Summary
Denne protokol giver en praktisk løsning, der muliggør måling af apoptose, mitokondriemembranpotentiale og DNA-skader i menneskelig sæd med et enkelt cytometer.
Abstract
Den konventionelle sædparameteranalyse bruges i vid udstrækning til at vurdere mandlig fertilitet. Undersøgelser har imidlertid vist, at ~ 15% af infertile patienter ikke viser nogen abnormiteter i konventionelle sædparametre. Yderligere teknologier er nødvendige for at forklare idiopatisk infertilitet og opdage subtile sæddefekter. I øjeblikket afslører biomarkører for sædfunktion, herunder sædapoptose, mitokondriemembranpotentiale (MMP) og DNA-skade, sædfysiologi på molekylært niveau og er i stand til at forudsige mandlig fertilitet.
Med flowcytometri (FCM) teknikker kan hver af disse markører måles hurtigt, præcist og præcist i humane sædprøver, men tidsomkostningerne stiger betydeligt, og resultaterne kan blive blokeret, hvis alle biomarkører skal testes med et enkelt cytometer. I denne protokol blev sædprøver efter opsamling og øjeblikkelig inkubation ved 37 °C til flydende fremstilling yderligere analyseret for sædapoptose under anvendelse af Annexin V-fluoresceinisothiocyanat (FITC)/propidiumiodid (PI) farvning. MMP blev mærket med 5,5′,6,6′-tetrachlor-1,1′,3,3′-tetraethyl-benzimidazolylcarbocyaniniodid (JC-1) sonde, og DNA-skader blev vurderet ved anvendelse af sædkromatinstrukturanalysen (SCSA) med acridinorange (AO) farvning. Således kan flowcytometrisk analyse af sædfunktionsmarkører være et praktisk og pålideligt værktøjssæt til diagnosticering af infertilitet og evaluering af sædfunktion på både bænk og seng.
Introduction
Infertilitet er blevet et folkesundhedsproblem, hvor mandlig infertilitet bidrager til 40% -50% af alle tilfælde 1,2. Selvom konventionel sædkvalitetsanalyse spiller en vigtig rolle i bestemmelsen af mandligt fertilitetspotentiale, har ca. 15% af patienterne med infertilitet normale sædparametre såsom sædtal, motilitet og morfologi3. Desuden har rutinemæssige sædundersøgelser dårlig repeterbarhed, giver begrænset information om sædfunktion og kan ikke give en nøjagtig vurdering af mandlig fertilitet eller afspejle sædcellernes subtile defekter. Flere teknikker er udviklet til at teste sædfunktion, såsom hemizona-analysen (HZA), sædpenetrationsanalysen, den hypoosmotiske hævelsestest, antispermantistoftesten, men disse metoder er tidskrævende og sårbare over for subjektive påvirkninger fra operatørerne. Derfor er det nødvendigt at udvikle hurtige og præcise metoder til sædfunktionsanalyse.
FCM er en hurtig, enkeltcelle analyse teknologi udviklet i 1970'erne, som har været meget udbredt i forskellige områder af cellebiologi og medicin. FCM er et robust værktøj til evaluering af sædfunktion, der analyserer spermatozoer mærket med en specifik fluorescenssonde4. Spermatozoerne passerer gennem enkelt- eller flerkanals lasere, og spredt lys og udsendt fluorescens produceres af en laserstråle. Det spredte lys inkluderer fremadrettet spredt lys (FSC) og sidespredt lys (SSC), som afspejler størrelsen på den testede celle og cellegranulariteten eller den interne struktur. Disse signaler indsamles, vises og analyseres af computersystemet, og følgelig måles en række egenskaber fra spermatozoerne hurtigt og præcist. Derfor er FCM en hurtig, objektiv, flerdimensionel og high-throughput teknik, der har fået stigende opmærksomhed inden for sædanalyse. Anvendelsen af FCM kan kompensere for mangler i traditionelle metoder og giver en ny tilgang til påvisning af sædets indre struktur og funktion.
Sperm apoptose er tæt forbundet med mandlig fertilitet5. Påvisning af sædapoptose er et vigtigt indeks til evaluering af sædfunktion på molekylært niveau. FCM er bredt anerkendt som en pålidelig og følsom metode til påvisning af sædapoptose ved hjælp af Annexin V-FITC / PI-farvning. Det grundlæggende princip er, at phosphatidylserin (PS) overføres fra det indre lag af cellemembranen til dets ydre lag i det tidlige stadium af apoptose. Annexin V er et Ca2+-afhængigt phospholipidprotein (normalt mærket af FITC), der har en høj affinitet for PS, og registrerer således PS udsat for den ydre overflade af cellemembranen6. Nekrose og apoptose kan skelnes i kombination med Pl-farvning. Derfor anvendes metoden til Annexin V-FITC / PI dobbeltfarvning i vid udstrækning, da det er hurtigt, enkelt og let at detektere forskellige apoptotiske sædceller.
En moden pattedyrsæd indeholder ca. 72-80 mitokondrier7, hvilket tyder på en biologisk årsag til tilbageholdelse af sædmitokondrier8. Sperm mitokondrier har vist sig at spille vigtige roller i at opretholde sædmotilitet og fertilitet9. JC-1-pletten, som kan bruges som indikator for MMP i en række celletyper, er en af de mest populære fluorkromer til vurdering af sædmitokondrieaktivitet10. JC-1 er et kationisk farvestof, der potentielt akkumuleres i mitokondrierne. JC-1 har en maksimal fluorescensemission ved 525 nm (grøn) og danner J-aggregater 11, når den bindes til membraner med et højt potentiale (ΔΨm, 80-100 mV), hvilket resulterer i et skift i fluorescensemission til ~ 590 nm (orange-rød). Derfor indikeres sædmitokondriel depolarisering ved et fald i det røde / grønne fluorescensintensitetsforhold, og FCM kan bruges til at detektere MMP-niveauer i humane sædprøver.
SCSA-metoden blev opfundet af Evenson et al.12 og betragtes som en præcis og gentagelig test med unikke dualparameterdata (rød vs grøn fluorescens) på en 1.024 × 1.024 kanalskala 13. I beskadigede sædceller mærkes DNA og ændrede proteiner i sædkerner med AO, og brud på DNA-strengen måles ved rød fluorescens, mens intakte dobbeltstrenge udsender grøn fluorescens i FCM14. I dag er der udviklet mange metoder til at estimere sædets DNA-integritet. Men i modsætning til SCSA er disse analyser ofte arbejdskrævende og mangler evnen til en diagnose af mandlig infertilitet. SCSA-testresultaterne korrelerer signifikant med human DNA-graviditet og abort, giver overbevisende bevis for, at SCSA kan være nyttigt i human sædanalyse og kan tjene som et værdifuldt værktøj til infertilitetsklinikere15.
Kromatinintegritet, MMP og apoptose afspejler forskellige aspekter af sædfunktionen, og kombinationen af disse biomarkører kan således give en mere omfattende indsigt i sædstatus. FCM kan anvendes til separate målinger af enten kromatinintegritet, MMP eller apoptose i humane sædprøver. Selv om udgifterne til materialer bestemt til kontakt med fødevarer og omkostningerne ved farvestoffer har begrænset den brede anvendelse af disse teknikker i kliniske laboratorier for reproduktiv sundhed, accepteres deres værdi for vurdering af frugtbarhed.
Da hvert af forsøgene kræver forbehandling af sædprøver, og alle forbehandlede prøver skal testes hurtigst muligt, kan samtidig måling af alle tre biomarkører for en prøve med en enkelt FCM imidlertid føre til lang ventetid på nogle af forsøgene og hindre resultaternes pålidelighed. Dette skyldes, at sædcellerne får yderligere skade under ventetiden, hvis protokollen ikke er ordentligt arrangeret under hensyntagen til alle de tre eksperimenter fuldt ud. Dette papir præsenterer en protokol, der realiserer den flydende måling af alle de tre biomarkører i en enkelt cytometri uden væsentligt kompromis med eksperimentkvaliteten induceret af langvarige ventetider.
Protocol
BEMÆRK: Arbejdsproces til påvisning af biomarkører for sædfunktionsskader ved flowcytometri inkluderer (1) celleforberedelse, (2) farvning med fluorescerende reagenser og (3) flowcytometrisk analyse og datafortolkning (figur 1). Protokollen følger retningslinjerne fra de etiske komitéer ved Army Medical University (1.0/2013.4-12).
1. Celle forberedelse
- Få humane sædprøver ved onani i plastik kliniske prøveglas, helst efter 3-5 dages afholdenhed.
- Sædprøverne inkuberes straks i en inkubator på 37 °C, og prøverne gøres fuldstændigt flydende (op til 1 time).
2. Sædceller talt ved hjælp af computerstøttet sædanalyse (CASA)
- Bland de flydende sædprøver grundigt.
- Tilsæt 10 μL sæd i et sædtællingskammer (se materialetabellen).
- Scan diasene i sædklasseanalysatoren (se materialetabellen), og tæl mindst seks områder og 400 spermatozoer til estimering af sædkoncentration.
BEMÆRK: Sædprøver skal være friske, ikke frosne, til sædapoptose og MMP-analyse.
3. Farvning af sædceller
- Påvisning af sædapoptose ved hjælp af Annexin V-FITC / PI-farvning
- Tilsæt 1 × 106 sædceller til et 1,5 ml centrifugerør.
- Cellerne vaskes med 500 μL koldt fosfatbufret saltvand (PBS).
- Sædcellesuspensionen centrifugeres ved 300 × g i 7 minutter, og supernatanten kasseres.
- Sædcellerne resuspenderes i 200 μL 1x bindende buffer.
- Der tilsættes 2 μL FITC Annexin V og 2 μL PI (se materialetabellen).
- Cellerne hvirvirvles forsigtigt ud, inkuberes i 15 minutter ved stuetemperatur (25 °C) i mørke, og de anbringes straks i flowcytometeret til analyse.
- Analyse af mitokondriemembranpotentiale ved hjælp af JC-1-sonde
- Tilsæt 2 × 106 sædceller til et 1,5 ml centrifugerør og centrifuger ved 600 × g i 5 min.
- Resuspender sædcellesuspensionen i 1 ml JC-1 arbejdsopløsning (se materialetabellen).
- Hvirvl forsigtigt cellerne og inkuber i 20 minutter ved 37 °C i mørke.
- Opslæmningen centrifugeres ved 600 × g i 5 min. og supernatanten kasseres.
- Pellet vaskes to gange med 1 ml PBS med en hastighed på 600 × g i 5 min hver.
- Resuspender de farvede sædceller i 1 ml PBS i flowcytometerrør, og anbring straks rørene i flowcytometeret til analyse.
- Brug carbonylcyanid m-chlorphenylhydrazon (CCCP) som en positiv kontrol. Sædcellerne resuspenderes (som tidligere beskrevet i trin 3.2.1) i 1 ml CCCP-arbejdsopløsning (se materialetabellen), og cellerne hvirvles forsigtigt og inkuberes i 20 minutter ved stuetemperatur. Opslæmningen centrifugeres ved 600 × g i 5 min. og supernatanten kasseres. Gentag trin 3.2.2-3.2.6.
- Sperm kromatin struktur assay
- En prøve flydende rå sæd (0,25 ml) anbringes i et kryorør, og sædprøverne fryses straks ned i flydende nitrogen (-196 °C), indtil de er klar til SCSA.
- Sædprøverne optøs i et 37 °C vandbad og fortyndes med TNE-buffer (se materialetabellen) til en koncentration på 1-2 × 106 celler/ml.
- Der tilsættes 200 μL af den fortyndede prøve til et flowcytometerreagensglas og blandes med 400 μL syreopløsning (se materialetabellen) i 30 s.
- Plet prøverne med 1,2 ml AO-farvningsopløsning (se materialetabellen) og læg dem straks i flowcytometeret til analyse.
- Brug en referenceprøve som intern standard til flowcytometeropsætning og kalibreringer. Referenceprøven fortyndes med 4 °C TNE-buffer til en koncentration på 1-2 × 106 celler/ml. Gentag trin 3.3.1-3.3.4.
BEMÆRK: Alle opløsninger og buffere opbevares ved 4 °C. (1) Sæden må ikke fortyndes før lynfrysning. Rå sædprøver skal optøs og fortyndes med TNE-buffer på tidspunktet for flowcytometrimålinger. (2) For infertilitetsklinikker skal ~ 0,25 ml rå sæd lynfryses i en ultrakold fryser eller en LN2-tank. Disse frosne alikvoter kan derefter sendes til et SCSA-diagnostisk laboratorium på tøris eller i en LN2-tørafsender. (3) En human ejakulatprøve, der viser heterogenitet af DNA-integritet (f.eks. 15% DNA-fragmenteringsindeks [DFI]), blev anvendt som en intern standardreference.
4. Opsætning af flowcytometer
BEMÆRK: Før flowcytometeret startes, skal instrumentets systemkontrol udføres for at verificere analytisk ydeevne. Kør prøverne, når alle kontroller er gennemført og bestået.
- Åbn flowcytometersoftwaren, og start cytometeret.
- Indsaml eksempeldata.
- Først skal du indlæse en kontrolprøve på flowcytometeret og klikke på KØR for at starte dataindsamling (juster indstillingerne, hvis det er nødvendigt). Vent på, at instrumentet begynder at aspirere prøven, og giv en forhåndsvisning i realtid af registrerede hændelser.
BEMÆRK: Kontrolprøven: en negativ kontrol (ufarvede sædceller) for sædapoptose; en positiv kontrol (CCCP-behandlede celler) for MMP en referenceprøve for SCSA. - Opret punktdiagrammer til visning af data, og vælg x/y-akseparametrene (f.eks. FSC, SSC) og lineær for at angive, at data vises. Vælg og anvend en polygonal port til at afgrænse sædpopulationen til analyse, og så instrumentet plotter detekterede begivenheder i realtid.
- Analyser sædhændelserne i regionen.
- For sædapoptose skal du indstille FL1 som x-aksen og FL2 som x-aksen. For at isolere de levende, apoptotiske eller nekrotiske celler skal du trykke og trække kvadrantporten for at underindstille sædpopulationerne ned til fire specifikke populationer.
- For MMP skal du indstille FL1 som x-aksen og FL2 som y-aksen. Opret en polygonal port for at undersætte sædpopulationerne ned til to specifikke populationer.
- For SCSA skal du indstille FL4 som x-aksen (rød fluorescens, 125/1.024 flowcytometrikanaler) og FL1 som y-aksen (grøn fluorescens, 475/1.024 flowcytometrikanaler). Træk portene i en vinkel på 45° for at udelukke signaler om celleaffald.
- Angiv en kørselsgrænse for at angive, hvornår indsamlingen af data skal stoppes. Beregn i alt 10.000 sædceller for hver prøve til sædapoptose-, MMP- og SCSA-analyser.
- Indstil fluidikhastigheden (langsom, medium og hurtig eller en brugerdefineret fluidikhastighed) afhængigt af celletallene.
BEMÆRK: Til SCSA-analyse skal du optø den frosne råprøve for at bestemme sædkoncentrationerne og køre den på FCM. Hvis strømningshastigheden er >250/s, fortyndes prøven til den korrekte strømningshastighed. Mål alle prøver uafhængigt to gange, og beregn middelværdierne. En referenceprøve blev testet, når hver 10-15 prøver blev målt for at sikre standardisering og stabilitet af instrumentet fra dag til dag. - Indstil tærsklen for at fjerne snavs og støj fra celleprøver. Anvend disse indstillinger for alle prøver i eksperimentet.
- Indstil om nødvendigt farvekompensationen for at korrigere fluorescensspild.
- Forsigtigt back-pipette prøverne, før du lægger dem på flowcytometeret, navngiv prøven og kør prøverne.
- Når alle prøver er kørt, skal du gemme eksempeldataene som FCS-filer ved at give dem et filnavn til yderligere softwareanalyse. Gem arbejdsskabelonen for det aktuelle eksperiment til hentning i fremtidige kørsler (valgfrit).
- Først skal du indlæse en kontrolprøve på flowcytometeret og klikke på KØR for at starte dataindsamling (juster indstillingerne, hvis det er nødvendigt). Vent på, at instrumentet begynder at aspirere prøven, og giv en forhåndsvisning i realtid af registrerede hændelser.
5. Analyse af data
- Importer dataene til dataanalysesoftwaren til flowcytometeret (se materialetabellen).
- Dobbeltklik på det første eksempel i arbejdsområdet. Vent, indtil et grafvindue åbnes, der viser et plot af begivenheder langs FSC versus SSC-parametre. Opret en port, der isolerer sædpopulationen, der er inkluderet i porten, og producerer en 'barn' population fra det overordnede sæt begivenheder.
- Dobbeltklik inden for det lukkede område, og åbn et nyt grafvindue , der kun indeholder sædhændelserne. Indstil x- og y-akseparametrene for at vælge fluorescerende kanal.
- Vælg portværktøjet . Klik inden for plottet for at få portene til at vises, så de oprettede porte isolerer de forskellige cellepopulationer.
- Højreklik (eller ctrl-klik) på en af de fremhævede rækker, og vælg Kopiér analyse for at gruppere. Anvend gating-træet på alle prøver i gruppen.
- Gem og eksportér datatabellen.
Representative Results
Figur 2 viser måling af sædapoptose ved hjælp af Annexin V-FITC / PI-farvning. FITC-signalet (grøn fluorescens) blev målt i FL1-kanalen, og PI-signalet (rød fluorescens) blev målt i FL2-kanalen. I Annexin V/PI-bivariatanalysen identificerede kvadrantproducenterne fire karakteristiske sædpopulationer. Resultaterne blev udtrykt som procentdelen af Annexin V-/PI-sædceller (levedygtige eller levende celler), Annexin V+/PI-sædceller (tidlige apoptotiske celler eller apoptotiske celler), Annexin V+/PI+-sædceller (sene apoptotiske celler) og Annexin V-/PI+-sædceller (nekrotiske celler)16,17 (figur 2B). En negativ kontrol (ubesmittede sædceller) blev også brugt til at oprette kompensation og kvadranter (figur 2A).
Figur 3 viser måling af MMP ved hjælp af JC-1-sonde i human sæd. MMP% præsenteres som orange-rød / (grøn + orange-rød) fluorescensforhold ved at analysere cytogrammet. En sædprøve af god kvalitet viser normalt høj orange-rød fluorescens og lav grøn fluorescens (aktive mitokondrier, øverste venstre kvadrant) (figur 3A). Omvendt viser en sædprøve af dårlig kvalitet normalt lav orange-rød fluorescens og høj grøn fluorescens (inaktive mitokondrier, nederste højre kvadrant), muligvis på grund af mitokondrieforstyrrelser (figur 3B).
Figur 4 viser dataene for SCSA13,14. Disse typiske SCSA-cytogrammer blev opnået fra to individuelle prøver. Prøve A kom fra en frugtbar mand og prøve B fra en ufrugtbar mand. Analyse af flowcytometriske data blev udført ved hjælp af FlowJo-software. Cytogrammer viser kilden til hver komponent i SCSA-data. X-aksen (rød fluorescens med 1.024 graderinger af rød fluorescens) indikerer fragmenteret DNA; y-aksen (grøn fluorescens med 1.024 graderinger) angiver native DNA-farvning. Den stiplede linje ved y = 750 repræsenterer grænsen for normal sæd. Over denne linje på y = 750 er sædceller med delvist ikke-kondenseret kromatin, som blev bestemt som umodne sædceller.
Figur 1: Arbejdsproces til påvisning af biomarkører for sædfunktionsskader ved flowcytometri. Sædprøver blev udtaget og forbehandlet som beskrevet i protokoltrin 1. (1) Cellepræparation, (2) farvning med fluorescerende reagenser og (3) flowcytometrisk analyse og datafortolkning. Forkortelser: MMP = mitokondriemembranpotentiale; SCSA = sædkromatinstrukturanalyse; PBS = fosfatbufret saltvand AO = acridin orange. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Repræsentative resultater af sædapoptose ved anvendelse af Annexin V-FITC / PI-farvning. Den nederste venstre kvadrant indeholder Annexin V-/PI-sædceller (levedygtige eller levende celler), den nederste højre kvadrant viser Annexin V+/PI-sædceller (tidlige apoptotiske celler eller apoptotiske celler), den øverste højre kvadrant repræsenterer Annexin V+/PI+ sædceller (sene apoptotiske celler), og den øverste venstre kvadrant indeholder Annexin V−/PI+ sædceller (nekrotiske celler). (A) Negativ kontrol (uplettede sædceller); B) en prøve med sædapoptose. Forkortelser: FITC = fluoresceinisothiocyanat; PI = propidiumiodid. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Måling af mitokondriemembranpotentiale ved hjælp af JC-1-sonde . (A) Sædsubpopulationen med høj MMP. (B) Sædsubpopulationen med lav MMP. Indstil FL1-A og FL2-A som henholdsvis x-aksen (grøn fluorescens) og y-aksen (orange-rød fluorescens). Forkortelser: MMP = mitokondriemembranpotentiale. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Påvisning af DNA-skader i menneskelig sæd ved hjælp af sædkromatinstrukturanalyse . (A) En sædprøve med normal kromatinstruktur. (B) En sædprøve med høj andel spermatozoer med unormal kromatinstruktur. FlowJo software blev brugt til at lave computerporte omkring cellepopulationerne identificeret som: 1) normal sæd, 2) HDS-sæd, 3) DFI-sæd og 4) celleaffald, og procentdele af HDS- og DFI-sæd blev beregnet. Forkortelse: SCSA = sædkromatinstrukturanalyse; HDS = høj DNA-farvning; DFI = DNA-fragmenteringsindeks. Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
Kromatinintegritet, MMP og apoptose af humane spermatozoer har vist sig at være værdifulde prædiktorer for reproduktive resultater. Den senest udgivne WHO-laboratoriemanual til undersøgelse og behandling af menneskelig sæd (sjette udgave) fremhævede også nogle af disse indikatorer (kromatinintegritet og apoptose) som udvidede undersøgelser ud over den grundlæggende undersøgelse af rutineparametre såsom sædtal18. Nylige publikationer tyder også på, at disse indikatorer kan være mere følsomme markører for reaktion på ekstern farlig eksponering, hvilket indikerer deres potentiale til identifikation af reproduktionsskader på et tidligere stadium19,20. Kombination af disse indikatorer med rutineundersøgelser kan også give en mere omfattende forståelse af profilen af sæddysfunktion og kompleksiteten af mandlig reproduktionsskade i befolkningen.
Der er flere nøglespørgsmål, der i det væsentlige bestemmer succesen med sædanalyse med FCM. For det første kræver måling af sæd MMP og apoptose øjeblikkelig undersøgelse, efter at sæden er flydende. For at minimere tidsomkostningerne kan to teknikere separat tage ansvaret for forbehandling af MMP og apoptoseanalyse af en prøve. Da forbehandlingen af apoptose er enklere, vil den overføre til det flowcytometriske trin hurtigere end MMP-analysen. Til SCSA-analysen skal friske sædprøver kryopræserveres umiddelbart efter tilgængelighed efter fortætning. Sædprøverne kan derefter opbevares i flydende nitrogen i en relativt lang periode og behøver ikke øjeblikkelig undersøgelse.
Følgelig kan eksperimentets tidsomkostninger på stedet komprimeres til 40 min, hvilket er varigheden af MMP-analyse plus det flowcytometriske trin i sædanalyse. For det andet skal opsætningen af gatingen i flowcytometrisk platform besluttes separat for hver batch af prøver. Sædprøverne med klare celleundergrupper i spredningsplottet kan vælges som reference for at tegne gatingområdet. For det tredje kan historiske resultater, da der ikke findes bredt accepterede kliniske referenceværdier for indikatorerne for dette eksperiment, anvendes som et vigtigt redskab til kvalitetskontrol. Der opfordres også til at indstille positive og negative kontroller i hver batch af målinger, især for SCSA og MMP.
De repræsentative resultater af sædanalyse, der leveres her, stammer ved hjælp af en Accuri C6. Teknikken kunne dog anvendes på andre kommercielle platforme med mindre ændringer. Normalt vil der være behov for i alt 5 × 106 sædceller for at opfylde kravet om måling af alle indikatorerne. Hvis sædkoncentrationen i en prøve er meget lavere end gennemsnittet, vil behovet for sædvolumen stige.
I lighed med rutinemæssige sædparametre er der også mærkbar intraindividuel variation i kromatinintegritet, MMP og apoptose af humane spermatozoer21. Derfor kan flere tests af prøver indsamlet på forskellige tidspunkter give et mere præcist skøn over sædfunktionsskadeniveauet. Selvom der ikke er nogen anbefalet periode med afholdenhed før sædprøver til flowcytometrisk analyse, kan 2-7 dages ejakulatorisk afholdenhed, foreslået til rutinemæssig sædanalyse af WHO, vedtages. Det kan bidrage til at forbedre sammenligneligheden af resultaterne mellem laboratorier og mellem forskellige prøver indsamlet fra de samme mænd.
En væsentlig begrænsning ved denne metode er, at to af de tre testede biomarkører - apoptose og mitokondriemembranpotentiale - kræver friske sædprøver. Dette kan begrænse deres anvendelse til mænd, der kan levere sædprøver til laboratoriet. Til test af DNA-skade (SCSA) skal referenceprøver forberedes før forsøget for at kalibrere flowcytometeret. Det skal bemærkes, at anvendelsen af denne protokol kræver et FCM-instrument i laboratoriet, hvilket stadig er en betydelig udfordring for mange kliniske laboratorier, selv om samarbejde med en tredjepartstjeneste kan være et alternativt valg i nogle regioner.
Derudover er udgifterne til farvestoffer og andre reagenser også en økonomisk faktor for mænd, der muligvis har brug for undersøgelsen. Endelig kan det være nødvendigt at ændre protokollen, hvis der anvendes forskellige mærker eller versioner af FCM til at undersøge biomarkørerne. Sammenfattende præsenterer dette papir en praktisk tilgang til at estimere tre biomarkører for human spermatozoskader ved hjælp af en enkeltstrømscytometrimaskine. Dette kan give værdifuld information om mandlig reproduktiv sundhed og supplere den rutinemæssige sædundersøgelse.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at der ikke er nogen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi takker alle feltarbejderne for deres hjælp og de interviewede for deres samarbejde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 M citric acid buffer | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | 251275-5G | Add 21.01 g/L citric acid monohydrate (FW = 210.14; 0.10 M) to 1.0 L H2O. Store up to several months at 4 °C. |
| 0.2 M Na2PO4 buffer | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | V900061-500G | Add 28.4 g sodium phosphate dibasic (FW = 141.96; 0.2 M) to 1.0 L H2O. Store up to several months at 4 °C. |
| 10 mM CCCP stock solution | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | C2759 | Add 20.46 mg CCCP to 10.0 mL DMSO,making up to the final of CCCP in a concentration of 10mM, aliquot and store at −80 °C. |
| 10 µM CCCP working solution | Add 10 mL of PBS to a 15 mL polypropylene centrifuge tube and add 10 μL CCCP stock solution, making up to the final of CCCP in a concentration of 10 µM. | ||
| 1 mM JC-1 stock solution | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | T4069 | JC-1 is purchased lyophilized. Add a small quantity of DMSO to the vial and vortex for several minutes until all the dye has dissolved. Transfer the solution to a light-tight tube and rinse the vial with appropriate volume of DMSO, making up to the final of JC-1 in a concentration of 1 mg/mL aliquot and store at −20 °C. |
| 37 °C incubator | Thermo Scientific, USA | ||
| 5 µM JC-1 working solution | Add 10 mL of PBS to a 15 mL polypropylene centrifuge tube and add 50 μL from a thawed JC-1 stock aliquot. Stir gently to assure a homogenous dilution. This solution must be stored in the dark and used promptly. | ||
| Accuri C6 Flow cytometer | BD Pharmingen, San Diego, CA, United States | ||
| Acid solution, pH 1.2 | Combine 20.0 mL of 2.0 N HCl (0.08 N), 4.39 g of NaCl (0.15 M), and 0.5 mL of Triton X-100 (0.1%) in H2O for a final volume of 500 mL. Adjust pH to 1.2 with 5 mol/L HCl. | ||
| Acridine Orange (AO) stock solution, 1.0 mg/mL | Polysciences, Inc, Warrington, Pa | 65-61-2 | Dissolve chromatographically purified AO in dd-H2O at 1.0 mg/mL. |
| AO staining solution (working solution) | Add 600 μL of AO stock solution to each 100 mL of staining buffer. | ||
| Biological safety hood | Airtech, USA | ||
| Computer-aided sperm analysis system (CASA ) | Microptic, Barcelona, Spain | Sperm Class Analyzer 5.3.00 | |
| Sperm Counting Chamber | Goldcyto, Spain | ||
| Equipments | |||
| FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I | BD Biosciences, San Jose, CA | 556547 | Included: (1) FITC Annexin V is bottled at 100 ng/µL; (2) Propidium Iodide (PI):The PI Staining Solution is composed of 50 µg PI/mL in PBS (pH 7.4) and is 0.2 µM sterile filtered; (3) 10x Binding Buffer: 0.1 M Hepes (pH 7.4), 1.4 M NaCl, 25 mM CaCl2. For a 1x working solution, dilute 1 part of the 10x Annexin V Binding Buffer to 9 parts of distilled water. Store at 4 °C and protected from prolonged exposure to light. Do not freeze. |
| FlowJo 10 | Tree Star, Inc., San Carlos, CA, USA | ||
| Horizontal centrifuge | Thermo Scientific, USA | ||
| liquid nitrogen tank | Thermolyne, USA | ||
| Materials | |||
| PBS | Beyotime, Shanghai, China | C0221A | Ready-to-use PBS buffers is purchased and stored at room temperature |
| Staining buffer, pH 6.0 | Combine 370 mL of 0.10 M citric acid buffer, 630 mL of 0.20 M Na2PO4 buffer, 372 mg of EDTA (disodium, FW = 372.24; 1 mM), and 8.77 g of NaC1 (0.15 M). Mix overnight on a stir plate to insure that the EDTA is entirely in solution. pH to 6.0 with saturated NaOH solution. | ||
| The reference sample for SCSA analysis | The reference sample was diluted with cold (4 °C) TNE buffer to a working concentration of 1–2 × 106 cells/mL, and used to set the green at 475/1,024 flow cytometry channels and set the red at 125/1,024 flow cytometry channels. | ||
| TNE buffer, 1x, pH 7.4 (working solution) | Combine 60 mL of 10x TNE and 540 mL of H2O. Check pH (7.4). | ||
| TNE buffer, 10x, pH 7.4 | Perfemiker, Shanghai, China | PM11733 | Ready-to-use buffers is purchased and stored at 4 °C. |
References
- Agarwal, A., Mulgund, A., Hamada, A., Chyatte, M. R. A unique view on male infertility around the globe. Reproductive Biology and Endocrinology. 13 (1), 1-9 (2015).
- Nachtigall, R. D. International disparities in access to infertility services. Fertility and Sterility. 85 (4), 871-875 (2006).
- Agarwal, A., Allamaneni, S. S. R. Sperm DNA damage assessment: a test whose time has come. Fertility and Sterility. 84 (4), 850-853 (2005).
- Peña, F. J., Ortega Ferrusola, C., Martín Muñoz, P. New flow cytometry approaches in equine andrology. Theriogenology. 86 (1), 366-372 (2016).
- Oosterhuis, G. J., et al. Measuring apoptosis in human spermatozoa: a biological assay for semen quality. Fertility and Sterility. 74 (2), 245-250 (2000).
- Koopman, G., et al. Annexin V for flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on B cells undergoing apoptosis. Blood. 84 (5), 1415-1420 (1994).
- Freitas, M. J., Vijayaraghavan, S., Fardilha, M. Signaling mechanisms in mammalian sperm motility. Biology of Reproduction. 96 (1), 2-12 (2017).
- Lehti, M. S., Sironen, A. Formation and function of sperm tail structures in association with sperm motility defects. Biology of Reproduction. 97 (4), 522-536 (2017).
- Durairajanayagam, D., Singh, D., Agarwal, A., Henkel, R. Causes and consequences of sperm mitochondrial dysfunction. Andrologia. 53 (1), 13666 (2021).
- Agnihotri, S. K., et al. Mitochondrial membrane potential (MMP) regulates sperm motility. In Vitro Cellular and Developmental Biology. Animal. 52 (9), 953-960 (2016).
- Smiley, S. T., et al. Intracellular heterogeneity in mitochondrial membrane potentials revealed by a J-aggregate-forming lipophilic cation JC-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (9), 3671-3675 (1991).
- Evenson, D. P., Darzynkiewicz, Z., Melamed, M. R. Relation of mammalian sperm chromatin heterogeneity to fertility. Science. 210 (4474), 1131-1133 (1980).
- Evenson, D. P., Djira, G., Kasperson, K., Christianson, J. Relationships between the age of 25,445 men attending infertility clinics and sperm chromatin structure assay (SCSA®) defined sperm DNA and chromatin integrity. Fertility and Sterility. 114 (2), 311-320 (2020).
- Evenson, D. P.
- Agarwal, A., Said, T. M. Role of sperm chromatin abnormalities and DNA damage in male infertility. Human Reproduction Update. 9 (4), 331-345 (2003).
- Ricci, G. Apoptosis in human sperm: its correlation with semen quality and the presence of leukocytes. Human Reproduction. 17 (10), 2665-2672 (2002).
- Zhang, H. -B., et al. Early apoptotic changes in human spermatozoa and their relationships with conventional semen parameters and sperm DNA fragmentation. Asian Journal of Andrology. 10 (2), 227-235 (2008).
- WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen. , Available from: https://www.who.int/publications/i/item/9789240030787 (2022).
- Evenson, D. P., Wixon, R. Environmental toxicants cause sperm DNA fragmentation as detected by the Sperm Chromatin Structure Assay (SCSA). Toxicology and Applied Pharmacology. 207 (2), 532-537 (2005).
- Wang, Y. X., et al. Phthalate exposure in association with serum hormone levels, sperm DNA damage and spermatozoa apoptosis: A cross-sectional study in China. Environmental Research. 150, 557-565 (2016).
- Ni, W., et al. Diurnal variation in sperm DNA fragmentation: analysis of 11,382 semen samples from two populations and in vivo animal experiments. Chronobiology International. 36 (11), 1455-1463 (2019).
