Evaluering av fotosyntetisk effektivitet i fotorespiratoriske mutanter ved klorofyllfluorescensanalyse

Summary

Vi beskriver en tilnærming for å måle endringer i fotosyntetisk effektivitet i anlegg etter behandling med lav CO₂ ved bruk av klorofyllfluorescens.

Abstract

Fotosyntese og fotorespirasjon representerer de største karbonfluksene i plantens primære metabolisme og er nødvendige for planteoverlevelse. Mange av enzymer og gener som er viktige for fotosyntese og fotorespirasjon har blitt godt studert i flere tiår, men noen aspekter av disse biokjemiske veiene og deres crosstalk med flere subcellulære prosesser er ennå ikke fullt ut forstått. Mye av arbeidet som har identifisert gener og proteiner som er viktige i plantemetabolisme, har blitt utført under svært kontrollerte miljøer som kanskje ikke best representerer hvordan fotosyntese og fotorespirasjon fungerer under naturlige og oppdrettsmiljøer. Tatt i betraktning at abiotisk stress resulterer i nedsatt fotosyntetisk effektivitet, er det nødvendig med utvikling av en høy gjennomstrømningsskjerm som kan overvåke både abiotisk stress og dens innvirkning på fotosyntese.

Derfor har vi utviklet en relativt rask metode for å screene for abiotiske stressinduserte endringer i fotosyntetisk effektivitet som kan identifisere ukarakteriserte gener med roller i fotorespirasjon ved hjelp av klorofyllfluorescensanalyse og lav CO₂ screening. Dette papiret beskriver en metode for å studere endringer i fotosyntetisk effektivitet i overførte DNA (T-DNA) knockout mutanter i Arabidopsis thaliana. Den samme metoden kan brukes til screening av etylmetansulfonat (EMS)-induserte mutanter eller suppressorscreening. Ved hjelp av denne metoden kan identifisere genkandidater for videre studier i plantens primære metabolisme og abiotiske stressresponser. Data fra denne metoden kan gi innsikt i genfunksjon som kanskje ikke gjenkjennes før eksponering for økte stressmiljøer.

Introduction

Abiotiske stressforhold som ofte ses i bondens felt, kan påvirke avlingene negativt ved å redusere fotosyntetisk effektivitet. Skadelige miljøforhold som varmebølger, klimaendringer, tørke og saltholdighet i jord kan forårsake abiotiske påkjenninger som endrer CO_{2-tilgjengeligheten} og reduserer plantens respons på høyt lysstress. De to største terrestriske karbonfluksene er fotosyntese og fotorespirasjon, som er avgjørende for plantevekst og avlinger. Mange av de viktige proteinene og enzymene som er involvert i disse prosessene har blitt karakterisert under laboratorieforhold og identifisert på genetisk nivå¹. Selv om det er gjort store fremskritt i forståelsen av fotosyntese og fotorespirasjon, forblir mange trinn, inkludert transport mellom planteorganeller, ukarakteriserte ^2,3.

Fotorespirasjon, den nest største karbonfluksen i planter etter fotosyntese, begynner når enzymet Rubisco fikserer oksygen i stedet for karbondioksid til ribulose 1,5 bisfosfat (RuBP), og genererer den hemmende forbindelsen 2-fosfoglykolat (2PG)¹. For å minimere de hemmende effektene av 2PG og for å resirkulere det tidligere faste karbonet, har C3-planter utviklet den multiorganellære prosessen med fotorespirasjon. Fotorespirasjon konverterer to molekyler av 2PG til ett molekyl av 3-fosfoglyserat (3PGA), som kan komme inn i C3-karbonfikseringssyklusen¹. Dermed konverterer fotorespirasjon bare 75% av det tidligere faste karbonet fra genereringen av 2PG og forbruker ATP i prosessen. Som et resultat er prosessen med fotorespirasjon et betydelig 10% -50% drag på fotosyntetisk prosess, avhengig av vanntilgjengelighet og vekstsesongtemperaturer⁴.

Enzymene som er involvert i fotorespirasjon har vært et forskningsområde i flere tiår, men bare et lite antall transportproteiner har blitt karakterisert på genetisk nivå, selv om minst 25 transporttrinn er involvert i prosessen ^5,6,7. De to transportproteinene som er direkte involvert i bevegelsen av karbon generert i fotorespirasjonsprosessen er plastidisk glykolat / glyserattransportør PLGG1 og gallesyrenatriumsymporter BASS6, som begge er involvert i eksport av glykolat fra kloroplast ^5,6.

Under ambient [CO₂] fikserer Rubisco et oksygenmolekyl til RuBP omtrent 20% av tiden¹. Når planter blir utsatt for lav [CO 2], øker fotorespirasjonshastigheten, noe som gjør lav [CO₂] til et ideelt miljø for å teste for mutanter som kan være viktige under forhøyet fotorespirasjonsstress. Testing av ytterligere antatt kloroplasttransportprotein T-DNA-linjer under lav CO₂ i 24 timer og måling av endringer i klorofyllfluorescens førte til identifisering av bass6-1 plantelinjer som viste en fotorespirasjonsmutant fenotype⁵. Videre karakterisering viste at BASS6 er en glykolattransportør i kloroplastens indre membran.

Dette papiret beskriver i detalj en protokoll som ligner på det som opprinnelig ble brukt til å identifisere BASS6 som en fotorespirasjonstransportør, som kom fra en liste over antatte transportproteiner lokalisert i kloroplastmembranen⁸ Denne protokollen kan brukes i et høykapasitetseksperiment som karakteriserer Arabidopsis T-DNA-mutanter eller EMS-genererte mutantplanter som en måte å identifisere gener som er viktige for å opprettholde fotosyntetisk effektivitet under en rekke abiotiske spenninger som varme, høyt lysstress, tørke og CO_{2-tilgjengelighet} . Screening av plantemutanter ved hjelp av klorofyllfluorescens har tidligere blitt brukt til raskt å identifisere gener som er viktige for primær metabolisme⁹. Med så mye som 30% av Arabidopsis-genomet som inneholder gener som koder for proteiner med ukjent eller dårlig karakterisert funksjon, kan stressindusert analyse av fotosyntetisk effektivitet gi innsikt i molekylære funksjoner som ikke observeres under kontrollerte forhold i mutante planter¹⁰. Målet med denne metoden er å identifisere mutanter av fotorespiratorisk vei ved hjelp av en lav CO_{2 screening} . Vi presenterer en metode for å identifisere mutanter som forstyrrer fotorespirasjon etter eksponering for lav CO₂. En fordel med denne metoden er at det er en høy gjennomstrømningsscreening for frøplanter som kan gjøres på relativt kort tid. Videoprotokollseksjonene gir detaljer om frøforberedelse og sterilisering, plantevekst og lav CO_2-behandling , konfigurasjonen av fluorescensavbildningssystemet, måling av kvanteutbytte av de behandlede prøvene, representative resultater og konklusjoner.

Protocol

1. Frøforberedelse og sterilisering

MERK: Frøforberedelse består av frø imbibing og frø sterilisering. Det er viktig å merke seg at alle disse trinnene skal utføres i en laminær strømningshette for å opprettholde sterile forhold. Alle nødvendige materialer, reagenser og vekstmedier må autoklaveres (se materialtabellen).

1. Seed imbibation og stratifisering
   MERK: Frølinjene som brukes er plgg1-1 (salk_053463), abcb26 (salk_085232) og villtype (WT, Col-0).
   1. Dispenser frøene i 1,5 ml mikrosentrifugerør. Imbibe frøene i sterilt vann i en laminær strømningshette og stratifiser ved 4 ° C i mørket i 2 dager.
2. Frø sterilisering
   1. Under sterile forhold, lag 10 ml 50% (v / v) blekemiddeloppløsning og tilsett ca. 20 μL Tween 20. For frøsterilisering, fjern vann fra de imbibed frøene, tilsett 1 ml blekemiddelløsning i mikrosentrifugerørene, og inkuber ved romtemperatur i 5 minutter.
   2. Fjern blekemiddeloppløsningen med en pipette.
   3. Skyll frøene i 1 ml sterilt vann for å resuspendere. Fjern vannet når frøene har lagt seg til bunnen. Gjenta trinn 1.6 og trinn 1.7 syv ganger.
   4. Resuspend frøene i steril 0,1% agaroseløsning.
3. Frøbelegg
   1. Lag et 1 L volum Murashige &Skoog Basal Medium med vitaminer og 1,0 g / L 2- (N-morphonio) etanesulfonsyre (MS) ved å tilsette 5,43 g av pulveret til 500 ml destillert vann. Juster pH mellom 5,6 og 5,8 ved hjelp av kaliumhydroksid (KOH). Fyll til 1 l med destillert vann.
      1. Del væskeoppløsningen i 500 ml og legg hver halvdel i en 1 liters kolbe som inneholder en magnetisk rørestang. Tilsett 5 g agarpulver for å oppnå en 1% agar w/v løsning for hver kolbe.
      2. Autoklav ved 121 °C og 15 psi i 30 min; Plasser deretter ved romtemperatur mens du rører sakte. Når den er avkjølt, hell 25 ml MS-agar i en firkantet petriskål. La det stivne.
         MERK: Disse Murashige &Skoog Basal Medium-platene inneholder 1% MS medium med vitaminer og 1% agar for dyrking av testmutantene.
   2. Skjær en pipettespiss på 200 μL med et barberblad. Plasser ett frø i midten av det angitte firkantede rutenettet for hver testmutant eller genotype (1 cm² kvadrat) av en firkantet MS-plate (figur 1) ved hjelp av en 200 μL mikropipette.
      MERK: Det firkantede rutenettet på 1 cm x 1 cm bidrar til å holde en jevn avstand mellom plantene og unngå overlapping, noe som vil være viktig i senere fluorescensavbildning og analyse.
   3. Når frøene er belagt, pakk med kirurgisk tape rundt lokket for å forsegle, og legg det i vekstkammeret under forhold som beskrevet nedenfor.

2. Plantevekst og lav CO_{2 -} behandling

1. Dyrk plantene i 7-9 dager ved 20 °C under en 8 timers lyssyklus på 120 μmol·m−²s⁻¹ og 16 timer mørke ved 18 °C. Sjekk plantene på den 6. dagen for å avgjøre om de er store nok til avbildning. På den 8. dagen etter plating, utsett plantene for lav CO₂.
2. Lav CO₂ behandling
   1. Etter 7-9 dager plasserer du fire av de åtte platene fra omgivelsesvekstkammerforholdene i fotorespiratoriske forhold på 20 °C, kontinuerlige lysnivåer på 200 μmol·m−2 s⁻¹ og lav CO₂ i ¹²timer.
   2. Konstruer den lave CO₂ -tilstanden ved hjelp av en lufttett gjennomsiktig beholder med 100 g sodakalk plassert i bunnen av beholderen. Plasser beholderen i samme vekstkammer som kontrollen. Hold kontrollanleggene under 120 μmol·m−2 s⁻¹ i omgivende CO₂ i ¹²timer.

3. Konfigurere fluorescensbildesystemet

1. Plasser en testplate (klargjort i henhold til avsnitt 1 og avsnitt 2) sentrert under kameraet på en fast avstand i fluorescensbildesystemet.
2. I instrumentets programvare navigerer du til Live Window og merker av i boksen Blinker for å slå på ikke-aktiniske måleblinker.
3. Klikk på zoom - og fokusverktøyene til et komplett og skarpt bilde er synlig. For dette formål, bruk en scene eller en hylle for å justere avstanden mellom plantene og kameraet. Hold zoom, fokus og avstand fra kameraet konstant under hele eksperimentet.
4. Sett verdien av El. Shutter til 0 og juster følsomheten for å få et fluorescerende signal i området 200-500 digitale enheter.
   MERK: En lavere El. Shutter-verdi (0-1) vil sikre at måleblitsene ikke er aktiniske, mens en høyere verdi (2) vil forbedre oppløsningen på bildet.
5. Plasser en lysmåler i samme posisjon som brukes til å justere kamerainnstillingene.
6. I Live Window merker du av i boksen Super for å starte en mettende puls som varer i 800 ms. Husk å merke av i boksen hver gang for en ny puls.
7. Bruk glidebryteren til å justere prosentandelen av relativ effekt for superpulsen til lysmåleren leser 6,000-8,000 μmol·m−²s⁻¹.

4. Design kvanteutbytteprogrammet

1. Importer standard driftsverktøy for bildebehandlingssystemet.
   Inkluder default.inc
   Inkluder light.inc
   MERK: Programsyntaksen som brukes som referanse i dette eksperimentet, er for et FluorCam-bildesystem.
2. Definer følgende globale variabler i henhold til de konfigurerte lysinnstillingene:
   Lukker = 0
   Følsomhet = 40
   Super = 65
3. Inkluder tidstrinnet for logging av data:
   TS = 20ms
4. Samle Fo-målingen ved å ta prøver av fluorescens i mørk tilpasset tilstand.
   F0varighet = 2s;
   F0period = 200ms;
   MERK: F0duration definerer tidsintervallet som den mørktilpassede fluorescensen registreres over. F0period definerer tidsintervallet som den mørktilpassede fluorescensmålingen gjentas over.
5. Registrer Fo-målene i datatabeller.
   <0,F0periode.. F0duration>=>mfmsub
   <0>->sjekkpunkt,"startFo"
   =>sjekkpunkt,"endFo";
   Hvor < , representerer > settet av fluorescensverdier indeksert etter tid; => lagrer målinger i en systemfil; mfmsub representerer hele datasettet for eksperimentet; og sjekkpunkt oppretter et delsett for data for spesifikke målinger som startFo.
6. Samle og lagre FM-målingen ved å ta prøver av fluorescens etter en mettende puls.
   PulseDuration = 960ms; ##
   a1=F0varighet + 40 ms
   a2 = a1 + 480 ms;
   =>SatPulse(PulseDuration);
   =>mfmsub
   =>mfmsub;
   =>sjekkpunkt,"startFm"
   =>checkpoint,"endFm"
   =>checkpoint,"timeVisual";
   Hvor a1 og a2 er variabler for å koordinere prøvetakingstiden med metningspulsen; a1 representerer starttidspunktet for Sm-målingen; og A2 representerer pulsens midtpunktstid.

5. Måling av kvanteutbyttet av de behandlede prøvene

1. Rett etter behandling, dekk platene med aluminiumsfolie i 15 minutter for mørk tilpasning. Fjern folien for å måle kvanteutbyttet til fotosystem II med et pulsamplitudemodifisert fluorometer. Plasser deretter frøplanteplaten direkte under kameraet og kjør kvanteutbytteprotokollen som finnes i GitHub-depotet.
2. Last ned quantum_yield protokollen fra GitHub (https://github.com/South-lab/fluorescent-screen) eller bruk et lignende designet program fra seksjon 4. Bruk fluorometerets programvare for å åpne programfilen ved å klikke på mappeikonet og navigere til filplasseringen.
3. Kjør quantum yield-programmet ved å klikke på det røde lynikonet.
4. Etter at protokollen er fullført, naviger til forhåndsanalysevinduet . Partisjoner platen i individuelle frøplanter ved å bruke markeringsverktøyene til å utheve alle pikslene for hver frøplante på platebildet. Klikk på Bakgrunnsekskludering for å fjerne eventuelle uthevede bakgrunnspiksler, slik at bare frøplanteområdet blir igjen.
5. Klikk på Analyser for å generere fluorescensdata for hver frøplante på platebildet. Juster fluorescensverdiområdet manuelt for å vise konsekvente minimums- og maksimumsverdier blant alle plater.
6. Klikk på Numerisk-gjennomsnitt fra fanen Eksperiment | Eksporter | Numerisk. Velg Alle data og kolonne og klikk OK for å generere en tekstfil som inneholder QY-målinger for hver frøplante.

6. Åpne datafilen

1. Åpne tekstfilen i et regneark for analyse. Av overskriftene som viser områdenummer, størrelse på piksler, Fm, Ft, Fq og QY, identifiserer du områdenummeret for kjernegenotypen (WT eller testmutant) og QYmax. Utfør en parvis t-test med hensyn til villtype for å bestemme betydning. Data tolkes som signifikant forskjellige når p-verdier er under 0,05.

Representative Results

Resultatene viser platebilder av rå- og fluorescensbilder fra omgivelses- og lav CO_2-screening av WT og testmutanter. Hver plantlet er merket med områdenummer, med tilsvarende fluorescensavlesninger gitt som QY. Dataene eksporteres som en tekstfil og kan åpnes i et regneark for analyse (se tilleggstabell S1). Mutantlinjene plgg1-1 og abcb26 ble valgt for å demonstrere positiv og negativ identifisering av gener assosiert med fotorespiratorisk stress. PLGG1 koder for den første transportøren i banen etter oksygenering av RuBP⁶, mens ABCB26 antas å kode for en antigentransportør som ikke er kjent for å være involvert i fotorespirasjon¹¹. Den mørktilpassede Fv/Fm QY-effektiviteten til WT og mutanter visualiseres av boks- og whisker-plott. For å teste den statistiske forskjellen mellom WT- og testmutantene ble det brukt parvis t-test med p-verdi < 0,05. Her brukte vi fotorespiratoriske mutantlinjer med redusert QY Fv/Fm som testmutanter for å sjekke effektiviteten av screeningmetoden. Resultatene viser at testmutantene har en signifikant lavere QY-effektivitet enn WT. Figur 3B viser en signifikant reduksjon i forholdet mellom variabel og maksimal fluorescens (Fv/Fm) for plgg1-1 , men ikke abcb26 ved lav CO₂. Dette resultatet er i samsvar med PLGG1s rolle som transportør involvert i fotorespirasjon, mens abcb26 ikke viser en fenotype som er forskjellig fra WT-kontrollen under lave CO_2-forhold . Dermed kan denne screeningmetoden identifisere fotorespiratoriske mutanter ved bruk av lav CO_{2 screening} .

Figur 1: Eksempel på skjematisk for frøplateoppsettet. To tekniske replikasjoner vises med seks frø plassert på rad. WT-kontrollfrø plassert over mutante frø. Forkortelse: WT = wild type. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2: Mørktilpasset F_v/F_m bilder av 9 dager gamle frøplanter. Wild-type-kontrollen sammenlignes med T-DNA-mutantlinjer ved omgivelses- og lav CO₂. Fargeskalaen representerer gjennomsnittlig F_v / F_m for hver frøplante. Skala bar = 1 cm. Forkortelser: Fv / Fm = forholdet mellom variabel og maksimal fluorescens; WT = vill type; plgg1-1 = plastidal glykolat / glyserattranslokator 1; abcb26 = ATP-bindende kassett B26. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3: Fluorescensobservasjoner. Maksimal kvanteutbytte (Fv / Fm) målinger gjort på frøplanter ved (A) omgivende og (B) lave CO₂ forhold. Boksene representerer området mellom de indre kvartilene, linjene i boksene representerer medianene, og værhårene representerer de maksimale og minimale observasjonene. * Indikerer signifikant forskjell basert på en parvis t-test i forhold til WT (n > 44, p < 0,05; Supplerende tabell S2). Forkortelser: Fv / Fm = forholdet mellom variabel og maksimal fluorescens; WT = vill type; plgg1-1 = plastidal glykolat / glyserattranslokator 1; abcb26 = ATP-bindende kassett B26. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Tilleggstabell S1: Samlet fluorescerende data fra alle frøplanteplater som ble brukt i forsøket. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende tabell S2: Det rapporteres statistikk fra en t-test mellom villtype og begge mutantgenotyper. Mutanter anses som vesentlig forskjellig fra villtype når p-verdien er lavere enn 0,05. Tabell A representerer t-tester utført på planter dyrket i omgivende CO 2, mens tabell B representerer t-tester utført på planter dyrket i lav CO₂. T-test: to utvalg med antatt lik varians. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

De eksperimentelle metodene som er skissert i denne artikkelen, har noen fordeler og begrensninger. En fordel er at denne metoden kan skjerme mange planteplanter, selv om det må tas noen forholdsregler for å forhindre forurensning av plantemedieplaten under pletterings- og vekstprosessen. Derfor er det viktig å forsegle Arabidopsis-platene med kirurgisk tape. En annen fordel med dette eksperimentet er at det har en kortere 12 timers fotorespiratorisk stressperiode sammenlignet med det tidligere publiserte arbeidet⁸. Reduksjonen i behandlingstid var for bedre å skille forskjeller i Fv/Fm mellom WT og utvalgte mutanter. Det kan være nødvendig å variere behandlingstiden avhengig av alvorlighetsgraden av fenotypen hos mutante stammer og nivået av CO₂ i det eksperimentelle oppsettet. En begrensning er imidlertid at denne metoden krever et bladareal som er stort nok til at fluorometeret kan måle og for at Fv/Fem-verdier skal beregnes. Justering av den første veksttiden for testede frøplanter vil sikre at fluorometerbildet har tilstrekkelig bladareal å måle for hver frøplante uten at bladene overlapper under avbildning. Frøplantene må avbildes ved de første sanne bladene for å holde bladstørrelsen og bladvinklene ensartede. Oppløsningen på bildet kan forbedres ved å øke lukkerhastigheten og følsomheten til kameraet. Nærliggende piksler vil bli bedre skilt; Å øke følsomheten for mye vil imidlertid overeksponere kameraet og føre til falske fluorescensmaksimum. Optimalisering og feilsøking kan være nødvendig for å balansere oppløsnings- og fluorescensverdiene.

Evnen til å skjerme for fotosyntetiske mutanter i en standardisert prosedyre er viktig. Det kan tillate en konsistent, høy gjennomstrømningsmetode for å identifisere fotorespirasjonsmutanter med gener av interesse for fotosyntese og fotorespirasjonsmetabolisme. