Summary
Her presenterer vi tre dataanalyseprotokoller for fluoresceinangiografi (FA) og optisk koherenstomografi (OCT) bilder i studien av retinal veneokklusjon (RVO).
Abstract
Fremskritt i oftalmiske bildebehandlingsverktøy gir et enestående nivå av tilgang til forskere som arbeider med dyremodeller av nevrovaskulær skade. For å utnytte denne større oversettbarheten på riktig måte, er det behov for å utarbeide reproduserbare metoder for å tegne kvantitative data fra disse bildene. Optisk koherens tomografi (OCT) avbildning kan løse retinal histologi ved mikrometeroppløsning og avsløre funksjonelle forskjeller i vaskulær blodstrøm. Her avgrenser vi ikke-invasive vaskulære avlesninger som vi bruker til å karakterisere patologisk skade etter vaskulær fornærmelse i en optimalisert musemodell av retinal veneokklusjon (RVO). Disse avlesningene inkluderer live imaging analyse av retinal morfologi, uorganisering av retinale indre lag (DRIL) måling av kapillær iskemi og fluorescein angiografi målinger av retinal ødem og vaskulær tetthet. Disse teknikkene samsvarer direkte med de som brukes til å undersøke pasienter med retinal sykdom i klinikken. Standardisering av disse metodene muliggjør direkte og reproduserbar sammenligning av dyremodeller med kliniske fenotyper av oftalmisk sykdom, noe som øker translasjonskraften til vaskulære skademodeller.
Introduction
Neurovaskulær sykdom er et stort helseproblem som er ansvarlig for iskemiske slag, en ledende årsak til dødelighet og sykelighet, og retinale vaskulære sykdommer som fører til synstap 1,2. For å modellere nevrovaskulær sykdom bruker vi en musemodell av retinal vene okklusjon (RVO). Denne modellen er ikke-invasiv og bruker lignende in vivo bildebehandlingsteknikker til de som brukes til å undersøke personer med retinal vaskulær sykdom i en klinisk setting. Bruken av denne modellen øker dermed translasjonspotensialet til studier som bruker denne modellen. Som med alle musemodeller er det avgjørende å maksimere reproduserbarheten av modellen.
Retinal vaskulære sykdommer er en viktig årsak til synstap hos personer under 70 år. RVO er den nest vanligste retinale vaskulære sykdommen etter diabetisk retinopati3. Kliniske trekk som er karakteristiske for RVO inkluderer iskemisk skade, retinal ødem og synstap som følge av nevrontap 3,4. Musemodeller av RVO ved bruk av laserfotokoagulering av store fartøy er utviklet og raffinert for å replikere viktige kliniske patologier observert i human RVO 5,6,7. Fremskritt i oftalmisk avbildning tillater også replikering av ikke-invasive diagnostiske verktøy som brukes hos mennesker, nemlig fluoresceinangiografi (FA) og optisk koherenstomografi (OCT)6. Fluoresceinangiografi tillater observasjon av lekkasje på grunn av nedbrytning av blod-retinalbarrieren (BRB) samt blodstrømningsdynamikk i netthinnen, inkludert okklusjonssteder, ved bruk av injeksjon av fluorescein, et lite fluorescerende fargestoff 8,9. OCT-avbildning muliggjør oppkjøp av høyoppløselige tverrsnittsbilder av netthinnen og studiet av tykkelsen og organiseringen av retinale lag10. Analyse av FA-bilder har historisk sett i stor grad vært kvalitativ, noe som begrenser potensialet for direkte og reproduserbar sammenligning mellom studier. Nylig har en rekke metoder blitt utviklet for kvantifisering av lagtykkelse i OCT-bildebehandling, selv om det for øyeblikket ikke er noen standardisert analyseprotokoll, og stedet for OCT-bildeinnsamling varierer11. For å kunne utnytte disse verktøyene riktig, er det nødvendig med standardisert, kvantitativ og replikerbar dataanalysemetodikk. I dette papiret presenterer vi tre slike vaskulære avlesninger som brukes til å evaluere patologisk skade i en musemodell av RVO-fluoresceinlekkasje, OCT-lagtykkelse og uorganisering av retinale lag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokollen følger Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) uttalelse for bruk av dyr i oftalmisk og visjonsforskning. Gnagere eksperimenter ble godkjent og overvåket av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Columbia University.
MERK: Avbildning ble gjort på 2 måneder gamle C57BL / 6J hannmus som veide ca. 23 g.
1. Fremstilling av reagenser for retinal avbildning
- Fremstilling av injiserbar fluoresceinoppløsning.
MERK: Fluorescein er veldig lysfølsomt. Beskytt mot lys og bruk det kort tid etter tilberedning.- Fortynn fluorescein til en konsentrasjon på 1% i steril saltvann.
- Tilberedning av ketamin/xylazin
- Fortynn ketamin og xylazin i steril saltvann tilsvarende for følgende konsentrasjon: Ketamin (80-100 mg/kg) og xylazin (5-10 mg/kg).
- Steril saltvann
- Klargjør en 5 ml sprøyte med en 26 G kanyle med sterilt saltvann.
2. OCT og fluorescein bildebehandling
- Slå lysboksen for retinal bildemikroskop, OCT-maskinen og den oppvarmede museplattformen PÅ.
- Slå datamaskinen PÅ og åpne bildebehandlingsprogrammet.
- Tilsett en dråpe fenylefrin og tropicamid til hvert øye.
- Injiser 150 μL anestesi (Ketamin (80-100 mg / kg) og Xylazin (5-10 mg / kg)) intraperitonealt (IP). Bestem dybden av anestesi ved tåklemme og vent til dyret ikke reagerer. Påfør oftalmisk salve eller kunstige tårer til begge øynene.
- Få plass til musen på plattformen.
- Juster høyden og vinkelen på plattformen til visningen av retinal fundus er klar og fokusert. Ta et bilde av fundus.
- Åpne bildebehandlings- og OCT-programvaren. I OCT-programmet justerer du nudge til 5.
- Ta et OCT-bilde ved 75 μm distalt fra brenningen. Gjenta for de tre andre kvadrantene av netthinnen.
- Injiser 100 μL med 1% fluorescein IP.
- Bytt kameraet til et 488 nm filter. Øk kameraforsterkningen til 5.
- Ta et bilde av fundus på nøyaktig 5 min etter fluorescein injeksjon.
MERK: Unngå langvarig eksponering av øyet for kameralyset ved maksimal innstilling, da fluorescein kan forverre retinal fotoskade. Hold lyskilden av til ventetiden på 5 minutter har gått og musen er klar for avbildning.
3. Ettervern
- Injiser 1 ml IP-adresse for steril saltvann. Påfør smøremiddel øyedråper til begge øynene. Påfør oftalmisk salve eller kunstige tårer til begge øynene.
- Vær oppmerksom på musen når den gjenoppretter fra anestesi. Gå tilbake til buret med andre dyr bare når de er helt restituert, vanligvis etter rundt 40 minutter.
4. Vurdering for eksklusjonskriterier
- Åpne fundusbildet tatt 24 timer etter prosedyren for å vurdere for eksklusjonskriterier. Ekskluder øyet hvis noen av følgende kriterier er identifisert.
- Vurder om bildet har null okklusjoner
- Evaluer bildet for antall okkluderte fartøy.
MERK: En vellykket okklusjon har vanligvis litt lilla pigmentering på eller rundt brenningen, veldig tynn eller diskontinuerlig beholder gjennom brenningen, svakt eller ikke-eksisterende fartøyutseende utenfor brennområdet og retinal misfarging fra hypoksi. Hvis hele fartøyet kan ses gjennom den hvite brenningen av laseren, klarte ikke fartøyet å okkludere. Noen ganger vil fartøyet virke delvis blokkert, men hvis det ser uavbrutt ut utenfor brenningen, okkluderte fartøyet sannsynligvis ikke. - For tvetydige tilfeller, bruk FA-bildebehandling samtidig for å evaluere okklusjoner. I disse bildene vil en okklusjon fremstå som et brudd i kontinuiteten til et fartøy, ofte med en nedtrapping av det omkringliggende fartøyet.
- Hvis null okklusjoner identifiseres, ekskluder øyet fra analysen, da RVO anses å være ineffektiv.
MERK: Okklusjoner løses vanligvis innen 48-72 timer etter RVO, og tilstedeværelsen av okklusjoner bør ikke lenger brukes som et eksklusjonskriterium på disse tidspunktene.
- Evaluer bildet for antall okkluderte fartøy.
- Vurder fundus- og OCT-bildene for overdreven retinal detachment
MERK: Subretinal væskeakkumulering er vanlig etter induksjon av RVO, og forårsaker separasjon av nevral retina fra RPE. Eksklusjonære kriterier for overdreven retinal detachment er definert som følger: OCT vil enten være helt usynlig, eller noen lag vil virke utrolig forvrengt. Bildekvaliteten er dårlig, med tap av oppløsning av ytre pleksiforme og RPE-lag. Separasjonen mellom nevrale retina og choroid er større enn hva OCT-synsfeltet tillater. På fundusbildet vil netthinnetonen være nesten helt hvit, med litt lilla flekker. En del av netthinnen kan virke forvrengt og ute av fokus. Dette skyldes at den har løsnet og er i en annen brennvidde enn resten av netthinnen.- Hvis vurderingen av bildene fra et øye bestemmer perifer eller fullstendig løsrivelse av netthinnen, utelukker øyet fra analysen.
- Ekskluder bilder med tegn på hornhinde katarakt
MERK: En hornhinde katarakt vises som en ugjennomsiktig hvit prikk på musens hornhinne. Katarakt oppstår vanligvis på grunn av utilstrekkelig smøring av øynene mens dyret bedøves og kan i stor grad unngås ved å passe på å bruke øyesalve sjenerøst. Katarakt kan generelt identifiseres før avbildning ved å inspisere dyret. Mus som har utviklet grå stær bør utelukkes fra datasettet uten å måtte gjennomgå avbildningsprosessen. Ved avbildning vil grå stær skjule netthinnen fra kameraet, og OCT vil virke vridd. - Vurder bildet for overdreven blødning
MERK: Overdreven blødning kan identifiseres som mengder rød væske i bildet, vanligvis skjuler retinal bakgrunn, fartøy og brenning. Disse områdene med rød væske vil være en lysere, ugjennomsiktig rød enn de lilla flekkene som er normale i vellykket RVO. Blødninger dukker opp ved ganglioncellelaget på OCT-avbildning og forstyrrer evnen til å visualisere andre retinale lag under blødningen.- Hvis bildet er fast bestemt på å ha overdreven blødning, utelukker du øyet fra analysen.
5. Fluorescein bildebehandling
- Åpne fluoresceinbildet i bildebehandlingsprogramvaren.
- Duplisere bildet
- Bruk et utvalgsverktøy til å spore de store fartøyene nøye.
- De store fartøyene er de tykkere venene og arteriene som stråler ut fra optisk plate. Ignorer eventuelle fartøy som forgrener seg fra disse fartøyene.
- Hvis lekkasje forhindrer at omrisset av fartøyet blir sett nær okklusjonsstedet, spor gjennom lekkasjen i fartøyets omtrentlige plassering (oppretthold tykkelsen, koble det siste synlige punktet til neste synlige punkt).
- I det første bildet sletter du markeringen, slik at bare bakgrunnen blir igjen. Lagre dette maskerte bildet.
- Flytt markeringen til det andre bildet, inverter markeringen og slett, isoler beholderne. Lagre dette maskerte bildet.
- Åpne de to bildene i ImageJ. Åpne bakgrunnsbildet og mål den integrerte tettheten.
- Åpne fartøyets bilde, velg omrisset av fartøyene, og mål deretter middelintensiteten.
- Del den integrerte tettheten av bakgrunnen med fartøyets gjennomsnittlige intensitet, og generer lekkasjeforholdet for øyet.
- Registrer dette lekkasjeforholdet for hvert øye i en eksperimentell kohort.
- For ytterligere kontroll for bakgrunn, normaliser eksperimentelle øyne til gjennomsnittlig lekkasjeforhold for ubesudlede kontrolløyne.
MERK: For å lage en standardisert kvantifisering av fluoresceinlekkasje i FA-bildet, bruker denne beregningen et forhold mellom bakgrunnstettheten (hvor lekkasjen vil være til stede) med lysstyrken til de store fartøyene for å skape resultater som styrer for variasjonen i lysstyrke fra bilde til bilde og kan kvantifiseres pålitelig. Øyne som er uskadet har ingen lekkasje og skal teoretisk ha forhold på null. Forholdene beregnet fra disse uskadede kontrolløynene representerer derfor bakgrunnsstøy, og denne verdien brukes til å normalisere eksperimentelle verdier ytterligere.
6. Retinal lag tykkelse
- Åpne OCT-bildet i bildebehandlingsprogramvaren.
- Spor kantene til ganglioncellelaget, det indre pleksiforme laget, det indre kjernelaget, det ytre pleksiformlaget, fotoreseptorlaget og RPE-laget. Mål gjennomsnittlig tykkelse på hvert lag.
- Gjenta for OCT-bilder fra de tre andre kvadrantene i netthinnen. Gjennomsnittlig gjennomsnittlig lagtykkelse over de fire kvadrantene for å oppnå gjennomsnittlig tykkelse på hvert retinallag for øyet.
- Gjenta for hvert øye i den eksperimentelle kohorten.
7. Uorganisering av retinale indre lag (DRIL)
- Åpne OCT-bildet i ImageJ.
- Bruk linjeverktøyet til å måle avstanden der den øvre grensen til det ytre pleksiforme laget er utydelig.
MERK: Det er viktig å skille mellom DRIL og områder med dårlig lagsynlighet forårsaket av bildeartefakter. Dårlig OCT-bildekvalitet kan ugyldiggjøre et øye for DRIL-analyse hvis tilstrekkelig bildeoppløsning ikke er mulig. Bilder med DRIL vil vanligvis ha andre regioner eller retinale lag som er tydelig løst og organisert, noe som kan være en god indikator på tilstrekkelig bildekvalitet.- Mål horisontalt fra breddegraden der uorganiseringen begynner til breddegraden der den øvre grensen til det ytre plexiformlaget blir synlig igjen, hvis i det hele tatt. Selv om det ytre pleksiforme laget forskyves oppover eller nedover vertikalt, må du måle perfekt horisontalt.
- Det kan være flere områder med uorganisering atskilt med områder uten uorganisering. Mål disse individuelt og beregn summen av avstandene.
- Del lengden på uorganisering med den totale lengden på netthinnen som er synlig i hvert OCT-bilde for å oppnå forholdet mellom uorganisering for bildet.
- Gjenta målingen og beregningen for OCT-bilder fra de tre andre kvadrantene i netthinnen.
- Ta gjennomsnittet av forholdet mellom uorganisering fra de fire OCT-bildene. Dette tallet representerer gjennomsnittlig uorganisering for hele netthinnen. Gjenta for hvert øye i den eksperimentelle kohorten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Disse analysemetodene tillater kvantifisering av retinal patologi fanget av FA og OCT imaging. Forsøkene som de representative dataene ekstraheres fra, brukte C57BL / 6J hannmus som enten fungerte som ubesudlede kontroller eller gjennomgikk ROVO-prosedyren og mottok enten Pen1-XBir3 behandlingsøyedråper eller Pen1-Saline kjøretøy øyedråper. ROVO-skademodellen involverte laserbestråling (532 nm) av de viktigste venene i hvert øye av en bedøvet mus etter en hale-veneinjeksjon av rosebengal, et fotoaktivatorfargestoff12. Tre laserpulser ble levert i en gjennomsnittlig avstand på 375 μm fra optisk nervesenter for å indusere fotokoagulering og okkludere karene12. Effektiv bruk av ROVO-prosedyren er demonstrert i Avrutsky et al.12, og ytterligere detaljer om ROVO-metodeoptimalisering er beskrevet i Colón Ortiz et al.13. Figur 1A viser eksempler på FA- og OCT-bilder fra begge gruppene. På grunn av den variable karakteren av okklusjonsdannelse og stabilisering gjennom fotokoagulasjonsprosessen, kan forskjellige grader av skade observeres. I noen netthinner introduserer skaden indusert av RVO-prosedyren oftalmiske patologier som gjør retinalbildene uegnet til analyse. Etter oppkjøpet bør bilder først evalueres for eksklusjonskriterier for å sikre optimal analyse og pålitelige resultater. Disse eksklusjonskriteriene, avgrenset i figur 1B, inkluderer netthinneløsning, blødning og katarakt. Som det fremgår av eksempelet fundus- og OCT-bilder, forhindrer disse patologiene klar OCT-avbildning, noe som gjør netthinnen uegnet til dataanalyse. I tillegg er det mulig at noen netthinner ikke inneholder stabile okklusjoner; Disse bildene modellerer ikke nøyaktig iskemisk-hypoksisk skade og bør utelukkes fra analysen.
Nedbrytningen av blod-retinal barrieren bidrar til patogenesen av RVO14,15. Evaluering av mengden lekkasje fra fartøy er en nyttig indikator på skadeindusert karpermeabilitet. FA-avbildning tillater visualisering av denne lekkasjen, men en rekke faktorer, for eksempel forskjeller i sirkulasjonshastigheten, påvirker råintensiteten til FA-bilder og gjør konsistent kvantifisering16,17. Vår metode styrer for denne variabiliteten ved å normalisere intensiteten observert i netthinnen til gjennomsnittlig intensitet av den store vaskulaturen. Dette gir et forhold mellom lekkasje for hvert retinalbilde som kan sammenlignes med andre og analyseres. Figur 2A viser de maskerte bildene som brukes til denne beregningen, og skiller den store vaskulaturen fra de andre områdene av netthinnen. Evnen til å kvantifisere fluorescein gjør det mulig å sammenligne skadens alvorlighetsgrad og behandlingseffekt, samt studere endringer i lekkasje over skadetidsforløpet (figur 2B), noe som kan være en for subtil effekt til å demonstrere med kvalitativ rapportering alene.
OCT-avbildning muliggjør analyse av virkningen av RVO på individuelle retinale lag og total retinal tykkelse. Figur 3A viser en avgrensning av lagene i netthinnen i et OCT-bilde. Sporing av grensene for hvert lag (figur 3B) gir mulighet for flere analyseveier. Kvantifiseringen av tykkelse for hvert retinallag viser seg å være nyttig, da den første edematøse responsen har en dypere effekt på de indre retinale lagene. Spor tillater også studier av total retinatykkelse og segregert analyse av indre versus ytre retinale lag. Figur 3C gir en analyse av et tidsforløp av ROVO-skade, hvor den første inflammatoriske hevelsen av retinale lag og eventuell degenerativ tynning kan observeres. Plotting av tykkelsen på hvert lag over tid avslører forskjellig dynamikk for de indre pleksiforme og indre kjernelagene, hvor det indre kjernelaget opplever en mye større respons på den første skaden, men det indre pleksiforme laget viser mer alvorlig tynning etter at det første ødemet er stabilisert og går tilbake til baseline (figur 3D ). Dette gir en mer presis forståelse av responsdriverne på forskjellige tidspunkter. Vi testet også effektiviteten av en caspaseinhibitor for å redusere hevelse og beskytte mot eventuell degenerasjon, med analyse som viste forskjellige effekter i individuelle lag.
Uorganiseringen av indre retinale lag (DRIL) er en annen OCT-funksjon som brukes som et diagnostisk mål på iskemi i diabetisk retinopati, samt et prediktivt mål for synsstyrke i RVO18,19. I OCT-avbildning manifesterer DRIL seg som en forsvinning av den øvre grensen til det ytre pleksiforme laget12, og blander de ytre pleksiforme og indre atomlagene sammen (figur 4A). Figur 4B viser to eksempler på OCT-bilder med uthevede områder av DRIL. Vi uttrykker DRIL som en andel av total retinal lengde, i gjennomsnitt over fire OCT-tverrsnitt. Dette tiltaket lar oss kvantitativt sammenligne eksperimentelle grupper; Figur 4C presenterer en eksempelanalyse, hvor retinal disorganisering av to eksperimentelle grupper ble sammenlignet for å undersøke effekten av en hemmer for å redusere retinal skade i RVO.
Figur 1: Bilder hentet fra fluoresceinangiografi (FA) og optisk koherenstomografi (OCT) avbildning . (A) Eksempler på FA- og OCT-bilder fra netthinner 24 timer etter RVO og ubesudlede kontroller. (B) Fundus- og OCT-avbildning av de forskjellige eksklusjonskriteriene: overdreven retinal detachment, blødning, hornhinde katarakt og ingen okklusjoner. Avstanden til OCT-oppkjøpet er angitt med den grønne retningslinjen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Kvantifisering av fluoresceinlekkasje. (A) Separasjon av FA-bildet i karene og bakgrunn for analyse (B) Fluoresceinlekkasjekvantifisering fra øynene til C57BL / 6J retinal vene okkludert (RVO) mus som får enten 10 mg Pen1-XBir3-hemmer øyedråper (N = 17) eller Pen1-Saline kjøretøy øyedråper (N = 13) ved 24 timer og 48 timer etter prosedyren. Intensitetsavlesning av bakgrunnsbildet normaliseres til gjennomsnittlig intensitetsavlesning fra fartøyets bilde. Gjennomsnittet av intensitetsavlesningen for ROVO-mus normaliseres ytterligere til ubesudlede kontroller. Feilfelt viser gjennomsnitt med SEM. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Kvantifisering av retinallagtykkelse i OCT-bilder. (A) Uninjured retina med de enkelte retinale lagene merket: Ganglion Cell Layer, Inner Plexiform Layer, Inner Nuclear Layer, Outer Plexiform Layer, Photoreceptor Layer, RPE og Choroid. (B) Eksempel på lagspor av OCT-bilder tatt fra ubesudlet kontroll og 24 timer etter RVO C57/BL6-mus. (C) Kvantifisering av endring i total retinal tykkelse og intraretinal tykkelse observert ved OCT-avbildning av C57BL / 6J mus retinas ved 4 timer, 24 timer, 48 timer, 72 timer og 8 dager etter RVO. (D) Kvantifisering av tykkelsesendring i indre pleksiforme og indre kjernelag av C57BL / 6J mus retinas ved 24 timer, 48 timer og 8 dager etter RVO for C57BL / 6J mus som mottar enten 10 mg Pen1-XBir3 hemmer øyedråper (N = 14) eller Pen1-Saline kjøretøy øyedråper (N = 15) umiddelbart etter RVO prosedyre og 24-timers post-RVO. Feilfelt viser gjennomsnitt med SEM. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Kvantifisering av desorganisering av de indre retinale lagene (DRIL) observert i OCT-bilder etter rvo. I OCT-bilder indikeres DRIL ved tap av en klar avgrensning mellom de indre kjernefysiske og ytre pleksiforme lagene. (A) Eksempler på deler av netthinnen med og uten DRIL i OCT-avbildning. (B) Områder med DRIL i OCT-avbildning av to regioner i en C57BL/6J-mus 24 timer etter RVO, angitt med hvite linjer. DRIL måles horisontalt over bildet i stedet for å følge formen på netthinnen. (C) Kvantifisering av andelen av retinallengden der DRIL ble observert ved 24 timer og 48 timer etter RVO for øynene til C57BL / 6J-mus som fikk enten 2,5 mg Pen1-XBir3-hemmer øyedråper (N = 19) eller Pen1-Saline kjøretøy øyedråper (N = 21) etter RVO-prosedyren. Feilfelt viser gjennomsnitt med SEM. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ikke-invasiv gnager retinal imaging presenterer en avenue for å studere patologi og utvikle intervensjoner. Tidligere studier har utviklet og optimalisert en musemodell av RVO, som begrenser variabiliteten og muliggjør pålitelig oversettelse av vanlige kliniske patologier i murine retina 5,7,13. Utviklingen i oftalmisk bildebehandlingsteknologi tillater videre bruk av kliniske in vivo avbildningsteknikker som FA og OCT i eksperimentelle dyr, noe som gir muligheten til å sammenligne musemodeller med profiler av menneskelig sykdom 6,12,15. For å maksimere informasjonen som kan hentes ut fra disse bildene og det generelle translasjonspotensialet til modellen, er det imidlertid behov for standardiserte, reproduserbare og strenge kvantitative metoder for å analysere bilder. Her presenterer vi analysemetoder som tillater kvantitative representasjoner av skadens alvorlighetsgrad, noe som muliggjør mer presise og pålitelige sammenligninger mellom mus og på tvers av eksperimentelle grupper. Disse analysene inkluderer lekkasjekvantifisering i FA-bilder, kvantifisering av gjennomsnittlig lagtykkelse og områder av DRIL i OCT-bilder.
En kritisk faktor i vellykket analyse ligger i kvaliteten på de oppkjøpte bildene. Dårlig løste OCT-bilder kan føre til vanskeligheter med å spore individuelle lag og manglende evne til å skille indre retinal disorganisering fra dårlig bildekvalitet. Ved avbildning er det viktig å være forsiktig med plasseringen av musen på plattformen, slik at fundusbildet er i fokus, optisk nerve er relativt sentrert, og retinaltverrsnittet er horisontalt over bildet. Konsekvent smøring av øynene mens dyret er bedøvet er også viktig, spesielt når det samme dyret er avbildet flere dager. Utilstrekkelig smøring kan føre til hornhinde katarakt, noe som vil skjule netthinnen og gjøre den uegnet til avbildning. Ulike retinale patologier kan forekomme i ROVO-avbildning, noe som gjør bilder uegnet til analyse. Disse inkluderer overdreven retinal detachment og overdreven blødning, som sammen med sterkt kompromitterende kvaliteten på bildebehandling, representerer også en grad av skade som er for alvorlig til å brukes som en modell av RVO. Det er i tillegg mulig for alle okkluderte fartøy å fullstendig reperfuse kort tid etter skade, noe som ikke nøyaktig modellerer ROBO-skade og bør brukes som et eksklusjonskriterium. Det er imidlertid viktig å merke seg at vellykkede okklusjoner naturlig vil løse seg ved 48-72 timer etter skade, og tilstedeværelsen av okklusjoner som eksklusjonskriterium brukes best ved eller før 24 timer etter prosedyren. Colón Ortiz et al.13 beskriver beste praksis for å begrense variabilitet og kalibrere skader i en optimalisert modell for ROVO-prosedyre. Identifisering og vurdering av eksklusjonskriterier er også et kritisk skritt for bildeanalyse. Siden dette i stor grad er opp til evaluatorens skjønn, er det viktig at evaluatorer er blinde for behandlingsgrupper og praktiserer konsistens i vurderingen av patologisk alvorlighetsgrad. Noen begrensninger i anvendelsen av disse metodene eksisterer, spesielt i praksis med å avbilde den samme musen på flere tidspunkter. Det er en grense for hvor ofte en mus kan bedøves for avbildning, noe som nødvendiggjør testing og justering av tidspunkter for å bestemme optimal tidskurs. Våre studier benytter bildetidspunkter ved 4 timer, 24 timer, 48 timer og 8 dager, som vi har funnet fangststadier av initial skade, akutt inflammatorisk respons og langsiktig skade12. I tillegg er visse musestammer mer utsatt for utvikling av hornhindekatarakt, som inkluderer forskjellige diabetiske musemodeller, noe som kan føre til et stort antall unntak eller ufullstendige tidskurs20,21. Studier som bruker slike muselinjer, kan trenge å skreddersy eksperimentell gruppestørrelse eller bildebehandlingstidspunkter avhengig av hornhinnens følsomhet.
Fluorescein angiografi imaging har i stor grad blitt brukt kvalitativt for å observere og gradere retinale patologier som lekkasje, samt mønstre av endret blodstrøm RVO6. Nylig har det vært arbeidet med å utvikle en kvantitativ analyse av FA i dyremodeller, for eksempel beregning av vaskulært areal og tortuositet16 og lineær regresjonsanalyse av bildeintensitet temporalitet17. Segmentering av de store fartøyene fra fundusbakgrunnen har tidligere blitt brukt, men i en pikselanalyse av fyll- og forfallsdynamikk, som vitner om variasjonen i bildeintensitet hos forskjellige mus17. I tillegg ble potensialet for skjevhet notert i tolkningen av fluoresceinpooling17. Den kvantitative metoden som diskuteres her, retter seg mot lekkasje av fluorescein fra den store retinale vaskulaturen, noe som indikerer nedbrytningen av BRB, som har vist seg å spille en rolle i RVO-skade11,12,14. En alternativ analyse av lekkasje kvantifiserer fargestofflekkasje på retinale flatfester22. Invasive post mortem-analyser er imidlertid mindre egnet for studier av tidslinjen for ROVO-skade i en enkelt mus, der lekkasjen studeres ved flere tidspunkter. Analyser av fluoresceinlekkasjeområde i ulike stadier av retinalsykdommen har tidligere vært brukt i kliniske studier og korrelert med andre observerte sykdomspatologier23. Denne metoden tillater lignende utnyttelse av FA-bilder for å studere fartøylekkasje in vivo, noe som muliggjør studier av lekkasjedynamikk innenfor tidslinjen for ROVO-skade. Siden valg av lekkasjeområde er avhengig av evaluering av en region, introduserer det potensielt en større mengde variabilitet via subjektivitet. Videre, siden studiene av ROVO-skademodellen som diskuteres her undersøker lekkasje i hele netthinnen, har vi i stedet valgt å bruke en maskeringsteknikk for beregning. Denne lekkasjemetoden gjenspeiler en annen fasett av ROVO-skader enn de som ble avslørt av DRIL- og OCT-lagsporingsanalyse, og korrelasjon med disse tiltakene gjør det mulig å skape en mer nøyaktig sykdomsprofil.
Vi presenterer to metoder for evaluering av OCT-bilder. Akutt betennelse og påfølgende degenerasjon av retinallagene er et kjennetegn på RVO-skade 6,12. OCT-lagsporingsmetoden som er beskrevet her, tillater presis studie av individuelle lag og avslører mer subtile effekter og forskjeller i dynamikk i forskjellige regioner i netthinnen. Denne analyseteknikken bygger på andre ofte brukte protokoller for kvantifisering av retinallagtykkelse i OCT-avbildning. Denne metoden adresserer variasjonen på tvers av protokoller i området som brukes til å estimere lagtykkelsen, samt antall målinger tatt over bildet11. Siden tynningen ikke er jevn i hvert netthinnelag, er det lite sannsynlig at metoder med færre punktmålinger vil gi et komplett bilde av skadeeffekter. Meta-analyse av flere målestrategier for retinal lagtykkelse rapporterte at protokoller i gjennomsnitt over større områder av OCT-bildet viste en høyere korrelasjon med sykdommens alvorlighetsgrad, samt større repeterbarhet11. Ved å gjennomsnittlig over hele bildet, fanger denne metoden en mer nøyaktig representasjon av retinal tynning tilstede i langsiktig RVO-skade. Studier varierer også når det gjelder plasseringen der OCT-bilder er tatt- mange studier sentrerer bildebehandling på optisk nerve. Derimot sentrerer den presenterte metoden i forhold til okklusjonene. En nylig utvikling i analysen av menneskelig OCT-bildebehandling er bruken av maskinlæringsalgoritmer for å klassifisere og kvantifisere funksjoner24. Slike analyser kan være en lovende fremtidig retning for analyse av dyrenetthinneavbildning.
I tillegg presenterer vi en oversettelse av DRIL, et klinisk mål på kapillær iskemi, til en gnagermodell. Hos mennesker har DRIL vist seg å være en prediktor for synsskarphetstap og retinal tykkelsesforskjeller og har vist høy diagnostisk følsomhet og spesifisitet18,19. Kvantifisering av DRIL hos mus ved å måle andelen av netthinnen som er uorganisert, har vist korrelasjon med fraksjonen av okkluderte vener, ERG b-bølgeamplitude ved 7 dager etter RVO og retinal tynning ved 8 dager etter RVO12. Et alternativ til DRIL-måling er bruken av HYPOX-4 for å måle retinal hypoksi og iskemisk skade. HYPOX-4 slutter seg til pimonidazol anime hydroklorid, en hypoksi markør, med en fluorescerende sonde for å oppdage retinal hypoksi25. De fleste protokoller som bruker HYPOX-4 er invasive og krever retinal flat mount-analyse, noe som kan være mindre egnet for bygging av skadetidslinjer, selv om en in vivo-bildeprotokoll ved hjelp av en HYPOX-4-sonde nylig har blitt pilotert25. DRIL-analyse er også nyttig som en rask avlesning av retinalskader, da enkeltmålinger i hvert OCT-bilde er mer tidseffektive enn analyser som retinal lagsporing. Det skal imidlertid bemerkes at disse tiltakene ikke er utskiftbare og avslører forskjellige retinale patologier. Snarere bør de brukes i konsert, hvor DRIL kan brukes som en første avlesning for effektstørrelse eller intervensjonseffekt, og lagsporing kan deretter brukes til en grundig analyse av mer subtile effekter i retinallagene.
Disse metodene er ortogonale i naturen, noe som gjør det mulig å skape en sykdomsprofil for hvert eksperimentelt emne. Siden patologiene rapportert av hver av disse metodene er forskjellige, er de ikke garantert å skalere proporsjonalt, og å få et mer helhetlig bilde av patologi vil tillate en strengere undersøkelse av de varierende manifestasjonskonfigurasjonene av ROVO-skade. Evnen til å maksimere mengden informasjon som kan ekstraheres fra avbildningen av hvert eksperimentelt dyr, vil redusere antall dyr som er nødvendige for å trekke betydelige konklusjoner, og øke effektiviteten av forsøksprosessen. Bruk av disse metodene på nylig raffinerte ROVO-protokoller muliggjør større reproduserbarhet og studier av oversettelsen av kliniske fenotyper til dyremodeller. Utover studiet av RVO-modeller har bruken av disse metodene applikasjoner til andre modeller av retinale sykdommer som bruker FA- og OCT-bildebehandling. Eksempler på slike musemodeller er de for aldersrelatert makulært ødem (AMD)26, diabetisk makulært ødem (DME)23, koroidal neovaskularisering (CNV)27, eksperimentell autoimmun uveoretinitt (EAU)28 og retinopati av prematuritet (ROP)15. Disse metodene kan videre generaliseres til studier ved hjelp av FA- og OCT-avbildning ved å studere modeller av disse sykdommene hos andre arter. Disse kvantifiseringene er også følsomme for mer subtile endringer i sykdomsmekanismen, noe som gjør dem nyttige i evalueringen av behandlingseffekt, som i figur 3D og figur 4C. Utility strekker seg også til bruk av bildebehandling i toksisitetstesting i toleransestudier av stoffforbindelser. Standardiseringen og reproduserbarheten av disse analyseprotokollene kan tjene til å forbedre translasjonsgyldigheten til dyremodeller og utvide vår forståelse av patogenesen og patofysiologien til retinovaskulær sykdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (NSF-GRFP) gi DGE - 1644869(til CKCO), National Eye Institute (NEI) 5T32EY013933 (til AMP), National Institute of Neurological Disorders and Stroke (RO1 NS081333, R03 NS099920 til CMT), og Department of Defense Army / Air Force (DURIP til CMT).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AK-Fluor 10% | Akorn | NDC: 17478-253-10 | light-sensitive |
| Carprofen | Rimadyl | NADA #141-199 | keep at 4 °C |
| GenTeal | Alcon | 00658 06401 | |
| Image J | NIH | ||
| InSight 2D | Phoenix Technology Group | OCT analysis software | |
| Ketamine Hydrochloride | Henry Schein | NDC: 11695-0702-1 | |
| Phenylephrine | Akorn | NDCL174478-201-15 | |
| Phoenix Micron IV | Phoenix Technology Group | Retinal imaging microscope | |
| Phoenix Micron Meridian Module | Phoenix Technology Group | Laser photocoagulator software | |
| Phoenix Micron Optical Coherence Tomography Module | Phoenix Technology Group | OCT imaging software | |
| Phoenix Micron StreamPix Module | Phoenix Technology Group | Fundus imaging and acquisition targeting | |
| Photoshop | Adobe | ||
| Refresh | Allergan | 94170 | |
| Tropicamide | Akorn | NDC: 174478-102-12 | |
| Xylazine | Akorn | NDCL 59399-110-20 |
References
- Tong, X., et al. The burden of cerebrovascular disease in the united states. Preventing Chronic Disease. 16, 180411 (2019).
- Nakahara, T., Mori, A., Kurauchi, Y., Sakamoto, K., Ishii, K. Neurovascular interactions in the retina: physiological and pathological roles. Journal of Pharmacological Sciences. 123 (2), 79-84 (2013).
- Jaulim, A., Ahmed, B., Khanam, T., Chatziralli, I. Branch retinal vein occlusion: epidemiology, pathogenesis, risk factors, clinical features, diagnosis, and complications. An update of the literature. Retina. 33 (5), 901-910 (2013).
- Ho, M., Liu, D. T. L., Lam, D. S. C., Jonas, J. B. Retinal vein occlusions, from basics to the latest treatment. Retina. 36 (3), 432-448 (2016).
- Zhang, H., et al. Development of a new mouse model of branch retinal vein occlusion and retinal neovascularization. Japanese Journal of Ophthalmology. 51 (4), 251-257 (2007).
- Ebneter, A., Agca, C., Dysli, C., Zinkernagel, M. S. Investigation of retinal morphology alterations using spectral domain optical coherence tomography in a mouse model of retinal branch and central retinal vein occlusion. PLoS One. 10 (3), 0119046 (2015).
- Fuma, S., et al. A pharmacological approach in newly established retinal vein occlusion model. Scientific Reports. 7, 43509 (2017).
- Cavallerano, A.
- Laatikainen, L. The fluorescein angiography revolution: a breakthrough with sustained impact. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 82 (4), 381-392 (2004).
- Huang, D., et al.
- Oberwahrenbrock, T., et al. Reliability of intra-retinal layer thickness estimates. PLoS One. 10 (9), 0137316 (2015).
- Avrutsky, M. I., et al. Endothelial activation of caspase-9 promotes neurovascular injury in retinal vein occlusion. Nature Communications. 11 (1), 3173 (2020).
- Colón Ortiz, C., Potenski, A., Lawson, J., Smart, J., Troy, C. Optimization of the retinal vein occlusion mouse model to limit variability. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (174), e62980 (2021).
- Schmidt-Erfurth, U., et al. Guidelines for the management of retinal vein occlusion by the European society of retina specialists (EURETINA). Ophthalmologica. 242 (3), 123-162 (2019).
- Yoshimura, T., et al. Comprehensive analysis of inflammatory immune mediators in vitreoretinal diseases. PLoS One. 4 (12), 8158 (2009).
- Mezu-Ndubuisi, O. J. In vivo angiography quantifies oxygen-induced retinopathy vascular recovery. Optometry and Vision Science. 93 (10), 1268-1279 (2016).
- Hui, F., et al. Quantitative spatial and temporal analysis of fluorescein angiography dynamics in the eye. PLoS One. 9 (11), 111330 (2014).
- Berry, D., Thomas, A. S., Fekrat, S., Grewal, D. S. Association of disorganization of retinal inner layers with ischemic index and visual acuity in central retinal vein occlusion. Ophthalmology. Retina. 2 (11), 1125-1132 (2018).
- Nicholson, L., et al. Diagnostic accuracy of disorganization of the retinal inner layers in detecting macular capillary non-perfusion in diabetic retinopathy. Clinical & Experimental Ophthalmology. 43 (8), 735-741 (2015).
- Obrosova, I., Chung, S., Kador, P. Diabetic cataracts: mechanisms and management. Diabetes/Metabolism Research and Reviews. 26 (3), 172-180 (2010).
- Hegde, K., Henein, M., Varma, S. Establishment of the mouse as a model animal for the study of diabetic cataracts. Ophthalmic Research. 35 (1), 12-18 (2003).
- Takahashi, H., et al. Time course of collateral vessel formation after retinal vein occlusion visualized by OCTA and elucidation of factors in their formation. Heliyon. 7 (1), 05902 (2021).
- Haj Najeeb, B., et al. Fluorescein angiography in diabetic macular edema: A new approach to its etiology. Investigation Ophthalmology & Visual Science. 58 (10), 3986-3990 (2017).
- Alam, M., et al. Quantitative optical coherence tomography angiography features for objective classification and staging of diabetic retinopathy. Retina. 40 (2), 322-332 (2020).
- Uddin, M., Jayagopal, A., McCollum, G., Yang, R., Penn, J. In vivo imaging of retinal hypoxia using HYPOX-4-dependent fluorescence in a mouse model of laser-induced retinal vein occlusion (RVO). Investigation Ophthalmology & Visual Science. 58 (9), 3818-3824 (2017).
- Qiang, W., Wei, R., Chen, Y., Chen, D. Clinical pathological features and current animal models of type 3 macular neovascularization. Frontiers in Neuroscience. 15, 734860 (2021).
- Park, J., et al. Imaging laser-induced choroidal neovascularization in the rodent retina using optical coherence tomography angiography. Investigation Ophthalmology & Visual Science. 57 (9), 331 (2016).
- Chen, J., Qian, H., Horai, R., Chan, C., Caspi, R. Use of optical coherence tomography and electroretinography to evaluate retinal pathology in a mouse model of autoimmune uveitis. PLoS One. 8 (5), 63904 (2013).
