Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

En multiplekset screening med høy gjennomstrømning for type 1 diabetes, cøliaki og COVID-19

Published: July 5, 2022 doi: 10.3791/63787
Automatic Translation
*1, *1,2, 1, 1, 1, 1
1Barbara Davis Center for Diabetes, University of Colorado School of Medicine, 2Department of Endocrinology, Guangzhou First People’s Hospital, School of Medicine, South China University of Technology
* These authors contributed equally

Summary

I tråd med det presserende behovet for screening for type 1 diabetes, cøliaki og koronavirussykdom 2019, utviklet vi en høy gjennomstrømning 6-Plex elektrokjemiluminescensanalyse for samtidig å oppdage alle fire øyautoantistoffer, vevstransglutaminaseautoantistoffer og antistoffer mot reseptorbindingsdomenet for alvorlig akutt respiratorisk syndrom coronavirus 2.

Abstract

En pågående klinisk studie, Autoimmunity Screening for Kids (ASK), er den første screeningstudien i befolkningen for type 1 diabetes (T1D) og cøliaki i USA. Med koronavirussykdommen 2019 (COVID-19) -pandemien er det presserende behov for epidemiologien til COVID-19 i befolkningen generelt og kunnskap om sammenhengen mellom COVID-19-infeksjon og T1D-utvikling. Den nåværende standard screeningmetoden for radiobindingsanalysen (RBA) har møtt to store utfordringer: lav effektivitet med et enkelt analyseformat og lav sykdomsspesifisitet med en stor andel lavaffinitetsantistoffer generert i screening. Med plattformen til multiplekselektrokjemiluminescensanalysen (ECL) vi etablerte tidligere, ble det utviklet en ny 6-Plex ECL-analyse som kombinerer, i en enkelt brønn, alle fire holme autoantistoffer (IAbs) til insulin, glutaminsyredekarboksylase (GAD65), insulinomantigen 2 (IA-2) og sinktransportør 8 (ZnT8) for T1D, transglutaminase autoantistoffer (TGA) for cøliaki og alvorlig akutt respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) reseptorbindende domene (RBD) antistoffer for COVID-19. Analysen ble validert i blinde ved hjelp av 880 prøver fra ASK-studien, inkludert 325 positive prøver og 555 alle antistoffnegative prøver, og sammenlignet med standard RBA og en enkelt ECL-analyse. Med fordelene med høy effektivitet, lave kostnader og lavt serumvolum har denne analysen blitt akseptert som det primære screeningverktøyet for ASK-studien.

Introduction

Store epidemiologiske studier over hele verden viser at forekomsten av type 1 diabetes (T1D) har økt raskt med 3% -5% årlig, og forekomsten av T1D har doblet seg de siste 20 årene, spesielt hos små barn 1,2. Islet autoantistoffer (IAbs) vises vanligvis år før kliniske symptomer og er for tiden de mest pålitelige prediktive og diagnostiske biomarkørene for T1D3. Screening for T1D-autoantistoffer kan identifisere personer i fare for å utvikle seg til klinisk T1D, utdanne publikum, i stor grad redusere livstruende komplikasjon av ketoacidose og dra nytte av kliniske studier for forebyggende terapier. Verdensomspennende forebyggende innsats for T1D pågår, og flere intervensjonsforsøk utføres blant personer med IAbs positive for å forsinke progresjonen til klinisk T1D, og Barbara Davis Center for Diabetes lanserte den første amerikanske kliniske studien av screening i befolkningen generelt i 2016 for T1D og cøliaki, Autoimmunity Screening for the Kids (ASK)4 . Cøliaki (CD) er en kronisk intestinal inflammatorisk sykdom relatert til immun og genetiske faktorer. Utbredelsen av CD hos barn med T1D kan nå opptil 24,5%5. Mer enn halvparten av personer med CD kan ikke ha typiske symptomer ved presentasjon6, så serologisk screening for cøliaki er ganske nødvendig.

