Summary
Här beskriver vi en metod för att generera glioblastom (GBM) organoider från primära patientprover eller patient-härledda cellkulturer och upprätthålla dem till mognad. Dessa GBM-organoider innehåller fenotypiskt olika cellpopulationer och återskapar tumörmikromiljöer ex vivo.
Abstract
Glioblastom (GBM) är den vanligaste primära maligna hjärncancern med en extremt dålig prognos. Intratumöral cellulär och molekylär mångfald, liksom komplexa interaktioner mellan tumörmikromiljöer, kan göra det svårt att hitta effektiva behandlingar. Traditionella vidhäftande eller sfärodlingsmetoder kan maskera sådana komplexiteter, medan tredimensionell organoidkultur kan rekapitulera regionala mikromiljögradienter. Organoider är en metod för tredimensionell GBM-odling som bättre efterliknar patientens tumörarkitektur, innehåller fenotypiskt olika cellpopulationer och kan användas för experiment med medelhög genomströmning. Även om tredimensionell organoidkultur är mer mödosam och tidskrävande jämfört med traditionell kultur, erbjuder den unika fördelar och kan tjäna till att överbrygga klyftan mellan nuvarande in vitro - och in vivo-system . Organoider har etablerat sig som ovärderliga verktyg i arsenalen av cancerbiologer för att bättre förstå tumörbeteende och resistensmekanismer, och deras tillämpningar fortsätter bara att växa. Här finns detaljer om metoder för att generera och underhålla GBM-organoider. Instruktioner för hur man utför organoidprovtagningsinbäddning och sektionering med både frysta och paraffininbäddningstekniker, samt rekommendationer för immunhistokemi och immunofluorescensprotokoll på organoidsektioner och mätning av total organoidcellviabilitet, beskrivs också alla.
Introduction
Glioblastom (GBM) är den vanligaste primära hjärntumören med en dyster prognos på cirka 15 månader från diagnos1. Behandlingar som är effektiva i prekliniska studier kan ofta vara dåligt effektiva hos patienter 2,3. Dåligt kliniskt svar tillskrivs många faktorer, inklusive mikromiljömässig heterogenitet hos GBM och komplexa intratumörala interaktioner. Dessa kan vara svåra att återskapa i laboratoriemiljö med traditionella vidhäftande eller sfärodlingsmetoder4. Förekomsten av en delmängd av självförnyande cancerstamceller (CSC) inom GBM kan också bidra till denna komplexitet 5,6. CSC är avgörande för tumörutbredning och upprätthåller tumörtillväxt genom att främja aktiv angiogenes, cancerinvasion och resistens mot terapier inklusive strålning 7,8,9. CSC är inte jämnt fördelade över tumörer utan berikas snarare inom specifika mikromiljöer, inklusive perivaskulär nisch och perinecrotic regioner, som var och en ger distinkt molekylär reglering av deras cellulära tillstånd 10,11,12,13,14. CSC är inte passiva mottagare av mikromiljösignaler utan har istället förmågan att omforma sina egna mikromiljöer 7,15,16. Mikromiljön i en CSC kan främja upprätthållandet av stamcellstillstånd som svar på tryck som näringsbrist, pH och hypoxi17,18,19,20, vilket tyder på vikten av dessa förhållanden i ett modellsystem. Rekapitulation av den olika cellulära mikromiljön inom tumörer är därför avgörande för att förstå terapeutisk resistens och identifiera nya terapier.
Tredimensionell kultur har ökat i popularitet de senaste åren21,22. Organoider har använts i andra typer av cancer, och det primära målet att upprätthålla celler som organoider är att möjliggöra tillväxt av heterogena cellpopulationer (varav många normalt kan konkurreras ut i mer homogen sfärkultur) och rumslig mångfald, sett som regionala tumörmikromiljöer med genetisk specificitet 4,23,24,25,26 . Det finns många metoder för tredimensionell odling av cancerceller, som var och en har fördelar och nackdelar27,28,29. Organoidkultur är inte avsedd att ersätta traditionell vidhäftande eller sfärkultur. Det används bäst som en kompletterande teknik till tvådimensionella metoder när det finns specifika frågor där interaktionen mellan cellmikromiljö och tumörcellsvar är kritisk.
Den här artikeln beskriver tillförlitliga och repeterbara metoder för att generera GBM-organoider från antingen primära patientprover eller patient-härledda kulturer. Vi adresserar två olika mål för tredimensionell organoidodling: (1) etablering av organoider från primär patientvävnad, med maximal engraftmentpotential oavsett enhetlighet, eller (2) odling av enhetliga organoider för mer kvantitativ experimentell användning. Vid upprättandet av ett primärprov som organoider är det inte nödvändigt att filtrera efter enstaka celler eller räkna celler, eftersom det är en prioritet att hålla maximala cellnummer och typer för att fastställa den ursprungliga kulturen. Vid odling av organoider för jämförande experiment behövs dock encellsfiltrering och cellräkning för att säkerställa att replikatorganoider är jämförbara för experimentell konsistens. Detta protokoll beskriver hur man etablerar organoidkulturer och skapar enhetliga organoider, samt förfinade metoder för inbäddning och bevarande av organoider och standardcellodlingsexperiment, inklusive immunhistokemi, immunofluorescens och bedömning av total cellviabilitet i GBM-organoider.
Protocol
Alla steg i protokollet /protokollen som beskrivs nedan utvecklades och genomfördes i enlighet med Cleveland Clinic Institutional Review Board (IRB) protokoll #2559 och godkännande av Institutional Biosafety Committee (IBC) #1711. Sfärer och organoider odlas i "Neurobasal Media Complete" (NBMc). Se tabell 1 för instruktioner.
1. Göra organoidformar
- Ta bort vaxpapperet från parafilmarket (ungefär 4 cm x 4 cm stort) och placera det mellan två sterila 96-brunns polymeraskedjereaktionsplattor (PCR).
- Utför dessa steg i kulturhuven och var särskilt noga med att hålla "insidan" av parafilmen (den sida som täcks av papperet) ren. Denna rena sida bör göra konkaviteten i indragningarna.
