Summary
Qui, presentiamo tre protocolli di analisi dei dati per l'angiografia fluoresceina (FA) e le immagini di tomografia a coerenza ottica (OCT) nello studio dell'occlusione venosa retinica (RVO).
Abstract
I progressi negli strumenti di imaging oftalmico offrono un livello senza precedenti di accesso ai ricercatori che lavorano con modelli animali di lesioni neurovascolari. Per sfruttare correttamente questa maggiore traducibilità, è necessario escogitare metodi riproducibili per estrarre dati quantitativi da queste immagini. La tomografia a coerenza ottica (OCT) può risolvere l'istologia retinica con risoluzione micrometrica e rivelare differenze funzionali nel flusso sanguigno vascolare. Qui, delineiamo letture vascolari non invasive che utilizziamo per caratterizzare il danno patologico post insulto vascolare in un modello murino ottimizzato di occlusione venosa retinica (RVO). Queste letture includono l'analisi di imaging dal vivo della morfologia retinica, la disorganizzazione degli strati interni della retina (DRIL) misura dell'ischemia capillare e misure di fluorangiografia dell'edema retinico e della densità vascolare. Queste tecniche corrispondono direttamente a quelle utilizzate per esaminare i pazienti con malattia retinica nella clinica. La standardizzazione di questi metodi consente il confronto diretto e riproducibile di modelli animali con fenotipi clinici di malattia oftalmica, aumentando il potere traslazionale dei modelli di danno vascolare.
Introduction
La malattia neurovascolare è un grave problema sanitario responsabile dell'ictus ischemico, una delle principali cause di mortalità e morbilità, e delle malattie vascolari retiniche che portano alla perdita della vista 1,2. Per modellare la malattia neurovascolare, utilizziamo un modello murino di occlusione venosa retinica (RVO). Questo modello non è invasivo e utilizza tecniche di imaging in vivo simili a quelle utilizzate per esaminare le persone con malattia vascolare retinica in un contesto clinico. L'uso di questo modello aumenta quindi il potenziale traslazionale degli studi che utilizzano questo modello. Come per tutti i modelli di mouse, è fondamentale massimizzare la riproducibilità del modello.
Le malattie vascolari retiniche sono una delle principali cause di perdita della vista nelle persone di età inferiore ai 70 anni. RVO è la seconda malattia vascolare retinica più comune dopo la retinopatia diabetica3. Le caratteristiche cliniche della RVO includono lesioni ischemiche, edema retinico e perdita della vista come conseguenza della perdita neuronale 3,4. Modelli murini di RVO che utilizzano la fotocoagulazione laser dei vasi principali sono stati sviluppati e perfezionati per replicare le principali patologie cliniche osservate nella RVO umana 5,6,7. I progressi nell'imaging oftalmico consentono anche la replicazione di strumenti diagnostici non invasivi utilizzati negli esseri umani, vale a dire l'angiografia con fluoresceina (FA) e la tomografia a coerenza ottica (OCT)6. La fluorangiografia consente l'osservazione delle perdite dovute alla rottura della barriera emato-retinica (BRB) e della dinamica del flusso sanguigno nella retina, compresi i siti di occlusione, utilizzando l'iniezione di fluoresceina, un piccolo colorante fluorescente 8,9. L'imaging OCT consente l'acquisizione di immagini in sezione trasversale ad alta risoluzione della retina e lo studio dello spessore e dell'organizzazione degli strati retinici10. L'analisi delle immagini FA è stata storicamente in gran parte qualitativa, il che limita il potenziale di confronto diretto e riproducibile tra gli studi. Recentemente, sono stati sviluppati diversi metodi per la quantificazione dello spessore dello strato nell'imaging OCT, sebbene attualmente non esista un protocollo di analisi standardizzato e il sito di acquisizione delle immagini OCT varia11. Per sfruttare correttamente questi strumenti, è necessaria una metodologia di analisi dei dati standardizzata, quantitativa e replicabile. In questo articolo, presentiamo tre di queste letture vascolari utilizzate per valutare il danno patologico in un modello murino di perdita di RVO-fluoresceina, spessore dello strato OCT e disorganizzazione degli strati retinici.
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Protocol
Questo protocollo segue la dichiarazione dell'Associazione per la ricerca in visione e oftalmologia (ARVO) per l'uso di animali nella ricerca oftalmica e visiva. Gli esperimenti sui roditori sono stati approvati e monitorati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Columbia University.
NOTA: L'imaging è stato eseguito su topi maschi C57BL / 6J di 2 mesi che pesavano circa 23 g.
1. Preparazione di reagenti per l'imaging retinico
- Preparazione di soluzione iniettabile di fluoresceina.