Siden pandemien med koronavirussykdom 2019 (COVID-19) startet, har over 200 millioner tilfeller blitt rapportert globalt, og barn står for opptil 16% av laboratoriebekreftede tilfeller7. Mange studier har vist virkningen av eksisterende T1D på alvorlighetsgraden og dødsfallet av COVID-19-infeksjon8, mens virkningen av COVID-19-infeksjon på T1D-utvikling ikke er klar. Undersøkelsen av den totale frekvensen av COVID-19-infeksjon i befolkningen generelt ved bestemmelse av alvorlig akutt respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS-COV-2) antistoffer og studien av sammenhengen mellom COVID-19-infeksjon og utløsende T1D-autoimmunitet eller akselererende T1D-progresjon er presserende og svært viktig, mens den pågående ASK-studien er en utmerket plattform for dette. På grunn av enkeltanalyseformatet og genereringen av en stor andel av antistoffpositivitet med lav affinitet, har standard radiobindende analyse (RBA) møtt en flaskehals med lav effektivitet og lav sykdomsspesifisitet9. I dette papiret presenterer vi en ny 6-plexed elektrokjemiluminescens (ECL) analyse bygget på vår forrige multiplex ECL-analyseplattform ved hjelp av en multiple-Plex-plate, som kombinerer seks autoantistoffanalyser i en enkelt brønn, inkludert alle fire store IAbs til insulin (IAA), glutaminsyredekarboksylase-65 (GADA), insulinomantigen-2 (IA-2A) og sinktransport-8 (ZnT8A), autoantistoffer mot transglutaminase (TGA) for cøliaki, og SARS-CoV-2 reseptorbindende domene (RBD) antistoffer (COVID-19A). Dette er den første multipleksanalysen som rekrutterte et komplett panel på fire store IAb-er og videre kombinerte dette med TGA og COVID-19A. Det er validert og formelt akseptert som det primære screeningverktøyet som erstatter standard RBA i ASK-studien.

Protocol

Forskningsprotokollen ble godkjent av Colorado Multiple Institutional Review Board.

1. Forberedelse av buffer

  1. Forbered merkebufferen (2x PBS, pH 7,9): Tilsett 100 ml 10x PBS til 400 ml destillert vann og juster pH ved hjelp av NaOH til 7,9.
  2. Lag 3 mM biotin og Ru Sulfo-NHS: Oppløs 1 mg biotin i 588 μL merkebuffer og oppløs 150 nmol Ru Sulfo-NHS i 50 μL merkebuffer.
  3. Forbered antigenbufferen (1% BSA): Løs opp 5 g bovint serumalbumin (BSA) i 500 ml 1x PBS.
  4. Forbered beleggbufferen (3% blokkering A): Oppløs 15 g blokkering A i 500 ml 1x PBS.
  5. Forbered den første vaskebufferen (0,05 % Tween 20, PBST): Bland 2,5 ml Tween 20 i 5000 ml 1x PBS.
  6. Forbered den andre vaskebufferen (0,4 M NaCl): Bland 50 ml 5 M NaCl i 575 ml destillert vann for å lage 0,4 M NaCl-oppløsningen.
    MERK: For effektiv merking, bruk alltid nytilberedte biotin- og Ru Sulfo-NHS-løsninger og ikke lagrede som er laget tidligere.

2. Antigenproteinmerking med biotin og Ru Sulfo-NHS separat

MERK: En høyere konsentrasjon av antigenprotein ≥0,5 mg / ml anbefales for høyere merkingseffektivitet.

  1. Forbered seks målrettede antigenproteinløsninger, inkludert proinsulin, GAD-65, IA-2, ZnT8, TG og reseptorbindende domene (RBD) av piggproteinet til SARS-CoV-2. Beregn molene til hvert antigenprotein i henhold til dets molekylvekt og gjør passende molare forhold mellom biotin eller Ru Sulfo-NHS. Forholdet mellom antigen og summen av biotin eller Ru Sulfo-NHS vil være 1: 5 for små molekylære antigener (molekylvekt ≤10 kd), slik som proinsulinprotein. For medium molekylære antigener (molekylvekt 10-50 kd), slik som ZnT8, vil forholdet justere seg til 1:10. For store molekylvektantigener (molekylvekt >50 kd), slik som GAD, vil molforholdet være 1:20.
  2. Del antigenproteinet i to like deler og bland det separat med biotin og Ru Sulfo-NHS ved hjelp av det beregnede molforholdet i trinn 2.1. Inkuber blandingen ved romtemperatur (RT) i 1,5 timer, unngå lys.
    MERK: Alle reduserende kjemikalier som Tris eller glycin i bufferen av antigenprotein må fjernes ved en dimensjoneringsspinnkolonne primet med en buffer på 2x PBS (pH 7,9).
  3. Prime spinnkolonnene med 2x PBS (størrelsen på spinnkolonnen, 2 ml eller 5 ml, avhenger av volumet av merkingsantigenproteinet): Tilsett 1 ml 2x PBS-buffer i spinnkolonnen, sentrifuger den ved 1,000 x g i 2 minutter, og gjenta trinn 2x mer.
  4. La antigenprotein-biotin eller -Ru Sulfo-NHS-blandingen gå gjennom den primede spinnkolonnen 1x (sentrifuger kolonnen ved 1000 x g i 2 minutter) for å rense og stoppe merkingsreaksjonen.
  5. Mål det endelige volumet av det merkede antigenproteinet eluert fra spinnkolonnene, og beregne konsentrasjonene av biotin- eller Ru Sulfo-NHS-merket antigenprotein. Lag mindre aliquots av merket antigenprotein (50 μL / rør) og lagre dem ved -80 ° C for langvarig bruk.
    MERK: Dekningen av protein etter hver spinnkolonne vil være en omtrentlig 90% -95% retensjonsrate.

3. Definer den beste konsentrasjonen og forholdene for biotin- og Ru Sulfo-NHS-merkede antigener for 6-Plex ECL-analysen (sjakkbrettanalyse)

MERK: Sjakkbrettanalysen for hvert antigen er nødvendig før integrering i den multipleksede analysen.

  1. Påfør sjakkbrettanalysen for hvert antigen separat.
    MERK: Trinn 3.2.-3.7. vil bruke TGA som et kort eksempel. TGA checkerboard assay-prosessen er å simulere analyseprosessen, men med bare en type antigen.
  2. Gjør seriell fortynning av biotinylert tTG og Ru Sulfo-NHS-merket tTG. De anbefalte arbeidskonsentrasjonene av den første blandingsoppløsningen starter fra 240 ng / ml for både biotinylert og Ru Sulfo-NHS-merket tTG. Anta at konsentrasjonene av både original biotinylert og Ru Sulfo-NHS-merket tTG er 1,0 μg / μL. Lag en 10x fortynning av den opprinnelige Ru Sulfo-NHS-merkede tTG og en 5x fortynning av den opprinnelige biotinylerte tTG med 5% BSA.
  3. Bland 4 μL biotinylert tTG-protein med 156 μL 5% BSA (antigenbuffer) og 240 μL av den streptavidinkonjugerte linkeren i ett rør og inkuber løsningen ved RT i 30 minutter. Tilsett deretter 160 μL stoppløsning, og inkuber ved RT i ytterligere 30 minutter. Ta 400 μL av blandingen og bland med 2 ml stoppoppløsning. Konsentrasjonen av biotinylert tTG i blandingen er 240 ng / ml.
  4. For å lage en seriell fortynning for biotinmerket ZnT8-antigen, lag ytterligere fem nye rør, ta 1 ml av en aliquot fra blandingen i trinn 3.3. og bland med 1 ml stoppløsning i et nytt rør, og få blandingen med en konsentrasjon på 120 ng / ml. Gjenta dette trinnet, lag serielle 1: 1 fortynninger, og få biotinmerket tTG ved 60 ng / ml, 30 ng / ml, 15 ng / ml og 7,5 ng / ml.
  5. Tilsett 4 μL Ru Sulfo-NHS-merket tTG med 1,6 ml stoppløsning, og få en blanding av Ru Sulfo-NHS-merket tTG i en konsentrasjon på 240 ng / ml. Med de samme trinnene på 3.4., lag serielle 1: 1 fortynninger og få Ru Sulfo-NHS-merket ZnT8-antigen ved 60 ng / ml, 30 ng / ml, 15 ng / ml, 7,5 ng / ml og 3,75 ng / ml. Den siste konsentrasjonen er 0 ng / ml, med bare stoppløsning og ikke noe Ru Sulfo-NHS-merket antigen.
  6. Forbered tTG-positive kontroll- og negative kontrollserumprøver (prekvalifisert og standardisert av en enkelt ECL tTG-analyse) og en 96-brønns PCR-plate. Aliquot de positive og negative kontrollserumprøvene til henholdsvis venstre halvdel og høyre halvdel av platen, med 7 μL i hver brønn. Tilsett 1x PBS på platen, med 33 μL per brønn.
  7. På venstre halvdel av PCR-platen tilsettes 24 μL av den seriefortynnede biotinmerkede tTG-linkerløsningen til hver brønn, en kolonne med en konsentrasjon i rekkefølge fra høyeste til laveste. På samme måte tilsettes 16 μL av serielt fortynnet Ru Sulfo-NHS merket tTG-antigen til hver brønn, en rad med en konsentrasjon, og blandes deretter grundig. Gjenta trinnet på høyre halvdel av PCR-platen.
  8. Fortsett resten av analysetrinnene som er beskrevet i trinn 5.3.-9.1. til råtellingsdataene er oppnådd.
  9. Beregn forholdet mellom positive styresignaler og tilsvarende negative styresignaler. Bestem den beste konsentrasjonen for det biotinmerkede antigenet og Ru Sulfo-NHS-merket antigen med høyere forholdsverdier og lavere bakgrunn for den negative kontrollprøven. De optimale arbeidskonsentrasjonene av biotin og Ru Sulfo-NHS merket antigenprotein er vist nedenfor: 16,0 ng / ml og 8,0 ng / ml for GAD65, 18,8 ng / ml og 9,4 ng / ml for SARS-CoV-2 RBD, 42,0 ng / ml og 42,0 ng / ml for IA-2, 60,0 ng / ml og 60,0 ng / ml for tTG, 4,2 ng / ml og 4,2 ng / ml for ZnT8, og 31,3 ng/ml og 31,3 ng/ml for proinsulin.

4. Lag linker-koblet antigenløsning

  1. Fortynn biotin- og Ru Sulfo-NHS-merkede antigener med 5% BSA til de optimale arbeidskonsentrasjonene i henhold til trinn 3.9.
  2. Bind forhåndsvalgte linkere til hvert biotinylert antigenprotein. For en 96-brønns plateanalyse, tilsett 4 μL biotinylert GAD65, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 og proinsulinantigenprotein i et separat rør som inneholder 156 μL 1% BSA og bland med 240 μL tilsvarende streptavidinkonjugerte linkere 1, 2, 3, 8, 9 og 10 (figur 1). Inkuber blandingen i 30 minutter ved RT.
  3. Aliquot 160 μL stoppløsning i hvert rør og inkuber blandingen ved RT i 30 minutter. Ta ut 400 μL av blandingsoppløsningen fra hvert rør og kombiner dem sammen.
  4. Tilsett 4 μL Ru Sulfo-NHS merket GAD65, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 og proinsulinantigen til blandingen ovenfor, og tilsett deretter 1,6 ml stoppløsning og 3,2 ml 1x PBS og bland. Nå er antigenoppløsningen klar til bruk i analysen.

5. Inkuber serumprøver med det merkede antigenet

  1. Aliquot 7 μL serum per brønn for en 96-brønns PCR-plate og deksel med tetningsfilm. Forvarm seraen ved 56 °C i 30 minutter på en PCR-maskin. Sentrifuger platen kort ved 100 x g i 1 min.
  2. Tilsett 63 μL antigenoppløsning (fremstilt i trinn 4.4) per brønn, og bland med sera. Dekk PCR-platen med tetningsfolie for å unngå lys.
  3. Rist platen på en shaker ved 450 o / min ved RT i 2 timer og inkuber deretter platen ved 4 ° C i 18-24 timer.

6. Forbered 6-Plex-platen

  1. Ta en 6-Plex plate fra 4 ° C kjøleskapet, slik at platen kommer til RT. Tilsett 150 μL 3% blokkering A til hver brønn på 6-plex-platen.
  2. Sett platen tilbake i 4 °C kjøleskap, dekk platen med folie og inkuber over natten.
    MERK: Analysetrinnene i dag 1 omfatter avsnitt 4.-6.

7. Overfør serum/antigen inkuberer til 6-plex-platen

  1. Neste dag, ta den rugende 6-Plex-platen fra kjøleskapet og dump all bufferen ut av platen. Klapp tallerkenen på tørkepapir for å tørke ut.
  2. Vask 6-Plex-platen 3x med 150 μL vaskebuffer per brønn hver gang. Tørk tallerkenen på tørkepapir, og aliquot serum/antigen inkuberer fra hver brønn i den inkuberende PCR-platen over natten i to brønner av 6-Plex-platen (30 μL per brønn for duplikater).
  3. Dekk platen med folie, legg deretter platen på en plateskaker, og rist med en hastighet på 450 o / min ved RT i 1 time.

8. Vask 6-Plex-platen og legg til lesebuffer

  1. Dump løsningen i 6-Plex-platen og vask platen 3x med 150 μL 0,4 M NaCl vaskebuffer per brønn hver gang.
  2. Etter at den tredje vasken er fullført, tørk platen mot papirhåndkleet og tilsett 150 μL lesebuffer i hver brønn.
    MERK: Luftbobler i brønnen påvirker nøyaktigheten til platelesermaskinen og bør unngås for enhver pris.

9. Les platen og analyser dataene

  1. Tell platen på en elektrokjemiluminescensanalysator. Leseresultatene vil bli presentert med verdiene i antall per sekund (CPS). Beregn den relative antistoffindeksen for hver prøve ved hjelp av rå CPS oppnådd fra lesemaskinen mot CPS for den interne standard positive og negative kontrollen av hvert spesifikt antistoff (Indeksverdi = [CPS (utvalg) - CPS (negativ standard)] / [CPS (positiv standard) - CPS (negativ standard)]).
  2. Bestem negative eller positive antistoffresultater ved hjelp av grenseverdiene som er etablert ved 99,5th til 99,8th persentiler av 555 negative kontrollprøver fra ASK-studien (alle antistoffer negative prøver uten historie eller familiehistorie av diabetes eller annen type autoimmun sykdom).
    MERK: Analysetrinnene på dag 2 omfatter §§ 7-9.

Representative Results

Tabell 1, tabell 2 og tabell 3 illustrerer de representative resultatene. Rå CPS hentet fra lesemaskinen er illustrert i tabell 1. I tabell 2 ble rå CPS ordnet og sortert etter de seks linkerne og tilsvarende antistoffer. Tabell 3 viser de beregnede indeksverdiene med CPS som beskrevet i analyseprotokollen. Alle rå telleverdier bør kontrolleres for å unngå feil endelige indeksresultater forårsaket av dårlige duplikater. I tabell 1 er det gitt eksempler på dårlige duplikater, noe som resulterte i en feil i den endelige indeksberegningen i tabell 3.

