Summary
这种多功能方案描述了通过从鸡胚胎中切除颅神经褶皱来分离前迁移神经嵴细胞（NCC）。在铺板和孵育时，迁移性NCC从神经折叠外植体中出现，允许在简化的2D环境中评估细胞形态和迁移。
Abstract
在脊椎动物发育过程中，神经嵴细胞（NCC）广泛迁移并分化成各种细胞类型，这些细胞类型有助于颅面骨骼和周围神经系统等结构。虽然在3D胚胎的背景下了解NCC迁移至关重要，但在2D培养中分离迁移细胞有助于可视化和功能表征，补充胚胎研究。本协议展示了一种分离鸡颅神经褶皱以产生原代NCC培养物的方法。迁移性NCC来自接种在纤连蛋白包被底物上的神经折叠外植体。这导致分散的、粘附的NCC群体，可以通过染色和定量形态学分析进行评估。这种简化的培养方法适应性强，可以与其他技术结合使用。例如，NCC迁移和迁移行为可以通过延时成像进行评估，或者通过包括抑制剂或基因表达的实验操作（例如，DNA，吗啉诺或CRISPR电穿孔）来询问功能。由于其多功能性，该方法为研究颅骨NCC的发展提供了一个强大的系统。
Introduction
神经嵴细胞（NCC）是脊椎动物胚胎中的瞬时细胞群。NCC 指定在神经板的边界，并经历上皮到间充质的过渡 （EMT） 以从背神经管迁移1。EMT后，NCC广泛分散在整个胚胎中，最终分化并促成各种结构，包括颅面骨骼，心脏流出道和大部分周围神经系统2。细胞极性、细胞骨架和粘附特性的变化是这种从迁移性细胞群向迁移性细胞群转变的基础3.研究NCC EMT和迁移提供了对细胞运动基本机制的见解，并为预防和治疗出生缺陷和癌症转移的努力提供了信息。
虽然体内分析对于理解胚胎环境中的NCC发育过程至关重要，但体外方法提供了视觉和物理可及性，促进了其他实验途径。在简化的 2D 环境中，可以评估 NCC 形态、细胞骨架结构和迁移距离。此外，遗传或可溶性因子扰动对运动NCC迁移行为的影响可以分析4，5，6，7，8，9，10。此外，可以收集、汇集分离的迁徙或迁移性 NCC 并用于高通量方法，以通过蛋白质组、转录组和表观基因组分析研究 NCC 的发育调控7，11。虽然有方法可用于从各种发育模式生物制备颅骨NCC12，13，14，但本文展示了那些首次学习从鸡胚胎培养颅骨NCC的方法的机制。
目前的协议描述了一种用于制备鸡颅NCC培养物的通用技术（图1）。由于NCC很容易从外植的神经褶皱迁移到培养基质上，因此雏鸡NCC自然地与胚胎组织分离，并且很容易产生原代培养物。随着中脑NCC从颅神经褶皱中大量迁移（与躯干15中长时间的逐细胞分层相反），这些培养物主要由迁移性颅神经嵴细胞组成，初始神经褶皱切除为迁移性NCC提供了一种收集方法。详细介绍了解剖和培养鸡颅神经褶皱的基本方法，并提供了该方法的不同应用和变化的建议。
图 1：小鸡颅神经褶皱培养方案的示意图。 （A，B）从具有五个体细胞的雏鸡胚胎中切除颅神经褶皱（以蓝色轮廓显示）（如A的背视图所示）。灰色带，心脏新月形。（C）当接种在纤连蛋白上时，迁移性神经嵴细胞从神经褶皱中出现并分散到基质上。 请点击此处查看此图的大图。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
可以使用任何品种的 瘿 品种，包括白里格霍恩、金性链或罗德岛红。本研究中使用的鸡蛋品种多样，来源多样，包括当地农场和孵化场。
1. 溶液和材料的制备
- 通过混合 123.3 mM NaCl、1.53 mM CaCl 2、4.96 mM KCl、0.809 mM Na 2 HPO 4 和 0.147 mM KH2PO4 来制备林格氏溶液（参见材料表）。将pH调节至7.4，并将灭菌过滤到100 mL瓶中。存放在干净干燥的地方。不要用肥皂清洗瓶子（作为组织培养玻璃器皿处理）。
- 通过将FN溶解在无菌林格氏溶液中来制备1mg / mL原液纤连蛋白（FN）（参见 材料表），并在-80°C（稳定至少4年）下以100μL等分试样储存。
- 通过补充 L15 培养基 0.8% L-谷氨酰胺、0.08% 青霉素/链霉素、10% FBS 和 10% 鸡胚提取物来制备完整的培养基12.生成 3 mL 等分试样并储存在 -20 °C 或 -80 °C。
注意：如果培养物在CO2 培养箱中孵育，则需要用DMEM / F12代替L15，L15被空气缓冲。 - 在1x PBS中制备4%多聚甲醛溶液。将pH值调节至7.4。创建10 mL等分试样并将其储存在-20°C。
注意：多聚甲醛必须在通风橱中处理。 - 准备滤纸支撑框架（大约 1 厘米 x 1.5 厘米的矩形纸，长轴上有两个或三个打孔重叠）。
- 使用标准的三孔打孔器沿着大片滤纸的边缘打孔，将打孔的边缘切割/修剪成条状，然后将孔之间的条切割成矩形~1.5厘米长。使用前高压灭菌滤纸（可选）。
- 收集解剖工具，包括细镊子、钝钳、解剖剪刀、弹簧剪刀和锋利的钨针16.
2. 胚胎孵化
- 从上述任何来源获得受精卵。
- 将受精卵置于38°C（100°F）的加湿培养箱内的直立位置（卵的长轴垂直，尖端朝下/钝面朝上）。
- 孵育直到形成四到七个体细胞（阶段8 + -9）17，这大约需要35小时。
注意：孵化时间可能会因菌株、母鸡年龄、季节等而有很大差异，必须通过实验确定。可编程出口定时器可用于在夜间启动孵育以获得所需的时间。 - 从孵化器中取出后，用 70% 乙醇彻底喷洒鸡蛋，让它们干燥以消毒外壳。
注意：胚胎可以立即收集，但让鸡蛋冷却到室温会降低蛋黄的脆弱性和收集过程中的胚胎损失。
3. 培养皿的准备
- 选择适合下游应用的神经折叠培养皿（参见 材料表）。
- 对于将要固定和染色的培养物，使用放置在多孔组织培养皿中的玻璃盖玻片。
注意：与孔尺寸相匹配的盖玻片在流体混合时移动较少，使外植体不太可能移动，并且更有可能粘附在盖玻片而不是培养皿底部。 - 选择玻璃底单室或分室培养皿（见 材料表）使用倒置显微镜进行实时成像。
- 对于正置或体视显微镜上的实时成像，请使用 6、12 或 24 孔光学合适的组织培养板。
- 选择塑料组织培养皿，用于迁移性神经嵴细胞的大量收集，以进行高通量分析。
- 对于将要固定和染色的培养物，使用放置在多孔组织培养皿中的玻璃盖玻片。
- 将 10 U/mL 青霉素和 10 μg/mL 链霉素加入 100 mL 无菌林格氏溶液中（例如，100 μL 10，000 U/mL 青霉素和 10，000 μg/mL 链霉素，以制成林格氏 P/S）。在 1 周内使用林格氏 P/S。
- 在冰上解冻 1 mg/mL FN 的等分试样。用林格氏 P/S 稀释至 10-100 μg/mL FN 浓度。
- 移取足够的FN溶液以覆盖孔或培养皿的底部。例如，24 孔板中每孔 100 μL，35 mm 培养皿中每孔 500 μL。
- 更换盖子，并在38°C（100°F）下在加湿的培养箱（或带有蒸馏水浸泡的纸巾的有盖托盘）中用FN溶液孵育培养皿或盘子至少1小时，同时解剖神经褶皱。
4. 雏鸡胚胎的分离
- 注意保持鸡蛋的方向（胚胎在孵化过程中漂浮到蛋黄的顶部）。用剪刀或钝镊子在蛋壳上戳一个小洞，大约是鸡蛋长度的1/4-1/3。
- 小心地将剪刀或钝钳的尖端插入小孔中，确保不会破坏蛋黄，然后切开鸡蛋周围的蛋壳，去除蛋壳的顶部（图2A）。
- 定位胚胎进行分离。
注意：如果胚胎在壳杯中的位置不理想，请使用钝钳小心地转动蛋黄，使胚胎在顶部。或者，将蛋黄倒入戴手套的杯状手中，注意不要破坏蛋黄并让白蛋白排出（图2B）。然后，可以通过将蛋黄从一只手移到另一只手来定位胚胎。 - 使用闭合的钝钳的平坦边缘轻轻擦去残留在覆盖胚胎的蛋黄表面上的任何多余白蛋白来准备胚胎（图2C）。多余的白蛋白也可以用精细的任务刮水器轻轻按压去除。
注意：清除白蛋白后，蛋黄的表面应呈现纹理而不是光滑。未能擦去足够的白蛋白将抑制第4节步骤4中滤纸支架的粘附。 - 使用镊子将滤纸支撑架放在胚胎上，胚胎在框架的窗口中。轻轻按压滤纸，将其粘在蛋黄上。
- 用解剖剪刀在滤纸框架的外部切割（图2D）。使用镊子或剪刀尖端抓住框架的边缘，轻轻地将胚胎从蛋黄上抬起（图2E）。以一定角度提起将有助于将胚胎从蛋黄中干净地取出。
- 将胚胎放在纸框朝下（胚胎腹侧朝上）的60毫米或100毫米培养皿中，培养皿中装满了林格氏P / S（图2F）。如果收集用于对RNA或蛋白质敏感的下游应用，请将胚胎的培养皿放在冰上。
注意：未能将胚胎腹侧朝上放置可能会使它们与纸框分离。在进入神经折叠解剖步骤之前，可以收集多个胚胎并将其存储在林格氏P / S中长达1小时。
5.解剖神经褶皱
- 将胚胎转移到含有林格氏P / S溶液的干净盘中，然后用镊子握住滤纸框架并轻轻来回漱口以清除任何遮挡胚胎视线的蛋黄来冲洗胚胎。更换铃声的P / S，如果它变得浑浊，则转移到新鲜的盘子上。
- 将胚胎背侧/框架面朝上放置在解剖显微镜下。将胚胎留在纸架上以保持其拉伸并固定到位，使用镊子去除卵黄膜以暴露神经褶皱。
注意：如果胚胎从纸架上掉下来，可以将其平放在培养皿中或固定在西尔加德涂层培养皿18 上进行解剖。 - 使用弹簧剪刀或锋利的钨针，小心地切除中脑神经褶皱。包括组织尾部到扩张的视囊泡和喙到后脑，其中菱形收缩刚刚开始出现（心新月形也是一个有用的指标， 图3B，C）。注意切除神经褶皱的最背侧，污染最小的神经管和非神经外胚层（图3C）。