NOTA: La fluoresceina è molto sensibile alla luce. Proteggere dalla luce e utilizzarlo poco dopo la preparazione.- Diluire la fluoresceina ad una concentrazione dell'1% in soluzione salina sterile.
- Preparazione di ketamina / xilazina
- Diluire Ketamina e Xilazina in soluzione salina sterile di conseguenza per la seguente concentrazione: Ketamina (80-100 mg/kg) e Xilazina (5-10 mg/kg).
- Soluzione salina sterile
- Preparare una siringa da 5 mL con un ago da 26 G con soluzione salina sterile.
2. OCT e imaging con fluoresceina
- Accendere la lightbox del microscopio per l'imaging retinico, la macchina OCT e la piattaforma del mouse riscaldata.
- Accendere il computer e aprire il programma di imaging.
- Aggiungere una goccia di fenilefrina e tropicamide a ciascun occhio.
- Iniettare 150 μL di anestesia (ketamina (80-100 mg/kg) e xilazina (5-10 mg/kg)) per via intraperitoneale (IP). Determinare la profondità dell'anestesia con un pizzico di punta e attendere che l'animale non risponda. Applicare unguento oftalmico o lacrime artificiali su entrambi gli occhi.
- Posizionare il mouse sulla piattaforma.
- Regolare l'altezza e l'angolazione della piattaforma fino a quando la vista del fondo retinico è chiara e focalizzata. Scatta una foto del fondo.
- Aprire il software di acquisizione delle immagini e dello Strumento di personalizzazione di Office. Nel programma dello Strumento di personalizzazione di Office regolare nudge su 5.
- Prendere un'immagine OCT a 75 μm distale dalla bruciatura. Ripetere per gli altri tre quadranti della retina.
- Iniettare 100 μL di fluoresceina IP all'1%.
- Passare la fotocamera a un filtro a 488 nm. Aumentare il guadagno della fotocamera a 5.
- Scatta una foto del fondo oculare esattamente 5 minuti dopo l'iniezione di fluoresceina.
NOTA: Evitare l'esposizione prolungata dell'occhio alla luce della fotocamera alla massima impostazione, poiché la fluoresceina può esacerbare il fotodanno alla retina. Tenere la sorgente luminosa spenta fino a quando non sono trascorsi i 5 minuti di attesa e il mouse è pronto per l'imaging.
3. Assistenza post-vendita
- Iniettare 1 mL di IP salino sterile. Applicare colliri lubrificanti su entrambi gli occhi. Applicare unguento oftalmico o lacrime artificiali su entrambi gli occhi.
- Osserva il topo mentre si riprende dall'anestesia. Tornare nella gabbia con altri animali solo quando si è completamente ristabiliti, generalmente dopo circa 40 minuti.
4. Valutazione dei criteri di esclusione
- Aprire l'immagine del fondo oculare scattata 24 ore dopo la procedura per valutare i criteri di esclusione. Escludere l'occhio se viene identificato uno dei seguenti criteri.
- Valutare se l'immagine ha zero occlusioni
- Valutare l'immagine per il numero di vasi occlusi.
NOTA: Un'occlusione di successo di solito ha una pigmentazione viola sopra o intorno alla bruciatura, vaso molto sottile o discontinuo attraverso l'ustione, aspetto del vaso debole o inesistente al di fuori dell'area bruciata e scolorimento retinico da ipossia. Se l'intero vaso può essere visto attraverso la bruciatura bianca dal laser, il vaso non è riuscito a occludere. A volte il vaso apparirà parzialmente ostruito, ma se sembra ininterrotto al di fuori della bruciatura, il vaso probabilmente non si è occluso. - Per i casi ambigui, utilizzare l'imaging FA allo stesso tempo per valutare le occlusioni. In queste immagini, un'occlusione apparirà come una rottura nella continuità di un vaso, spesso con un rastremamento del vaso circostante.
- Se vengono identificate zero occlusioni, escludere l'occhio dall'analisi, poiché la RVO è considerata inefficace.
NOTA: Le occlusioni si risolvono tipicamente entro 48-72 ore dopo la RVO e la presenza di occlusioni non dovrebbe più essere utilizzata come criterio di esclusione in questi momenti.
- Valutare l'immagine per il numero di vasi occlusi.
- Valutare le immagini del fondo oculare e dell'OCT per un eccessivo distacco di retina
NOTA: L'accumulo di liquido sottoretinico è comune dopo l'induzione di RVO e causa la separazione della retina neurale dall'RPE. I criteri di esclusione per un eccessivo distacco di retina sono definiti come segue: l'OCT sarà completamente invisibile o alcuni strati appariranno incredibilmente distorti. La qualità dell'immagine è scarsa, con una perdita di risoluzione degli strati plessiformi esterni e RPE. La separazione tra la retina neurale e la coroide è maggiore di quanto consentito dal campo visivo OCT. Sull'immagine del fondo oculare, il tono della retina sarà quasi completamente bianco, con qualche macchia viola. Parte della retina può apparire distorta e fuori fuoco. Questo perché si è staccato e si trova a una distanza focale diversa rispetto al resto della retina.- Se la valutazione delle immagini da un occhio determina un distacco periferico o completo della retina, escludere l'occhio dall'analisi.
- Escludere immagini con evidenza di cataratta corneale
NOTA: Una cataratta corneale appare come un punto bianco opaco sulla cornea del topo. La cataratta si verifica tipicamente a causa di una lubrificazione insufficiente degli occhi mentre l'animale è anestetizzato e può essere in gran parte evitato avendo cura di applicare generosamente unguento oculare. La cataratta può generalmente essere identificata prima dell'imaging ispezionando l'animale. I topi che hanno sviluppato la cataratta dovrebbero essere esclusi dal set di dati senza dover sottoporsi al processo di imaging. Nell'imaging, la cataratta oscurerà la retina dalla fotocamera e l'OCT apparirà deformato. - Valutare l'immagine per un'emorragia eccessiva
NOTA: L'emorragia eccessiva può essere identificata come quantità di liquido rosso nell'immagine, di solito oscurando lo sfondo retinico, il vaso e l'ustione. Queste aree di fluido rosso saranno di un rosso più luminoso e opaco rispetto alle chiazze viola che sono normali in RVO di successo. Le emorragie si manifestano nello strato di cellule gangliari sull'imaging OCT e interferiscono con la capacità di visualizzare altri strati retinici sotto l'emorragia.- Se l'immagine è determinata per avere un'emorragia eccessiva, escludere l'occhio dall'analisi.
5. Elaborazione delle immagini di fluoresceina
- Aprire l'immagine della fluoresceina nel software di elaborazione delle immagini.
- Duplicare l'immagine
- Utilizzando uno strumento di selezione, tracciare attentamente le navi principali.
- I vasi principali sono le vene e le arterie più spesse che si irradiano dal disco ottico. Ignorare tutte le navi che si diramano da queste navi.
- Se la perdita impedisce di vedere il contorno del recipiente vicino al sito di occlusione, tracciare attraverso la perdita nella posizione approssimativa del recipiente (mantenere lo spessore, collegare l'ultimo punto visibile al successivo punto visibile).
- Nella prima immagine, eliminare la selezione, lasciando solo lo sfondo. Salva questa immagine mascherata.
- Spostare la selezione sulla seconda immagine, invertire la selezione ed eliminare, isolando i vasi. Salva questa immagine mascherata.
- Aprire le due immagini in ImageJ. Aprire l'immagine di sfondo e misurare la densità integrata.
- Aprire l'immagine della nave, selezionare il contorno dei vasi e quindi misurare l'intensità media.
- Dividere la densità integrata dello sfondo per l'intensità media dei vasi, generando il rapporto di perdita per l'occhio.
- Registrare questo rapporto di perdita per ciascun occhio in una coorte sperimentale.
- Per controllare ulteriormente lo sfondo, normalizzare gli occhi sperimentali al rapporto medio di perdita degli occhi di controllo illesi.
NOTA: Al fine di creare una quantificazione standardizzata della perdita di fluoresceina nell'immagine FA, questo calcolo utilizza un rapporto tra la densità di fondo (dove sarà presente la perdita) con la luminosità dei principali recipienti per creare risultati che controllano la variazione di luminosità da immagine a immagine e possono essere quantificati in modo affidabile. Gli occhi che non sono danneggiati non hanno perdite e dovrebbero teoricamente avere rapporti pari a zero. I rapporti calcolati da questi occhi di controllo non danneggiati, quindi, rappresentano il rumore di fondo e questo valore viene utilizzato per normalizzare ulteriormente i valori sperimentali.
6. Spessore dello strato retinico
- Aprire l'immagine dello Strumento di personalizzazione di Office nel software di elaborazione delle immagini.
- Traccia i bordi dello strato di cellule ganglionari, dello strato plessiforme interno, dello strato nucleare interno, dello strato plessiforme esterno, dello strato fotorecettore e dello strato RPE. Misurare lo spessore medio di ogni strato.
- Ripetere l'operazione per le immagini OCT degli altri tre quadranti della retina. Calcola la media degli spessori dello strato nei quattro quadranti per ottenere lo spessore medio di ciascuno strato retinico per l'occhio.
- Ripetere l'operazione per ciascun occhio nella coorte sperimentale.
7. Disorganizzazione degli strati interni della retina (DRIL)
- Aprire l'immagine dello Strumento di personalizzazione di Office in ImageJ.
- Utilizzando lo strumento linea, misurate la distanza in cui il bordo superiore dello strato plessiforme esterno è indistinto.
