Summary
Ett protokoll för expansionsmikroskopi för etikettretention (LR-ExM) demonstreras. LR-ExM använder en ny uppsättning trifunktionella ankare, vilket ger bättre märkningseffektivitet jämfört med tidigare introducerade expansionsmikroskopier.
Abstract
Expansionsmikroskopi (ExM) är en provberedningsteknik som kan kombineras med de flesta ljusmikroskopimetoder för att öka upplösningen. Efter inbäddning av celler eller vävnader i svällbar hydrogel kan proverna expanderas fysiskt tre till sexton gånger (linjär dimension) jämfört med den ursprungliga storleken. Därför ökas den effektiva upplösningen av något mikroskop med expansionsfaktorn. En viktig begränsning av den tidigare introducerade ExM är reducerad fluorescens efter polymerisation och matsmältningsproceduren. För att övervinna denna begränsning har expansionsmikroskopi för etikettretention (LR-ExM) utvecklats, vilket förhindrar signalförlust och kraftigt förbättrar märkningseffektiviteten med hjälp av en uppsättning nya trifunktionella ankare. Denna teknik gör att man kan uppnå högre upplösning när man undersöker cellulära eller subcellulära strukturer i nanometrisk skala med minimal fluorescerande signalförlust. LR-ExM kan användas inte bara för immunofluorescensmärkning utan också med självmärkning av proteintaggar, såsom SNAP- och CLIP-taggar, vilket ger högre märkningseffektivitet. Detta arbete presenterar proceduren och felsökningen för detta immunfärgningsbaserade tillvägagångssätt, samt diskussion om självmärkningsmetoder för LR-ExM som ett alternativ.
Introduction
Expansionsmikroskopi (ExM) har använts av forskare sedan det först introducerades som ett bekvämt tillvägagångssätt för att uppnå superupplösningsavbildning med konventionella mikroskop, såsom epifluorescens och konfokalmikroskop 1,2,3,4,5,6,7 . Med hjälp av ExM är det möjligt att uppnå ~ 70 nm lateral upplösning även med vanliga konfokalmikroskop. När ExM kombineras med superupplösningsavbildning förbättras upplösningen ytterligare. Till exempel kan man uppnå ungefär 30 nm upplösning med strukturerad belysningsmikroskopi (SIM) och ungefär 4 nm upplösning med stokastisk optisk rekonstruktionsmikroskopi (STORM)1,5.
Låg märkningseffektivitet är dock ett kritiskt problem med standard ExM-metoder. Fluorescensförlust kan variera beroende på typen av fluorescerande grupper och matsmältningstid. I genomsnitt har det dock rapporterats att mer än 50% av fluoroforerna går förlorade efter polymerisationen och proteinförtunningsstegen för ExM, vilket är skadligt för bildkvaliteten 3,4.
Således har expansionsmikroskopi för etikettretention (LR-ExM) utvecklats, vilket effektivt kan behålla etiketter och minska signalförlusten1. Den viktigaste innovationen med LR-ExM är användningen av en uppsättning trifunktionella ankare istället för att bara använda fluorescerande färgämnen - som i standard ExM-proceduren - för färgning av proteiner av intresse. Dessa trifunktionella länkar består av tre delar: (1) kontakten (t.ex. N-hydroxisuccinimid (NHS)) för att ansluta till antikroppen, (2) ankaret (t.ex. metakrylamid (MA)) för att förankra proteiner till polymeren och (3) reportern (t.ex. biotin eller digoxigenin (DIG)) för att konjugera till ett organiskt färgämne. De trifunktionella ankarna överlever polymerisations- och proteinförtunningsstegen och förhindrar därför fluoroforförlust.
Dessutom har denna metod stor potential eftersom den är kompatibel med självmärkning av enzymatiska taggar som SNAP eller CLIP. Enzymatiska taggmetoder har vissa fördelar jämfört med immunfärgningsmetoden när det gäller hög specificitet och märkningseffektivitet 8,9,10.
I detta manuskript demonstreras ett detaljerat förfarande för LR-ExM. LR-ExM är en mycket effektiv och flexibel metod för att uppnå hög rumslig upplösning med förbättrad märkningseffektivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellodling
- Använd U2OS-celler odlade i McCoys 5A-medium kompletterat med 10% FBS vid 37 ° C i 5% CO2.
- Odla celler på ett 16 väl avtagbart kammarglas (odlingsområde 0,4 cm2) för enkel hantering.
2. Fixering och permeabilisering
OBS: Fixerings- och permeabiliseringsförhållanden beror på de optimerade immunfärgningsprotokollen. Följande är ett fixerings- och permeabiliseringsprotokoll till co-immunostain mikrotubuli och clathrinbelagda gropar (CCP).
- När cellantalet når ~ 0,04 x 10 6, fixera celler med 100 μL 3,2% paraformaldehyd (PFA) i PEM-buffert (100 mM PIPES, 1 mM EGTA och 1 mM MgCl2, pH6,9) i 10 min vid rumstemperatur (tabell 1).
OBS: Fixering med PFA utförs i en certifierad säkerhetshuv. - Tvätta cellerna tre gånger i 5 minuter vardera med 200 μl fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Permeabilisera celler med 100 μl permeabiliseringsbuffert vid rumstemperatur i 15 minuter (tabell 1).
OBS: Fortsätt med märkning så snart som möjligt för att undvika målprotein, RNA eller DNA-nedbrytning och för att få ett optimalt resultat. Om det behövs kan dock fasta prover lagras under en längre tid (upp till en månad) i en PBS-buffert vid 4 °C. Byt ut eventuell förångad PBS och skydda provet från fotoblekning.
3. Endogen streptavidin och biotinblockering
- Inkubera celler med streptavidinlösningen utspädd i en cellblockerande buffert (100 μl) i 15 minuter vid rumstemperatur (tabell 1).
- Skölj kort med 200 μl cellblockerande buffert.
- Inkubera celler med 100 μl biotinlösning utspädd i en cellblockerande buffert i 15 minuter vid rumstemperatur.
När du använder en metod för självetikettering, till exempel att använda SNAP- eller CLIP-taggar, hoppar du över steg 4 och fortsätter till steg 5.1: taggningsmetod för självmärkning.
4. Primär antikroppsfärgning
- Inkubera celler med råttanti-α-tubulinantikropp (1:500 utspädning) och kanin-anti-clathrin tungkedjig antikropp (1:100 utspädning) i 100 μl cellblockerande buffert i 16 timmar vid 4 °C eller 1 timme vid rumstemperatur. Fördubbla inkubationstiden för vävnadsproverna.
- Tvätta proverna fyra gånger med 200 μl PBS i 5 minuter vardera.
5. LR-ExM-specifik sekundär antikroppsfärgning
- Konjugera IgG-antikroppar med de trifunktionella länkarna såsom N-hydroxisuccinimid (NHS) - metakrylamid (MA) -Biotin eller NHS-MA-Digoxigenin (Dig) (Figur 1B). Syntes av trifunktionella ankare och konjugering av de sekundära antikropparna har tidigare introducerats i Shi et al.1. Självmärkningsmetod: Konjugera IgG-antikroppar med de trifunktionella länkarna, såsom MA-bensylguanin (BG) -Biotin eller MA-bensylcytosin (BC) -Dig (Figur 1B). Syntes av trifunktionella ankare och en konjugering av de sekundära antikropparna introducerades tidigare i Shi et al.1.
- Inkubera celler med åsnan anti-kanin-Dig-MA (1:100 utspädning) och åsna anti-råtta-biotin-MA (1:100 utspädning) sekundära antikroppar i 100 μl cellblockerande buffert i 1 h vid rumstemperatur. Fördubbla denna inkubationstid för vävnadsproverna.
- Tvätta proverna fyra gånger i 200 μl PBS i 5 minuter vardera.
6. Ytterligare förankring
- Inkubera celler med 0,25% glutaraldehyd (GA) i PBS (100 μL) i 15 min vid rumstemperatur för att förankra proteinerna på hydrogelen. Alternativt kan du använda 25 mM metakrylsyra N-hydroxisuccinimidester (MA-NHS) för förankring. En timmes inkubation vid rumstemperatur uppmuntras.
- Tvätta proverna tre gånger i PBS i 5 min vardera.
7. Gelering
OBS: Expansionshastigheten bestäms av diffusionstiden för salt och vatten ut eller in i gelén; Således påskyndar gjutning av tunna geler expansionstiden.
- Ta bort den övre strukturen på gelplattan med 16 brunnar. Tillsätt 40 μl monomerlösning till varje brunn för att konditionera celler på is. Inkubera på is i 5 min.
- För beredning av en monomerlösning, se tabell 2.
- Förbered geleringslösningen på is. Tillsätt dubbeldestillerat vatten och 10% N,N,N′,N′ Tetrametyletylendiamin (TEMED) accelerator till monomerlösningen (10% TEMED: monomerlösning = 1:47); Lägg inte till initiativtagaren ännu (tabell 3).
- För en cellodlingskammare med en yta av 0,4 cm2, använd en geleringslösningsvolym på ca 40 μl. Förbered 45 μL geleringslösning för varje brunn.
- Tillsätt 10% ammoniumpersulfat (APS) till geleringslösningen, inkubera på is och pipettera omedelbart 40 μL geleringslösning i varje silikonpackning väl på is. Inkubera på is i 3 min (10% APS: 10% TEMED: monomerlösning = 1:1:47).
- Skydda provet från ljus och flytta täckglaset i 10 cm petriskålen till en 37 °C inkubator i 1,5 timmar för gelering. För att hålla gelens fuktighet under inkubationen på 37 °C, täck petriskålen med locket och lägg några droppar vatten i petriskålen.
8. Matsmältning
- Efter gelering, ta bort glaset för att separera gelén och överför gelén till 6 brunnsplattor. Röta inbäddade celler med 2 ml matsmältningsbuffert (tabell 1) över natten vid rumstemperatur eller 4 timmar vid 37 °C. Använd minst 10-faldig överskottsvolym av matsmältningsbuffert.
- Tvätta geler med minst en 10-faldig överskottsvolym vatten än den slutliga gelvolymen. Upprepa tvättsteget fyra gånger i 20 till 30 minuter varje gång. Gelén expanderar med ungefär två gånger i varje dimension.
OBS: Gelprover kan förvaras i upp till 1 månad i en PBS-buffert vid 4 °C. Byt ut allt indunstat vatten för att undvika torkning och skydda provet från ljus under lagring. För att undvika nedbrytning av trifunktionella ankare bör proverna färgas så snart som möjligt efter matsmältning och tvätt.
9. Färgning av fluorescens efter matsmältningen
- Inkubera geler i 2 ml volym streptavidin (STV)/digoxigenin (DIG) färgningsbuffert med 2 till 5 μM STV-färgämne och/eller anti-DIG-färgämne i 24 timmar vid rumstemperatur. Förvara proverna i mörkret.
10. Expansion
- Tvätta och expandera gelén fyra gånger med mycket vatten (2-3 ml) i 30 min till 1 h varje gång.
- För enklare visualisering av celler under fluorescerande mikroskopi, fläcka celler med DAPI under den tredje av de fem tvättarna. Späd DAPI-stamkoncentration (5 mg/ml, förvaras vid 4 °C) i 1:5 000 spädningar i tvättvatten. Inkubera gelén med en DAPI-vattenlösning (2 ml) i 30 min till 1 timme.
- Tvätta ytterligare två gånger med 3 ml vatten.
- Expandera geler i alla platta skålar som är tillräckligt stora för att innehålla proverna. De expanderade gelerna som är beredda på 0,4 cm2 ytöverdragsglas passar fint i en glasbotten 6-brunnsplatta.
OBS: Prover efter expansionsfärgade prover kan förvaras i upp till 4 månader i en PBS-buffert vid 4 ° C. Tillsätt tillräckligt med vatten för att undvika torkning och skydda provet från fotoblekning. Upprepa expansions- och DAPI-färgningssteget innan du bildar. För att undvika risk för nedbrytning av fluoroforer måste proverna avbildas så snart som möjligt.
11. Bildbehandling
- Täck 6-brunnsglasbottenbildkammaren med 0,01% poly-L-lysin (3 ml vardera) för att immobilisera gelproverna.
- Överför gelprover till den belagda bildkammaren.
- Avbilda proverna med önskade fluorescensomfång.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Klatherinbelagda gropar (CCP) immunfärgas med hjälp av trifunktionella ankare (figur 1B) och LR-ExM utförs enligt beskrivningen i figur 1A. LR-ExM (figur 2C,E) visar mycket högre fluorescensintensitet jämfört med proteinretentionsexpansionsmikroskopin (proExM, figur 2A) eller biotin-ExM (figur 2B). signalen för LR-ExM var ungefär sex gånger högre än proExM (figur 2D). LR-ExM kan effektivt fånga små strukturer som CCP, som är ännu mindre än diffraktionsgränsen (figur 2F,G).
Några representativa resultat av LR-ExM visas med hjälp av immunfärgningsmetoden. Mikrotubuli och CCP samimmunstaineras med hjälp av trifunktionella ankare, inklusive NHS-MA-DIG och NHS-MA-biotin (figur 3A,B). LR-ExM är tillgängligt för det enzymatiska taggbaserade tillvägagångssättet. Resultatet demonstreras med hjälp av trifunktionella ankare BG-MA-biotin (för SNAP-tag) och BC-MA-DIG (för CLIP-tag) i figur 3C-F. Dessutom kan man kombinera både immunfärgning och proteintaggmetoden i LR-ExM som visas i figur 3G-J. Från dessa resultat bekräftas att LR-ExM är fördelaktigt att få högkvalitativa bilder med förbättrad märkningseffektivitet och upplösning.
LR-ExM visar också bra prestanda i vävnadsprover. LR-ExM utförs på musens hjärnvävnad genom att samimmunstaina den presynaptiska markören Fagott och postsynaptisk markör Homer1. De två etiketterna är tydliga och väl separerade, vilket stöder hög upplösning och märkningseffektivitet (figur 4A-E).
Bild 1: Arbetsflöde för expansionsmikroskopi för etikettretention (LR-ExM). (A) Arbetsflöde för LR-ExM. (B) Scheman över trifunktionella ankare. Denna siffra har modifierats från Shi et al.1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Kvantifiering av signalretention (A-C) expansionsmikroskopi (ExM) konfokala bilder av clathrinbelagda gropar (CCP) i U2OS-celler indirekt immunfärgade för clathrin heavy-chain (POI). (A) Proteinretention ExM (ProExM) med användning av AF488-konjugerade sekundära antikroppar. (B) ExM med märkning efter expansion med biotinkonjugerade antikroppar. C) LR-ExM med användning av antikroppar konjugerade med NHS-MA-biotin trifunktionella ankare. Prover i B och C är efterexpansionsfärgade med streptavidin-AF488. D) Kvantifiering av A-C:s intensitet. Felstaplar representerar SD. n = 3 för varje enskilt fall. Längdutvidgningsförhållandena för bilder i A, B, C och E-G är 4,3, 4,5, 4,6 respektive 4,3. Längdutvidgningsförhållandet för de prover som används i område D är 4,5 ± 0,2. Skalstreck, 500 nm (A-C och E) och 100 nm (F och G). Alla skalstänger finns i enheter före expansion. Arb. u., godtyckliga enheter; STV, streptavidin. Alla bilder erhålls med hjälp av ett konfokalmikroskop med snurrande skivor (Nikon CSU-W1) med ett 60x vattensänkningsmål (NA1.27). Denna siffra har modifierats från Shi et al.1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Representativa resultat av LR-ExM med konfokalmikroskop. (A,B) LR-ExM konfokala bilder av mikrotubuli märkta med NHS-MA-biotinkonjugerade sekundära antikroppar (magenta) och CCP: er märkta med NHS-MA-DIG-konjugerade sekundära antikroppar (grön) i en U2OS-cell. (B) Förstorad vy. (C-F) LR-ExM-konfokala bilder av CCP och / eller mitokondrier i HeLa-celler märkta med proteintaggmetod (C) SNAP-taggmärkt clathrin, (D) CLIP-taggmärkt TOMM20 och (E) tvåfärgsavbildning. (F) Förstorad vy. (G) Tvåfärgade konfokala LR-ExM-bilder med en kombination av immunfärgningsmetod (NPC, glödhet) och proteintaggmetod (SNAP-taggad lamin A / C (cyan)). (H) Förstorad vy. (Jag,J) Visningar av enskilda kanaler i H. Observera att den cytoplasmatiska bakgrunden i G orsakas av anti-NUP153-antikroppen. Längdutvidgningsförhållandena för bilder i A-B: 4,7, C-D: 4,4, E-F: 4,5 och G-J är 4,5. Skalstreck,1 μm för A, 200 nm för B och F, 500 nm för C-E, 2 μm för G och 500 nm för H, I och J. Alla skalstänger finns i enheter före expansion. Alla bilder erhålls med hjälp av ett konfokalmikroskop med snurrande skivor (Nikon CSU-W1) med ett 60x vattensänkningsmål (NA1.27). Denna siffra har modifierats från Shi et al.1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Representativa resultat av LR-ExM på vävnadsprover. (A) LR-ExM konfokal bild av mushjärnskiva indirekt immunfärgad för den presynaptiska markören Bassoon (magenta) och den postsynaptiska markören Homer1 (grön). (B,C) Inzoomade bilder av synapser. (D,E) Tvärgående intensitetsprofiler längs den gula lådans långa axlar. Fagott är märkt med NHS-MA-DIG-konjugerade sekundära antikroppar, och Homer1 är märkt med NHS-MA-biotinkonjugerade sekundära antikroppar. Alla prover är efter expansion färgade med streptavindin-AF488 och eller anti-Digoxin-AF594. Längdutvidgningsförhållandena för bilder i A-C är 4,2. Skalstreck, 1 μm (A) och 200 nm (B,C). Alla skalstänger finns i enheter före expansion. Alla bilder erhålls med hjälp av ett konfokalmikroskop med snurrande skivor (Nikon CSU-W1) med ett 60x vattensänkningsmål (NA1.27). Denna siffra har modifierats från Shi et al.1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1: Kemikalier och buffertar Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 2: Monomerlösning Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Tabell 3: Geleringslösning Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den viktigaste innovationen med LR-ExM är att använda trifunktionella ankare för att effektivt märka målproteinerna och förbättra bildkvaliteten. Denna metod är begränsad av trifunktionella ankare, som inte är så lättillgängliga för forskare. Trifunktionella ankare kan dock delas med andra forskare på begäran, och liknande produkter som ExM-sonder från Chrometa är nu också kommersiellt tillgängliga.
I detta protokoll har 1 h inkubation vid rumstemperatur utförts för de primära och sekundära antikroppsfärgningsstegen. Dessa steg kan dock alternativt göras över natten vid 4 °C, och det observeras att färgning över natten sänker bakgrundsbruset.
För att förhindra strukturell distorsion härledd från anisotrop expansion av hydrogelen är det viktigt att utföra en grundlig proteinförtunning med användning av proteas3. Tidigare expansionsmikroskopier visar dock att mer än 50% av fluorescensetiketterna kan gå förlorade efter polymerisation och proteinförtunningssteg, vilket resulterar i dålig bildkvalitet 3,4. För att lösa problemet har LR-ExM utvecklats, vilket minimerar signalförlusten genom att införa fluorescerande etiketter efter matsmältning1.
LR-ExM kan användas i stor utsträckning med immunfärgningsbaserade metoder för att studera målstrukturen. Dessutom kan LR-ExM kombineras med självmärkande proteintaggmetoder som SNAP- eller CLIP-taggbaserade metoder. Detta är till hjälp, särskilt när bra antikroppar av intresse inte finns tillgängliga eller om man behöver förbättrad målspecificitet.
I detta dokument introduceras protokollet för LR-ExM med längdutvidgningsfaktorn på cirka 4. LR-ExM är dock inte begränsat till vissa expansionsförhållanden eller typer av prover. Faktum är att denna metod kan kombineras med alla befintliga expansionsmikroskopier, såsom X10-expansionsmikroskopi 4,11 eller TREx 12 för att uppnå högre upplösning. LR-ExM kan också kombineras med pan-ExM, så att den effektivt visualiserar hela proteinlandskapet med hög upplösning utan att offra specificitet13.
Sammanfattningsvis har LR-ExM potential att användas i stor utsträckning av många forskare som ett verktyg för att belysa cellulära strukturer med hög upplösning och märkningseffektivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av U.S. National Institutes of Health (R00 GM126136 till X.S.), U.S. National Science Foundation (DMS1763272 till S.P.) och Simons Foundation (594598 till S.P.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylamide | Sigma | A9099 | ExM Gel |
| AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | H+L, 711–005-152 | Antibody |
| AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG | Jackson ImmunoResearch | H+L, 712–005-153 | Antibody |
| Alexa Fluor 488-Streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-540-084 | Fluorescent probes |
| Alexa Fluor 594 Streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-580-084 | Fluorescent probes |
| Alexa Fluor 647 Streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-600-084 | Fluorescent probes |
| Ammonium Persulfate | Sigma | A3678 | ExM Gel |
| anti-H3K4me3 | Abcam | ab8580 | Antibody |
| anti-H3K9me3 | Abcam | ab176916 | Antibody |
| DAPI dilacetate | Thermofisher Scientific | D3571 | Fluorescent probes |
| DyLight 488 Labeled Anti-Digoxigenin/Digoxin (DIG) | Vector Laboratories | DI-7488 | Fluorescent probes |
| DyLight 594 Labeled Anti-Digoxigenin/Digoxin (DIG) | Vector Laboratories | DI-7594 | Fluorescent probes |
| EGTA | EMD Millipore Corp. | 324626-25GM | Fixation buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | EDTA | Digestion buffer |
| Glutaraldehyde 10% EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 50-262-13 | Anchoring |
| Grace Bio-Labs CultureWell removable chambered coverglass | Grace Bio-Labs | GBL112358-8EA | Cell culture chamber |
| Grace Bio-Labs CultureWell removal tool | Grace Bio-Labs | GBL103259 | Removal tool |
| Guanidine HCl | Sigma | G3272 | Digestion buffer |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266-1KG | Fixation buffer |
| McCoy's 5a | ATCC | 30–2007 | Celll culture medium |
| Methacrylic acid N-hydroxysuccinimide ester,98% (MA-NHS) | Sigma | 730300-1G | Anchoring |
| monoclonal mouse anti-Nup153 antibody | Abcam | ab24700 | Antibody |
| N,N′Methylenebisacrylamide | Sigma | M7279 | ExM Gel |
| N,N,N′,N′ Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma | T7024 | ExM Gel |
| 16% Paraformaldehyde Aqueous Solutions | Electron Microscopy Sciences | 50-980-487 | Fixation buffer |
| PIPES | Sigma | P6757-25G | Fixation buffer |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920-100ML | Chamber coating |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P4850-5ML | Digestion buffer |
| Rabbit anti-clathrin heavy-chain antibody | Abcam | ab21679 | Antibody |
| rat anti–α-tubulin antibody,tyrosinated, clone YL1/2 | Millipore Sigma | MAB1864-I | Antibody |
| Sodium Acrylate | Sigma | 408220 | ExM Gel |
| Streptavidin / Biotin blocking kit | Vector Laboratories | SP-2002 | Blocking buffer |
| Tris-HCl | Life Technologies | AM9855 | Digestion buffer |
| U2OS | ATCC | HTB-96 | Cell line |
| 6 well glass bottom plates | Cellvis | P06-1.5H-N | Imaging plate |
References
- Shi, X., et al.
- Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S.
- Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).
- Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy. Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).
- Wang, Y., et al. Combined expansion microscopy with structured illumination microscopy for analyzing protein complexes. Nature Protocols. 13 (8), 1869-1895 (2018).
- Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
- Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super resolution imaging of three-dimensional protein localization in size adjustable tissues. Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).
- Gautier, A., et al. An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells. Chemistry & Biology. 15 (2), 128-136 (2008).
- Keppler, A., Pick, H., Arrivoli, C., Vogel, H., Johnsson, K. Labeling of fusion proteins with synthetic fluorophores in live cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (27), 9955-9959 (2004).
- Thevathasan, J. V., et al. Nuclear pores as versatile reference standards for quantitative super resolution microscopy. Nature Methods. 16 (10), 1045-1053 (2019).
- Truckenbrodt, S., et al. X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes. EMBO Reports. 19 (19), 45836 (2018).
- Damstra, H. G. J., et al. Visualizing cellular and tissue ultrastructure using Ten-fold Robust Expansion Microscopy (TREx). eLife. 11, 73775 (2021).
- M'Saad, O., Bewersdorf, J. Light microscopy of proteins in their ultrastructural context. Nature Communications. 11 (1), 3850 (2020).