Denne analysen ble validert på en blind måte ved hjelp av 880 utvalgte prøver fra ASK-studien med 325 IAbs positive prøver og 555 alle Abs negative prøver. Nivåene av autoantistoffer fra 6-Plex ECL-analyse for de 880 prøvene ble sammenlignet punkt for punkt med nivåene av tilsvarende enkelt-ECL-analyser (figur 2) og med tilsvarende enkeltstandard RBA (figur 3). Avskjæring, sensitivitet og spesifisitet for hvert antistoff er listet opp i tabell 4. Sensitiviteten og spesifisiteten til denne ECL-COVID-19A-analysen er identifisert som henholdsvis100 % og 99,9 %.

Figure 1
Figur 1: Illustrasjon av 6-plex ECL-analysen. Serumautoantistoffer gjør forbindelsen av Ru Sulfo-NHS-merket antigen til det biotinylerte antigenet, som er kombinert med en spesifikk linker og danner et kompleks av antigen-antistoff-antigen-linker. Kompleksene fanges gjennom hver spesifikke linker på de spesifikke stedene i 6-Plex-platen. For hvert antigen ble de spesifikke linkernumrene tildelt: GAD-linker-1, Covid-19-linker-2, IA-2-linker-3, tTG-linker-8, ZnT8-linker-9 og Proinslulin-linker-10. Dette tallet er endret med tillatelse fra He et al.11. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Sammenligning av seks antistoffnivåer i 880 prøver fra ASK-studien mellom den enkle ECL-analysen og 6-plex ECL-analysen. Panelene viser sammenligninger av antistoffnivåer for henholdsvis GADA, IAA, IA-2A, ZnT8A, TGA og COVID-19A (indeks for COVID-19A ble presentert som (100 x beregnet indeksverdi)). De stiplede linjene representerer analyseavskjæringene for hver antistoffanalyse. Dette tallet er endret med tillatelse fra He et al.11. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Sammenligning av fem antistoffnivåer i 880 prøver fra ASK-studien mellom RBA og 6-Plex ECL-analysen. Panelene viser sammenligninger av antistoffnivåer for henholdsvis GADA, IAA, IA-2A, ZnT8A og TGA. De stiplede linjene representerer analyseavskjæringene for hver antistoffanalyse. Dette tallet er endret med tillatelse fra He et al.11. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Tabell 1: Rå CPS-antall (venstre halvdel av platen). Rå CPS-tellinger ervervet fra venstre halvdel av en analyseplate. Hver prøve utføres i duplikat. Hvert CPS-antall i samme kolonne (A1, A2, A3 osv.) representerer lesedataene fra de 10 stedene i samme brønn (tilsvarende koblingsnumre er merket). Eksempler på ugyldige duplikater er uthevet i grått, som vist i rad D-linker 3 kolonne 5 og kolonne 6. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 2: Arrangement av tabell 1-dataene, sortert med seks linkere. CPS-verdier fra tabell 1 ble omorganisert, gjennomsnittsverdier for duplikatavlesninger av CPS og sletting av ubrukte verdier for linkere 4-7. Verdiene for den interne standarden høy positiv, lav positiv og negativ kontroll av hver autoantistoffanalyse er merket med mørk fet skrift. PC, positiv kontroll. NC, negativ kontroll. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 3: Resultater av indeksverdier. Indeksverdier for hver prøve for alle seks antistoffene ble beregnet mot de tilsvarende positive og negative kontrollene. En indeksverdi større enn grenseverdien ble definert som positiv, markert med mørk fet skrift. De dårlige dupliserte CPS-verdiene i tabell 1, rad D-linker 3-kolonne 5 og 6, førte til en positiv IA-2A-indeksverdi på utvalg 11 (uthevet i grått), som sannsynligvis var et falskt positivt resultat. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 4: Analyseavskjæring, sensitivitet og spesifisitet for GADA, IA-2A, ZnT8A, IAA og TGA blant 880 ASK-prøver, inkludert 325 IAbs positive prøver og 555 alle antistoffer negative prøver. Den optimale grenseindeksverdien for GADA-, IA-2A-, ZnT8A-, IAA- og TGA-analysen ble satt til minst 99-prosentilen av de 555 normale kontrollprøvene. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Discussion

Intervensjonen for T1D har gått inn i pre-T1D-æraen, med pågående nasjonale og internasjonale storskala screeningsprogrammer for T1D og blomstrende kliniske studier som brukes i trinn 1 T1D for å oppheve eller bremse progresjonen til kliniskT1D 12,13. Målinger av fire IAb-er ved bruk av gjeldende standard RBA med et enkelt IAb-analyseformat er arbeidskrevende og ineffektivt for et massescreeningsprogram. Med den presserende etterspørselen etter en multiplekset IAbs-analyse med høy gjennomstrømning, har multiplekset ECL-analyse, 3-Screen ICA ELISA og antistoffdeteksjon ved agglutinerings-PCR (ADAP) dukket opp som for tiden konkurransedyktige teknologier. I Fr1da-studien av screening for T1D i en populasjon av små barn i Tyskland, ble 3-Screen ICA ELISA kombinere 3 IAbs (GADA, IA-2A og ZnT8A) brukt som hovedtest14. En stor begrensning av 3-Screen ICA ELISA er mangelen på IAA, som for det meste er den første IAb som vises med høy prevalens hos små barn med T1D. Videre er analysen ikke i stand til å skille hvilken av de tre IAbene som er positiv fra et positivt signal, og hver positiv prøve må gjentas med tre enkeltanalyser for bekreftelse. ADAP15 kombinerer GADA, IA-2A og IAA og illustrerte høy analysefølsomhet og spesifisitet i IASP-verkstedet, men mangler data om hvor prediktivt det er i populasjonsbasert screening for T1D-studier, som IASP-verkstedet ikke er i stand til å bestemme. Multiplex ECL-analysen i denne studien er bygget på plattformen av en enkelt ECL-analyse som er validert mot gjeldende standard RBA i flere kliniske studier som TrailNet 9,16, DAISY17,18,19 og ASK 4,20,21 studium. Den foreliggende analysen er validert mot både RBA- og enkelt-ECL-analyse ved bruk av 880 serumprøver fra deltakerne i ASK-studien. Som vist i figur 2 og figur 3 var antistoffnivåer mellom 6-plex og enkelt ECL eller mellom 6-plex og RBA for det meste kongruente med hverandre for positiviteten til antistoffer. Tilfeldighetsratene for IAbs testet av RBA og 6-Plex var 91,7% -97,8%, og tilfeldighetsratene for IAbs testet av enkelt ECL og 6-Plex var 95,3% -99,2%. Uenighet mellom ECL-analysen og RBA var hovedsakelig fra de med enkelt IAb. Nivåene av IAbs testet av 6-Plex og enkelt ECL (r = 0,6431-0,9434, alle p < 0,0001) og 6-Plex og RBA (r = 0,5775-0,8576, alle p < 0,0001) var også godt korrelert. TGA testet med 6-plex analyse var sterkt korrelert med resultatene av både RBA (99,4 %) og enkelt ECL-analyse (99,4 %). I tillegg oppnådde COVID-19A testet av 6-Plex 99,8 % samsvar med resultatene av den enkle ECL-analysen.

Som et resultat har 6-Plex ECL-analysen formelt blitt akseptert som den primære screeningmetoden for den pågående ASK-studien og erstattet standarden RBA22. Denne analysen viste sin utmerkede følsomhet og spesifisitet med høyere gjennomstrømning, lavere kostnader og mindre volum serum sammenlignet med standard RBA.

Det er dokumentert at i T1D-screeningstudien var enkelt IAb oppdaget av RBA, som tok opp en stor andel av IAb-positiviteter, av lav affinitet, med lav sykdomsrisiko, og resulterte i samlet lav prediktiv verdi 19,21,23,24,25,26. Slike lav risiko prediksjon forårsaket store ekstra kostnader for oppfølgingsbesøk og resulterte i vanskeligheter for T1D forebyggende studier. Den etablerte ECL-analyseplattformen har blitt demonstrert i flere kliniske studier for å diskriminere IAb-er med høy affinitet fra IAb-er med lav affinitet generert av RBA og forbedre de prediktive verdiene for alle fire IAb-ene, spesielt med enkelt IAb-positivitet16,17,18,21 . Multiplex ECL-analyseteknologien ble bygget på plattformen til den enkle ECL-analysen, med denne distinkte fordelen med deteksjon av abs med høy affinitet. I denne studien illustrerte 6-Plex ECL-analysen dens likhet med de tilsvarende enkelt-ECL-analysene i sensitivitet og spesifisitet.

Noen begrensninger og de tekniske bekymringene til multipleks-ECL-analysen ved bruk av flere Plex-plater er allerede dekket i tidligere publikasjoner27,28. Med seks merkede antigener i en brønn kan det være noen påvirkninger mellom forskjellige antigener, og analysebakgrunnen kan øke når man legger til hver antistoffanalyse for multipleksing i samme brønn. En stor mengde analyseoptimaliseringsarbeid er nødvendig for å justere analysebetingelsene, spesielt for å justere de endelige konsentrasjonene av hvert merket antigenprotein basert på sjakkbrettanalysen for hvert antigen, for å opprettholde følsomheten og spesifisiteten for hver antistoffanalyse. Som nevnt i tidligere studier27,28, resulterer et lite antall prøver (<1%) i falsk positivitet på flere Plex-plater uten en klar underliggende årsak. Alle positive resultater bør gjentas og bekreftes med en enkelt ECL-analyse som rutinemessig laboratoriekvalitetssikring; Vanligvis vil de falske positivene bli fjernet. Falske negative resultater forårsaket av "prozoneffekten" observert i den forrige 7-Plex ECL-analysen27,28 ble ikke observert i denne studien. I analysen beskrevet her fjernet vi trinnet i syrebehandlingen av serumprøver fra forrige protokoll; i stedet forvarmet vi serumprøvene ved 56 °C i 30 minutter (trinn 5.1.). På den andre dagen av platevask brukte vi en vaskebuffer som inneholdt 0,4 M NaCl (trinn 8,1.) i stedet for vanlig vaskebuffer for å vaske platen strengere. Disse modifikasjonene gjorde multipleksen ECL-analysen enklere og senket bakgrunnen uten å miste analysefølsomheten.

Avslutningsvis har denne analysen enestående ytelse for å oppdage fire IAbs, TGA og COVID-19A samtidig. Multipleksingsfunksjonen, samt høy gjennomstrømning, lave kostnader og lite serumvolumkrav, gjør storskala screening for T1D og samtidige sykdommer mye mer gjennomførbart i befolkningen generelt. Pasienter med T1D eller noen autoimmune sykdommer har en mye høyere risiko for andre autoimmune sykdommer. Multiplex ECL-analysen gir en utmerket plattform for å skjerme for T1D og flere autoimmune sykdommer samtidig.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Studien ble støttet av JDRF-stipend 2-SRA-2019-695-S-B, 2-SRA-2020-965-S-B, 1-SRA-2017-564-M_N, NIH-stipend DK32083 og Diabetes Research Center (DRC) stipend P30 DK116073.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5 mM NaCl ThermoFisher 1070832
96-well Plate Shaker VWR 12620-926
96-well round bottom plate Fisher 8408220
Biotin ThermoFisher PI21329
Blocker A MSD R93AA
Bottle-Top 500 ml-Filter Units Fisher 0974064A
Bovine Serum Albumin Sigma A-7906
GAD65 protein Diamyd Medical 10-65702-01
IA-2 protein (aa 605-979) Creative BioMart 283309
MESO QuickPlex SQ120 MSD R31QQ-3 Electrochemiluminescence analyzer
PBS 10x ThermoFisher 70011044
PBS 1x ThermoFisher 10010023
Proinsulin protein AmideBio 20160118B3
Read buffer B MSD Y0800019
SARS-CoV-2 RBD protein Creative Biomart Spike-190V
Stop Solution MSD Y0090019
Sulfo-TAG MSD R91AO-1
tTG protein Diarect AG 15201
Tween 20 Sigma P-1379
U-Plex 6-Assay SECTOR plate MSD Z00U0142E 6-plex plate
U-PLEX Linker 1 MSD L0010022
U-PLEX Linker 10 MSD L0100020
U-PLEX Linker 2 MSD L0020015
U-PLEX Linker 3 MSD L0030018
U-PLEX Linker 8 MSD L0080018
U-PLEX Linker 9 MSD L0090014
ZeBa Column ThermoFisher 89892 Spin columns
ZnT8 protein Research Laboratory n/a