NOTA: è importante distinguere tra DRIL e aree di scarsa visibilità dello strato causate da artefatti di imaging. Una scarsa qualità dell'immagine OCT può invalidare un occhio per l'analisi DRIL se non è possibile una risoluzione sufficiente dell'immagine. Le immagini con DRIL avranno in genere altre regioni o strati retinici chiaramente risolti e organizzati, il che può essere un buon indicatore di una qualità dell'immagine sufficiente.- Misurare orizzontalmente dalla latitudine in cui inizia la disorganizzazione alla latitudine in cui il bordo superiore dello strato plessiforme esterno diventa nuovamente visibile, se non del tutto. Anche se lo strato plessiforme esterno si sposta verticalmente verso l'alto o verso il basso, misurare perfettamente orizzontalmente.
- Ci possono essere più aree di disorganizzazione separate da aree senza disorganizzazione. Misurateli singolarmente e calcolate la somma delle distanze.
- Dividere la lunghezza della disorganizzazione per la lunghezza totale della retina visibile in ciascuna immagine OCT per ottenere il rapporto di disorganizzazione per l'immagine.
- Ripetere la misurazione e il calcolo per le immagini OCT dagli altri tre quadranti della retina.
- Prendiamo la media dei rapporti di disorganizzazione dalle quattro immagini dello Strumento di personalizzazione di Office. Questo numero rappresenta la disorganizzazione media per l'intera retina. Ripetere l'operazione per ciascun occhio nella coorte sperimentale.
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Representative Results
Questi metodi di analisi consentono la quantificazione della patologia retinica catturata dall'imaging FA e OCT. Gli esperimenti da cui vengono estratti i dati rappresentativi hanno utilizzato topi maschi C57BL / 6J che sono serviti come controlli illesi o sono stati sottoposti alla procedura RVO e hanno ricevuto colliri di trattamento Pen1-XBir3 o colliri di veicoli Pen1-Saline. Il modello di lesione RVO ha coinvolto l'irradiazione laser (532 nm) delle vene principali in ciascun occhio di un topo anestetizzato a seguito di un'iniezione di vena della coda di rosa bengala, un colorante fotoattivatore12. Tre impulsi laser sono stati erogati a una distanza media di 375 μm dal centro del nervo ottico per indurre la fotocoagulazione e occludere i vasi12. L'uso efficace della procedura RVO è dimostrato in Avrutsky et al.12, e ulteriori dettagli sull'ottimizzazione del metodo RVO sono dettagliati in Colón Ortiz et al.13. La Figura 1A mostra esempi di immagini FA e OCT di entrambi i gruppi. A causa della natura variabile della formazione dell'occlusione e della stabilizzazione attraverso il processo di fotocoagulazione, si possono osservare diversi gradi di danno. In alcune retine, il danno indotto dalla procedura RVO introduce patologie oftalmiche che rendono le immagini retiniche inadatte all'analisi. Dopo l'acquisizione, le immagini devono prima essere valutate per i criteri di esclusione per garantire un'analisi ottimale e risultati affidabili. Questi criteri di esclusione, delineati nella Figura 1B, includono il distacco di retina, l'emorragia e la cataratta. Come si può osservare nelle immagini del fondo oculare e dell'OCT di esempio, queste patologie impediscono l'imaging OCT chiaro, rendendo le retine inadatte all'analisi dei dati. Inoltre, è possibile che alcune retine non contengano occlusioni stabili; Queste immagini non modellano accuratamente il danno ischemico-ipossico e devono essere escluse dall'analisi.
La rottura della barriera emato-retinica contribuisce alla patogenesi di RVO14,15. La valutazione della quantità di perdite dalle navi è un utile indicatore della permeabilità dei vasi indotta da lesioni. L'imaging FA consente la visualizzazione di questa perdita, ma una serie di fattori, come le differenze nella velocità di circolazione, influenzano l'intensità grezza delle immagini FA e rendono coerente la quantificazione16,17. Il nostro metodo controlla questa variabilità normalizzando l'intensità osservata nella retina all'intensità media della vascolarizzazione maggiore. Ciò fornisce un rapporto di perdita per ogni immagine retinica che può essere confrontato con altri e analizzato. La figura 2A mostra le immagini mascherate utilizzate per questo calcolo, separando la vascolarizzazione maggiore dalle altre aree della retina. La capacità di quantificare la fluoresceina consente il confronto della gravità della lesione e dell'efficacia del trattamento, nonché lo studio dei cambiamenti nella perdita nel corso del tempo della lesione (Figura 2B), che potrebbe essere un effetto troppo sottile da dimostrare con la sola segnalazione qualitativa.
L'imaging OCT consente l'analisi dell'impatto della RVO sui singoli strati retinici e sullo spessore complessivo della retina. La figura 3A mostra una delineazione degli strati della retina in un'immagine OCT. Tracciare i confini di ciascun livello (Figura 3B) consente diverse vie di analisi. La quantificazione dello spessore per ogni strato retinico si rivela utile, in quanto la risposta edematosa iniziale ha un effetto più profondo sugli strati retinici interni. Le tracce consentono anche lo studio dello spessore totale della retina e l'analisi segregata degli strati retinici interni rispetto a quelli esterni. La figura 3C fornisce un'analisi di un decorso temporale del danno RVO, in cui è possibile osservare il gonfiore infiammatorio iniziale degli strati retinici e l'eventuale assottigliamento degenerativo. Tracciare lo spessore di ogni strato nel tempo rivela dinamiche diverse per gli strati plessiformi interni e nucleari interni, dove lo strato nucleare interno sperimenta una risposta molto maggiore alla lesione iniziale, ma lo strato plessiforme interno mostra un assottigliamento più grave dopo che l'edema iniziale è stato stabilizzato e ritorna al basale (Figura 3D ). Ciò garantisce una comprensione più precisa dei driver di risposta in diversi punti temporali. Abbiamo anche testato l'efficacia di un inibitore della caspasi nel mitigare il gonfiore e proteggere da eventuali degenerazioni, con analisi che rivelano effetti diversi nei singoli strati.
La disorganizzazione degli strati retinici interni (DRIL) è un'altra caratteristica dell'OCT utilizzata come misura diagnostica dell'ischemia nella retinopatia diabetica, nonché come misura predittiva dell'acuità visiva in RVO18,19. Nell'imaging OCT, il DRIL si manifesta come una scomparsa del limite superiore dello strato plessiforme esterno12, fondendo insieme gli strati plessiformi esterni e interni (Figura 4A). La Figura 4B mostra due esempi di immagini dello Strumento di personalizzazione di Office con aree evidenziate di DRIL. Esprimiamo DRIL come percentuale della lunghezza totale della retina, con una media di quattro sezioni trasversali OCT. Questa misura ci permette di confrontare quantitativamente i gruppi sperimentali; La Figura 4C presenta un esempio di analisi, in cui la disorganizzazione retinica di due gruppi sperimentali è stata confrontata per studiare l'efficacia di un inibitore nel mitigare il danno retinico nella RVO.
Figura 1: Immagini ottenute dalla fluorangiografia (FA) e dalla tomografia a coerenza ottica (OCT). (A) Esempi di immagini FA e OCT da retine 24 ore dopo RVO e controlli illesi. (B) Imaging del fondo oculare e dell'OCT dei diversi criteri di esclusione: eccessivo distacco di retina, emorragia, cataratta corneale e assenza di occlusioni. La distanza di acquisizione degli PTOM è indicata dalla linea guida verde. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Quantificazione della perdita di fluoresceina. (A) Separazione dell'immagine FA nei vasi e sfondo per l'analisi (B) Quantificazione della perdita di fluoresceina dagli occhi di topi con occlusione venosa retinica C57BL/6J (RVO) che ricevono 10 mg di collirio inibitore di Pen1-XBir3 (N = 17) o colliri del veicolo Pen1-Saline (N = 13) a 24 ore e 48 ore dopo la procedura. La lettura dell'intensità dell'immagine di sfondo è normalizzata alla lettura dell'intensità media dall'immagine della nave. La media della lettura dell'intensità per i topi RVO è ulteriormente normalizzata ai controlli non danneggiati. Le barre di errore mostrano la media con SEM. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Quantificazione dello spessore dello strato retinico nelle immagini OCT. (A) Retina non lesa con i singoli strati retinici etichettati: strato di cellule ganglionari, strato plessiforme interno, strato nucleare interno, strato plessiforme esterno, strato fotorecettore, RPE e coroide. (B) Esempio di tracce di strati di immagini OCT prelevate da topi C57/BL6 non danneggiati e 24 ore post-RVO. (C) Quantificazione della variazione dello spessore retinico totale e dello spessore intraretinico osservata nell'imaging OCT di retine di topi C57BL/6J a 4 ore, 24 ore, 48 ore, 72 ore e 8 giorni dopo RVO. (D) Quantificazione della variazione di spessore negli strati plessiformi interni e nucleari interni delle retine di topi C57BL/6J a 24 ore, 48 ore e 8 giorni dopo la RVO per topi C57BL/6J che ricevono 10 mg di collirio inibitore di Pen1-XBir3 (N = 14) o colliri del veicolo Pen1-Saline (N = 15) immediatamente dopo la procedura RVO e 24 ore dopo la RVO. Le barre di errore mostrano la media con SEM. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Quantificazione della disorganizzazione degli strati retinici interni (DRIL) osservata nelle immagini OCT post-RVO. Nelle immagini OCT, DRIL è indicato dalla perdita di una chiara delineazione tra gli strati plessiformi interni nucleari ed esterni. (A) Esempi di sezioni della retina con e senza DRIL nell'imaging OCT. (B) Aree di DRIL nell'imaging OCT di due regioni in un topo C57BL/6J 24 ore dopo la RVO, indicate da linee bianche. Il DRIL viene misurato orizzontalmente attraverso l'immagine invece di seguire la forma della retina. (C) Quantificazione della proporzione della lunghezza retinica in cui è stato osservato DRIL a 24 ore e 48 ore post-RVO per gli occhi di topi C57BL/6J che hanno ricevuto 2,5 mg di collirio inibitore Pen1-XBir3 (N = 19) o collirio del veicolo Pen1-Saline (N = 21) dopo la procedura RVO. Le barre di errore mostrano la media con SEM. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
L'imaging retinico non invasivo dei roditori rappresenta una strada per studiare la patologia e sviluppare interventi. Studi precedenti hanno sviluppato e ottimizzato un modello murino di RVO, limitando la variabilità e consentendo una traduzione affidabile delle patologie cliniche comuni nella retina murina 5,7,13. Gli sviluppi nella tecnologia di imaging oftalmico consentono inoltre l'uso di tecniche di imaging clinico in vivo come FA e OCT negli animali da esperimento, garantendo la possibilità di confrontare modelli murini con profili di malattia umana 6,12,15. Tuttavia, per massimizzare le informazioni che possono essere estratte da queste immagini e il potenziale traslazionale complessivo del modello, sono necessari metodi quantitativi standardizzati, riproducibili e rigorosi per l'analisi delle immagini. Qui presentiamo metodi di analisi che consentono rappresentazioni quantitative della gravità del danno, consentendo confronti più precisi e affidabili tra topi e tra gruppi sperimentali. Queste analisi includono la quantificazione delle perdite nelle immagini FA, la quantificazione dello spessore medio dello strato e le aree di DRIL nelle immagini OCT.
Un fattore critico per un'analisi di successo risiede nella qualità delle immagini acquisite. Immagini OCT mal risolte possono portare a difficoltà nel tracciare i singoli strati e all'incapacità di distinguere la disorganizzazione retinica interna dalla scarsa qualità dell'immagine. Durante l'imaging, è importante fare attenzione nel posizionamento del mouse sulla piattaforma, assicurandosi che l'immagine del fondo oculare sia a fuoco, che il nervo ottico sia relativamente centrato e che la sezione trasversale retinica sia orizzontale attraverso l'immagine. Anche la lubrificazione costante degli occhi mentre l'animale è anestetizzato è importante, specialmente quando lo stesso animale viene ripreso più giorni. Una lubrificazione insufficiente può causare cataratta corneale, che oscurerà la retina e la renderà inadatta per l'imaging. Varie patologie retiniche possono verificarsi nell'imaging RVO, rendendo le immagini inadatte all'analisi. Questi includono un eccessivo distacco di retina e un'eccessiva emorragia, che, oltre a compromettere notevolmente la qualità dell'imaging, rappresentano anche un grado di danno troppo grave per essere utilizzato come modello di RVO. È inoltre possibile che tutti i vasi occlusi si riperdano completamente poco dopo l'infortunio, il che non modellerà accuratamente il danno RVO e dovrebbe essere utilizzato come criterio di esclusione. Tuttavia, è importante notare che le occlusioni riuscite si risolveranno naturalmente entro 48-72 ore dopo l'infortunio e la presenza di occlusioni come criterio di esclusione è meglio utilizzata entro 24 ore dopo la procedura. Colón Ortiz et al.13 descrivono in dettaglio le migliori pratiche per limitare la variabilità e calibrare le lesioni in un modello ottimizzato per la procedura RVO. Anche l'identificazione e il giudizio dei criteri di esclusione è un passo fondamentale per l'analisi delle immagini. Poiché questo dipende in gran parte dalla discrezione del valutatore, è importante che i valutatori siano ciechi ai gruppi di trattamento e pratichino la coerenza nel giudizio della gravità della patologia. Esistono alcune limitazioni nell'applicazione di questi metodi, in particolare nella pratica di visualizzare lo stesso mouse in più punti temporali. Esiste un limite alla frequenza alla quale un topo può essere anestetizzato per l'imaging, rendendo necessario il test e la regolazione dei punti temporali per determinare il decorso temporale ottimale. I nostri studi impiegano punti temporali di imaging a 4 ore, 24 ore, 48 ore e 8 giorni, che abbiamo trovato fasi di cattura di lesioni iniziali, risposta infiammatoria acuta e lesioni a lungo termine12. Inoltre, alcuni ceppi murini sono più inclini allo sviluppo della cataratta corneale, che includono vari modelli murini diabetici, che possono portare a un gran numero di esclusioni o corsi temporali incompleti20,21. Gli studi che utilizzano tali linee di topo potrebbero dover adattare le dimensioni del gruppo sperimentale o i punti temporali di imaging a seconda della sensibilità della cornea.
L'imaging fluorangiografico è stato ampiamente utilizzato qualitativamente per osservare e classificare patologie retiniche come perdite, nonché modelli di flusso sanguigno alterato RVO6. Recentemente, ci sono stati sforzi per sviluppare un'analisi quantitativa della FA in modelli animali, come il calcolo dell'area vascolare e della tortuosità16 e l'analisi di regressione lineare della temporalità dell'intensità dell'immagine17. La segmentazione dei vasi principali dal fondo del fondo oculare è stata precedentemente utilizzata, ma in un'analisi dei pixel delle dinamiche di riempimento e decadimento, testimoniando la variabilità dell'intensità dell'immagine in diversi topi17. Inoltre, il potenziale di distorsione è stato notato nell'interpretazione del pooling di fluoresceina17. Il metodo quantitativo qui discusso mira alla fuoriuscita di fluoresceina dalla vascolarizzazione retinica principale, indicativa della rottura del BRB, che ha dimostrato di svolgere un ruolo nel danno RVO11,12,14. Un'analisi alternativa delle perdite quantifica la perdita di colorante su supporti piatti retinici22. Tuttavia, le analisi post-mortem invasive sono meno adatte per gli studi sulla tempistica della lesione RVO all'interno di un singolo topo, in cui la perdita viene studiata in più punti temporali. Le analisi dell'area di perdita di fluoresceina in diversi stadi della malattia retinica sono state precedentemente utilizzate in studi clinici e correlate con altre patologie osservate23. Questo metodo consente di sfruttare in modo simile le immagini FA per studiare le perdite del vaso in vivo, consentendo lo studio della dinamica delle perdite all'interno della timeline della lesione RVO. Poiché la selezione dell'area di perdita si basa sulla selezione del valutatore di una regione, introduce potenzialmente una maggiore quantità di variabilità attraverso la soggettività. Inoltre, poiché gli studi del modello di lesione RVO discussi qui indagano le perdite in tutta la retina, abbiamo invece optato per utilizzare una tecnica di mascheramento per il calcolo. Questo metodo di perdita riflette un aspetto diverso del danno RVO da quelli rivelati dall'analisi di tracciamento degli strati DRIL e OCT e la correlazione con queste misure consente la creazione di un profilo di malattia più accurato.
Presentiamo due metodi per la valutazione delle immagini OCT. L'infiammazione acuta e la successiva degenerazione degli strati retinici è un segno distintivo della lesione RVO 6,12. La metodologia di tracciamento degli strati OCT qui descritta consente lo studio preciso dei singoli strati e rivela effetti più sottili e differenze dinamiche in diverse regioni della retina. Questa tecnica di analisi si basa su altri protocolli comunemente usati per la quantificazione dello spessore dello strato retinico nell'imaging OCT. Questo metodo affronta la variazione tra i protocolli nell'area utilizzata per stimare lo spessore dello strato, nonché il numero di misurazioni effettuate nell'immagine11. Poiché l'assottigliamento non è uniforme all'interno di ogni strato retinico, è improbabile che i metodi che utilizzano meno misurazioni puntuali forniscano un quadro completo degli effetti delle lesioni. La meta-analisi di più strategie di misurazione per lo spessore dello strato retinico ha riportato che i protocolli medi su aree più ampie dell'immagine OCT hanno mostrato una maggiore correlazione con la gravità della malattia, nonché una maggiore ripetibilità11. Calcolando la media dell'intera immagine, questo metodo cattura una rappresentazione più accurata dell'assottigliamento della retina presente nella lesione RVO a lungo termine. Gli studi differiscono anche in termini di posizione in cui vengono prese le immagini OCT: molti studi si concentrano sull'imaging sul nervo ottico. Al contrario, il metodo presentato centra le occlusioni. Uno sviluppo recente nell'analisi dell'imaging OCT umano è l'uso di algoritmi di apprendimento automatico per classificare e quantificare le caratteristiche24. Tali analisi potrebbero essere una direzione futura promettente per l'analisi dell'imaging retinico animale.
Inoltre, presentiamo una traduzione di DRIL, una misura clinica dell'ischemia capillare, in un modello di roditore. Nell'uomo, il DRIL è risultato essere un predittore della perdita di acuità visiva e delle differenze di spessore retinico e ha dimostrato un'elevata sensibilità diagnostica e specificità18,19. Quantificare il DRIL nei topi misurando la proporzione di retina disorganizzata ha mostrato correlazione con la frazione di vene occluse, l'ampiezza dell'onda ERG b a 7 giorni post-RVO e l'assottigliamento della retina a 8 giorni dopo RVO12. Un'alternativa alla misurazione DRIL è l'uso di HYPOX-4 per misurare l'ipossia retinica e il danno ischemico. HYPOX-4 unisce il pimonidazolo anime cloridrato, un marcatore di ipossia, con una sonda fluorescente per rilevare l'ipossia retinica25. La maggior parte dei protocolli che utilizzano HYPOX-4 sono invasivi e richiedono l'analisi retinica a montaggio piatto, che potrebbe essere meno adatta per la costruzione di tempistiche di lesioni, sebbene un protocollo di imaging in vivo che utilizza una sonda HYPOX-4 sia stato recentemente sperimentato25. L'analisi DRIL è utile anche come lettura rapida del danno retinico, poiché le singole misurazioni in ciascuna immagine OCT sono più efficienti in termini di tempo rispetto ad analisi come il tracciamento dello strato retinico. Tuttavia, va notato che queste misure non sono intercambiabili e rivelano diverse patologie retiniche. Piuttosto, dovrebbero essere utilizzati in concerto, dove DRIL può essere utilizzato come lettura iniziale per la dimensione dell'effetto o l'efficacia dell'intervento, e il tracciamento degli strati può essere successivamente impiegato per un'analisi approfondita degli effetti più sottili negli strati retinici.
Questi metodi sono di natura ortogonale, il che consente la creazione di un profilo di malattia per ciascun soggetto sperimentale. Poiché le patologie riportate da ciascuno di questi metodi sono distinte, non è garantito che scalino proporzionalmente e ottenere un quadro più olistico della patologia consentirà un'indagine più rigorosa delle diverse configurazioni di manifestazione del danno RVO. La capacità di massimizzare la quantità di informazioni che possono essere estratte dall'imaging di ciascun animale da esperimento ridurrà il numero di animali necessari per trarre conclusioni significative, migliorando l'efficienza del processo sperimentale. L'applicazione di questi metodi su protocolli RVO recentemente perfezionati consente una maggiore riproducibilità e studio della traduzione dei fenotipi clinici in modelli animali. Oltre allo studio dei modelli RVO, l'uso di questi metodi ha applicazioni ad altri modelli di malattie retiniche che impiegano l'imaging FA e OCT. Esempi di tali modelli murini includono quelli per l'edema maculare legato all'età (AMD)26, l'edema maculare diabetico (DME)23, la neovascolarizzazione coroideale (CNV)27, l'uveoretinite autoimmune sperimentale (EAU)28 e la retinopatia del prematuro (ROP)15. Questi metodi possono essere ulteriormente generalizzati agli studi che utilizzano l'imaging FA e OCT nello studio di modelli di queste malattie in altre specie. Queste quantificazioni sono anche sensibili a cambiamenti più sottili nel meccanismo della malattia, rendendole utili nella valutazione dell'efficacia del trattamento, come nella Figura 3D e nella Figura 4C. L'utilità si estende anche all'uso dell'imaging nei test di tossicità negli studi di tollerabilità dei composti farmaceutici. La standardizzazione e la riproducibilità di questi protocolli di analisi può servire a migliorare la validità traslazionale dei modelli animali e ampliare la nostra comprensione della patogenesi e della fisiopatologia della malattia retinovascolare.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione del National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (NSF-GRFP) DGE - 1644869 (a CKCO), dal National Eye Institute (NEI) 5T32EY013933 (all'AMP), dal National Institute of Neurological Disorders and Stroke (RO1 NS081333, R03 NS099920 a CMT) e dal Department of Defense Army / Air Force (DURIP a CMT).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AK-Fluor 10% | Akorn | NDC: 17478-253-10 | light-sensitive |
| Carprofen | Rimadyl | NADA #141-199 | keep at 4 °C |
| GenTeal | Alcon | 00658 06401 | |
| Image J | NIH | ||
| InSight 2D | Phoenix Technology Group | OCT analysis software | |
| Ketamine Hydrochloride | Henry Schein | NDC: 11695-0702-1 | |
| Phenylephrine | Akorn | NDCL174478-201-15 | |
| Phoenix Micron IV | Phoenix Technology Group | Retinal imaging microscope | |
| Phoenix Micron Meridian Module | Phoenix Technology Group | Laser photocoagulator software | |
| Phoenix Micron Optical Coherence Tomography Module | Phoenix Technology Group | OCT imaging software | |
| Phoenix Micron StreamPix Module | Phoenix Technology Group | Fundus imaging and acquisition targeting | |
| Photoshop | Adobe | ||
| Refresh | Allergan | 94170 | |
| Tropicamide | Akorn | NDC: 174478-102-12 | |
| Xylazine | Akorn | NDCL 59399-110-20 |
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