Summary
この汎用性の高いプロトコルは、ニワトリ胚からの脳神経襞の切除による遊走性神経堤細胞(NCC)の単離について説明しています。プレーティングとインキュベーションを行うと、遊走性NCCが神経襞の外植片から出現し、単純化された2D環境での細胞形態と遊走の評価を可能にします。
Abstract
脊椎動物の発生中、神経堤細胞(NCC)は広範囲に移動し、頭蓋顔面骨格や末梢神経系などの構造に寄与するさまざまな細胞型に分化します。NCCの移動を3D胚の文脈で理解することは重要ですが、2D培養で遊走細胞を単離することで、可視化と機能特性評価が容易になり、胚研究を補完します。本プロトコルは、初代NCC培養物を生成するためにニワトリ脳神経襞を単離する方法を示す。遊走性NCCは、フィブロネクチンでコーティングされた基質に播種された神経襞の外植片から出現します。これにより、分散した付着性NCC集団が得られ、染色および定量的形態学的分析によって評価できます。この単純化された文化アプローチは適応性が高く、他の手法と組み合わせることができます。例えば、NCCの遊走および移動行動は、タイムラプスイメージングによって評価するか、または遺伝子発現の阻害剤または実験的操作(例えば、DNA、モルホリノ、またはCRISPRエレクトロポレーション)を含むことによって機能的に照会することができる。その汎用性のために、この方法は頭蓋NCC発達を調査するための強力なシステムを提供します。
Introduction
神経堤細胞(NCC)は、脊椎動物の胚の一過性細胞集団です。NCCは神経板の境界で特定され、背側神経管1から移行するために上皮間葉転換(EMT)を受けます。EMT後、NCCは胚全体に広範囲に分散し、最終的には頭蓋顔面骨格、心臓の流出路、末梢神経系の大部分など、さまざまな構造を分化させて寄与します2。細胞極性、細胞骨格、および接着特性の変化は、遊走性細胞集団から遊走性細胞集団へのこのシフトの根底にあります3。NCC EMTと遊走を研究することで、細胞の運動性の基本的なメカニズムについての洞察が得られ、先天性欠損症と癌転移を予防および治療するための取り組みに情報を提供します。
in vivo分析は、胚の文脈でNCC発生プロセスを理解するために不可欠ですが、in vitroメソッドは、追加の実験手段を容易にする視覚的および物理的なアクセシビリティを提供します。単純化された2D環境では、NCC形態、細胞骨格構造、および移動距離を評価できます。さらに、運動性NCCの移動行動に対する遺伝的または可溶性因子の摂動の影響を分析することができます4、5、6、7、8、9、10。さらに、単離された遊走性または移動性NCCを収集、プールし、プロテオミクス、トランスクリプトミクス、およびエピゲノムプロファイリングを通じてNCCの発生調節を研究するためのハイスループット方法論に使用することができます7,11。さまざまな発生モデル生物から頭蓋NCCを調製する方法が利用可能である12,13,14が利用可能ですが、この記事では、ニワトリ胚から頭蓋NCCを培養することを最初に学んだ人のためのアプローチの仕組みを示します。
現在のプロトコルは、ニワトリ頭蓋NCC培養物を調製するための汎用性の高い技術を記載しています(図1)。NCCは外植された神経襞から培養基質に容易に移動するため、ニワトリNCCは胚組織から自然に分離し、初代培養物が容易に生成されます。中脳NCCが脳神経襞から一斉に移動すると(体幹15の細胞ごとの層間剥離とは対照的に)、これらの培養物は主に遊走性脳神経堤細胞で構成され、最初の神経襞切除は遊走性NCCの収集方法を提供します。ニワトリ脳神経襞を解剖して培養するための基本的な方法を詳述し、この方法のさまざまな用途とバリエーションの提案を提供します。
図1:ニワトリ脳神経襞培養プロトコルの概略図。 (A,B)脳神経襞(青色で輪郭が描かれている)は、5つの体節を持つニワトリ胚から切除されます(Aの背側図で示されています)。灰色の帯、心臓の三日月。(C)フィブロネクチンにプレーティングすると、遊走性神経堤細胞が神経襞から出現し、基質上に分散する。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Protocol
ホワイトレグホーン、ゴールデンセックスリンク、ロードアイランドレッドなど、あらゆる種類のガル スガルス 品種を使用できます。本研究で使用した鶏卵は様々な品種であり、地元の農場や孵化場を含む複数の供給源から入手した。
1.溶液と材料の調製
- 123.3 mM NaCl、1.53 mM CaCl 2、4.96 mM KCl、0.809 mM Na 2 HPO 4、および0.147 mM KH2PO4を混合してリンゲル溶液を調製します(材料表を参照)。pHを7.4に調整し、100mLボトルにろ過滅菌します。清潔で乾燥した場所に保管してください。ボトルを石鹸で洗わないでください(組織培養ガラス製品として扱います)。
- FNを滅菌リンゲル溶液に溶解して1 mg/mLのフィブロネクチン(FN)ストック溶液( 材料の表を参照)を調製し、100 μLアリコートで-80°Cで保存します(少なくとも4年間安定)。
- L15培地に0.8%L-グルタミン、0.08%ペニシリン/ストレプトマイシン、10%FBS、および10%ニワトリ胚抽出物を添加して、完全培養培地を調製します12。3 mLアリコートを作成し、-20°Cまたは-80°Cで保存します。
注:培養物をCO2インキュベーターでインキュベートする場合は、DMEM/F12 を空気用に緩衝されたL15に置き換える必要があります。 - 1x PBSで4%パラホルムアルデヒド溶液を調製します。pHを7.4に調整します。10 mLアリコートを作成し、-20°Cで保存します。
注意: パラホルムアルデヒドはドラフトで取り扱う必要があります。 - ろ紙のサポートフレーム(長軸に2つまたは3つのパンチ穴が重なっている約1 cm x 1.5 cmの長方形の用紙)を準備します。
- 標準の3穴パンチを使用して大きなろ紙の端に沿って穴を開け、打ち抜いたエッジをストリップにカット/トリミングしてから、穴の間のストリップを長方形~長さ1.5cmにカットします。使用前にオートクレーブろ紙を貼ってください(オプション)。
- 細かい鉗子、鈍い鉗子、解剖はさみ、ばねはさみ、鋭利なタングステン針などの解剖ツールを収集します16。
2.胚のインキュベーション
- 上記の供給源のいずれかから受精卵を入手してください。
- 受精卵を38°C(100°F)の加湿インキュベーター内で直立位置(尖った端を下/鈍い面を上にして卵の垂直の長軸)に置きます。
- 4〜7個の体節が形成されるまでインキュベートし(ステージ8 + -9)17、これには約35時間かかります。
注:潜伏時間は、株、鶏の年齢、季節などによって大きく異なる可能性があるため、実験的に決定する必要があります。プログラム可能なアウトレットタイマーは、夜間にインキュベーションを開始して目的のタイミングを得るのに役立ちます。 - インキュベーターから取り出した後、卵に70%エタノールを徹底的にスプレーし、それらを乾燥させて殻を消毒します。
注:胚はすぐに収集できますが、卵を室温まで冷やすと、卵黄の脆弱性と収集中の胚の損失が減少します。
3.培養皿の準備
- ダウンストリームアプリケーションに適したニューラルフォールド培養皿( 材料表を参照)を選択します。
- 固定および染色される培養物には、マルチウェル組織培養皿に入れたガラスカバーガラスを使用します。
注意: ウェルサイズに一致するカバーガラスは、流体の混合による移動が少なくなり、外植片がずれにくくなり、皿の底ではなくカバーガラスに付着する可能性が高くなります。 - 倒立顕微鏡によるライブイメージング用に、ガラス底のシングルチャンバーまたは分割チャンバーディッシュ( 材料表を参照)を選択します。
- 正立顕微鏡または実体顕微鏡でのライブイメージングには、6ウェル、12ウェル、または24ウェルの光学的に適切な組織培養プレートを使用してください。
- ハイスループット分析のために遊走性神経堤細胞の大量収集のためのプラスチック組織培養皿を選択してください。
- 固定および染色される培養物には、マルチウェル組織培養皿に入れたガラスカバーガラスを使用します。
- 10 U / mLのペニシリンと10 μg / mLのストレプトマイシンを滅菌リンゲル溶液の100 mLボトルに追加します(たとえば、100 μLの10,000 U / mLペニシリンと10,000 μg / mLストレプトマイシンを使用して、リンゲルのP / Sを作成します)。1週間以内にリンガーのP / Sを使用してください。
- 1 mg/mLのFNのアリコートを氷上で解凍します。リンガーP / Sで10〜100μg / mLのFNの濃度に希釈します。
- 井戸または皿の底を覆うのに十分なFN溶液をピペットする。例えば、24ウェルプレートではウェルあたり100 μL、35 mmディッシュでは500 μLです。
- 蓋を元に戻し、加湿インキュベーター(または蒸留水に浸したペーパータオルが入った蓋付きトレイ)で皿またはプレートをFN溶液とともに38°C(100°F)で少なくとも1時間インキュベートし、神経襞を解剖します。
4.ニワトリ胚の分離
- 卵の向きを維持するように注意してください(孵卵中に胚は卵黄の上に浮かびます)。はさみまたは鈍い鉗子を使用して、卵の長さの約1 / 4〜1 / 3の小さな穴を殻に開けます。
- はさみまたは鈍い鉗子の先端を小さな穴に慎重に挿入し、卵黄を乱さないようにし、卵の周りの卵殻を切り裂き、卵殻の上部を取り除きます(図2A)。
- 胚を分離のために配置します。
注:胚がシェルカップに理想的に配置されていない場合は、鈍い鉗子を使用して卵黄を慎重に回転させ、胚が上になるようにします。または、卵黄を手袋をはめたカップ状の手に注ぎ、卵黄を壊さないように注意し、アルブミンを排出させます(図2B)。次に、卵黄を手から手へと動かすことによって胚を配置することができます。 - 閉じた鈍い鉗子の平らな端をそっと使用して胚を準備し、胚を覆う卵黄の表面に残っている余分なアルブミンを拭き取ります(図2C)。余分なアルブミンは、繊細なタスクワイパーで穏やかな圧力を使用して除去することもできます。
注意: アルブミンが取り除かれると、卵黄の表面は滑らかではなくテクスチャーで見えるはずです。十分なアルブミンを拭き取らないと、セクション4、ステップ4のろ紙支持体の接着が阻害されます。 - 鉗子を使用して、胚をフレームのウィンドウに入れた状態で、胚の上にろ紙サポートフレームを置きます。ろ紙をそっと押し下げて、卵黄に付着させます。
- ろ紙フレームの外側を解剖ハサミで切り取ります(図2D)。鉗子またははさみの先端を使用してフレームの端をつかみ、胚を卵黄からそっと持ち上げます(図2E)。斜めに持ち上げると、卵黄から胚をきれいに取り除くのに役立ちます。
- 紙枠を下にして(胚腹側を上にして)胚をリンガーP / Sで満たされた60mmまたは100mmのペトリ皿に入れます(図2F)。RNAまたはタンパク質感受性の下流アプリケーションのために収集する場合は、胚の皿を氷の上に置いてください。
注:胚を腹側を上にして配置しないと、胚が紙枠から剥がれるリスクがあります。複数の胚を収集し、神経襞解剖ステップに移行する前に最大1時間リンガーのP / Sに保存することができます。
5.神経襞の解剖
- リンゲルのP / S溶液を含むきれいな皿に胚を移し、濾紙フレームを鉗子で持ち、ゆっくりと前後に振り回して、胚の視界を覆い隠す卵黄を取り除きます。呼び出し音のP / Sを交換するか、曇った場合は新鮮な皿に移します。
- 解剖顕微鏡下で胚の背側/フレーム側を上にして配置します。胚を紙枠に残してぴんと張って所定の位置に保持し、鉗子を使用して卵子膜を取り除き、神経ひだを露出させます。
注:胚が紙枠から落ちた場合は、皿に平らに配置するか、解剖のためにシルガードコーティングされた皿18 に固定することができます。 - スプリングハサミまたは鋭利なタングステン針を使用して、中脳神経ひだを慎重に切除します。拡大する視神経小胞への組織尾と、菱形の狭窄が現れ始めたばかりの後脳への吻側を含めます(心臓三日月も有用な指標です、 図3B、C)。神経襞の最背側を切除し、神経管と非神経外胚葉の汚染を最小限に抑えるように注意してください(図3C)。
- P20ピペッターまたは卵黄リンガーP/Sですすいだ滅菌ガラス製パスツールピペットを使用して、神経襞をリンガーP/Sを含む清潔な皿に移します(これはプラスチックまたはガラスをブロックして組織がくっつくのを防ぎます)。追加の折り目を解剖しながら、集めた折り目を氷の上に保管します。
6.神経襞のメッキ
- 完全培養培地のアリコートを解凍します(セクション1、ステップ3)。100 U/mLのペニシリンと100 μg/mLのストレプトマイシンを加え、フィルター滅菌します。準備した培地を37〜38°Cに保ちながら、他の手順を実行します。
- 培養皿をインキュベーターから取り出します(セクション3、ステップ5)。ピペッターまたはパスツールピペットを使用して、カバーガラス、皿、またはウェルからFN溶液を取り除きます。FNコーティング基板をリンゲルP/Sですすいだ後、適切な量の完全培養培地をディッシュまたはウェルに加えます(24ウェルプレートのウェルの場合は500 μL、35 mmディッシュまたは6ウェルプレートの場合は2 mL)。
注:容量を小さくすると、高価な試薬(たとえば、24ウェルプレートの場合は200 μL)を保存できますが、ディッシュが蒸発しないように十分に加湿されていることを確認してください。 - p20またはp200ピペッターを使用して、まずピペットチップを卵黄リンガーのP / Sですすぎ、プラスチックをブロックし、組織が付着するのを防ぎます。次に、孤立した神経襞をFNコーティングされたカバーガラスに移し、リンガーのP / Sをできるだけ少なくするように注意します。折り目をFNコーティングされたカバーガラスの中央に向かって配置します。
注:1つまたはいくつかの神経襞は、19 mmウェルの12 mmカバーガラスにメッキでき、35 mmプレートには最大50個までメッキできます。 - 外植片を10〜15分間落ち着かせた後、播種した神経襞で培養皿をゆっくりと注意深く運んで、38°C(100°F)の加湿チャンバーに入れます。これにより、ウェル内の神経襞の移動が最小限に抑えられ、分散したままでカバーガラスに付着します。
注:L15(DMEMではない)を使用する場合、外植片培養皿は、湿らせたペーパータオルでカバー付きのトレイを使用して卵インキュベーターでインキュベートすることもできます。 - 加湿インキュベーター内で神経襞培養物を能動的遊走の期間中インキュベートする(合計約16〜20時間、 図4)。
7. 形態素解析のための培養移動性NCCの固定と染色
- パスツールピペットで培地を取り出し、フィルター滅菌した1x PBSでウェルをすすぎます。
- 室温で4%パラホルムアルデヒドを15分間加えます。
注:固定時間は実験的に決定する必要がある場合があります。パラホルムアルデヒドを培地に直接10分間(50:50)添加し、除去し、希釈していない4%パラホルムアルデヒドと10分間交換して、より繊細な細胞構造を保持することもできます。 - パラホルムアルデヒドを除去し、1x PBSで3回すすぎます。
- 形態学的評価のために、固定されたNCCを適切な染料で染色します。一例として、オレゴングリーンコンジュゲートファロイジンによる染色がここで詳述される。
注:ファロイジン19でアクチン細胞骨格を視覚化すると、比較的均一な染色強度で遊走性NCCの構造的複雑さが明らかになります。ただし、ファロイジンはすべての細胞領域を強調表示するわけではありません。原形質膜を標識する色素(例えば、小麦胚芽凝集素またはDiI)または細胞質も使用することができるが、明るく染色する細胞体に対する微細な突起のイメージングを複雑にする。さらに、免疫蛍光法は、神経堤細胞をHNK-1で標識するため、または目的のタンパク質の細胞内局在を決定するために同時に行うことができる7,20。- 最後のPBSリンスを取り除き、カバーガラスを覆うためにPBS + 0.5%Triton X-100(PBST)+ 5%血清(FBSまたは抗体との共染色に適した別の動物由来)を加え、室温のプラットフォームシェーカーで10分間インキュベートします。
- Pipet 200 nMのオレゴングリーンコンジュゲートファロイジン(PBST + 5%血清で希釈)を、各カバーガラスの滑らかな表面(フレキシブルパラフィンシーリングフィルムなど)上に配置します。カバーガラスが12 mmの場合は、容量30 μLのピペットで固定します。
- 一対の鉗子を使用して、PBST + 5%血清からカバーガラスを取り除き、細胞の向きが上を向いていることを確認します。カバーガラスの端を繊細なタスクワイパーに軽く触れて、余分な液体を吸い取ります。
- 各カバーガラスセル側を下にして、希釈したファロイジンの滴の上にそっと置きます。室温で30分間インキュベートします。染色中はカバーガラスを暗所に保管してください(アルミホイルで覆われた皿で覆うか、引き出しに入れます)。
- インキュベーション中に、培養皿のウェルにPBSTを加えます(24ウェルプレートの各ウェルに750 μLのPBST)。
- インキュベーション期間が経過したら、染色液からカバーガラスを持ち上げて培養皿に戻し、カバーガラスを裏返して細胞側が上になるようにします。カバーガラスがPBSTで覆われていることを確認し、カバーガラスを覆い、暗闇の中で10分間プラットフォームシェーカーに置きます。PBSTを取り外し、この手順を2回繰り返して、合計3回の10分間の洗浄を行います。
- 封入剤( 材料の表を参照)を顕微鏡スライドに1滴(カバーガラスごとに)置きます。25 μLの容量は、12 mmのカバーガラスに適しています。
- PBSTで最後に洗浄した後、カバーガラスの端を繊細なタスクワイパーに触れて余分な液体を取り除き、カバーガラスのセル側を追跡します。
- カバースリップセルを下にして、カバースリップをインパウンティングメディアに斜めにゆっくりと下げて、気泡が発生しないようにします。イメージングの前にメディアをセットします。
8. 培養渡り性NCCの形態学的評価
- 染色された細胞を画像化し、.tiffファイルとしてエクスポートします。
注:40倍の対物レンズはイメージング培養に適していますが、10倍(移動性NCCの全フィールドをキャプチャするため)から100倍(単一のNCC)の範囲の対物レンズを使用して、形態学的評価用の画像を収集することができます。本研究の画像は、倒立マルチモーダルイメージングプラットフォームを使用してキャプチャされました( 材料の表を参照)。 - 画像を画像解析ソフトウェア(ImageJ21、 材料表を参照)にアップロードします。[ 画像] > [複製] をクリックして、分析に使用する各画像の 2 番目のコピーを作成し、ほとんどの画像処理を元に戻すことができないため、元の画像は未編集のままにします。
- 画像をクリックして >明るさ/コントラスト>調整 し、スライドバーを使用して画像の明るさまたはコントラストを調整します。
- 以下の手順に従って、画像をグレースケールに変換します。
- 画像がRGBでエクスポートされた場合、マージされたチャネルとしてRGBでアップロードされます。画像を分離するには、[ 画像>カラー]>[チャンネルの分割 ]をクリックして、シングルチャンネルのグレースケール画像を取得します。
- 画像がすでに分離されている場合は、 画像>「8ビット 」と入力して>ファイルをグレースケールに変換します。
- [画像]をクリックして>[しきい値>調整]をクリックして、ピクセルがセル(前景、黒)または背景(白)として識別されるバイナリ画像に変換します。スライドバーを使用するか、[自動]をクリックして、背景からセルを明確に定義するしきい値設定を選択します。
- 細胞が重なり合っているか、または染色が連続していない場合は、流域または穴埋め機能22を使用してさらに処理する必要があるかもしれません。これにより、セルが互いに分離されるか、分析するセル内のギャップが埋められます。[ バイナリ>プロセス]>[バイナリの作成] をクリックして、最初に画像を8ビットバイナリ形式に変換します。次に 、[集水域>>バイナリ処理 ]または [穴を埋め]をクリックします。
注意: このソフトウェアは、信号を分離または入力する必要がある場所に最適であり、必要に応じてプラグインを使用してさらに調整できます。
- 細胞が重なり合っているか、または染色が連続していない場合は、流域または穴埋め機能22を使用してさらに処理する必要があるかもしれません。これにより、セルが互いに分離されるか、分析するセル内のギャップが埋められます。[ バイナリ>プロセス]>[バイナリの作成] をクリックして、最初に画像を8ビットバイナリ形式に変換します。次に 、[集水域>>バイナリ処理 ]または [穴を埋め]をクリックします。
- キャプチャする測定値を選択します。[ 分析>測定値の設定 ]をクリックし、[形状記述子]チェックボックスをオンにして、真円度(円形)、アスペクト比(AR)、真円度(円形)、および固さを分析します。
注:必要な分析のタイプに応じて、面積や周長などの他の測定値も含まれる場合があります。 - [ 解析]>[パーティクルの解析]をクリックし、[パーティクルの解析]メニューからパラメータを設定します。
- [サイズ] で、Size パラメーターが 0-Infinity (たとえば、 図 5 で 500-Infinity) に設定されている場合、バックグラウンド信号またはより小さなセル デブリも含まれるため、対象のセルまたはパーティクルの大きさをピクセル単位で大まかに推定します。
注: [サイズ]を狭い範囲に調整すると、解析に必要な粒子よりも小さい粒子や大きい粒子を除外できます。 - [円形度]で、0〜1.0のままにして、画像内のすべてのセル形状を測定します。
- [表示]で、ドロップダウンメニューから [ベアアウトライン ]を選択して、[パーティクルの分析]機能で選択したセルのアウトラインを調べます。アウトラインをスキャンして、重なり合うセルが区別されるようにしますが、セルが不必要に分割されていないことを確認します。また、「結果の表示」、「要約」、「マネージャーに追加」のメニューボックスにチェックを入れます。
- [サイズ] で、Size パラメーターが 0-Infinity (たとえば、 図 5 で 500-Infinity) に設定されている場合、バックグラウンド信号またはより小さなセル デブリも含まれるため、対象のセルまたはパーティクルの大きさをピクセル単位で大まかに推定します。
- すべてのパラメータを設定したら、[ OK]をクリックします。
注:4つの別々のウィンドウがポップアップし、(1)画像で識別されたセルの裸の輪郭、(2)画像でカウントされたセル、(3)各セルの測定結果、および(4)カウントされたセルの総数とその平均測定値の概要が表示されます。- 破片がカウントされた場合、重複するセルが1つとしてカウントされた場合、単一のセルが倍数としてカウントされた場合、または多くのセルがカウントから除外された場合、元の未編集の画像に戻り、別の複製を作成し、「しきい値」またはその他のパラメーターを調整します。
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Representative Results
本プロトコルの概要を 図1に示す。孵化した卵を開き、表面に胚を置いた卵黄を手袋をはめた手のひらにそっと注ぐことによって単離しました(図2A、B)。アルブミンを取り除いた後(図2C)、胚を囲む卵黄膜にろ紙フレームを適用して、卵黄膜が切断されるとこぼれ始める卵黄から胚を切断して持ち上げやすくしました(図2D、E)。
図2:4〜7個の体節ヒニワトリ胚の分離。受精卵を35時間インキュベートした。卵を鈍い鉗子で開き(A)、卵黄を手袋をはめた手に注ぎました(B)。ろ紙支持体(D、挿入図)が卵黄に付着するように、過剰のアルブミンを除去した(C)。胚を卵黄から切り取り(D)、持ち上げ(E)、リンガーのP / S(F)に入れました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
胚をすすぎ、リンゲルのP / Sをきれいにするために移動した後、単離された胚に神経襞が見られました(図3A)。これらのひだは、遊走性頭蓋神経堤細胞を含む。胚から摘出され(図3B、C)、収集(図3D)、単離された神経襞を播種して遊走性NCC培養物を作成することができます。
図3:ニワトリ背側神経襞の解剖。 リンガーのP / Sで作業し、スプリングハサミを使用して神経ひだを切除しました。(A)図の上部に向かって前方の胚背側図。神経襞は周囲の組織よりも不透明に見えます。中脳神経襞は視神経葉の後方(ピンク色)と心臓三日月面(黄色)の前方にあります。(b)神経襞が除去された後の胚の背側図、切除境界を示す。(C)神経襞を取り除いた胚の側面図。解剖技術は背側神経管を除去し、腹側および非神経管構造を回避する。(D)リンガーのP / Sスケールバー= 300 μmの孤立した神経襞。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
神経襞をFNに播種すると、NCCはインキュベーション後3〜4時間以内に接着性神経襞外植片から出現し始め(図4A)、約20時間後に遊走が完了しました(図4B)。遊走性NCCs20を標識するHNK-1染色は、培養中のほとんどの細胞で明らかでした(図4D)。神経襞がカバーガラスに付着しなかったり、NCCが外植片から移動しなかったりすると、否定的な結果が生じました(データは示されていません)。NCCは、培養物を固定し、糸状アクチンを染色し、ImageJでさまざまな測定を実行してNCCの形態と遊走を評価することによって分析されました(図5)。分析された69個の細胞の平均面積は802.11 ± 69.65 μm 2で、範囲は60.27〜2664.53 μm2で、棒グラフとバイオリンプロットに示すように分布しています(図5C)。円形度(式:円形度= 4π(面積/周囲長²))は、細胞の突出性を反映する尺度であり、0.101〜0.875の範囲で、平均は0.38〜0.15±。低い値は細長い形状を示し、値 1 は完全な円を示します。バイオリンプロットで明らかなように、ほとんどの細胞は細長い形状を示します(図5D)。セル形状の別の尺度は、セルの長軸を短軸で割ったアスペクト比(AR)です。AR 値 1 は、対称形状23 を示します。この分野の渡り鳥NCCの平均ARは2.13±0.11で、値は1.14〜5.59の範囲でした(図5E)。NCC形態のこれらの定量的測定を使用して、実験条件と異なる発表された研究の間で厳密な比較を行うことができます。
図4:移動性NCCは培養された神経襞から出現する。 3時間のインキュベーション(A)および20時間のインキュベーション(B)後の播種神経襞の明視野画像。スケールバー= 200μm。(C,D)神経襞は、20時間のインキュベーション後に大部分が分散しているが、これらの画像の右側に残っている。スケールバー= 500μm。遊走性NCCは、DAPI(C)およびHNK-1染色(D)で見ることができます。HNK-1免疫染色により、培養細胞が遊走性NCCであることが確認されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:培養移動性NCCの形態学的評価。 (A)NCCにおける糸状アクチンのファロイジン染色は、培養20時間後に神経襞から移行した。スケールバー= 50μm。(B)セルが黒く、背景が白く表示されているしきい値画像。黄色のアウトラインがセルとしてカウントされるオブジェクトを囲み、セルに番号が付けられます。(C-E)形態素評価データを表示するためのグラフ作成オプション。パネルBに示す69個のセルの測定値から棒グラフとバイオリンプロットを作成し、測定されたセルの面積(μm2、C)、円形度(D)、およびアスペクト比(E)を描写しました。棒グラフは平均値を示し、各パネルの左側に平均の標準誤差を表す誤差バーが表示されます。バイオリンプロットは app.rawgraphs.io で作成されました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ここで説明する技術は、ニワトリの神経襞を分離し、それらをメッキして移動性頭蓋NCCの培養物を作成する適応可能な方法を提供します。これらの培養物は、ニワトリNCCの移動および形態の容易な分析のための単純化された2D条件を提供し、卵子イメージング法におけるより技術的に困難なものを補完することができる24、25、26。このin vitro法は比較的単純ですが、一貫した結果は高品質の卵と試薬に依存します。さらに、培養物に固有の変動性のために、再現性には実験の繰り返しと定量が必要です。
FNへの神経襞の接着は、培養におけるNCCの移動に不可欠です。時折、外植片が適切に接着せず、神経襞が浮遊するか、移動性NCCをまったくまたはほとんど生成しません。これは、脳神経襞が切断された側を下にして着地しない場合に発生する可能性があります。インキュベーション前に培養容器内の外植片の向きを変え、移動する前に10〜15分間落ち着かせてください。しかしながら、インキュベーターへの移送中の流体混合のために、いくつかの神経襞は必然的に時々最適ではない接着であろう。接着と遊走が実験全体で問題となる場合、これは古いFN(すべての実験に-80°Cの新鮮なアリコートを使用)、期限切れの成分を含む培地(実験サイズのアリコートで調製した培地を-20°Cで保存し、使用時に新鮮な抗生物質を追加する)、または細胞培養に適さないカバーガラスの使用(たとえば、 細胞は組織学のためのカバーガラスに付着しません)。汚染されたインキュベーターは、NCC培養実験全体が失敗する原因にもなります。
培養中に分散したNCCを生成し、移動性NCC形態の分析を可能にすることに加えて、このプロトコルは他の多くの実験の出発点でもあります。カバーガラス上に播種された外植体は、目的のタンパク質の細胞内局在を決定するために免疫蛍光のために処理することもできる(セクション7、ステップ3の後)7。固定培養では形態や遊走距離の解析が可能ですが、ここで説明するように、培養インキュベーション中のNCCのタイムラプスイメージング(セクション6、ステップ5)により、遊走の方向性と持続性、および細胞運動のダイナミクス(膜突起、接着などの測定)に関する追加のデータ収集が可能になります。14,24,27。胚の一過性遺伝子操作は、ハンバーガーおよびハミルトンステージ4+17での試薬(モルホリノス29、DNA発現構築物、またはCRISPRベクター30)のエレクトロポレーション18,28によって達成することができる。次に、これらのエレクトロポレーションされた胚をプロトコルで使用して、目的の遺伝子の機能喪失または過剰発現を伴う移動性NCC培養物を作成できます。機能分析は、NCC培養7、27の培地に化学阻害剤を添加することによっても達成することができる(セクション6、ステップ2)。オミクスレベル分析によるNCCの集団レベルのプロファイリングには、原料としてのNCCの収集が必要です7,11,31。マーカーは、蛍光活性化セルソーティング31によってNCCを単離するために使用されてきましたが、これには特殊なフローサイトメトリー装置と細胞の酵素解離が必要です。背側神経襞を注意深く切除するためにここで説明した方法に従う(腹側神経管および非神経外胚葉細胞の収集を最小限に抑える)ことは、遊走性NCCを収集するための安価な方法を提供する11(セクション5、ステップ4)。培養液に分散した後にNCCを収集すると(セクション6、ステップ5)、さらなる分析のために、自然に分離された遊走性NCCの比較的純粋な集団が得られます(図4Dの培養細胞の大部分における遊走性NCCのマーカーであるHNK-1染色;7と同様)。最後に、これらのバリエーションを組み合わせて使用できます。例えば、免疫蛍光またはタイムラプス画像化を使用して、遺伝子発現操作または阻害剤27の添加の効果を評価することができる。全体として、この適応可能で安価なプロトコルは、さまざまな実験目標を達成するための複数の潜在的な修飾を伴う培養における野生型頭蓋移動性NCCの形態を評価する手段を提供します。
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Disclosures
著者には利益相反はありません。
Acknowledgments
コリーヌ・A・フェアチャイルドとケイティ・L・バーミリオンが、ニワトリ脳神経襞培養プロトコルの開発に参加してくださったことに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AxioObserver equipped with an LSM710 confocal scan head controlled by ZEN 3.0 SR software | Zeiss | Used alpha Plan-Apochromat 100x/1.46 Oil DIC M27 objective | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Chamber dishes (glass bottom, single or divided) | MatTek; Cell Vis | P35G-1.5-14-C (MatTek) X000NOJQGX (Cellvis) X000NOK1OJ (Cellvis) |
Single chamber 35 mm or 4 chamber 35 mm |
| Cover glass | Carolina Biological Supply Company | 633029, 633031, 633033, 633035, 633037 | circles, 0.13–0.17 mm thickness, available in 12-25 mm diameter |
| DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 11320033 | Alternative for L15 media |
| Egg incubator | Sportsman | 1502 | |
| FBS | Life Technologies | 10437-028 | |
| Fibronectin | Fisher Scientific | CB-40008A | |
| Filter paper | Whatman | grade 3MM chromatography | |
| Forceps (blunt) | Fisher Scientific; Thomas Scientific | 08-890 (Fisher);1141W97 (Thomas) | |
| Forceps (fine) | Fine Science Tools | 11252-20 | Dumont #5 |
| Image J | https://fiji.sc/ | Free image analysis software | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| L15 media | Invitrogen | 11415064 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030 | |
| Mounting Media (Vectashield or ProLong Gold) | Vector Laboratories; Thermofisher Scientific | H-1700 (Vectashield); P36930 (ProLong Gold) | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140-148 | 10,000 Units/mL Penicillin; 10,000 mg/mL Streptomycin |
| Petri Dishes | VWR (or similar) | 60 mm, 100 mm | |
| Phalloidin | Sigma-Aldrich | P1951 | multiple flurophores available |
| Pin holder | Fine Science Tools | 26016-12 | For tungsten needle (alternative for spring scissors) |
| Scissors (dissection) | Fine Science Tools | 14061-10 | |
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | 2.5 mm cutting edge (alternative for tungsten needle) |
| Sylgard | Krayden | Sylgard 184 | |
| Syringe Filters | Sigma-Aldrich | SLGVM33RS | Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized |
| Tissue culture dishes | Sarstedt | 83-3900 | 35 mm culture dishes for bulk neural fold cultures |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Tungsten wire | Variety of sources | 0.01" diameter for tungsten needle (alternative for spring scissors) |
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