Summary
Ce protocole polyvalent décrit l’isolement des cellules de la crête neurale prémigratoire (CCN) par l’excision des plis neuraux crâniens des embryons de poussins. Lors du placage et de l’incubation, les NCC migrateurs émergent des explants de plis neuraux, ce qui permet d’évaluer la morphologie et la migration des cellules dans un environnement 2D simplifié.
Abstract
Au cours du développement des vertébrés, les cellules de la crête neurale (NCC) migrent largement et se différencient en différents types de cellules qui contribuent à des structures telles que le squelette craniofacial et le système nerveux périphérique. Bien qu’il soit essentiel de comprendre la migration des NCC dans le contexte d’un embryon 3D, l’isolement des cellules migratrices en culture 2D facilite la visualisation et la caractérisation fonctionnelle, complétant ainsi les études embryonnaires. Le présent protocole démontre une méthode pour isoler les plis neuraux crâniens des poussins afin de générer des cultures primaires de NCC. Les NCC migrateurs émergent des explants de plis neuraux plaqués sur un substrat recouvert de fibronectine. Il en résulte des populations de CNC dispersées et adhérentes qui peuvent être évaluées par coloration et analyses morphologiques quantitatives. Cette approche de culture simplifiée est hautement adaptable et peut être combinée avec d’autres techniques. Par exemple, l’émigration NCC et les comportements migratoires peuvent être évalués par imagerie accélérée ou interrogés fonctionnellement en incluant des inhibiteurs ou des manipulations expérimentales de l’expression génique (par exemple, l’ADN, morpholino ou électroporation CRISPR). En raison de sa polyvalence, cette méthode fournit un système puissant pour étudier le développement des CNC crâniens.
Introduction
Les cellules de la crête neurale (CCN) sont une population cellulaire transitoire chez les embryons de vertébrés. Les NCC sont spécifiés aux bords de la plaque neurale et subissent une transition épithéliale vers mésenchymateuse (EMT) pour migrer du tube neural dorsal1. Après l’EMT, les NCC se dispersent largement dans l’embryon, se différenciant et contribuant à diverses structures, y compris le squelette craniofacial, les voies d’écoulement du cœur et la majorité du système nerveux périphérique2. Les changements dans la polarité cellulaire, le cytosquelette et les propriétés d’adhésion sous-tendent ce passage d’une population cellulaire prémigratoire à une population cellulaire migratrice3. L’étude de l’EMT NCC et de la migration fournit des informations sur les mécanismes fondamentaux de la motilité cellulaire et éclaire les efforts visant à prévenir et à traiter les malformations congénitales et les métastases cancéreuses.
Bien que l’analyse in vivo soit essentielle pour comprendre les processus de développement des CCN dans un contexte embryonnaire, les méthodes in vitro offrent une accessibilité visuelle et physique qui facilite d’autres voies expérimentales. Dans un environnement 2D simplifié, la morphologie NCC, les structures cytosquelettiques et la distance migrée peuvent être évaluées. De plus, les effets de la perturbation génétique ou des facteurs solubles sur les comportements migratoires des CCN mobiles peuvent être analysés 4,5,6,7,8,9,10. De plus, les CCN prémigratoires ou migrateurs isolés peuvent être recueillis, mis en commun et utilisés pour des méthodologies à haut débit afin d’étudier la régulation du développement des CCN par le biais du profilage protéomique, transcriptomique et épigénomique 7,11. Bien qu’il existe des méthodes pour préparer les CNC crâniennes à partir de divers organismes modèles de développement12,13,14, cet article démontre la mécanique de l’approche pour ceux qui apprennent d’abord à cultiver des NCC crâniens à partir d’embryons de poussins.
Le protocole actuel décrit une technique polyvalente pour préparer des cultures de CNC crâniennes de poussins (figure 1). Parce que les NCC migrent facilement des plis neuraux explantés sur un substrat de culture, les NCC de poussins se séparent naturellement des tissus embryonnaires et les cultures primaires sont facilement générées. Comme les NCC du mésencéphale migrent en masse à partir des plis neuraux crâniens (contrairement à la délamination prolongée cellule par cellule dans le tronc15), ces cultures sont principalement constituées de cellules de crête neurale crâniennes migratoires, l’excision initiale des plis neuraux fournissant une méthode de collecte pour les NCC prémigratoires. Une méthode de base pour disséquer et cultiver les plis neuraux crâniens des poussins est détaillée, et des suggestions pour différentes applications et variations de cette méthode sont proposées.
Figure 1 : Vue d’ensemble schématique du protocole de culture du pli neural crânien du poussin. (A,B) Les plis neuraux crâniens (encadrés en bleu) sont excisés d’un embryon de poussin à cinq somites (en vue dorsale en A). Bandes grises, croissant cardiaque. (C) Lorsqu’elles sont plaquées sur fibronectine, les cellules de la crête neurale migratrice émergent des plis neuraux et se dispersent sur le substrat. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Protocol
Toute variété de races Gallus gallus peut être utilisée, y compris White Leghorn, Golden Sex Link ou Rhode Island Red. Les œufs de poule utilisés dans la présente étude étaient de diverses races et provenaient de sources multiples, y compris des fermes et des couvoirs locaux.
1. Préparation des solutions et des matériaux
- Préparer la solution de Ringer en mélangeant 123,3 mM de NaCl, 1,53 mM de CaCl2, 4,96 mM de KCl, 0,809 mM deNa2HPO 4 et 0,147 mM KH2PO 4 (voir tableau des matériaux). Ajuster le pH à 7,4 et filtrer stériliser dans des bouteilles de 100 mL. Conserver dans un endroit propre et sec. Ne pas laver les bouteilles avec du savon (traiter comme de la verrerie de culture tissulaire).
- Préparer la solution mère de fibronectine (FN) à 1 mg/mL (voir le tableau des matières) en dissolvant la FN dans la solution stérile de Ringer et conserver dans des aliquotes de 100 μL à -80 °C (stable pendant au moins 4 ans).
- Préparer des milieux de culture complets en complétant les milieux L15 avec 0,8 % de L-glutamine, 0,08 % de pénicilline/streptomycine, 10 % de FBS et 10 % d’extrait d’embryon de poussin12. Créer des aliquotes de 3 mL et conserver à -20 °C ou -80 °C.
REMARQUE : Si les cultures sont incubées dans un incubateur de CO2 , le DMEM/F12 doit être substitué à la L15, qui est tamponnée pour l’air. - Préparer une solution de paraformaldéhyde à 4% dans 1x PBS. Ajuster le pH à 7,4. Créer des aliquotes de 10 mL et les conserver à -20 °C.
ATTENTION : Le paraformaldéhyde doit être manipulé dans une hotte. - Préparez des cadres de support en papier filtre (rectangles de papier d’environ 1 cm x 1,5 cm avec deux ou trois trous perforés se chevauchant sur l’axe long).
- Perforez des trous le long du bord d’un grand morceau de papier filtre à l’aide d’un poinçon standard à trois trous, coupez / coupez le bord perforé en une bande, puis coupez la bande entre les trous en rectangles ~ 1,5 cm de longueur. Papiers filtres autoclave avant utilisation (facultatif).
- Rassemblez les outils de dissection, y compris les pinces fines (# 1), les pinces émoussées, les ciseaux à dissection, les ciseaux à ressort et les aiguilles en tungstèneaiguisées 16.
2. Incubation d’embryons
- Obtenez des œufs fécondés de l’une des sources mentionnées ci-dessus.
- Placer les œufs fécondés en position verticale (axe long de l’œuf vertical avec l’extrémité pointue vers le bas/le côté émoussé vers le haut) à l’intérieur d’un incubateur humidifié à 38 °C (100 °F).
- Incuber jusqu’à ce que quatre à sept somites se soient formés (stades 8+-9)17, ce qui prend environ 35 h.
REMARQUE : Le temps d’incubation peut varier considérablement en fonction de la souche, de l’âge des poules, de la saison, etc., et doit être déterminé expérimentalement. Les minuteries de sortie programmables sont utiles pour initier l’incubation pendant la nuit afin d’obtenir le moment souhaité. - Après avoir été retiré de l’incubateur, vaporisez soigneusement les œufs avec de l’éthanol à 70% et laissez-les sécher pour désinfecter les coquilles.
REMARQUE: Les embryons peuvent être prélevés immédiatement, mais laisser les œufs refroidir à température ambiante diminue la fragilité des jaunes et la perte d’embryons pendant la collecte.
3. Préparation de plats de culture
- Choisir des boîtes de culture de plis neuraux (voir le tableau des matériaux) appropriées pour l’application en aval.
- Pour les cultures qui seront fixées et colorées, utilisez des lamelles de verre placées dans des boîtes de culture tissulaire multipuits.
REMARQUE: Les lamelles de couverture qui correspondent à la taille du puits se déplaceront moins avec le mélange de fluide, ce qui rendra les explants moins susceptibles de se déplacer et plus susceptibles d’adhérer à la lamelle de couverture plutôt qu’au fond de la boîte. - Choisissez des boîtes à chambre unique ou à chambre divisée à fond de verre (voir le tableau des matériaux) pour l’imagerie en direct avec un microscope inversé.
- Pour l’imagerie en direct sur un microscope vertical ou stéréoscopique, utilisez des plaques de culture tissulaire optiquement appropriées à 6, 12 ou 24 puits.
- Sélectionnez des boîtes de culture de tissus plastiques pour la collecte de masse de cellules de crête neurale migratrice pour des analyses à haut débit.
- Pour les cultures qui seront fixées et colorées, utilisez des lamelles de verre placées dans des boîtes de culture tissulaire multipuits.
- Ajouter 10 U/mL de pénicilline et 10 μg/mL de streptomycine à un flacon de 100 mL de solution stérile de Ringer (par exemple, 100 μL de 10 000 U/mL de pénicilline et 10 000 μg/mL de streptomycine, pour obtenir le P/S de Ringer). Utilisez le P/S de Ringer dans un délai de 1 semaine.
- Décongeler une partie aliquote de 1 mg/mL de FN sur la glace. Diluer avec le P/S de Ringer à une concentration de 10-100 μg/mL de FN.
- Pipeter suffisamment de solution FN pour couvrir le fond du puits ou de la boîte. Par exemple, 100 μL par puits dans une plaque de 24 puits, 500 μL pour une antenne de 35 mm.
- Remplacez le couvercle et incuber la vaisselle ou les assiettes avec une solution de FN dans un incubateur humidifié (ou un plateau couvert avec des serviettes en papier distillées imbibées d’eau) à 38 °C (100 °F) pendant au moins 1 h pendant la dissection des plis neuraux.
4. Isolement des embryons de poussins
- Prenez soin de maintenir l’orientation de l’œuf (l’embryon flotte au sommet du jaune pendant l’incubation). Utilisez des ciseaux ou des pinces émoussées pour percer un petit trou dans la coquille, environ 1/4-1/3 de la longueur de l’œuf.
- Insérez délicatement l’extrémité des ciseaux ou des pinces émoussées dans le petit trou, en veillant à ne pas perturber le jaune, et coupez la coquille autour de l’œuf, en enlevant le dessus de la coquille d’œuf (Figure 2A).
- Positionner l’embryon pour l’isoler.
REMARQUE: Si l’embryon n’est pas idéalement situé dans la coupe de la coquille, utilisez des pinces émoussées pour retourner soigneusement le jaune, de sorte que l’embryon soit sur le dessus. Sinon, versez le jaune dans une main gantée en coupe, en prenant soin de ne pas casser le jaune et en laissant l’albumine s’écouler (Figure 2B). Ensuite, l’embryon peut être positionné en déplaçant le jaune de main en main. - Préparez l’embryon en utilisant doucement le bord plat des pinces émoussées fermées pour essuyer tout excès d’albumine qui reste sur la surface du jaune recouvrant l’embryon (Figure 2C). L’excès d’albumine peut également être éliminé en utilisant une légère pression avec un essuie-glace délicat.
REMARQUE: Une fois l’albumine éliminée, la surface du jaune doit apparaître texturée au lieu d’être lisse. Si vous n’essuyez pas suffisamment d’albumine, l’adhérence du support de papier filtre de la section 4 est inhibée. - Utilisez une pince pour placer un cadre de support en papier filtre sur l’embryon, avec l’embryon dans la fenêtre du cadre. Appuyez doucement sur le papier filtre pour le coller sur le jaune.
- Couper autour de l’extérieur du cadre en papier filtre à l’aide de ciseaux à dissection (Figure 2D). Utilisez des pinces ou des pointes de ciseaux pour saisir le bord du cadre et soulever doucement l’embryon loin du jaune (Figure 2E). Soulever à un angle aidera à retirer l’embryon proprement du jaune.
- Placez l’embryon avec le cadre en papier vers le bas (côté ventral de l’embryon vers le haut) dans une boîte de Petri de 60 mm ou 100 mm remplie de P/S de Ringer (Figure 2F). Gardez la boîte d’embryons sur la glace si vous la collecte pour une application en aval sensible à l’ARN ou aux protéines.
NOTE: Ne pas placer les embryons face ventrale vers le haut risque de les détacher de leurs cadres en papier. Plusieurs embryons peuvent être collectés et stockés dans le P/S de Ringer jusqu’à 1 h avant de passer aux étapes de dissection du pli neural.
5. Disséquer les plis neuronaux
- Transférer un embryon dans un plat propre contenant la solution P/S de Ringer et rincer l’embryon en tenant le cadre en papier filtre avec une pince et en se balançant doucement d’avant en arrière pour éliminer tout jaune qui obscurcit la vue de l’embryon. Échangez le P/S du sonneur ou transférez-le dans un plat frais s’il devient trouble.
- Placez le côté dorsal/cadre de l’embryon vers le haut sous un microscope à dissection. En laissant l’embryon sur le cadre en papier pour le maintenir tendu et maintenu en place, retirez la membrane vitelline à l’aide d’une pince pour exposer les plis neuraux.
REMARQUE: Si l’embryon tombe du cadre en papier, il peut être disposé à plat dans le plat ou épinglé à un plat enduit de sylgard18 pour la dissection. - À l’aide de ciseaux à ressort ou d’une aiguille en tungstène aiguisée, excisez soigneusement les plis neuronaux du mésencéphale. Inclure la caudale tissulaire aux vésicules optiques en expansion et la rostrale au cerveau postérieur, où les constrictions rhombomères commencent tout juste à apparaître (le croissant cardiaque est également un indicateur utile, Figure 3B, C). Prenez soin d’exciser l’aspect le plus dorsal du pli neural avec un minimum de tube neural contaminant et d’ectoderme non neural (Figure 3C).
- Transférer les plis neuronaux dans un plat propre contenant le P/S de Ringer à l’aide d’un pipeteur P20 ou d’une pipette Pasteur en verre stérile rincée avec du P/S de Ringer jaune (cela bloque le plastique ou le verre pour empêcher le tissu de coller). Conservez les plis collectés sur de la glace tout en disséquant les plis supplémentaires.
6. Placage des plis neuraux
- Décongeler une partie aliquote du milieu de culture complet (section 1, étape 3). Ajouter 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine et filtrer stériliser. Maintenez le support préparé à 37-38 °C tout en effectuant d’autres étapes.
- Retirez les boîtes de culture de l’incubateur (section 3, étape 5). À l’aide d’une pipette ou d’une pipette Pasteur, retirer la solution FN des lamelles de couverture, de la vaisselle ou des puits. Après avoir rincé le substrat enduit de FN avec le P/S de Ringer, ajouter un volume approprié de milieux de culture complets dans les boîtes ou les puits (500 μL pour les puits dans une plaque de 24 puits, 2 mL pour une boîte de 35 mm ou une plaque à six puits).
REMARQUE : Des volumes plus petits peuvent préserver des réactifs coûteux (p. ex., aussi bas que 200 μL pour une plaque de 24 puits), mais assurer que la capsule est suffisamment humidifiée pour éviter l’évaporation. - À l’aide d’un pipetor p20 ou p200, rincez d’abord l’embout de la pipette avec le P/S jaune de Ringer pour bloquer le plastique et empêcher le tissu de coller. Ensuite, transférez les plis neuronaux isolés sur les lamelles de couverture enduites de FN, en prenant soin de transférer le moins de P/S de Ringer possible. Placez le(s) pli(s) vers le centre de la lamelle de couverture enduite de FN.
REMARQUE: Un ou quelques plis neuronaux peuvent être plaqués sur une lame de couverture de 12 mm dans un puits de 19 mm, jusqu’à 50 sur une plaque de 35 mm. - Après avoir laissé les explants se déposer pendant 10-15 min, placez-les dans une chambre humidifiée à 38 ° C (100 ° F) en portant lentement et soigneusement les boîtes de culture avec des plis neuraux plaqués. Cela minimisera le déplacement des plis neuronaux dans les puits, en veillant à ce qu’ils restent dispersés et adhèrent aux lames de couverture.
REMARQUE: Lors de l’utilisation de L15 (pas de DMEM), les boîtes de culture explant peuvent également être incubées dans un incubateur à œufs à l’aide d’un plateau couvert avec des serviettes en papier humidifiées. - Incuber des cultures de plis neuraux dans l’incubateur humidifié pendant la durée de la migration active (environ 16-20 h au total, Figure 4).
7. Fixation et coloration des CNC migrateurs d’élevage pour analyse morphologique
- Retirez le milieu de culture avec une pipette Pasteur et rincez les puits avec du PBS 1x stérilisé par filtre.
- Ajouter 4% de paraformaldéhyde pendant 15 min à température ambiante.
REMARQUE: Il peut être nécessaire de déterminer expérimentalement le temps de fixation. Il est également possible d’ajouter du paraformaldéhyde directement dans le milieu pendant 10 min (50:50), de l’enlever et de le remplacer par du paraformaldéhyde non dilué à 4 % pendant 10 min pour conserver les structures cellulaires plus délicates. - Retirer le paraformaldéhyde et rincer trois fois avec 1x PBS.
- Colorer les NCC fixés avec un colorant approprié pour l’évaluation morphologique. À titre d’exemple, la coloration à la phalloïdine conjuguée Oregon Green est détaillée ici.
REMARQUE : La visualisation du cytosquelette d’actine avec la phalloïdine19 révèle la complexité structurelle du CNC migrateur avec une intensité de coloration relativement uniforme; Cependant, la phalloïdine peut ne pas mettre en évidence toutes les zones cellulaires. Les colorants qui marquent la membrane plasmique (p. ex. agglutinine de germe de blé ou DiI) ou le cytoplasme peuvent également être utilisés, mais compliquent l’imagerie des saillies fines par rapport au corps cellulaire qui colore vivement. De plus, l’immunofluorescence peut être réalisée simultanément pour marquer les cellules de la crête neurale avec HNK-1 ou pour déterminer la localisation subcellulaire d’une protéine d’intérêt 7,20.- Retirer le rinçage final du PBS et ajouter du PBS + 0,5% de Triton X-100 (PBST) + 5% de sérum (FBS ou d’un autre animal approprié pour le costaiing avec un anticorps) pour couvrir les lamelles de couverture et incuber pendant 10 minutes sur une plate-forme agitatrice à température ambiante.
- Pipet 200 nM de phalloïdine conjuguée Oregon Green (diluée dans du PBST + 5% de sérum) sur une surface lisse (comme un film d’étanchéité à la paraffine flexible) pour chaque lamelle de couverture. Pour une lamelle de couverture de 12 mm, pipeter un volume de 30 μL.
- À l’aide d’une paire de pinces, retirez la lamelle de couverture du sérum PBST + 5%, en veillant à maintenir l’orientation des cellules vers le haut. Touchez brièvement le bord de la lamelle de couverture sur un essuie-glace délicat pour évacuer l’excès de liquide.
- Placez délicatement chaque glissement de couverture côté cellule vers le bas sur la goutte de phalloïdine diluée. Incuber pendant 30 min à température ambiante. Gardez les lamelles dans l’obscurité pendant la coloration (couvrir avec un plat recouvert de papier d’aluminium ou placer dans un tiroir).
- Pendant l’incubation, ajouter du PBST aux puits de la boîte de culture (750 μL de PBST pour chaque puits d’une plaque de 24 puits).
- Après la période d’incubation, soulevez les lamelles de couverture de la solution de coloration et replacez-les dans la boîte de culture, en retournant la housse pour que le côté cellulaire soit relevé. Assurez-vous que le capot est recouvert de PBST et placez-le sur une plate-forme agitatrice pendant 10 minutes, en gardant les lamelles couvertes et dans l’obscurité. Retirez PBST et répétez cette étape deux fois, pour un total de trois lavages de 10 minutes.
- Placez une goutte (par couvercle) de support de montage (voir le tableau des matériaux) sur une lame de microscope. Un volume de 25 μL fonctionne bien pour une lamelle de couverture de 12 mm.
- Après le lavage final avec PBST, touchez le bord de la lamelle de couverture à un essuie-glace délicat pour éliminer l’excès de liquide, en gardant une trace du côté cellule de la lamelle de couverture.
- Montez la cellule de couvercle côté vers le bas en abaissant lentement la lamelle de couverture à un angle sur le support de montage pour éviter de créer des bulles. Laissez le support se définir avant l’imagerie.
8. Évaluation morphologique des CCN migrateurs d’élevage
- Images colorées cellules et exportation sous forme de fichiers .tiff.
NOTE: Un objectif 40x fonctionne bien pour les cultures d’imagerie, mais des objectifs allant de 10x (pour capturer tout un champ de CNC migrateurs) à 100x (CNC uniques) peuvent être utilisés pour collecter des images pour l’évaluation morphologique. Les images de la présente étude ont été capturées à l’aide d’une plateforme d’imagerie multimodale inversée (voir le tableau des matériaux). - Téléchargez les images dans un logiciel d’analyse d’images (ImageJ21, voir Tableau des matériaux). Cliquez sur Image > Dupliquer pour créer une deuxième copie de chaque image à utiliser pour l’analyse, laissant ainsi l’original non édité, car la plupart des traitements d’image ne peuvent pas être inversés.
- Cliquez sur Image > Ajuster > Luminosité / Contraste et utilisez des barres coulissantes pour ajuster la luminosité ou le contraste des images.
- Convertissez les images en niveaux de gris en suivant les étapes ci-dessous.
- Si les images sont exportées en RVB, elles seront téléchargées en RVB en tant que canal fusionné. Pour séparer les images, cliquez sur Image > Color > Split Channels pour acquérir des images en niveaux de gris monocouches.
- Si les images sont déjà séparées, accédez à l'> Image Type > 8 bits pour convertir le fichier en niveaux de gris.
- Cliquez sur Image > Ajuster > Seuil pour convertir en une image binaire où les pixels sont identifiés comme des cellules (premier plan; noir) ou un arrière-plan (blanc). Utilisez la barre coulissante et/ou cliquez sur Auto pour sélectionner le paramètre Seuil qui définit clairement les cellules à partir de l’arrière-plan.
- Si les cellules se chevauchent ou si la coloration n’est pas continue, il peut être nécessaire de poursuivre le traitement à l’aide des fonctions Bassin versant ou Trous de remplissage22. Cela séparera les cellules les unes des autres ou comblera les lacunes dans les cellules à analyser. Cliquez sur Traiter > Binaire > Rendre binaire pour convertir d’abord l’image en un format binaire 8 bits. Cliquez ensuite sur Traiter > Binary > Watershed ou Fill Holes.
REMARQUE: Le logiciel s’adaptera au mieux aux endroits où les signaux doivent être séparés ou remplis, ce qui peut être ajusté davantage à l’aide de plug-ins si nécessaire.
- Si les cellules se chevauchent ou si la coloration n’est pas continue, il peut être nécessaire de poursuivre le traitement à l’aide des fonctions Bassin versant ou Trous de remplissage22. Cela séparera les cellules les unes des autres ou comblera les lacunes dans les cellules à analyser. Cliquez sur Traiter > Binaire > Rendre binaire pour convertir d’abord l’image en un format binaire 8 bits. Cliquez ensuite sur Traiter > Binary > Watershed ou Fill Holes.
- Sélectionnez les mesures à capturer. Cliquez sur Analyser > Définir les mesures et cochez les cases Descripteurs de forme pour l’analyse de la circularité (circ.), du rapport d’aspect (AR), de la rondeur (ronde) et de la solidité.
REMARQUE : D’autres mesures peuvent également être incluses, comme la superficie et le périmètre, selon le type d’analyse nécessaire. - Cliquez sur Analyser > Analyser les particules et définissez les paramètres à partir du menu « Analyser les particules ».
- Sous « Taille », estimez approximativement la taille des cellules ou des particules d’intérêt en pixels, car le signal de fond ou les débris de cellules plus petits seront également inclus si le paramètre Taille reste défini sur 0-Infini (par exemple, défini sur 500-Infinity dans la Figure 5).
REMARQUE: L’ajustement de la taille à une plage plus étroite peut exclure des particules plus petites ou plus grosses que celles nécessaires pour l’analyse. - Sous « Circularité », laissez à 0-1,0 pour mesurer toutes les formes de cellules de l’image.
- Sous « Afficher », sélectionnez Contours nus dans le menu déroulant pour inspecter les contours de cellule sélectionnés avec la fonction « Analyser les particules ». Scannez les contours pour vous assurer que les cellules qui se chevauchent sont distinguées, mais que les cellules ne sont pas divisées inutilement. Vérifiez également les cases de menu « Afficher les résultats », « Résumer » et « Ajouter au gestionnaire ».
- Sous « Taille », estimez approximativement la taille des cellules ou des particules d’intérêt en pixels, car le signal de fond ou les débris de cellules plus petits seront également inclus si le paramètre Taille reste défini sur 0-Infini (par exemple, défini sur 500-Infinity dans la Figure 5).
- Une fois tous les paramètres définis, cliquez sur Ok.
REMARQUE: Quatre fenêtres distinctes apparaîtront, montrant (1) les contours nus des cellules identifiées dans l’image, (2) les cellules comptées dans l’image, (3) les résultats des mesures de chaque cellule et (4) un résumé du nombre total de cellules comptées et de leurs mesures moyennes.- Si les débris ont été comptés, les cellules qui se chevauchent ont été comptées comme une, les cellules individuelles ont été comptées comme des multiples, ou de nombreuses cellules ont été omises du dénombrement, revenir à l’image originale non éditée, faire un autre doublon et ajuster « Seuil » ou d’autres paramètres.
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Representative Results
La figure 1 donne un aperçu du présent protocole. Les œufs couvés ont été ouverts et le jaune, avec l’embryon à la surface, a été isolé en versant doucement dans la paume d’une main gantée (Figure 2A,B). Après avoir éliminé l’albumine (figure 2C), des cadres en papier filtre ont été appliqués sur la membrane vitelline entourant l’embryon pour faciliter la coupe et le soulèvement de l’embryon du jaune, qui commence à se répandre une fois que les membranes vitelliniques sont coupées (Figure 2D,E).
Figure 2 : Isolement de quatre à sept embryons de poussins de somite. Les œufs fécondés ont été incubés pendant 35 h. Un œuf a été ouvert avec une pince émoussée (A) et le jaune a été versé dans une main gantée (B). L’excès d’albumine a été éliminé (C) afin qu’un support de papier filtre (D, encadré) adhère au jaune. L’embryon a été coupé du jaune (D), soulevé (E) et placé dans le P/S (F) de Ringer. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Après avoir rincé l’embryon et déménagé pour nettoyer le P/S de Ringer, des plis neuraux étaient visibles dans les embryons isolés (Figure 3A). Ces plis contiennent des cellules de crête neurale crânienne prémigratoires. Une fois excisés d’un embryon (Figure 3B,C) et prélevés (Figure 3D), les plis neuraux isolés peuvent être plaqués pour créer des cultures de CNC migrateurs.
Figure 3 : Dissection des plis neuraux dorsaux des poussins. Travaillant dans le P/S de Ringer, des ciseaux à ressort ont été utilisés pour exciser les plis neuraux. (A) Vue dorsale embryonnaire, antérieure vers le haut de la figure. Les plis neuraux semblent plus opaques que les tissus environnants. Les plis neuraux du mésencéphale se trouvent en arrière des lobes optiques (rose) et antérieurs au croissant cardiaque (jaune). (B) Vue dorsale de l’embryon après l’ablation des plis neuraux, montrant les limites de l’excision. (C) Vue latérale de l’embryon avec les plis neuraux enlevés. La technique de dissection enlève le tube neural dorsal, évitant ainsi les structures du tube ventral et non neural. (D) Plis neuronaux isolés dans le P/S. Barre d’échelle de Ringer = 300 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Lorsque les plis neuraux ont été plaqués sur FN, les NCC ont commencé à émerger des explants de plis neuraux adhérents dans les 3 à 4 heures suivant l’incubation (figure 4A), et la migration a été achevée après environ 20 heures (figure 4B). La coloration HNK-1, qui marque les CCN migrateurs20, était apparente dans la plupart des cellules de la culture (figure 4D). Un résultat négatif s’est produit lorsque les plis neuronaux n’adhéraient pas à la lame-couverture ou qu’aucun NCC n’avait émigré de l’explant (données non présentées). Les NCC ont été analysés en fixant les cultures, en colorant l’actine filamenteuse et en effectuant diverses mesures dans ImageJ pour évaluer la morphologie et la migration des NCC (Figure 5). La surface moyenne des 69 cellules analysées était de 802,11 ± 69,65 μm2, avec une plage de 60,27 à 2664,53μm2, répartie comme indiqué dans le graphique à barres et le tracé du violon (figure 5C). La circularité (formule : circularité = 4π(surface/périmètre²)), une mesure qui reflète la saillie d’une cellule, variait de 0,101 à 0,875, avec une moyenne de 0,38 ± 0,15. Les valeurs inférieures indiquent une forme allongée, tandis qu’une valeur de 1 indique un cercle parfait. Comme le montre le tracé du violon, la plupart des cellules présentent une forme allongée (Figure 5D). Une autre mesure de la forme de la cellule est le rapport hauteur / largeur (AR), qui est l’axe principal de la cellule divisé par le petit axe. Une valeur AR de 1 indique une forme symétrique23. Les CCN migrateurs dans ce domaine avaient un AR moyen de 2,13 ± 0,11, avec des valeurs allant de 1,14 à 5,59 (figure 5E). À l’aide de ces mesures quantitatives de la morphologie des NCC, des comparaisons rigoureuses peuvent être effectuées entre les conditions expérimentales et différentes études publiées.
Figure 4 : Les CCN migrateurs émergent des plis neuronaux cultivés. Images en fond clair de plis neuronaux plaqués après 3 h d’incubation (A) et 20 h d’incubation (B). Barre d’échelle = 200 μm. (C, D) Le pli neural est largement dispersé après 20 h d’incubation mais résiduellement présent sur le côté droit de ces images. Barre d’échelle = 500 μm. Les CCN migrateurs sont visibles avec une coloration DAPI (C) et HNK-1 (D). L’immunomarquage HNK-1 confirme que les cellules en culture sont des CCN migrateurs. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Évaluation morphologique des CCN migrateurs d’élevage. (A) Coloration phalloïdine de l’actine filamenteuse dans les CCN migrées d’un pli neural après 20 heures en culture. Barre d’échelle = 50 μm. (B) Image de seuil avec des cellules apparaissant en noir et l’arrière-plan blanc. Des contours jaunes entourent les objets comptés comme des cellules et les cellules sont numérotées. (C-E) Options graphiques pour afficher les données d’évaluation morphologique. Des diagrammes à barres et des diagrammes de violon ont été créés à partir des mesures des 69 cellules montrées dans le panneau B pour représenter la surface (μm2, C), la circularité (D) et le rapport d’aspect (E) des cellules mesurées. Les graphiques à barres montrent les valeurs moyennes avec des barres d’erreur représentant l’erreur type de la moyenne à gauche de chaque panneau. Des tracés pour violon ont été créés avec app.rawgraphs.io. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
La technique décrite ici fournit une méthode adaptable pour isoler les plis neuraux des poussins et les plaquer pour créer des cultures de CCN crâniens migrateurs. Ces cultures fournissent des conditions 2D simplifiées pour une analyse facile de la migration et de la morphologie des NCC des poussins qui peuvent compléter les méthodes d’imagerie in ovo plus difficiles sur le plan technique24,25,26. Bien que cette méthode in vitro soit relativement simple, des résultats cohérents dépendent d’ovules et de réactifs de haute qualité. De plus, en raison de la variabilité inhérente des cultures, la reproductibilité nécessite une répétition expérimentale et une quantification.
L’adhésion des plis neuraux à la PN est essentielle pour la migration des NCC en culture. Parfois, les explants n’adhèrent pas correctement et le pli neural flotte ou ne produit pas ou peu de NCC migrateurs. Cela peut se produire lorsqu’un pli neural crânien n’atterrit pas côté coupé vers le bas; Essayez d’orienter les explants dans le récipient de culture avant l’incubation et laissez-les s’installer pendant 10-15 minutes avant de les déplacer. Cependant, en raison du mélange de fluides lors du transfert vers l’incubateur, certains plis neuronaux adhéreront inévitablement de manière sous-optimale de temps en temps. Lorsque l’adhésion et la migration sont problématiques pour l’ensemble d’une expérience, cela peut refléter une ancienne FN (utiliser une partie aliquote fraîche de -80 °C pour chaque expérience), un milieu de culture avec des composants périmés (stocker des milieux préparés dans des aliquotes de la taille de l’expérience à -20 °C et ajouter un antibiotique frais au moment de l’utilisation) ou l’utilisation de lamelles de couverture qui ne conviennent pas à la culture cellulaire (par exemple, les cellules n’adhèrent pas aux feuillets de couverture pour l’histologie). Un incubateur contaminé peut également faire échouer des expériences entières de culture de CNC.
En plus de produire des CNC dispersés en culture et de permettre l’analyse de la morphologie des NCC migrateurs, ce protocole est également un point de départ pour de nombreuses autres expériences. Les explants plaqués sur des lamelles de couverture peuvent également être traités pour l’immunofluorescence (après la section 7, étape 3) afin de déterminer la localisation subcellulaire d’une protéine d’intérêt7. Bien que l’analyse de la morphologie et de la distance de migration soit possible dans des cultures fixes, comme décrit ici, l’imagerie accélérée des CCN pendant l’incubation de la culture (section 6, étape 5) permet de collecter des données supplémentaires sur la directionnalité et la persistance de la migration et la dynamique de la motilité cellulaire (mesures de la saillie membranaire, de l’adhésion, etc.). 14,24,27. La manipulation génétique transitoire d’embryons peut être réalisée par électroporation18,28 de réactifs (morpholinos29, constructions d’expression de l’ADN, ou vecteurs CRISPR30) aux stades 4+17 de Hamburger et Hamilton. Ces embryons électroporés peuvent ensuite être utilisés dans le protocole pour créer des cultures migratrices de NCC avec perte de fonction ou surexpression de gènes d’intérêt. L’analyse fonctionnelle peut également être réalisée en ajoutant des inhibiteurs chimiques aux milieux des cultures de CCN 7,27 (section 6, étape 2). Le profilage des CCN au niveau de la population au moyen d’analyses au niveau -omique nécessite la collecte des CCN en tant que matière première 7,11,31. Bien que des marqueurs aient été utilisés pour isoler les NCC par tri cellulaire activé par fluorescence31, cela nécessite un équipement spécialisé de cytométrie en flux et une dissociation enzymatique des cellules. Suivre les méthodes décrites ici pour exciser soigneusement les plis neuraux dorsaux (en minimisant la collecte du tube neural ventral et des cellules ectodermiques non neurales) fournit une méthode peu coûteuse pour collecter les NCCprémigratoires 11 (section 5, étape 4). La collecte des CNC après dispersion en culture (section 6, étape 5) fournit une population relativement pure de CCN migrateurs naturellement séparés pour une analyse plus approfondie (coloration HNK-1, un marqueur des CCN migrateurs, dans la majorité des cellules cultivées de la figure 4D; voir7). Enfin, ces variations peuvent être utilisées en combinaison. Par exemple, l’immunofluorescence ou l’imagerie accélérée peuvent être utilisées pour évaluer les effets des manipulations de l’expression génique ou de l’ajout d’inhibiteurs27. Dans l’ensemble, ce protocole adaptable et peu coûteux fournit les moyens d’évaluer la morphologie des CCN migrateurs crâniens de type sauvage en culture avec de multiples modifications potentielles pour atteindre divers objectifs expérimentaux.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Nous remercions Corinne A. Fairchild et Katie L. Vermillion, qui ont participé à l’élaboration de notre version du protocole de culture des plis neuraux crâniens des poussins.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AxioObserver equipped with an LSM710 confocal scan head controlled by ZEN 3.0 SR software | Zeiss | Used alpha Plan-Apochromat 100x/1.46 Oil DIC M27 objective | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Chamber dishes (glass bottom, single or divided) | MatTek; Cell Vis | P35G-1.5-14-C (MatTek) X000NOJQGX (Cellvis) X000NOK1OJ (Cellvis) |
Single chamber 35 mm or 4 chamber 35 mm |
| Cover glass | Carolina Biological Supply Company | 633029, 633031, 633033, 633035, 633037 | circles, 0.13–0.17 mm thickness, available in 12-25 mm diameter |
| DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 11320033 | Alternative for L15 media |
| Egg incubator | Sportsman | 1502 | |
| FBS | Life Technologies | 10437-028 | |
| Fibronectin | Fisher Scientific | CB-40008A | |
| Filter paper | Whatman | grade 3MM chromatography | |
| Forceps (blunt) | Fisher Scientific; Thomas Scientific | 08-890 (Fisher);1141W97 (Thomas) | |
| Forceps (fine) | Fine Science Tools | 11252-20 | Dumont #5 |
| Image J | https://fiji.sc/ | Free image analysis software | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| L15 media | Invitrogen | 11415064 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030 | |
| Mounting Media (Vectashield or ProLong Gold) | Vector Laboratories; Thermofisher Scientific | H-1700 (Vectashield); P36930 (ProLong Gold) | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140-148 | 10,000 Units/mL Penicillin; 10,000 mg/mL Streptomycin |
| Petri Dishes | VWR (or similar) | 60 mm, 100 mm | |
| Phalloidin | Sigma-Aldrich | P1951 | multiple flurophores available |
| Pin holder | Fine Science Tools | 26016-12 | For tungsten needle (alternative for spring scissors) |
| Scissors (dissection) | Fine Science Tools | 14061-10 | |
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | 2.5 mm cutting edge (alternative for tungsten needle) |
| Sylgard | Krayden | Sylgard 184 | |
| Syringe Filters | Sigma-Aldrich | SLGVM33RS | Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized |
| Tissue culture dishes | Sarstedt | 83-3900 | 35 mm culture dishes for bulk neural fold cultures |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Tungsten wire | Variety of sources | 0.01" diameter for tungsten needle (alternative for spring scissors) |
References
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