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Group, T. S. The Environmental Determinants of Diabetes in the Young (TEDDY) Study. Annals of the New York Academy of Sciences. 1150, 1-13 (2008).
  2. Vehik, K., et al. Increasing incidence of type 1 diabetes in 0- to 17-year-old Colorado youth. Diabetes Care. 30 (3), 503-509 (2007).
  3. Insel, R. A., et al. Staging presymptomatic type 1 diabetes: a scientific statement of JDRF, the Endocrine Society, and the American Diabetes Association. Diabetes Care. 38 (10), 1964-1974 (2015).
  4. Stahl, M. G., et al. Mass screening for celiac disease: The autoimmunity screening for kids study. The American Journal of Gastroenterology. 116 (1), 180-187 (2021).
  5. Al-Hussaini, A., Sulaiman, N., Al-Zahrani, M., Alenizi, A., El Haj, I. High prevalence of celiac disease among Saudi children with type 1 diabetes: A prospective cross-sectional study. BMC Gastroenterology. 12, 180 (2012).
  6. Agardh, D., et al. Clinical features of celiac disease: A prospective birth cohort. Pediatrics. 135 (4), 627-634 (2015).
  7. Jaime, G., Deville, E. S., Ouellette, C. P. COVID-19: Clinical manifestations and diagnosis in children. UpToDate. , Available from: https://www.uptodate.com/contents/covid-19-clinical-manifestations-and-diagnosis-in-children/print (2021).
  8. Barron, E., et al. Associations of type 1 and type 2 diabetes with COVID-19-related mortality in England: a whole-population study. The Lancet Diabetes & Endocrinology. 8 (10), 813-822 (2020).
  9. Miao, D., et al. Electrochemiluminescence assays for insulin and glutamic acid decarboxylase autoantibodies improve prediction of type 1 diabetes risk. Diabetes Technology & Therapeutics. 17 (2), 119-127 (2015).
  10. Jia, X., et al. Prevalence of SARS-CoV-2 antibodies in children and adults with Type 1 diabetes. Diabetes Technology & Therapeutics. 23 (7), 517-521 (2021).
  11. He, L., et al. High-throughput multiplex electrochemiluminescence assay applicable to general population screening for type 1 diabetes and celiac disease. Diabetes Technology & Therapeutics. , (2022).
  12. McQueen, R. B., et al. Cost and cost-effectiveness of large-scale screening for type 1 diabetes in Colorado. Diabetes Care. 43 (7), 1496-1503 (2020).
  13. Insel, R. A., Dunne, J. L., Ziegler, A. G. General population screening for type 1 diabetes: has its time come. Current Opinion in Endocrinology & Diabetes and Obesity. 22 (4), 270-276 (2015).
  14. Ziegler, A. G., et al. 3 Screen ELISA for high-throughput detection of beta cell autoantibodies in capillary blood. Diabetes Technology & Therapeutics. 18 (11), 687-693 (2016).
  15. Cortez, F. J., et al. Sensitive detection of multiple islet autoantibodies in type 1 diabetes using small sample volumes by agglutination-PCR. PLoS One. 15 (11), 0242049 (2020).
  16. Steck, A. K., et al. ECL-IAA and ECL-GADA can identify high-risk single autoantibody-positive relatives in the TrialNet pathway to prevention study. Diabetes Technology & Therapeutics. 18 (7), 410-414 (2016).
  17. Yu, L., et al. Proinsulin/Insulin autoantibodies measured with electrochemiluminescent assay are the earliest indicator of prediabetic islet autoimmunity. Diabetes Care. 36 (8), 2266-2270 (2013).
  18. Miao, D., et al. GAD65 autoantibodies detected by electrochemiluminescence assay identify high risk for type 1 diabetes. Diabetes. 62 (12), 4174-4178 (2013).
  19. Yu, L., et al. Distinguishing persistent insulin autoantibodies with differential risk: Nonradioactive bivalent proinsulin/insulin autoantibody assay. Diabetes. 61 (1), 179-186 (2012).
  20. Zhao, Z., et al. Higher sensitivity and earlier identification of celiac disease autoimmunity by a nonradioactive assay for transglutaminase autoantibodies. Journal of Immunology Research. 2016, 2904563 (2016).
  21. Jia, X., et al. High-affinity ZnT8 autoantibodies by electrochemiluminescence assay improve risk prediction for type 1 diabetes. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 106 (12), 3455-3463 (2021).
  22. He, L., et al. A complete-panel islet autoantibody multiplex ECL assay. Diabetes. 70, Supplement 1 158 (2021).
  23. Achenbach, P., et al. Mature high-affinity immune responses to (pro)insulin anticipate the autoimmune cascade that leads to type 1 diabetes. Journal of Clinical Investigation. 114 (4), 589-597 (2004).
  24. Schlosser, M., et al. In insulin-autoantibody-positive children from the general population, antibody affinity identifies those at high and low risk. Diabetologia. 48 (9), 1830-1832 (2005).
  25. Mayr, A., et al. GAD autoantibody affinity and epitope specificity identify distinct immunization profiles in children at risk for type 1 diabetes. Diabetes. 56 (6), 1527-1533 (2007).
  26. Siljander, H., et al. Role of insulin autoantibody affinity as a predictive marker for type 1 diabetes in young children with HLA-conferred disease susceptibility. Diabetes/Metabolism Research and Reviews. 25 (7), 615-622 (2009).
  27. Gu, Y., et al. High-throughput multiplexed autoantibody detection to screen type 1 diabetes and multiple autoimmune diseases simultaneously. Ebiomedicine. 47, 365-372 (2019).
  28. Jia, X., He, L., Gu, Y., High, H., Yu, L. A high-throughput electrochemiluminescence 7-plex assay simultaneously screening for type 1 diabetes and multiple autoimmune diseases. Journal of Visualized Experiments. (159), e61160 (2020).

Tags

Immunologi og infeksjon utgave 185 Elektrokjemiluminescensanalyse multipleks autoantistoffanalyse type 1 diabetes autoimmun sykdom COVID-19 screening prediksjon
En multiplekset screening med høy gjennomstrømning for type 1 diabetes, cøliaki og COVID-19
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jia, X., He, L., Miao, D., Zhang,… More

Jia, X., He, L., Miao, D., Zhang, C., Rewers, M., Yu, L. A High-Throughput Multiplexed Screening for Type 1 Diabetes, Celiac Diseases, and COVID-19. J. Vis. Exp. (185), e63787, doi:10.3791/63787 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter