب جهاز الطرد المركزي الصغير.
- قم بإنشاء خليط من الخلايا في حجم إجمالي (4 ميكرولتر × X عدد من المواد العضوية المقصودة) التي ستحتوي على 20000 خلية / عضوي وأضف هذا إلى أنبوب الطرد المركزي الصغير مع lrECM على الجليد.
- ماصة بعناية 20 ميكرولتر من خليط lrECM / تعليق الخلايا على قوالب بارافيلم. هذا سوف يشكل قطرة تشبه اللؤلؤ.
- تأكد من خلط خليط lrECM / تعليق الخلايا جيدا ، حيث تميل الخلايا إلى الاستقرار بسهولة داخل lrECM ، وهذا سيؤدي إلى عضويات غير متجانسة.
- احتفظ بخليط lrECM/تعليق الخلايا على الجليد. إذا ارتفعت درجة حرارة lrECM ، فيمكنها البلمرة والمساس بتكوين العضوي.
- تأكد من تبريد طرف الماصة كل اثنين إلى ثلاثة عضويات لمنع بلمرة lrECM. لا تقم بإدخال فقاعات الهواء في المواد العضوية (تجنب "الدفع المزدوج" لطرف الماصة).
- بمجرد أن يتم ماصة العدد المطلوب من المواد العضوية على قالب بارافيلم في لوحة ثقافة 10 سم ، احتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 1-2 ساعة في حاضنة زراعة الخلايا.
- بعد تصلب المواد العضوية ، استخدم وسائط NBMc لطردها بلطف من قالب البارافيلم وإلى لوحة استزراع جديدة معقمة مقاس 10 سم مع 20 مل من إجمالي NBMc. استخدام طرف p1000 يعمل بشكل أفضل لطرد المواد العضوية من القالب. سوف ينزلقون بلطف.
ملاحظة: يوصى بحوالي 15-20 عضويا لكل طبق ثقافة 10 سم. - ضع طبق الثقافة 10 سم في حاضنة (دون اهتزاز) لمدة 4 أيام.
- بعد 4 أيام ، تبادل الوسائط ووضعها على شاكر مداري عند 80 دورة في الدقيقة في حاضنة زراعة الخلايا. تبادل الوسائط كل 2-3 أيام بعد ذلك.
- يعد تبادل الوسائط مع المواد العضوية غير الناضجة أمرا صعبا لأنه يصعب تصورها. إمالة طبق زراعة الخلايا وانتظر ما لا يقل عن 20 ثانية ؛ سوف تستقر المواد العضوية في الأسفل وتسمح بإزالة الوسائط من الأعلى باستخدام ماصة زجاجية كبيرة تفتح ببطء.
- إيلاء اهتمام دقيق لجمع المواد العضوية في الجزء السفلي ؛ إذا بدا أنهم متحمسون بقوة إزالة الوسائط ، فتوقف مؤقتا واسمح لهم بإعادة التوطين. عندما تنضج المواد العضوية ويسهل تصورها ، تصبح هذه العملية أقل دقة.
ملاحظة: في بعض الأحيان، يمكن أن يساعد وضع قطعة من الورق الداكن أسفل لوحة زراعة الخلايا في تصور المواد العضوية غير الناضجة. لا تستخدم ماصة باستور مع شفط فراغ لإزالة الوسائط لأنه من السهل جدا أن تمتص المواد العضوية وتضيع بهذه الطريقة. - عندما يتم إنشاء المواد العضوية لأول مرة ، فإنها لا تستهلك الوسائط بنفس سرعة المواد العضوية الناضجة. ابدأ ب 50٪ من عمليات تبادل الوسائط لتقليل الاستخدام غير الضروري للوسائط وتقليل فرصة إتلاف أو شفط المواد العضوية الجديدة عن طريق الخطأ أثناء عملية تبادل الوسائط.
5. التبريد
- ضع كل عضوي في أنبوب فردي 1.5 مل (باستخدام طرف p1000 مقطوع) يحتوي على 1 مل من 4٪ بارافورمالديهايد (PFA). تخزين المواد العضوية بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. في حالة تضمين المواد العضوية في البارافين ، انتقل إلى القسم 6.
- بعد التثبيت بين عشية وضحاها في 4٪ PFA ، اغسل المواد العضوية في 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ثلاث مرات.
- انقل العضو العضوي إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل (باستخدام طرف ماصة p1000 مقطوع) يحتوي على 1 مل من 30٪ من السكروز في الماء ويخزن عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
- أضف كمية صغيرة (عادة 1-2 مل) من مركب درجة حرارة القطع الأمثل (OCT) إلى قالب التبريد ، وتغطي الجزء السفلي وتملأ حوالي 1/3 إلى 1/2 من عمق القالب.
- انقل عضويا واحدا إلى cryomold باستخدام طرف ماصة p1000 المقطوع. سيؤدي ذلك إلى نقل بعض الوسائط مع العضوي ، وهو أمر لا مفر منه. استخدم طرف ماصة أصغر لإزالة الوسائط المحيطة بعناية دون إزعاج العضوي.
ملاحظة: قد يكون من الصعب تصور ذلك ، لكن السحب البطيء سيظهر اختلافا واضحا في الكثافات بين الوسائط و OCT ، لذلك يتم ذلك "عن طريق الشعور" إلى حد ما). - ضع المبرد على صينية من الثلج الجاف. سيبدأ OCT في التجمد ، ويصبح غير شفاف في هذه العملية.
- أضف OCT إضافيا لتغطية العضوية بالكامل ، وملء بقية حجم قالب التبريد. يمكن تخزين الكتل عند -20 درجة مئوية للتخزين على المدى القصير لعدة أيام أو عند -80 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل إلى أجل غير مسمى.
6. تضمين البارافين
- فرز المواد العضوية حسب الحجم (المواد العضوية الصغيرة أقل من 3 مم ، والمواد العضوية الكبيرة أكثر من 3 مم). انقل كل عضوي إلى كاسيت الأنسجة باستخدام طرف ماصة p1000 مقطوع وقم بمعالجته في شمع البارافين وفقا للجدول 2 أو الجدول 3.
ملاحظة: حجم/تكوين كاسيت الأنسجة متروك للمستخدم. - انقل المواد العضوية من الكاسيت إلى قوالب التضمين مع 1-2 مل من شمع البارافين المذاب وقم بتبريده حتى يصبح الشمع شبه صلب.
- بمجرد تصلب الشمع جزئيا ، أضف المزيد من الشمع إلى الجزء العلوي من القالب. ضع أعلى الكاسيت المسمى فوق القالب وانقله إلى طبق بارد. استمر في التبريد حتى يصبح الشمع صلبا تماما.
- عندما يتصلب الشمع ، قسم الكتلة باستخدام ميكروتوم. بدلا من ذلك ، قم بتخزينه في RT أو 4 درجات مئوية للتقسيم لاحقا.
7. التألق المناعي (IF)
- إزالة البارافينات وإعادة ترطيب 5-12 ميكرومتر من أقسام الأنسجة المضمنة في البارافين باستخدام طبق تلطيخ الشرائح ، وفقا للخطوات التالية.
ملاحظة: في حالة استخدام مقاطع من المواد العضوية المضمنة في OCT، نوصي باستخدام أقسام 12 ميكرومتر. قم بإزالة OCT عن طريق اهتزاز الشريحة في PBS لمدة 30 دقيقة. انتقل إلى الخطوة 7.2.- احتضان لمدة 5 دقائق في الزيلين. كرر هذا مرتين أخريين. ثم احتضن لمدة 10 دقائق في الإيثانول بنسبة 100٪. كرر هذا مرة أخرى.
- احتضان لمدة 10 دقائق في 95 ٪ من الإيثانول. كرر مرة أخرى. اغسل الأقسام في الماء المقطر لمدة 5 دقائق ، مرتين.
- لكشف المستضدات ، قم بغمر الشرائح في محلول كشف السترات 1x (جدول المواد) والميكروويف في درجة حرارة الغليان الفرعي لمدة 10 دقائق. تأكد من عدم ترك المحلول يغلي.
ملاحظة: من الأفضل تحقيق ذلك إذا تم وضعه في الميكروويف في البداية لمدة 2 دقيقة تقريبا حتى يحدث الغليان ، ثم خفض الطاقة والمراقبة لضمان عدم غليان المحلول. درجة الحرارة المفضلة لكشف القناع أقل بقليل من 100 درجة مئوية ، من الناحية المثالية 98 درجة مئوية. - دع الشرائح تبرد لمدة 30 دقيقة في RT في محلول فك السترات 1x.
ملاحظة: هذا هو نفس حل سيترات 1x. لا يلزم استبدال الحل في هذه الخطوة. - اغسل الشرائح في الماء المقطر لمدة 5 دقائق ، مرتين.
- اغسل الشرائح في مخزن مؤقت 1x TBST (محلول ملحي مخزن مؤقتا ب Tris مع 0.1٪ Tween 20) لمدة 5 دقائق.
- قم بإزالة الشرائح من TBST وجففها بعناية حول أقسام الأنسجة باستخدام منديل تنظيف المختبر مع الحرص على عدم ترك قسم الأنسجة يجف. بمجرد أن تجف الشريحة بما فيه الكفاية ، قم بتدوير أقسام الأنسجة باستخدام قلم حاجز مسعور.
- قم بحظر كل قسم باستخدام 100-400 ميكرولتر من محلول حجب المصل بنسبة 10٪ لمدة 1 ساعة في RT. اختر محلول حجب المصل بناء على الجسم المضاد الثانوي. على سبيل المثال ، إذا كنت تستخدم جسما مضادا ثانويا مصليا للحمار مصلا طبيعيا بنسبة 10٪ في 1x TBST.
- قم بإزالة محلول الحجب ثم أضف 100-400 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية المخففة إلى التركيز المطلوب في محلول الحظر.
- عند 4 درجات مئوية ، احتضن الأقسام بالجسم المضاد الأساسي بين عشية وضحاها.
- قم بإزالة محلول الأجسام المضادة الأساسي واغسل الشرائح في 1x TBST لمدة 5 دقائق ، ثلاث مرات.
- أضف 100-400 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية (تخفيف 1:1000 في محلول الحجب ، أو وفقا لتوجيهات الشركة المصنعة) إلى كل قسم واحتضنها لمدة 1.5 ساعة في RT.
- اغسل الشرائح في 1x TBST لمدة 5 دقائق ، مرتين. ثم اغسل الشرائح في 1x PBS لمدة 5 دقائق.
- قم بإزالة الشرائح من PBS وجففها حول أقسام الأنسجة باستخدام منديل تنظيف المختبر. أضف بضع قطرات من حامل المعالجة السائل وقم بتركيب غطاء زجاجي بعناية. بمجرد أن تجف الشرائح ، تخزن على درجة حرارة -20 درجة مئوية محمية من الضوء حتى تصبح جاهزة للتصوير.
8. الكيمياء النسيجية المناعية
- قم بإزالة البارافين وإعادة ترطيب أقسام الأنسجة المضمنة بالبارافين باستخدام طبق تلطيخ الشرائح ، وفقا للخطوات التالية.
ملاحظة: في حالة استخدام مقاطع من المواد العضوية المضمنة في OCT، قم بإزالة OCT عن طريق هز الشريحة في PBS لمدة 30 دقيقة. انتقل إلى الخطوة 8.2.- احتضان لمدة 5 دقائق في الزيلين. كرر مرتين أخريين.
- احتضان لمدة 10 دقائق في الإيثانول 100٪. كرر مرة أخرى.
- احتضان لمدة 10 دقائق في 95 ٪ من الإيثانول. كرر مرة أخرى.
- اغسل الأقسام في الماء المقطر لمدة 5 دقائق ، مرتين.
- لكشف المستضدات ، قم بغمر الشرائح في محلول فك السترات 1x والميكروويف في درجة حرارة الغليان الفرعي لمدة 10 دقائق. تأكد من عدم ترك المحلول يغلي.
- دع الشرائح تبرد لمدة 30 دقيقة في RT في محلول فك السترات 1x.
- اغسل الشرائح لمدة 5 دقائق في الماء المقطر ، ثلاث مرات.
- احتضان الشرائح لمدة 10 دقائق في 3٪ بيروكسيد الهيدروجين.
- اغسل الشرائح لمدة 5 دقائق في الماء المقطر مرتين.
- اغسل الشرائح لمدة 5 دقائق في 1x TBST.
- قم بإزالة الشرائح من 1x TBST ثم استخدم زاوية منديل تنظيف المختبر لتجف بعناية حول أقسام الأنسجة.
- ضع دائرة حول أقسام الأنسجة باستخدام قلم حاجز مسعور بمجرد أن تجف الشريحة.
- ضع 100-400 ميكرولتر من محلول الحجب على كل قسم داخل دائرة قلم الحاجز الكارهة للماء في RT لمدة 1 ساعة. استخدم إما 10٪ مصل الحمير العادي (NDS) أو 0.75٪ من ألبومين مصل البقر (BSA) المخفف في 1x TBST.
- بعد ذلك ، قم بإزالة محلول الحجب وإضافة 100-400 ميكرولتر من الجسم المضاد الأساسي إلى كل قسم. قم بتخفيف هذا الجسم المضاد الأساسي إلى التركيز المطلوب باستخدام مخفف الشركة المصنعة المناسب.
- احتضان الأقسام عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. قم بإزالة محلول الأجسام المضادة الأساسي واغسل الشرائح في 1x TBST لمدة 5 دقائق ، ثلاث مرات.
- أضف 100-400 ميكرولتر من كاشف الكشف عن IHC إلى كل قسم واحتضنه لمدة 1 ساعة في RT. اختر كاشف الكشف عن IHC وفقا للجسم المضاد الأساسي.
- اغسل كل قسم باستخدام 1x TBST لمدة 5 دقائق ، مرتين ، متبوعا ب 1x PBS لمدة 5 دقائق مرة واحدة.
- تحضير محلول 3,3-Diaminobenzidine (DAB) وفقا لتوجيهات الشركة المصنعة. أضف 100-400 ميكرولتر من محلول DAB إلى كل قسم من أقسام الأنسجة وراقب عن كثب تحت المجهر. بين 1-10 دقيقة ستوفر كثافة تلطيخ مقبولة ؛ تأكد من ملاحظة هذه المرة والحفاظ على اتساق لجميع أقسام الأنسجة.
- بعد الوصول إلى كثافة التلطيخ المطلوبة ، اغمر الشرائح في الماء المقطر.
- قم بإجراء مكافحة الهيماتوكسيلين والجفاف المنزلق للتركيب وفقا للتعليمات الواردة في الجدول 4.
- قم بإزالة الشريحة من بديل الزيلين (جدول المواد) وامسح السائل الزائد حول قسم الأنسجة باستخدام منديل تنظيف المختبر. استخدم كمية صغيرة من وسط التركيب الدائم لتركيب الغطاء فوق قسم الأنسجة واتركه حتى يجف.
9. قياس الجدوى الكلية للخلية
- انقل كل عضوي إلى أنبوب 2 مل ، وباستخدام طرف ماصة صغير ، قم بإزالة جميع الوسائط الزائدة حول العضو العضوي بعناية (انظر الشكل 3 للحصول على مخطط لهذا الإجراء).
ملاحظة: يجب إجراء اختبارات صلاحية الخلايا باستخدام المواد العضوية التي تم إجراؤها بأعداد متطابقة من الخلايا. لا ينبغي إجراء هذه التجربة على المواد العضوية المصنوعة مباشرة من عينات المرضى من الجراحة ، أو من قطع المواد العضوية المكونة من ألريدي ، أو الحالات الأخرى التي لم يتم فيها تصفية الخلايا المفردة وحسابها. - قم بإعداد كاشف فحص صلاحية الخلية المضيئة و 1x PBS بنسبة 1: 1 وأضف 500 ميكرولتر إلى كل أنبوب.
- استخدم طرف ماصة p1000 للماصة بقوة لأعلى ولأسفل لتحطيم العضو العضوي واتركه لمدة 5 دقائق. يجب أن يكون العضوي منفصلا إلى حد ما وأكثر ليونة الآن ؛ كرر الخلط مع طرف ماصة p1000 مرة أخرى.
- الهدف هو الحصول على حجم إجمالي 100 ميكرولتر لكل بئر من صفيحة 96 بئرا. أضف 25 ميكرولتر من الخليط من الخطوة 9.3 (سيكون لديه ما يكفي من النسخ المتماثلة التقنية المتعددة) وأضف 75 ميكرولتر من فحص صلاحية الخلايا المضيئة المتبقية وخليط PBS.
- ضع الطبق على شاكر لمدة 2 دقيقة ثم احتضنه لمدة 20 دقيقة في RT.
- اقرأ اللوحة باستخدام إعداد التلألؤ على قارئ الألواح وجمع البيانات (انظر الشكل 4).
Representative Results
يوضح الشكل 1 النمو العضوي المبكر الذي شوهد عبر المجهر الضوئي عند تكبير 10x. يوضح الشكل 1A هجرة وغزو الخلايا المفردة من خلال lrECM في العرض الأوسط. ستستمر الخلايا في التوسع و "استعمار" lrECM ، وستظهر أكثر كثافة وغير شفافة في النهاية عن طريق الفحص البصري. يوضح الشكل 1B العديد من المواد العضوية الناضجة (في 7 أسابيع) دون تكبير ، بالنسبة لحجم عشرة سنتات.
يوضح الشكل 2 تلطيخ المناعة النسيجية الكيميائية للعضويات GBM للفوسفو هيستون H3 ، وهو علامة على الانتشار النشط. وينظر إلى معظم الخلايا التكاثرية للغاية في محيط العضوية مقارنة مع النواة العضوية. سيكون للتلطيخ الإيجابي مظهر بني / نحاسي.
يصف الشكل 3 عملية تجانس وقياس إجمالي عدد الخلايا في عضويات GBM باستخدام فحص جدوى الخلايا المضيئة الخاصة ب 3D. نظرا للعدد الكبير من الخلايا الموجودة في المواد العضوية GBM ، يتم تجانس البنية العضوية الأكبر في البداية عن طريق التثليث في كاشف المقايسة المضيئة. ثم يتم تحميل أجزاء من إجمالي التحلل العضوي في آبار فردية وتخفيفها بكاشف فحص مضيء إضافي قبل الحضانة والقراءة على قارئ ألواح مناسب متعدد الآبار.
يمثل الشكل 4 بيانات التحكم في DMSO (المركبات الشائعة) للعضويات. تظهر البيانات المرسومة الاتساق داخل العضوية وبين العضويات. عادة ما يتم تطبيع بيانات الجدوى المضيئة إلى عناصر تحكم لكل عينة عند إنشاء بيانات تجريبية.
الشكل 1: عرض من خلال المجهر الضوئي (10x). (أ) النمو العضوي المبكر الذي يوضح هجرة / غزو خلايا GBM في جميع أنحاء المصفوفة خارج الخلية الغنية باللامينين. (ب) المواد العضوية الناضجة بالنسبة لحجم السنت الواحد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الكيمياء النسيجية المناعية للعضويات GBM. (A ، B) تظهر الكائنات العضوية GBM الخلايا الملطخة بالفوسفو هيستون H3 للانتشار النشط. قضبان المقياس هي 600 ميكرومتر و 300 ميكرومتر ل A و B ، على التوالي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: بروتوكول صلاحية الخلايا المضيئة للعضويات . (أ) نقل المواد العضوية الفردية إلى أنابيب الطرد المركزي الصغيرة وإزالة الوسائط الزائدة. (ب) إضافة 500 ميكرولتر من 1: 1 PBS وخليط فحص صلاحية الخلايا المضيئة إلى كل أنبوب وماصة بقوة لتحطيم العضوي. (ج) إضافة 25 ميكرولتر من هذا الخليط العضوي و 75 ميكرولتر من نفس 1: 1 PBS وخليط فحص صلاحية الخلايا المضيئة إلى كل بئر من صفيحة 96 بئرا. (د) ضعه على شاكر لمدة 2 دقيقة ، يليه حضانة لمدة 20 دقيقة في RT ، ثم اقرأ التلألؤ على قارئ اللوحات. الرقم المصنوع باستخدام BioRender.com. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: صلاحية الخلية. بيانات جدوى الخلية للعضويات في 0.1٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) لستة نسخ طبق الأصل تقني من أربعة عضويات لأربع عينات من المرضى. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| مكون | كم |
| الوسط العصبي القاعدي ناقص الفينول الأحمر | 500 مل |
| B-27 الملحق ناقص فيتامين (أ) (50x) | 10 مل |
| مضاد حيوي مضاد للفطريات (100x) | 5 مل |
| بيروفات الصوديوم (100 ملليمتر) | 5 مل |
| الجلوتامين في 0.85٪ كلوريد الصوديوم (200 ملليمتر) | 5 مل |
| FGF البشري المؤتلف الأساسي (250 ميكروغرام / مل) | 20 ميكرولتر |
| بروتين EFG البشري المؤتلف (250 ميكروغرام / مل) | 20 ميكرولتر |
| أحمر الفينول | 500 ميكرولتر |
الجدول 1: صياغة الوسط العصبي القاعدي الكامل (NBMc)
| الكاشف | الوقت |
| 50٪ إيثانول | 3 دقائق |
| 75٪ إيثانول | 3 دقائق |
| 95٪ إيثانول | 3 دقائق |
| 95٪ إيثانول | 4 دقائق |
| 100٪ إيثانول | 2 دقيقة |
| 100٪ إيثانول | 3 دقائق |
| 100٪ إيثانول | 4 دقائق |
| بديل الزيلين | 2 دقيقة |
| بديل الزيلين | 3 دقائق |
| بديل الزيلين | 4 دقائق |
| شمع البارافين | 15 دقيقة |
| شمع البارافين | 15 دقيقة |
الجدول 2: جدول تجهيز المواد العضوية الصغيرة (قطرها أقل من 3 مم)
| الكاشف | الوقت |
| 50٪ إيثانول | 6 دقائق |
| 75٪ إيثانول | 6 دقائق |
| 95٪ إيثانول | 5 دقائق |
| 95٪ إيثانول | 8 دقائق |
| 100٪ إيثانول | 5 دقائق |
| 100٪ إيثانول | 5 دقائق |
| 100٪ إيثانول | 8 دقائق |
| بديل الزيلين | 5 دقائق |
| بديل الزيلين | 5 دقائق |
| بديل الزيلين | 8 دقائق |
| شمع البارافين | 30 دقيقة |
| شمع البارافين | 30 دقيقة |
الجدول 3: جدول معالجة المواد العضوية الكبيرة (التي يزيد قطرها عن 3 مم)
| الكاشف | الوقت |
| هيماتوكسيلين | 2 دقيقة |
| تشغيل diH2O | 2 دقيقة |
| كاشف توضيح الهيماتوكسيلين النووي | 1 دقيقة |
| تشغيل diH2O | 1 دقيقة |
| كاشف بلوينغ | 1 دقيقة |
| تشغيل diH2O | 2 دقيقة |
| 70٪ إيثانول | 1 دقيقة |
| 100٪ إيثانول | 1 دقيقة |
| 100٪ إيثانول | 1 دقيقة |
| بديل الزيلين | 2 دقيقة |
| بديل الزيلين | 2 دقيقة |
الجدول 4: الهيماتوكسيلين المضاد للوصمة
Discussion
GBM organoids هي طريقة استزراع مكملة للمجالات التقليدية التي تتضمن عدم تجانس خلوي وبيئي دقيقأكبر 4,22,30. على الرغم من أن الثقافة العضوية تتطلب المزيد من الوقت والموارد الكثيفة الاستخدام ، إلا أنها يمكن أن توفر نظرة ثاقبة قيمة على السلوك داخل الأخلاق وآليات مقاومة الأدوية.
يتم دفع GBM من قبل عدد سكان CSCs 5,31 ، وقد تم تطوير هذه الأساليب للسماح بالنمو المستمر والتجديد الذاتي لسكان CSC هؤلاء. من المعروف أن عامل نمو البشرة (EGF) وعامل نمو الخلايا الليفية (FGF) يعززان صيانة الخلايا الجذعية ونموها ويوفران إشارات مستقبلات التيروزين كيناز النشطة (RTK). يعتمد تكوين مجموعات خلوية غير متجانسة وبيئات دقيقة متميزة للورم داخل أورام GBM على دعم سلوكيات CSC. اختيار lrECM يحاكي بيئة الدماغ الغنية باللامينين ويدعم الخلايا في الثقافة العضوية للتنظيم الذاتي والهجرة عن طريق الغزو. على الرغم من أن بعض المجموعات قد أنشأت ثقافة عضوية دون استخدام وسائط lrECM أو EGF / FGF المخصبة24,28 ، والتي قد توفر طريقة أكثر كفاءة من حيث الوقت لطريقة الاستزراع هذه واختيار أقوى للإشارات السرطانية المنشأ لدفع النمو ، فقد تم اختيار هذه الطرق لتحسين بيئة الخلايا الجذعية المؤيدة لتحديد أفضل عدم التجانس الخلوي للعضويات. تم تصنيع كل من المواد العضوية الدماغية و GBM العضوية باستخدام lrECM في الأدبيات السابقة21،32،33. على الرغم من أننا أنشأنا بيانات تتعلق بمجموعات الأورام الموجودة داخل المواد العضوية والتباين المكاني ، إلا أنه لا يعرف سوى القليل عن المجموعات السكانية غير السرطانية داخل المواد العضوية ومدة بقائها على قيد الحياة من عينات المرضى الأصلية. قد توفر بعض بقع المدينة العالمية للخدمات الإنسانية (مثل CD45) هذه البيانات ، ويمكن أن تكون نقطة بحث مثيرة للاهتمام في المستقبل مع المواد العضوية.
معرفة الاستخدام المقصود للثقافة العضوية مهم لاختيار الطرق المناسبة. إن إنشاء عضويات من العينات الأولية مقابل زراعة عضويات موحدة لتجارب محددة لها إجراءات مختلفة قليلا. إن تقدير كيفية نضج المواد العضوية وملئها بصريا في سقالة lrECM أمر مهم للتمكن من تخصيص الوقت والموارد المناسبة للثقافة العضوية. سوف تتوسع المناطق المتناثرة من الخلايا في المواد العضوية ببطء وتنمو لملء lrECM ، والتي يمكن أن تستغرق في أي مكان من 2-8 أسابيع ، اعتمادا على سلوك العينة. معدل النمو هذا جوهري إلى حد ما لكل عينة. يتم الحفاظ عليها عبر دفعات مختلفة من المواد العضوية وتتفق إلى حد ما مع المعدل النسبي لنمو الكرة. يمكن الحفاظ على المواد العضوية لأكثر من 1 سنة والاحتفاظ بقدرات تكوين الورم على xenograft في الفئران. ومع ذلك ، يوصى بزراعتها لغرض متميز يتمثل في عدم إهدار موارد المختبر (المواد والوقت على حد سواء)4. تم اختبار النمو العضوي في أحجام وتنسيقات آبار متعددة ، ويظهر أن لوحة 10 سم هي الإعداد المثالي للحفاظ على الجدوى المثلى للخلية ، تليها لوحة من 6 آبار مع ثلاثة عضويات لكل بئر34. تستهلك المواد العضوية المزيد من الوسائط مقارنة بنظيراتها من الثقافة ثنائية الأبعاد ، ولا يؤدي استخدام تنسيق بئر أصغر إلى الصيانة المناسبة. على سبيل المثال ، لا يحتوي بئر واحد من لوحة تنسيق 96 بئرا على مساحة كافية أو حجم وسائط بالنسبة لحجم العضو العضوي للحفاظ على نمو العضوي.
كما تنشأ المواد العضوية ، فإن الملاحظة أمر مهم لزيادة النجاح. في البداية ، سوف تستهلك المواد العضوية الوسائط ببطء ، ولكن عندما تصبح أكثر كثافة وأكثر نضجا ، فإنها ستستهلك الوسائط بسرعة أكبر. يمكن أن تساعد إضافة الفينول الأحمر إلى الوسائط في العمل كمؤشر على استهلاك الوسائط. عندما تكون الوسائط صفراء أكثر، قد يدفعنا ذلك إلى تعديل نمط التغذية، سواء كان ذلك لتبادل حجم أكبر من الوسائط، أو زيادة إجمالي كمية الوسائط في اللوحة، أو تقسيم المواد العضوية بين لوحات زراعة الخلايا المتعددة لمواكبة نموها، أو حتى ضبط الجدول الزمني للتجارب.
من نواح كثيرة ، تعد المواد العضوية طريقة غير فعالة لإجراء أبحاث السرطان. فهي تنطوي على نطاقات زمنية طويلة ، وهي مكلفة وكثيفة الموارد مقارنة بثقافة المجال GBM. ومع ذلك ، بالمقارنة مع xenografts المشتقة من المريض ، وهي طريقة بديلة لإعادة خلق التنوع الخلوي والبيئي الجزئي ، فهي أكثر وضوحا وأقل تكلفة ويمكن التحكم فيها. اختيار أفضل وقت لاستخدام المواد العضوية مهم للباحثين في مجال السرطان. وليس المقصود منها أن تحل محل المجال التقليدي أو الثقافة الملتزمة بها وليس أن تحل محل نماذج xenograft. يمكن للعضويات ، عند تطبيقها على السؤال العلمي الصحيح ، الجمع بين فوائد هذين النظامين وقد تسمح لنا بمراقبة بيولوجيا الخلايا السرطانية التي كانت ستبقى مخفية لولا ذلك. بدأ المجتمع العلمي للتو في فهم فرص التعلم التي توفرها المواد العضوية ، ولكن من الواضح أنها ستكون أداة لا تقدر بثمن في المستقبل لفهم البيولوجيا المعقدة ل GBM.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب للكشف عنه.
Acknowledgments
نود أن نشكر الدكتور جاستن لاثيا على نصائحه القيمة ودعمه المستمر. كما نشكر كاترينا فايف وليزا والاس ومايا كامهي على دعمهم الفني الممتاز.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3,3-Diaminobenzidine (DAB) tablets | MP Biomedicals | 08980681 | 3,3-Diaminobenzidine (DAB) tablets |
| 96-well PCR plates | ThermoFisher Scientific | 96-well PCR plates | |
| Accutase | ThermoFisher Scientific | SCR005 | Cell detachment solution |
| Antibiotic-antimycotic | ThermoFisher Scientific | 15240062 | Antibiotic-antimycotic |
| B-27 supplement minus vitamin A | ThermoFisher Scientific | 12587001 | B-27 supplement minus vitamin A (50x) |
| GelCode Blue Stain Reagent | ThermoFisher Scientific | 24590 | Bluing reagent |
| Cell strainer (70 µm) | CellTreat Scientific | 229483 | Cell strainer (70 µm) |
| CellTiter-Glo 3D | Promega | G9681 | Luminescent cell viability assay |
| Clarifier 2 | ThermoFisher Scientific | 7301 | Nuclear hematoxylin clarifying reagent |
| Clear-Rite 3 | ThermoFisher Scientific | 6901 | xylene substitute |
| Epredia Gill 2 Hematoxylin | ThermoFisher Scientific | 72504 | Hematoxylin |
| Glutamine in 0.85% NaCl | ThermoFisher Scientific | 35050061 | Glutamine in 0.85% NaCl (200 mM) |
| Matrigel | ThermoFisher Scientific | 354234 | Laminin-enriched extracellular matrix |
| Mini PAP pen | ThermoFisher Scientific | 008877 | Hydrophobic barrier pen |
| Mounting medium | ThermoFisher Scientific | 22-050-102 | Mounting medium |
| Neurobasal media minus phenol red | ThermoFisher Scientific | 12349015 | Neurobasal media minus phenol red (500 mL) |
| Normal donkey serum (NDS) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | Normal donkey serum (NDS) |
| Paraformaldehyde 4% in PBS | ThermoFisher Scientific | AAJ19943K2 | Paraformaldehyde 4% in PBS |
| Phenol red | Sigma | P0290 | Phenol red (0.5%) |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | ThermoFisher Scientific | P10144 | Liquid curing mountant |
| Recombinant human EGF protein | R&D systems | 236-EG-01M | Recombinant human EGF protein (250 µg/mL) |
| Recombinant human FGF basic | R&D systems | 4144-TC-01 | Recombinant human FGF basic (250 µg/mL) |
| SignalStain Antibody Diluent | Cell Signaling | 8112 | Antibody diluent |
| SignalStain Boost IHC Detection Reagent | Cell Signaling | 8114 | Immunohistochemistry detection reagent |
| SignalStain Citrate Unmasking Solution | Cell Signaling | 14746 | Citrate unmasking solution |
| Single edge razor blade | Uline | H-595B | Single edge razor blade |
| Sodium pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11360070 | Sodium pyruvate (100 mM) |
| Tissue-Tek Cryomolds | VWR | 25608-916 | Disposable cryomolds |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | VWR | 25608-930 | Optimal cutting temperature compound |
| Trypan Blue Stain | ThermoFisher Scientific | T10282 | Cell impermeant stain (0.4%) |
| Xylene | ThermoFisher Scientific | X3P-1GAL | Xylene |
References
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
- Heffernan, J. M., Sirianni, R. W. Modeling microenvironmental regulation of glioblastoma stem cells: a biomaterials perspective. Frontiers in Materials. 5, 7 (2018).
- Zanders, E. D., Svensson, F., Bailey, D. S. Therapy for glioblastoma: is it working. Drug Discovery Today. 24 (5), 1193-1201 (2019).
- Hubert, C. G., et al. A Three-dimensional organoid culture system derived from human glioblastomas recapitulates the hypoxic gradients and cancer stem cell heterogeneity of tumors found in vivo. Cancer Research. 76 (8), 2465-2477 (2016).
- Lathia, J. D., Heddleston, J. M., Venere, M., Rich, J. N. Deadly teamwork: neural cancer stem cells and the tumor microenvironment. Cell Stem Cell. 8 (5), 482-485 (2011).
- Meyer, M., et al. Single cell-derived clonal analysis of human glioblastoma links functional and genomic heterogeneity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 851-856 (2015).
- Bao, S., et al. Stem cell-like glioma cells promote tumor angiogenesis through vascular endothelial growth factor. Cancer Research. 66 (16), 7843-7848 (2006).
- Yu, S. C., Bian, X. W. Enrichment of cancer stem cells based on heterogeneity of invasiveness. Stem Cell Reviews and Reports. 5 (1), 66-71 (2009).
- Bao, S., et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).
- Vescovi, A. L., Galli, R., Reynolds, B. A.
- Zhu, T. S., et al. Endothelial cells create a stem cell niche in glioblastoma by providing NOTCH ligands that nurture self-renewal of cancer stem-like cells. Cancer Research. 71 (18), 6061-6072 (2011).
- Calabrese, C., et al. A perivascular niche for brain tumor stem cells. Cancer Cell. 11 (1), 69-82 (2007).
- Charles, N., et al. Perivascular nitric oxide activates notch signaling and promotes stem-like character in PDGF-induced glioma cells. Cell Stem Cell. 6 (2), 141-152 (2010).
- Seidel, S., et al. A hypoxic niche regulates glioblastoma stem cells through hypoxia inducible factor 2 alpha. Brain. 133, 983-995 (2010).
- Yan, K., et al. Glioma cancer stem cells secrete Gremlin1 to promote their maintenance within the tumor hierarchy. Genes & Development. 28 (10), 1085-1100 (2014).
- Cheng, L., et al. Glioblastoma stem cells generate vascular pericytes to support vessel function and tumor growth. Cell. 153 (1), 139-152 (2013).
- Flavahan, W. A., et al. Brain tumor initiating cells adapt to restricted nutrition through preferential glucose uptake. Nature Neuroscience. 16 (10), 1373-1382 (2013).
- Hjelmeland, A. B., et al. Acidic stress promotes a glioma stem cell phenotype. Cell Death and Differentiation. 18 (5), 829-840 (2011).
- Bar, E. E., Lin, A., Mahairaki, V., Matsui, W., Eberhart, C. G. Hypoxia increases the expression of stem-cell markers and promotes clonogenicity in glioblastoma neurospheres. The American Journal of Pathology. 177 (3), 1491-1502 (2010).
- Li, Z., et al. Hypoxia-inducible factors regulate tumorigenic capacity of glioma stem cells. Cancer Cell. 15 (6), 501-513 (2009).
- Azzarelli, R., Ori, M., Philpott, A., Simons, B. D. Three-dimensional model of glioblastoma by co-culturing tumor stem cells with human brain organoids. Biology Open. 10 (2), 056416 (2021).
- Linkous, A., et al. Modeling patient-derived glioblastoma with cerebral organoids. Cell Reports. 26 (12), 3203-3211 (2019).
- da Silva, B., Mathew, R. K., Polson, E. S., Williams, J., Wurdak, H. Spontaneous glioblastoma spheroid infiltration of early-stage cerebral organoids models brain tumor invasion. SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R & D. 23 (8), 862-868 (2018).
- Jacob, F., et al. A Patient-derived glioblastoma organoid model and biobank recapitulates inter- and intra-tumoral heterogeneity. Cell. 180 (1), 188-204 (2020).
- Boretto, M., et al. Patient-derived organoids from endometrial disease capture clinical heterogeneity and are amenable to drug screening. Nature Cell Biology. 21 (8), 1041-1051 (2019).
- Huang, L., et al. Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell-and patient-derived tumor organoids. Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).
- Ledur, P. F., Onzi, G. R., Zong, H., Lenz, G. Culture conditions defining glioblastoma cells behavior: what is the impact for novel discoveries. Oncotarget. 8 (40), 69185-69197 (2017).
- Lenin, S., et al. A drug screening pipeline using 2D and 3D patient-derived in vitro models for preclinical analysis of therapy response in glioblastoma. International Journal of Molecular Sciences. 22 (9), 4322 (2021).
- Rybin, M. J., Ivan, M. E., Ayad, N. G., Zeier, Z. Organoid models of glioblastoma and their role in drug discovery. Frontiers in Cellular Neuroscience. 15 (4), 605255 (2021).
- Shakya, S., et al. Altered lipid metabolism marks glioblastoma stem and non-stem cells in separate tumor niches. Acta Neuropathologica Communications. 9 (1), 101 (2021).
- Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
- Bian, S., et al. Genetically engineered cerebral organoids model brain tumor formation. Nature Methods. 15 (8), 631-639 (2018).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
- Sundar, S. J., et al. Three-dimensional organoid culture unveils resistance to clinical therapies in adult and pediatric glioblastoma. Translational Oncology. 15 (1), 101251 (2021).