- Applicera jämnt tryck på den övre 96-brunns PCR-plattan för att bilda små gropar i parafilmen. Målet är att groparna ska vara ungefär 2 mm djupa utan att skapa hål i parafilmen.
- Separera de två 96-brunns PCR-plattorna försiktigt. Den dimpled parafilmen kommer att hålla fast vid toppplattan. Lägg detta på torris i ca 30 s.
- Efter att parafilmen har legat på torris i 30 s, använd sterila tångar för att dra bort parafilmen från den övre 96-brunns PCR-plattan.
- När du tar bort parafilmen, använd en snabb rörelse snarare än att vara mycket "försiktig". Fryst parafilm är lättare att ta bort än uppvärmd parafilm, vilket kan få groparna att invertera.
- Placera den färdiga parafilmformen i en täckt, steril 10 cm cellodlingsskål. Mögel kan tillverkas i förväg och lagras om sterilitet bibehålls.
2. Makrodissektion av patientens vävnadsprov
- I en steril odlingsskål (10 cm cellodlingsplattor), använd två sterila rakblad för att finhacka patientprovet medan du applicerar jämnt tryck.
OBS: Att mala provet är enklast med cirka 500 μL NBMc på odlingsskålen. Försök med rakblad att hacka bitar så fint som möjligt; Helst är enskilda bitar 1 mm3 eller mindre. - Överför de finhackade tumörbitarna till ett 15 ml centrifugrör med en skuren p1000-pipettspets.
OBS: Vid hantering av organoider är det viktigt att endast använda skurna p1000-pipettspetsar. Dessa kan skäras med en vass rakhyvel till önskad öppningsstorlek (mellan 5 och 8 mm ungefär) och autoklaveras. - Tillsätt 2 ml rumstemperatur (RT) cellavskiljningslösning (materialtabell) och placera den i en 37 °C, 5% CO 2-inkubator i cirka 10 minuter.
OBS: Observera och blanda med några minuters mellanrum. Vissa cellavskiljningslösningar eller prover kan behöva varierande inkubationstider. Om klumpning uppträder, vilket kan indikera DNA-frisättning på grund av celllys, fortsätt omedelbart till nästa steg. - Tillsätt 8 ml NBMc-media för att neutralisera cellavskiljningslösningen och snurra i 3 minuter vid 65 x g.
- Aspirera supernatanten och återsuspendera vävnaden i 1-2 ml NBMc.
3. Generera organoider från primär patientvävnad
OBS: Målet när man gör organoider från primär patientvävnad är att etablera tredimensionell kultur. Filtrera inte efter enskilda celler eller räkna celler, men håll den ursprungliga cellbelastningen så enhetlig som möjligt med hjälp av visuell inspektion. Det är normalt att ha heterogenitet i tillväxten och etableringen av initiala organoider. Varje organoid kommer att vara 20 μl i volym (16 μL lamininrik extracellulär matris (lrECM) och 4 μL vävnad suspenderad i NBMc, från steg 2.5). Instruktioner kan justeras för antalet avsedda organoider; Målet är att vanligtvis bilda cirka 20-30 organoider från primära patientprover.
- Placera lrECM och ett litet centrifugrör i en ishink eller ett kallt block. Placera lämplig mängd lrECM (16 μL x X antal avsedda organoider) i det lilla centrifugröret.
- Tillsätt lämplig volym vävnadssuspension från steg 2.5 (4 μl x antalet avsedda organoider) till centrifugröret på is.
- Pipettera försiktigt 20 μL av lrECM/cellsuspensionsblandningen på parafilmformar. Detta kommer att bilda en pärlliknande droppe.
- Var noga med att blanda lrECM / cellsuspensionsblandningen noggrant; cellerna tenderar att sätta sig lätt inom lrECM, vilket resulterar i heterogena organoider.
- Håll lrECM/cellsuspensionsblandningen på is. Om lrECM värms upp kan det polymerisera och äventyra organoidbildning. Var noga med att kyla pipettspetsen varannan till tre organoider för att förhindra lrECM-polymerisation. För inte in luftbubblor i organoider (undvik att "dubbeltrycka" pipetten).
- När det önskade antalet organoider pipetteras på parafilmform i en 10 cm cellodlingsplatta, täck med plattlock och inkubera i en cellodlingsinkubator vid 37 ° C, 5%CO2 i 1-2 timmar.
- När organoiderna stelnat, använd NBMc-media för att spola dem försiktigt från parafilmformen och in i en ny, steril 10 cm odlingsplatta med totalt 20 ml NBMc. Att använda en p1000-spets fungerar bäst för att spola organoiderna från formen; de kommer att glida av försiktigt.
OBS: När organoider spolas från formarna till cellodlingsplattor bör de vara synliga i media som små rosa sfärer. Om organoiderna verkar ha fallit isär eller krossats i media, indikerar detta ett tidigare problem med att lrECM har polymeriserats, och organoider kan fortfarande växa men kommer sannolikt inte att vara enhetliga i storlek. - Placera odlingsskålen på 10 cm i en cellodlingsinkubator vid 37 °C, 5 %CO2 (utan skakning) i 4 dagar.
OBS: Att placera organoider på en orbital shaker under de första dagarna kan få dem att falla isär. Se till att de inte skakar förrän dag 4. - Efter 4 dagar, byt ut mediet och placera på en orbital shaker vid 80 RPM i en cellodlingsinkubator vid 37 ° C, 5% CO2.
- Att utbyta media med omogna organoider är utmanande eftersom de är svåra att visualisera. Luta cellodlingsskålen och vänta i minst 20 s; organoiderna kommer att sätta sig i botten och låta mediet ovanifrån avlägsnas med en glas- eller plastpipett på 10-20 ml långsamt.
- Var noga med samlingen av organoider längst ner; Om de verkar rörda med kraften av borttagning av media är det bäst att pausa och låta dem återställas. När organoider mognar och är lättare att visualisera blir denna process mindre nyanserad.