- 使用P20移液器或无菌玻璃巴斯德移液管（用卵黄林格氏P / S冲洗）将神经折叠转移到含有林格氏P / S的干净培养皿中（这会阻止塑料或玻璃以防止组织粘附）。将收集的褶皱存放在冰上，同时解剖其他褶皱。
6. 电镀神经褶皱
- 解冻等分试样的完整培养基（第 1 节，第 3 步）。加入 100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素并过滤灭菌。在执行其他步骤时，将准备好的培养基保持在37-38°C。
- 从培养箱中取出培养皿（第 3 节，步骤 5）。使用移液器或巴斯德移液器，从盖玻片、培养皿或孔中取出 FN 溶液。用林格氏P / S冲洗FN包被的底物后，向培养皿或孔中加入适当体积的完整培养基（24孔板中的孔为500μL，35mm培养皿或六孔板为2 mL）。
注意：较小的体积可以保存昂贵的试剂（例如，24孔板低至200μL），但要确保培养皿充分加湿以避免蒸发。 - 首先，使用 p20 或 p200 移液器，用蛋黄林格氏 P/S 冲洗移液器吸头，以阻挡塑料并防止组织粘连。然后，将分离的神经折叠转移到FN涂层的盖玻片上，注意尽可能少地转移林格氏P / S。将折叠带朝 FN 涂层盖玻片的中心放置。
注意：一个或几个神经褶皱可以接种在 19 mm 孔中的 12 mm 盖玻片上，在 35 mm 板上最多可接种 50 个。 - 让外植体沉淀10-15分钟后，通过缓慢而小心地携带带有镀神经褶皱的培养皿，将它们放入38°C（100°F）的加湿室中。这将最大限度地减少孔中神经褶皱的移动，确保它们保持分散并粘附在任何盖玻片上。
注意：当使用L15（不是DMEM）时，外植体培养皿也可以使用带有湿纸巾的有盖托盘在鸡蛋培养箱中孵育。 - 在加湿培养箱中孵育神经折叠培养物以保持活性迁移持续时间（总共约16-20小时， 图4）。
7. 培养的迁移性NCC的固定和染色以进行形态学分析
- 用巴斯德移液管取出培养基，并用过滤灭菌的1x PBS冲洗孔。
- 在室温下加入4%多聚甲醛15分钟。
注意：固定时间可能需要通过实验确定。也可以将多聚甲醛直接添加到培养基中10分钟（50：50），取出并用未稀释的4%多聚甲醛代替10分钟，以保留更脆弱的细胞结构。 - 去除多聚甲醛，用 1x PBS 冲洗三次。
- 用适当的染料对固定的NCC进行染色以进行形态学评估。例如，此处详细介绍了用俄勒冈绿共轭鬼笔环肽染色。
注意：用鬼笔环肽19 可视化肌动蛋白细胞骨架揭示了具有相对均匀染色强度的迁移性NCC的结构复杂性;然而，鬼笔环肽可能无法突出显示所有细胞区域。也可以使用标记质膜（例如小麦胚芽凝集素或DiI）或细胞质的染料，但会使相对于明亮染色的细胞体的细突起成像复杂化。此外，可以同时进行免疫荧光以用HNK-1标记神经嵴细胞或确定感兴趣的蛋白质7，20的亚细胞定位。- 取出最后的PBS冲洗液，加入PBS + 0.5%Triton X-100（PBST）+ 5%血清（FBS或其他适合与抗体配合的动物）以覆盖盖玻片并在室温下在平台摇床上孵育10分钟。
- 将 200 nM 俄勒冈绿共轭鬼笔环肽（在 PBST + 5% 血清中稀释）移液到光滑表面（例如柔性石蜡密封膜）上。对于 12 mm 盖玻片，移液 30 μL 体积。
- 使用一对镊子，从PBST + 5%血清中取出盖玻片，确保保持细胞朝上的方向。将盖玻片的边缘轻轻触摸到精致的任务刮水器上，以吸走多余的液体。
- 轻轻地将每个盖玻片细胞面朝下放在稀释的鬼笔环肽滴上。在室温下孵育30分钟。染色期间将盖玻片放在黑暗中（用铝箔覆盖的盘子盖住或放在抽屉中）。
- 在孵育期间，将PBST添加到培养皿的孔中（24孔板的每个孔750μLPBST）。
- 孵育期后，将盖玻片从染色溶液中取出并放回培养皿中，将盖玻片翻转过来，使细胞侧朝上。确保盖玻片被PBST覆盖，并放在平台摇床上10分钟，保持盖玻片盖住并在黑暗中。取出PBST并重复此步骤两次，总共三次10分钟洗涤。
- 将一滴（每张盖玻片）封片剂（见 材料表）放在显微镜载玻片上。25 μL 体积适用于 12 mm 盖玻片。
- 用PBST进行最后一次洗涤后，将盖玻片的边缘接触到精密的任务刮水器上以去除多余的液体，并跟踪盖玻片的细胞侧。
- 通过将盖玻片以一定角度缓慢降低到安装介质上，以避免产生气泡，从而将盖玻片电池面朝下安装。允许在映像之前设置介质。
8. 培养迁徙性NCC的形态学评估
- 对染色的细胞进行图像处理并导出为.tiff文件。
注意：40倍物镜适用于成像培养物，但可以使用10倍（捕获整个迁移性NCC）到100倍（单个NCC）的物镜进行形态学评估。本研究中的图像是使用倒置多模态成像平台捕获的（见 材料表）。 - 将图像上传到图像分析软件（ImageJ21，参见 材料表）。单击“ 图像>复制 ”以创建每个图像的第二个副本以用于分析，从而使原始图像保持未编辑状态，因为大多数图像处理无法逆转。
- 单击 图像>调整>亮度/对比度 ，然后使用滑动条调整图像的亮度或对比度。
- 按照以下步骤将图像转换为灰度。
- 如果图像以 RGB 格式导出，它们将以 RGB 作为合并通道上传。要分离图像，请单击“ 图像>颜色”>“分割通道 ”以获取单通道灰度图像。
- 如果图像已分离，请转到 图像>键入 8 位> 将文件转换为灰度。
- 单击 图像>调整>阈值 以转换为二进制图像，其中像素被标识为单元格（前景;黑色）或背景（白色）。使用滑动条和/或单击 “自动 ”以选择从背景中明确定义单元格的阈值设置。
- 如果细胞重叠或染色不连续，则可能需要使用分水岭或填充孔功能22进一步处理。这将分离细胞或填补要分析的细胞内的空白。单击“ 处理二进制>>”制作二进制 “，首先将图像转换为 8 位二进制格式。然后单击处理二进制 >>分水岭 或 填充孔。
注意：该软件将使其最适合需要分离或填充信号的地方，如有必要，可以使用插件进一步调整。
- 如果细胞重叠或染色不连续，则可能需要使用分水岭或填充孔功能22进一步处理。这将分离细胞或填补要分析的细胞内的空白。单击“ 处理二进制>>”制作二进制 “，首先将图像转换为 8 位二进制格式。然后单击处理二进制 >>分水岭 或 填充孔。
- 选择要捕获的测量值。单击分析 >设置测量 值并选中形状描述符框以分析圆度（圆周）、纵横比 （AR）、圆度（圆形）和坚固度。
注意：根据所需的分析类型，可能还包括其他测量值，例如面积和周长。 - 单击 分析>分析粒子，然后从“分析粒子”菜单中设置参数。
- 在“大小”下，粗略估计感兴趣的细胞或颗粒的大小（以像素为单位），因为如果 Size 参数保持设置为 0-无穷大（例如，在 图 5 中设置为 500-Infinity），则背景信号或较小的细胞碎片也将包括在内。
注意：将尺寸调整到更窄的范围可以排除比分析所需颗粒更小或更大的颗粒。 - 在“圆形”下，保留在 0-1.0 以测量图像中的所有单元格形状。
- 在“显示”下，从下拉菜单中选择裸轮廓以检查使用“分析颗粒”功能选择的单元格 轮廓 。扫描轮廓以确保区分重叠的单元格，但不必要地分割单元格。此外，选中“显示结果”、“汇总”和“添加到管理器”的菜单框。
- 在“大小”下，粗略估计感兴趣的细胞或颗粒的大小（以像素为单位），因为如果 Size 参数保持设置为 0-无穷大（例如，在 图 5 中设置为 500-Infinity），则背景信号或较小的细胞碎片也将包括在内。
- 设置完所有参数后，单击 “确定”。
注意：将弹出四个单独的窗口，显示（1）图像中标识的细胞的裸露轮廓，（2）图像中计数的细胞，（3）每个细胞的测量结果，以及（4）计数的细胞总数及其平均测量值的摘要。- 如果对碎片进行计数，将重叠的细胞计数为一个，将单个细胞计为多个细胞，或者从计数中省略了许多细胞，返回到原始的，未经编辑的图像，制作另一个副本，并调整“阈值”或其他参数。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
本协议的概述如图 1所示。打开孵化的鸡蛋，通过轻轻倒入戴手套的手掌中来分离带有胚胎表面的蛋黄（图2A，B）。清除白蛋白后（图2C），将滤纸框架涂在胚胎周围的蛋黄膜上，以促进切割和提起胚胎从蛋黄中取出，一旦卵黄膜被切割，蛋黄就开始溢出（图2D，E）。
图2：分离四到七个体细胞雏鸡胚胎。 受精卵孵育35小时。用钝钳（A）打开鸡蛋，将蛋黄倒入戴手套的手（B）。去除多余的白蛋白（C），使滤纸载体（D，插图）粘附在蛋黄上。胚胎从蛋黄（D）中切下，取出（E），并放入林格氏P / S（F）中。 请点击此处查看此图的大图。
冲洗胚胎并清洁林格氏P / S后，在分离的胚胎中可以看到神经褶皱（图3A）。这些褶皱含有前迁移的颅神经嵴细胞。一旦从胚胎中切除（图3B，C）并收集（图3D），就可以接种孤立的神经褶皱以产生迁移性NCC培养物。
图 3：小鸡背神经褶皱的解剖。 在Ringer的P / S中工作，弹簧剪刀被用来切除神经褶皱。（A）胚胎背视图，朝向图顶。神经褶皱看起来比周围组织更不透明。中脑神经褶皱位于视叶后方（粉红色）和心新月形（黄色）前方。（B）切除神经褶皱后胚胎的背视图，显示切除边界。（C）去除神经褶皱的胚胎侧视图。解剖技术切除背侧神经管，避免腹侧和非神经管结构。（D）林格氏P / S中的孤立神经褶皱比例尺= 300μm。 请点击此处查看此图的大图。
当神经折叠接种在FN上时，NCC在孵育后3-4小时内开始从贴壁神经折叠外植体中出现（图4A），并在大约20小时后完成迁移（图4B）。标记迁移性NCC20的HNK-1染色在培养物中的大多数细胞中很明显（图4D）。当神经褶皱未能粘附在盖玻片上时，或者没有NCC从外植体迁移时，就会发生阴性结果（数据未显示）。通过固定培养物、染色丝状肌动蛋白并在 ImageJ 中进行各种测量来分析 NCC，以评估 NCC 形态和迁移（图 5）。分析的69个细胞的平均面积为802.11±69.65μm 2，范围为60.27-2664.53μm2，分布如条形图和小提琴图所示（图5C）。圆度（公式：圆度= 4π（面积/周长²）），一种反映细胞突出度的度量，范围为0.101-0.875，平均值为0.38±0.15。较低的值表示细长的形状，而值 1 表示完美的圆形。如小提琴图所示，大多数细胞表现出细长的形状（图5D）。细胞形状的另一个度量是纵横比（AR），它是细胞的长轴除以短轴。AR 值为 1 表示对称形状23。该领域的迁移性NCC的平均AR为2.13±0.11，值范围为1.14-5.59（图5E）。使用这些NCC形态的定量测量，可以在实验条件和不同的已发表研究之间进行严格的比较。
图 4：迁移性 NCC 从培养的神经褶皱中出现。 孵育3小时（A）和孵育20小时（B）后铺板神经折叠的明场图像。比例尺 = 200 μm。（中，四）神经折叠在孵育20小时后大部分分散，但残留存在于这些图像的右侧。比例尺 = 500 μm。迁移性NCC在DAPI（C）和HNK-1染色（D）中可见。HNK-1免疫染色证实培养的细胞是迁移性NCC。 请点击此处查看此图的大图。
图5：培养的迁移性NCC的形态学评估。 （A）NCC中丝状肌动蛋白的鬼笔环肽染色在培养20小时后从神经折叠迁移。比例尺 = 50 μm。（B） 单元格显示为黑色且背景为白色的阈值图像。黄色轮廓包围了计为单元格的对象，并且单元格已编号。（中欧）用于显示形态学评估数据的图形选项。根据面板B中显示的69个细胞的测量值创建了条形图和小提琴图，以描绘被测细胞的面积（μm2，C），圆度（D）和纵横比（E）。条形图显示平均值，误差条表示每个面板左侧平均值的标准误差。小提琴情节是用 app.rawgraphs.io 创建的。请点击此处查看此图的大图。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
这里描述的技术提供了一种适应性强的方法来分离雏鸡神经褶皱并对其进行铺板以创建迁徙性颅 NCC 培养物。这些培养物为轻松分析雏鸡NCC迁移和形态提供了简化的2D条件，可以补充卵巢成像方法中更具技术挑战性的24，25，26。虽然这种体外方法相对简单，但一致的结果取决于高质量的卵子和试剂。此外，由于培养物固有的可变性，重现性需要实验重复和定量。
神经褶皱对FN的粘附对于培养中的NCC迁移至关重要。偶尔，外植体将无法正常粘附，神经折叠将漂浮或产生无/很少的迁移NCC。当颅神经褶皱没有将切口面朝下落地时，就会发生这种情况;尝试在孵育前将外植体定向到培养容器中，并让它们在移动它们之前沉淀10-15分钟。然而，由于转移到培养箱过程中的流体混合，一些神经褶皱将不可避免地不时地粘附在次优状态。当整个实验的粘附和迁移出现问题时，这可能反映了旧的FN（每次实验使用-80°C的新鲜等分试样），具有过期组分的培养基（在-20°C下以实验大小的等分试样制备培养基，并在使用时添加新鲜抗生素）或使用不适合细胞培养的盖玻片（例如， 细胞不会粘附在组织学的盖玻片上）。受污染的培养箱也可能导致整个NCC培养实验失败。
除了在培养物中产生分散的NCC并允许分析迁移性NCC形态外，该协议也是许多其他实验的起点。接种在盖玻片上的外植体也可以处理免疫荧光（在第7节，步骤3之后），以确定感兴趣的蛋白质7的亚细胞定位。虽然在固定培养物中可以分析形态和迁移距离，但如此处所述，在培养培养期间对NCC进行延时成像（第6节，步骤5）允许收集有关迁移的方向性和持久性以及细胞运动动力学的额外数据（膜突出，粘附等的测量）14，24，27.胚胎的瞬时遗传操作可以通过在汉堡和汉密尔顿阶段4 + 17的试剂（吗啉诺29，DNA表达构建体或CRISPR载体30）的电穿孔18，28来实现。然后可以在协议中使用这些电穿孔胚胎来创建具有功能丧失或目的基因过表达的迁移性NCC培养物。功能分析也可以通过在NCC培养物7，27的培养基中添加化学抑制剂来实现（第6节，步骤2）。通过组学水平分析对NCC进行人群水平分析需要收集NCC作为原材料7，11，31。虽然标记物已被用于通过荧光激活细胞分选31分离NCC，但这需要专门的流式细胞术设备和细胞的酶解离。遵循此处描述的方法仔细切除背神经褶皱（尽量减少腹侧神经管和非神经外胚层细胞的收集）提供了一种廉价的方法来收集迁移性NCC11（第5节，步骤4）。在培养物中分散后收集NCC（第6节，步骤5）可提供相对纯净的自然分离，迁移NCC群体以进行进一步分析（HNK-1染色，迁移NCC的标志物，在图4D中的大多数培养细胞中;如7）。最后，这些变体可以组合使用。例如，免疫荧光或延时成像可用于评估基因表达操作或添加抑制剂的效果27。总体而言，这种适应性强、廉价的方案提供了评估培养物中野生型颅迁移性 NCC 形态的方法，具有多种潜在的修饰以实现各种实验目标。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有利益冲突。
Acknowledgments
我们感谢Corinne A. Fairchild和Katie L. Vermillion，他们参与了我们版本的小鸡颅神经褶皱培养方案的开发。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AxioObserver equipped with an LSM710 confocal scan head controlled by ZEN 3.0 SR software | Zeiss | Used alpha Plan-Apochromat 100x/1.46 Oil DIC M27 objective | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Chamber dishes (glass bottom, single or divided) | MatTek; Cell Vis | P35G-1.5-14-C (MatTek) X000NOJQGX (Cellvis) X000NOK1OJ (Cellvis) |
Single chamber 35 mm or 4 chamber 35 mm |
| Cover glass | Carolina Biological Supply Company | 633029, 633031, 633033, 633035, 633037 | circles, 0.13–0.17 mm thickness, available in 12-25 mm diameter |
| DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 11320033 | Alternative for L15 media |
| Egg incubator | Sportsman | 1502 | |
| FBS | Life Technologies | 10437-028 | |
| Fibronectin | Fisher Scientific | CB-40008A | |
| Filter paper | Whatman | grade 3MM chromatography | |
| Forceps (blunt) | Fisher Scientific; Thomas Scientific | 08-890 (Fisher);1141W97 (Thomas) | |
| Forceps (fine) | Fine Science Tools | 11252-20 | Dumont #5 |
| Image J | https://fiji.sc/ | Free image analysis software | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| L15 media | Invitrogen | 11415064 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030 | |
| Mounting Media (Vectashield or ProLong Gold) | Vector Laboratories; Thermofisher Scientific | H-1700 (Vectashield); P36930 (ProLong Gold) | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140-148 | 10,000 Units/mL Penicillin; 10,000 mg/mL Streptomycin |
| Petri Dishes | VWR (or similar) | 60 mm, 100 mm | |
| Phalloidin | Sigma-Aldrich | P1951 | multiple flurophores available |
| Pin holder | Fine Science Tools | 26016-12 | For tungsten needle (alternative for spring scissors) |
| Scissors (dissection) | Fine Science Tools | 14061-10 | |
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | 2.5 mm cutting edge (alternative for tungsten needle) |
| Sylgard | Krayden | Sylgard 184 | |
| Syringe Filters | Sigma-Aldrich | SLGVM33RS | Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized |
| Tissue culture dishes | Sarstedt | 83-3900 | 35 mm culture dishes for bulk neural fold cultures |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Tungsten wire | Variety of sources | 0.01" diameter for tungsten needle (alternative for spring scissors) |
References
- Pla, P., Monsoro-Burq, A. H. The neural border: Induction, specification and maturation of the territory that generates neural crest cells. Developmental Biology. 444, 36-46 (2018).
- Tang, W., Bronner, M. E. Neural crest lineage analysis: From past to future trajectory. Development. 147 (20), (2021).
- Piacentino, M. L., Li, Y., Bronner, M. E. Epithelial-to-mesenchymal transition and different migration strategies as viewed from the neural crest. Current Opinion in Cell Biology. 66, 43-50 (2020).
- McLennan, R., et al. Neural crest cells bulldoze through the microenvironment using Aquaporin 1 to stabilize filopodia. Development. 147 (1), 185231 (2020).
- Carmona-Fontaine, C., et al. Complement fragment C3a controls mutual cell attraction during collective cell migration. Developmental Cell. 21 (6), 1026-1037 (2011).
- Giovannone, D., et al. Slits affect the timely migration of neural crest cells via robo receptor. Developmental Dynamics. 241 (8), 1274-1288 (2012).
- Vermillion, K. L., Lidberg, K. A., Gammill, L. S. Cytoplasmic protein methylation is essential for neural crest migration. Journal of Cell Biology. 204 (1), 95-109 (2014).
- Yang, X., Li, J., Zeng, W., Li, C., Mao, B. Elongator Protein 3 (Elp3) stabilizes Snail1 and regulates neural crest migration in Xenopus. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
- Gonzalez Malagon, S. G., et al. Glycogen synthase kinase 3 controls migration of the neural crest lineage in mouse and Xenopus. Nature Communications. 9 (1), 1-15 (2018).
- Bhattacharya, D., Azambuja, A. P., Simoes-Costa, M. Metabolic reprogramming promotes neural crest migration via yap/tead signaling. Developmental Cell. 53 (2), 199-211 (2020).
- Jacques-Fricke, B. T., et al. Profiling NSD3-dependent neural crest gene expression reveals known and novel candidate regulatory factors. Developmental Biology. 475, 118-130 (2021).
- Bronner-Fraser, M., García-Castro, M. Chapter 4 manipulations of neural crest cells or their migratory pathways. Methods in Cell Biology. 87, 75-96 (2008).
- Milet, C., Monsoro-Burq, A. H. Dissection of xenopus laevis neural crest for in vitro explant culture or in vivo transplantation. Journal of Visualized Experiments. (85), e51118 (2014).
- Malagon, S. G. G., et al. Dissection, culture and analysis of primary cranial neural crest cells from mouse for the study of neural crest cell delamination and migration. Journal of Visualized Experiments. (152), e60051 (2019).
- Theveneau, E., Mayor, R. Neural crest delamination and migration: From epithelium-to-mesenchyme transition to collective cell migration. Developmental Biology. 366 (1), 34-54 (2012).
- Conrad, G. W., Bee, J. A., Roche, S. M., Teillet, M. A. Fabrication of microscalpels by electrolysis of tungsten wire in a meniscus. Journal of Neuroscience Methods. 50 (1), 123-127 (1993).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Gammill, L. S., Jacques-Fricke, B., Roffers-Agarwal, J. Embryological and genetic manipulation of chick development. Methods in Molecular Biology. 1920, 75-97 (2019).
- Vandekerckhove, J., Deboben, A., Nassal, M., Wieland, T.
- Bronner-Fraser, M. Analysis of the early stages of trunk neural crest migration in avian embryos using monoclonal antibody HNK-1. Developmental Biology. 115 (1), 44-55 (1986).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Soille, P., Vincent, L. Determining watersheds in digital pictures via flooding simulations. Visual Communications and Image Processing '90: Fifth in a Series. (1360), 240-250 (1990).
- Haupt, A., Minc, N. How cells sense their own shape - mechanisms to probe cell geometry and their implications in cellular organization and function. Journal of Cell Science. 131 (6), (2018).
- Ezin, M., Fraser, S. Chapter 11 time-lapse imaging of the early avian embryo. Methods in Cell Biology. 87, 211-236 (2008).
- Kulesa, P. M., Bailey, C. M., Cooper, C., Fraser, S. E. In ovo live imaging of avian embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 5 (6), (2010).
- McKinney, M. C., Kulesa, P. M. Live imaging of the neural crest cell epithelial-to-mesenchymal transition in the chick embryo. Methods in Molecular Biology. 2179, 107-114 (2021).
- Gustafson, C. M., Roffers-Agarwal, J., Gammill, L. S. Chick cranial neural crest cells release extracellular vesicles that are critical for their migration. Journal of Cell Science. , (2022).
- Williams, R., Sauka-Spengler, T. Ex ovo electroporation of early chicken embryos. STAR Protocols. 2 (2), 100424 (2021).
- Moulton, J. D. Using morpholinos to control gene expression. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. 68 (1), 4-30 (2017).
- Gandhi, S., et al. A single-plasmid approach for genome editing coupled with long-term lineage analysis in chick embryos. Development. 148 (7), (2021).
- Williams, R. M., et al. Reconstruction of the Global Neural Crest Gene Regulatory Network In Vivo. Developmental Cell. 51 (2), 255-267 (2019).