OBS: Ibland kan placering av en bit mörkt papper under cellodlingsplattan hjälpa till att visualisera omogna organoider. Det rekommenderas att inte använda en Pasteur-pipett med vakuumsug för att ta bort media eftersom det är mycket lätt för organoiderna att sugas upp och förloras på detta sätt. - När organoider först etableras konsumerar de inte media lika snabbt som mogna organoider. Från och med 50% medieutbyten minskar onödig medieanvändning och minskar risken för att oavsiktligt skada eller aspirera nya organoider under medieutbytesprocessen.
4. Generera organoider från etablerad GBM-sfär, anhängare eller organoidkultur
OBS: Målet här är att göra organoider som är enhetliga i storlek och cellkvantitet för användning i jämförande experiment, så använd ett encellsfilter och räkna celler för att säkerställa detta.
- Förbereda encellssuspension från GBM-sfärodling.
OBS: Sfärkulturer av GBM-celler upprätthålls i NBMc-media.- Placera sfärer i ett 15 ml centrifugrör och snurra vid 120 x g i 5 minuter.
- Ta bort supernatanten och tillsätt 2 ml RT-cellavskiljningslösning. Placera i en 37 °C inkubator i 3 minuter.
- Tillsätt 8 ml NBMc-media för att neutralisera cellavskiljningslösningen. Sila genom en enda cellsil (70 μm) och snurra i 5 min vid 120 x g.
- Ta bort supernatanten från röret och återsuspendera de återstående cellerna i ~ 1 ml NBMc. Räkna cellerna (med cellimpermeant fläck) och hoppa till steg 4.4.
- Förbereda encellssuspension från GBM-vidhäftande kultur.
- Ta bort det använda mediet från plattan, tillsätt 2 ml RT-cellavskiljningslösning till plattan och placera i en 37 °C inkubator i 3 minuter.
- Bekräfta under mikroskopet att cellerna är lossnade från plattan.
- Tillsätt 8 ml NBMc-media för att neutralisera cellavskiljningslösningen. Sila genom en encellssil (70 μm).
OBS: Encellsspänning är valfritt när man arbetar med vidhäftande kultur. - Snurra i 5 min vid 120 x g. Ta bort supernatanten från röret och återsuspendera de återstående cellerna i ~ 1 ml NBMc. Räkna cellerna (med cellimpermeant fläck) och hoppa till steg 4.4.
- Förbereda encellssuspension från GBM-organoidkultur.
- Överför organoiderna med en skuren p1000-pipettspets till en 10 cm odlingsplatta och ta försiktigt bort så mycket kvarvarande media som möjligt.
- Använd två sterila rakhyvlar och hacka försiktigt organoider fint. Med den skurna p1000-spetsen, flytta de malet organoiderna till ett 15 ml centrifugrör och tillsätt ~ 2-3 ml NBMc-media.
- Snurra på 120 x g i 3 min och ta bort supernatanten (rekommenderar att du använder en pipettspets snarare än vakuumsug för denna del).
- Tillsätt 2 ml kallcellslösning i 10 minuter.
OBS: Cellavskiljningslösning ska användas direkt från 4 °C, inte värmas först. Detta verkar mjuka upp eventuella kvarvarande matrigel och hjälper till med cellåtervinning. - Flytta sedan till en 37 °C inkubator i 10-20 minuter, observera och blanda med några minuters mellanrum. Om klumpning uppträder, vilket kan indikera celllys, fortsätt omedelbart till nästa steg.
- Tillsätt 8 ml NBMc-media för att späda cellavskiljningslösningen. Sila genom en encellssil (70 μm) och snurra i 5 min vid 120 x g.
- Ta bort supernatanten från röret och återsuspendera de återstående cellerna i ~ 1 ml NBMc. Räkna cellerna (med hjälp av cellimpermeant fläck) och fortsätt till steg 4.4.
- Tillverkning av organoider från en encellssuspension
- Placera lrECM och ett litet centrifugrör i en ishink eller ett kallt block. Placera lämplig mängd lrECM (16 μL x X antal avsedda organoider) i det lilla centrifugröret.
- Skapa en blandning av celler i en total volym (4 μL x X antal avsedda organoider) som kommer att innehålla 20 000 celler / organoid och lägg till detta i det lilla centrifugröret med lrECM på is.
- Pipettera försiktigt 20 μL av lrECM/cellsuspensionsblandningen på parafilmformar. Detta kommer att bilda en pärlliknande droppe.
- Var noga med att blanda lrECM / cellsuspensionsblandningen noggrant, eftersom cellerna tenderar att sätta sig lätt i lrECM, och detta kommer att resultera i heterogena organoider.
- Håll lrECM/cellsuspensionsblandningen på is. Om lrECM värms upp kan det polymerisera och äventyra organoidbildning.
- Var noga med att kyla pipettspetsen varannan till tre organoider för att förhindra lrECM-polymerisation. För inte in luftbubblor i organoider (undvik att "dubbeltrycka" pipettspetsen).
- När det önskade antalet organoider pipetteras på parafilmform i en 10 cm odlingsplatta, inkubera vid 37 ° C i 1-2 timmar i en cellodlingsinkubator.
- När organoiderna har stelnat, använd NBMc-media för att spola dem försiktigt från parafilmformen och in i en ny, steril 10 cm odlingsplatta med totalt 20 ml NBMc. Att använda en p1000-spets fungerar bäst för att spola organoider från formen; de kommer att glida av försiktigt.
OBS: Cirka 15-20 organoider per 10 cm odlingsskål rekommenderas. - Placera 10 cm odlingsskålen i en inkubator (utan att skaka) i 4 dagar.
- Efter 4 dagar, byt ut media och placera på en orbital shaker vid 80 RPM i cellodlingsinkubatorn. Byt media var 2-3: e dag därefter.
- Att utbyta media med omogna organoider är utmanande eftersom de är svåra att visualisera. Luta cellodlingsskålen och vänta i minst 20 s; Organoiderna kommer att sätta sig i botten och låta media ovanifrån avlägsnas med en stor öppningsglaspipett långsamt.
- Var noga med samlingen av organoider längst ner; om de verkar rörda med kraften av borttagning av media, pausa och låt dem återställa sig. När organoider mognar och är lättare att visualisera blir denna process mindre nyanserad.
OBS: Ibland kan placering av en bit mörkt papper under cellodlingsplattan hjälpa till att visualisera omogna organoider. Använd inte en Pasteur-pipett med vakuumsug för att ta bort media eftersom det är mycket lätt för organoiderna att sugas upp och förloras på detta sätt. - När organoider först etableras konsumerar de inte media lika snabbt som mogna organoider. Börja med 50% medieutbyten för att minska onödig medieanvändning och minska risken för att oavsiktligt skada eller aspirera nya organoider under medieutbytesprocessen.
5. Kryoembedding
- Placera varje organoid i ett individuellt 1,5 ml rör (med skuren p1000-spets) som innehåller 1 ml 4% paraformaldehyd (PFA). Förvara organoider över natten vid 4 °C. Om du bäddar in organoider i paraffin, fortsätt till avsnitt 6.
- Efter fixering över natten i 4% PFA, tvätta organoiderna i 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) tre gånger.
- Överför organoiden till ett nytt 1,5 ml rör (med skuren p1000-pipettspets) som innehåller 1 ml 30% sackaros i vatten och förvara vid 4 ° C över natten.
- Tillsätt en liten mängd (vanligtvis 1-2 ml) optimal skärtemperaturförening (OCT) till en kryomold, täck botten och fyll cirka 1/3 till 1/2 av formens djup.
- Överför en enda organoid till cryomold med skuren p1000 pipettspets. Detta kommer att resultera i att vissa medier överförs med organoiden, vilket är oundvikligt. Använd en mindre pipettspets för att försiktigt ta bort omgivande media utan att störa organoiden.
OBS: Detta kan vara svårt att visualisera, men långsam pipettering kommer att visa en tydlig skillnad i densitet mellan media och OCT, så detta görs "genom känsla" till viss del). - Placera kryomolden på en bricka med torris. OCT kommer att börja frysa och bli ogenomskinlig i processen.
- Lägg till ytterligare OCT för att helt täcka organoiden och fyll resten av volymen på kryomolden. Block kan lagras vid -20 °C för kortvarig lagring i flera dagar eller vid -80 °C för långtidsförvaring på obestämd tid.
6. Paraffinbäddning
- Sortera organoider efter storlek (små organoider är under 3 mm, stora organoider är över 3 mm). Överför varje organoid till en histologikassett med en skuren p1000-pipettspets och bearbeta till paraffinvax enligt antingen tabell 2 eller tabell 3.
OBS: Storleken / konfigurationen av histologikassetten är upp till användaren. - Överför organoider från kassetterna till inbäddningsformar med 1-2 ml smält paraffinvax och kyla det tills vaxet är halvfast.
- När vaxet har stelnat delvis, tillsätt mer vax till toppen av formen. Placera den märkta kassetttoppen över formen och överför den till en kall tallrik. Fortsätt kyla tills vaxet är helt fast.
- När vaxet har stelnat, dela blocket med ett mikrotom. Alternativt kan du förvara vid RT eller 4 °C för senare sektionering.
7. Immunofluorescens (IF)
- De-paraffinisera och rehydrera 5-12 μm paraffinbäddade vävnadssektioner med hjälp av en glidfärgningsskål, enligt följande steg.
OBS: Om du använder sektioner från OCT-inbäddade organoider rekommenderar vi att du använder 12 μm sektioner. Ta bort OCT genom att skaka bilden i PBS i 30 min. Gå vidare till steg 7.2.- Inkubera i 5 minuter i xylen. Upprepa detta två gånger till. Inkubera sedan i 10 minuter i 100% etanol. Upprepa detta en gång till.
- Inkubera i 10 minuter i 95% etanol. Upprepa en gång till. Tvätta sektionerna i destillerat vatten i 5 min, två gånger.
- För antigenavmaskering, nedsänka objektglas i 1x citratavmaskeringslösning (materialtabell) och mikrovågsugn vid underkokningstemperatur i 10 minuter. Se till att inte låta lösningen koka.
OBS: Detta uppnås bäst om mikrovågsugn initialt i ~ 2 minuter tills kokning inträffar, sedan sänker kraften och tittar på för att säkerställa att lösningen inte kokar över. Den föredragna avmaskeringstemperaturen är strax under 100 °C, helst 98 °C. - Låt bilderna svalna i 30 min vid RT i 1x citratavmaskeringslösningen.
OBS: Detta är samma 1x citratlösning; Lösningen behöver inte bytas ut i detta steg. - Tvätta bilderna i destillerat vatten i 5 min, två gånger.
- Tvätta bilderna i 1x TBST (Tris-buffrad saltlösning med 0,1% Tween 20) buffert i 5 min.
- Ta bort bilderna från TBST och torka dem försiktigt runt vävnadssektioner med en laboratorierengöringsservett medan du är försiktig så att du inte låter vävnadssektionen torka. När bilden är tillräckligt torr, cirkel vävnadssektioner med en hydrofob barriärpenna.
- Blockera varje sektion med 100-400 μL 10% serumblockerande lösning i 1 h vid RT. Välj serumblockerande lösning baserat på den sekundära antikroppen. Till exempel, om du använder en sekundär antikropp tillverkad i åsna, använd ett 10% normalt åsneserum i 1x TBST.
- Ta bort blockeringslösningen och tillsätt sedan 100-400 μl primär antikropp utspädd till önskad koncentration i blockeringslösningen.
- Vid 4 °C inkubera sektionerna med den primära antikroppen över natten.
- Ta bort den primära antikroppslösningen och tvätta objektglasen i 1x TBST i 5 min, tre gånger.
- Tillsätt 100–400 μl sekundär antikropp (1:1000 utspädning i blockerande lösning eller enligt tillverkarens anvisningar) till varje sektion och inkubera i 1,5 timmar vid RT.
- Tvätta bilderna i 1x TBST i 5 min, två gånger. Tvätta sedan bilderna i 1x PBS i 5 min.
- Ta bort bilderna från PBS och torka dem runt vävnadssektioner med en laboratorierengöringsservett. Tillsätt några droppar flytande härdningsfäste och montera försiktigt en glaskåpa. När bilderna är torra, förvara vid -20 °C skyddade från ljus tills de är klara för avbildning.
8. Immunhistokemi
- De-paraffinisera och rehydrera de paraffininbäddade vävnadssektionerna med hjälp av en glidfärgningsskål, enligt följande steg.
OBS: Om du använder sektioner från OCT-inbäddade organoider, ta bort OCT genom att skaka bilden i PBS i 30 minuter. Gå vidare till steg 8.2.- Inkubera i 5 minuter i xylen. Upprepa ytterligare två gånger.
- Inkubera i 10 min i 100% etanol. Upprepa en gång till.
- Inkubera i 10 minuter i 95% etanol. Upprepa en gång till.
- Tvätta sektionerna i destillerat vatten i 5 min, två gånger.
- För antigenavmaskering, nedsänk bilder i 1x citrat avmaskeringslösning och mikrovågsugn vid underkokningstemperatur i 10 min. Se till att inte låta lösningen koka.
- Låt diabilderna svalna i 30 min vid RT i 1x citratavmaskeringslösningen.
- Tvätta bilderna i 5 min i destillerat vatten, tre gånger.
- Inkubera objektglasen i 10 minuter i 3% väteperoxid.
- Tvätta bilderna i 5 min i destillerat vatten två gånger.
- Tvätta bilderna i 5 min i 1x TBST.
- Ta bort bilderna från 1x TBST och använd sedan hörnet av en laboratorierengöringsservett för att försiktigt torka runt vävnadssektioner.
- Cirkla vävnadssektionerna med en hydrofob barriärpenna när bilden är torr.
- Placera 100–400 μl av blockeringslösningen på varje sektion inom den hydrofoba barriärpennans cirkel vid RT i 1 timme. Använd antingen 10% normalt åsneserum (NDS) eller 0,75% bovint serumalbumin (BSA) utspätt i 1x TBST.
- Ta sedan bort blockeringslösningen och tillsätt 100-400 μL av den primära antikroppen till varje sektion. Späd denna primära antikropp till önskad koncentration med lämplig tillverkares utspädningsmedel.
- Inkubera sektionerna vid 4 °C över natten. Ta bort den primära antikroppslösningen och tvätta objektglasen i 1x TBST i 5 min, tre gånger.
- Tillsätt 100-400 μL IHC-detektionsreagens till varje sektion och inkubera i 1 timme vid RT. Välj IHC-detektionsreagenset enligt den primära antikroppen.
- Tvätta varje sektion med 1x TBST i 5 min, två gånger, följt av 1x PBS i 5 min en gång.
- Förbered 3,3-Diaminobenzidine (DAB) lösning enligt tillverkarens anvisningar. Tillsätt 100-400 μl DAB-lösning till varje vävnadssektion och övervaka noggrant under ett mikroskop. Mellan 1-10 min ger acceptabel färgningsintensitet; Var noga med att notera den här gången och håll dig konsekvent för alla vävnadssektioner.
- Efter önskad färgningsintensitet har uppnåtts, sänk ner bilderna i destillerat vatten.
- Utför hematoxylinmotfärgning och gliduttorkning för montering enligt anvisningarna i tabell 4.
- Ta bort bilden från xylensubstitutet (Materialtabell) och torka av extra vätska runt vävnadsdelen med en rengöringsservett för laboratorier. Använd en liten mängd permanent monteringsmedium för att montera täckglas över vävnadssektionen och låt torka.
9. Mätning av total cellviabilitet
- Överför varje organoid till ett 2 ml rör och ta försiktigt bort alla överflödiga medier runt organoiden med hjälp av en liten pipettspets (se figur 3 för schemat för denna procedur).
OBS: Cellviabilitetsanalyser måste utföras med organoider som gjordes med identiskt antal celler. Detta experiment bör inte utföras på organoider gjorda direkt från patientprover från kirurgi, från skärning av alredyformade organoider eller andra fall där enstaka celler inte filtrerades och räknades. - Förbered det självlysande cellviabilitetsanalysreagenset och 1x PBS i förhållandet 1: 1 och tillsätt 500 μL till varje rör.
- Använd en p1000 pipettspets för att aggressivt pipettera upp och ner för att bryta ner organoiden och låt sitta i 5 min. Organoiden bör vara något dissocierad och mjukare nu; Upprepa blandningen med P1000-pipettspetsen igen.
- Målet är att ha 100 μL total volym per brunn av en 96-brunnsplatta. Tillsätt 25 μl av blandningen från steg 9.3 (tillräckligt för flera tekniska replikat) och tillsätt 75 μl återstående analys av självlysande cellviabilitet och PBS-blandning.
- Lägg tallriken på en shaker i 2 min och inkubera sedan i 20 min vid RT.
- Läs av plattan med hjälp av en luminiscensinställning på en plattläsare och samla in data (se figur 4).
Representative Results
Figur 1 visar tidig organoidtillväxt sett via ljusmikroskopi vid 10x förstoring. Figur 1A visar migrering och invasion av enskilda celler genom lrECM i mittvyn. Cellerna kommer att fortsätta att expandera och "kolonisera" lrECM, och de kommer att se mer täta och så småningom ogenomskinliga ut genom visuell inspektion. Figur 1B visar flera mogna organoider (vid 7 veckor) utan förstoring, i förhållande till storleken på en krona.
Figur 2 visar immunohistokemisk färgning av GBM-organoider för fosfo-histon H3, en markör för aktiv spridning. De flesta starkt proliferativa celler ses i organoidomkretsen jämfört med organoidkärnan. Positiv färgning kommer att ha ett brunt / kopparutseende.
Figur 3 beskriver processen för att homogenisera och mäta det totala cellantalet i GBM-organoider med hjälp av en 3D-specifik luminescerande cellviabilitetsanalys. På grund av det stora antalet celler som finns i GBM-organoider homogeniseras den större organoidstrukturen initialt genom triturering i självlysande analysreagens. Därefter laddas fraktioner av det totala organoidlysatet i enskilda brunnar och späds ut med ytterligare självlysande analysreagens före inkubation och avläsning på en lämplig flerbrunnsplattläsare.
Figur 4 representerar DMSO-kontrolldata (common vehicle) för organoider. Plottade data visar intraorganoid och interorganoid konsistens. Luminescerande viabilitetsdata normaliseras vanligtvis till kontroller för varje prov när experimentella data genereras.
Figur 1: Visa genom ett ljusmikroskop (10x). (A) Tidig organoidtillväxt som visar migration / invasion av GBM-celler i hela den lamininrika extracellulära matrisen. (B) Mogna organoider i förhållande till storleken på en krona. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Immunohistokemi av GBM-organoider. (A, B) GBM-organoider som visar fosfo-histon H3-färgade celler för aktiv spridning. Skalstänger är 600 μm och 300 μm för A respektive B. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Protokoll för luminescerande cellviabilitet för organoider. (A) Flytta enskilda organoider till små centrifugrör och ta bort överflödiga medier. (B) Tillsätt 500 μl 1:1 PBS och en blandning av analys av luminescerande cellviabilitet i varje rör och pipettera aggressivt för att bryta ner organoiden. (C) Tillsätt 25 μl av denna organoidblandning och 75 μl av samma 1:1 PBS och luminescerande cellviabilitetsanalysblandning till varje brunn på en 96-brunnsplatta. (D) Placera på en skakapparat i 2 minuter, följt av inkubation i 20 minuter vid RT, och läs sedan luminiscensen på en plattläsare. Figur gjord med BioRender.com. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 4: Cellviabilitet. Cellviabilitetsdata för organoider i 0,1% dimetylsulfoxid (DMSO) för sex tekniska replikat av fyra organoider för fyra patientprover. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Komponent | Kvantitet |
| Neurobasalt medium minus fenolrött | 500 ml |
| B-27 tillskott minus vitamin A (50x) | 10 ml |
| Antibiotika-antimykotiska (100x) | 5 ml |
| Natriumpyruvat (100 mM) | 5 ml |
| Glutamin i 0,85% NaCl (200 mM) | 5 ml |
| Rekombinant humant FGF basiskt (250 μg/ml) | 20 μl |
| Rekombinant humant EFG-protein (250 μg/ml) | 20 μl |
| Fenolröd | 500 μl |
Tabell 1: Neurobasal medium komplett (NBMc) formulering
| Reagens | Tid |
| 50% etanol | 3 minuter |
| 75% etanol | 3 minuter |
| 95% etanol | 3 minuter |
| 95% etanol | 4 minuter |
| 100% etanol | 2 minuter |
| 100% etanol | 3 minuter |
| 100% etanol | 4 minuter |
| Xylen ersättare | 2 minuter |
| Xylen ersättare | 3 minuter |
| Xylen ersättare | 4 minuter |
| Paraffinvax | 15 minuter |
| Paraffinvax | 15 minuter |
Tabell 2: Bearbetningsschema för små organoider (under 3 mm i diameter)
| Reagens | Tid |
| 50% etanol | 6 minuter |
| 75% etanol | 6 minuter |
| 95% etanol | 5 minuter |
| 95% etanol | 8 minuter |
| 100% etanol | 5 minuter |
| 100% etanol | 5 minuter |
| 100% etanol | 8 minuter |
| Xylen ersättare | 5 minuter |
| Xylen ersättare | 5 minuter |
| Xylen ersättare | 8 minuter |
| Paraffinvax | 30 minuter |
| Paraffinvax | 30 minuter |
Tabell 3: Bearbetningsschema för stora organoider (över 3 mm i diameter)
| Reagens | Tid |
| Hematoxylin | 2 minuter |
| Löpande diH2O | 2 minuter |
| Nukleärt hematoxylinklarande reagens | 1 minuter |
| Löpande diH2O | 1 minuter |
| Bluing reagens | 1 minuter |
| Löpande diH2O | 2 minuter |
| 70% etanol | 1 minuter |
| 100% etanol | 1 minuter |
| 100% etanol | 1 minuter |
| Xylen ersättare | 2 minuter |
| Xylen ersättare | 2 minuter |
Tabell 4: Hematoxylinmotfärg
Discussion
GBM-organoider är en kompletterande odlingsmetod till traditionella sfärer som inkluderar större cellulär och mikromiljö heterogenitet 4,22,30. Även om det är mer tids- och resurskrävande kan organoidkultur erbjuda värdefull insikt i intratumörbeteende och mekanismer för läkemedelsresistens.
GBM drivs av en befolkning av CSC 5,31, och dessa metoder utvecklades för att möjliggöra fortsatt tillväxt och självförnyelse av denna CSC-befolkning. Epidermal tillväxtfaktor (EGF) och fibroblasttillväxtfaktor (FGF) är kända för att förbättra stamcellsunderhåll och tillväxt och ge aktiv receptortyrosinkinas (RTK) signalering. Bildandet av heterogena cellulära populationer och distinkta tumörmikromiljöer inom GBM-tumörer är beroende av att stödja CSC-beteenden. Valet av en lrECM efterliknar den lamininrika hjärnmiljön och stöder cellerna i organoidkulturen att självorganisera och migrera genom invasion. Även om vissa grupper har etablerat organoidkultur utan användning av ett lrECM- eller EGF / FGF-berikat media24,28, vilket kan erbjuda ett mer tidseffektivt sätt för denna odlingsmetod och starkare urval av onkogen signalering för att driva tillväxt, valdes dessa metoder för att optimera pro-stamcellsmiljön för att bäst fastställa organoidernas cellulära heterogenitet. Både cerebrala organoider och GBM-organoider har gjorts med lrECM i litteraturen tidigare 21,32,33. Även om vi har etablerat data om tumörpopulationerna som finns inom organoider och den rumsliga variationen, är mindre känt om icke-tumörpopulationer inom organoiderna och hur länge de överlever från de ursprungliga patientproverna. Vissa IHC-fläckar (som CD45) kan ge dessa data och kan vara en intressant forskningspunkt i framtiden med organoider.
Att känna till den avsedda användningen för organoidkultur är viktigt för att välja lämpliga metoder. Att etablera organoider från primära prover kontra växande enhetliga organoider för specifika experiment har något olika procedurer. Att ha en uppskattning för hur organoider mognar och visuellt fyller i lrECM-ställningen är viktigt för att kunna avsätta rätt tid och resurser till organoidkultur. Glesa regioner av celler i organoider kommer långsamt att expandera och växa för att fylla lrECM, vilket kan ta allt från 2-8 veckor, beroende på provets beteende. Denna tillväxttakt är något inneboende för varje exemplar; Det bevaras över olika partier av organoider och ganska förenligt med den relativa hastigheten för sfärtillväxt. Organoider kan bibehållas i över 1 år och behålla tumörbildningsförmåga på xenograft till möss; Det rekommenderas dock att odla dem med ett tydligt syfte att inte slösa bort laboratorieresurser (både material och tid)4. Organoidtillväxt har testats i flera brunnsstorlekar och format och visar att en 10 cm platta är den perfekta inställningen för att upprätthålla optimal cellviabilitet, följt av en 6-brunnsplatta med tre organoider per brunn34. Organoider konsumerar mer media jämfört med deras tvådimensionella kulturmotsvarigheter, och att använda ett mindre brunnformat leder inte till korrekt underhåll. Till exempel har en brunn i en 96-brunnsformatplatta inte tillräckligt med utrymme eller medievolym i förhållande till storleken på en organoid för att upprätthålla organoidtillväxt.
Som organoider etablerar är det viktigt att vara observant för att öka framgången. Inledningsvis kommer organoider att konsumera media långsamt, men när de blir tätare och mer mogna kommer de att konsumera media snabbare. Att lägga till fenolrött i media kan hjälpa till att fungera som en indikator på mediekonsumtion. När mediet är mer gult kan det få oss att justera matningsmönstret, oavsett om det är att utbyta en högre volym media, öka den totala mediemängden i plattan, dela organoider mellan flera cellodlingsplattor för att hålla jämna steg med deras tillväxt eller till och med justera tidslinjen för experiment.
På många sätt är organoider ett ineffektivt sätt att bedriva cancerforskning. De involverar långa tidsskalor och är dyra och resurstunga jämfört med GBM-sfärkulturen. Men jämfört med patient-härledda xenografter, en alternativ metod för att återskapa cellulär och mikromiljömässig mångfald, är de enklare, billigare och kontrollerbara. Val av när organoider ska användas bäst är viktigt för cancerforskare. De är inte avsedda att ersätta traditionell sfär eller vidhäftande kultur och inte att ersätta xenograftmodeller. Organoider kan, när de tillämpas på rätt vetenskaplig fråga, kombinera fördelarna med båda dessa system och kan tillåta oss att observera tumörcellbiologi som annars skulle förbli dold. Det vetenskapliga samfundet börjar bara förstå vilka inlärningsmöjligheter organoider erbjuder, men det är uppenbart att de kommer att vara ett ovärderligt verktyg i framtiden för att förstå GBM: s komplexa biologi.
Disclosures
Författarna har inga konflikter att avslöja.
Acknowledgments
Vi vill tacka Dr. Justin Lathia för hans ovärderliga råd och pågående stöd. Vi tackar också Katrina Fife, Lisa Wallace och Maya Camhi för deras utmärkta tekniska support.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3,3-Diaminobenzidine (DAB) tablets | MP Biomedicals | 08980681 | 3,3-Diaminobenzidine (DAB) tablets |
| 96-well PCR plates | ThermoFisher Scientific | 96-well PCR plates | |
| Accutase | ThermoFisher Scientific | SCR005 | Cell detachment solution |
| Antibiotic-antimycotic | ThermoFisher Scientific | 15240062 | Antibiotic-antimycotic |
| B-27 supplement minus vitamin A | ThermoFisher Scientific | 12587001 | B-27 supplement minus vitamin A (50x) |
| GelCode Blue Stain Reagent | ThermoFisher Scientific | 24590 | Bluing reagent |
| Cell strainer (70 µm) | CellTreat Scientific | 229483 | Cell strainer (70 µm) |
| CellTiter-Glo 3D | Promega | G9681 | Luminescent cell viability assay |
| Clarifier 2 | ThermoFisher Scientific | 7301 | Nuclear hematoxylin clarifying reagent |
| Clear-Rite 3 | ThermoFisher Scientific | 6901 | xylene substitute |
| Epredia Gill 2 Hematoxylin | ThermoFisher Scientific | 72504 | Hematoxylin |
| Glutamine in 0.85% NaCl | ThermoFisher Scientific | 35050061 | Glutamine in 0.85% NaCl (200 mM) |
| Matrigel | ThermoFisher Scientific | 354234 | Laminin-enriched extracellular matrix |
| Mini PAP pen | ThermoFisher Scientific | 008877 | Hydrophobic barrier pen |
| Mounting medium | ThermoFisher Scientific | 22-050-102 | Mounting medium |
| Neurobasal media minus phenol red | ThermoFisher Scientific | 12349015 | Neurobasal media minus phenol red (500 mL) |
| Normal donkey serum (NDS) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | Normal donkey serum (NDS) |
| Paraformaldehyde 4% in PBS | ThermoFisher Scientific | AAJ19943K2 | Paraformaldehyde 4% in PBS |
| Phenol red | Sigma | P0290 | Phenol red (0.5%) |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | ThermoFisher Scientific | P10144 | Liquid curing mountant |
| Recombinant human EGF protein | R&D systems | 236-EG-01M | Recombinant human EGF protein (250 µg/mL) |
| Recombinant human FGF basic | R&D systems | 4144-TC-01 | Recombinant human FGF basic (250 µg/mL) |
| SignalStain Antibody Diluent | Cell Signaling | 8112 | Antibody diluent |
| SignalStain Boost IHC Detection Reagent | Cell Signaling | 8114 | Immunohistochemistry detection reagent |
| SignalStain Citrate Unmasking Solution | Cell Signaling | 14746 | Citrate unmasking solution |
| Single edge razor blade | Uline | H-595B | Single edge razor blade |
| Sodium pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11360070 | Sodium pyruvate (100 mM) |
| Tissue-Tek Cryomolds | VWR | 25608-916 | Disposable cryomolds |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | VWR | 25608-930 | Optimal cutting temperature compound |
| Trypan Blue Stain | ThermoFisher Scientific | T10282 | Cell impermeant stain (0.4%) |
| Xylene | ThermoFisher Scientific | X3P-1GAL | Xylene |
References
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
- Heffernan, J. M., Sirianni, R. W. Modeling microenvironmental regulation of glioblastoma stem cells: a biomaterials perspective. Frontiers in Materials. 5, 7 (2018).
- Zanders, E. D., Svensson, F., Bailey, D. S. Therapy for glioblastoma: is it working. Drug Discovery Today. 24 (5), 1193-1201 (2019).
- Hubert, C. G., et al. A Three-dimensional organoid culture system derived from human glioblastomas recapitulates the hypoxic gradients and cancer stem cell heterogeneity of tumors found in vivo. Cancer Research. 76 (8), 2465-2477 (2016).
- Lathia, J. D., Heddleston, J. M., Venere, M., Rich, J. N. Deadly teamwork: neural cancer stem cells and the tumor microenvironment. Cell Stem Cell. 8 (5), 482-485 (2011).
- Meyer, M., et al. Single cell-derived clonal analysis of human glioblastoma links functional and genomic heterogeneity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 851-856 (2015).
- Bao, S., et al. Stem cell-like glioma cells promote tumor angiogenesis through vascular endothelial growth factor. Cancer Research. 66 (16), 7843-7848 (2006).
- Yu, S. C., Bian, X. W. Enrichment of cancer stem cells based on heterogeneity of invasiveness. Stem Cell Reviews and Reports. 5 (1), 66-71 (2009).
- Bao, S., et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).
- Vescovi, A. L., Galli, R., Reynolds, B. A.
- Zhu, T. S., et al. Endothelial cells create a stem cell niche in glioblastoma by providing NOTCH ligands that nurture self-renewal of cancer stem-like cells. Cancer Research. 71 (18), 6061-6072 (2011).
- Calabrese, C., et al. A perivascular niche for brain tumor stem cells. Cancer Cell. 11 (1), 69-82 (2007).
- Charles, N., et al. Perivascular nitric oxide activates notch signaling and promotes stem-like character in PDGF-induced glioma cells. Cell Stem Cell. 6 (2), 141-152 (2010).
- Seidel, S., et al. A hypoxic niche regulates glioblastoma stem cells through hypoxia inducible factor 2 alpha. Brain. 133, 983-995 (2010).
- Yan, K., et al. Glioma cancer stem cells secrete Gremlin1 to promote their maintenance within the tumor hierarchy. Genes & Development. 28 (10), 1085-1100 (2014).
- Cheng, L., et al. Glioblastoma stem cells generate vascular pericytes to support vessel function and tumor growth. Cell. 153 (1), 139-152 (2013).
- Flavahan, W. A., et al. Brain tumor initiating cells adapt to restricted nutrition through preferential glucose uptake. Nature Neuroscience. 16 (10), 1373-1382 (2013).
- Hjelmeland, A. B., et al. Acidic stress promotes a glioma stem cell phenotype. Cell Death and Differentiation. 18 (5), 829-840 (2011).
- Bar, E. E., Lin, A., Mahairaki, V., Matsui, W., Eberhart, C. G. Hypoxia increases the expression of stem-cell markers and promotes clonogenicity in glioblastoma neurospheres. The American Journal of Pathology. 177 (3), 1491-1502 (2010).
- Li, Z., et al. Hypoxia-inducible factors regulate tumorigenic capacity of glioma stem cells. Cancer Cell. 15 (6), 501-513 (2009).
- Azzarelli, R., Ori, M., Philpott, A., Simons, B. D. Three-dimensional model of glioblastoma by co-culturing tumor stem cells with human brain organoids. Biology Open. 10 (2), 056416 (2021).
- Linkous, A., et al. Modeling patient-derived glioblastoma with cerebral organoids. Cell Reports. 26 (12), 3203-3211 (2019).
- da Silva, B., Mathew, R. K., Polson, E. S., Williams, J., Wurdak, H. Spontaneous glioblastoma spheroid infiltration of early-stage cerebral organoids models brain tumor invasion. SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R & D. 23 (8), 862-868 (2018).
- Jacob, F., et al. A Patient-derived glioblastoma organoid model and biobank recapitulates inter- and intra-tumoral heterogeneity. Cell. 180 (1), 188-204 (2020).
- Boretto, M., et al. Patient-derived organoids from endometrial disease capture clinical heterogeneity and are amenable to drug screening. Nature Cell Biology. 21 (8), 1041-1051 (2019).
- Huang, L., et al. Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell-and patient-derived tumor organoids. Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).
- Ledur, P. F., Onzi, G. R., Zong, H., Lenz, G. Culture conditions defining glioblastoma cells behavior: what is the impact for novel discoveries. Oncotarget. 8 (40), 69185-69197 (2017).
- Lenin, S., et al. A drug screening pipeline using 2D and 3D patient-derived in vitro models for preclinical analysis of therapy response in glioblastoma. International Journal of Molecular Sciences. 22 (9), 4322 (2021).
- Rybin, M. J., Ivan, M. E., Ayad, N. G., Zeier, Z. Organoid models of glioblastoma and their role in drug discovery. Frontiers in Cellular Neuroscience. 15 (4), 605255 (2021).
- Shakya, S., et al. Altered lipid metabolism marks glioblastoma stem and non-stem cells in separate tumor niches. Acta Neuropathologica Communications. 9 (1), 101 (2021).
- Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
- Bian, S., et al. Genetically engineered cerebral organoids model brain tumor formation. Nature Methods. 15 (8), 631-639 (2018).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
- Sundar, S. J., et al. Three-dimensional organoid culture unveils resistance to clinical therapies in adult and pediatric glioblastoma. Translational Oncology. 15 (1), 101251 (2021).
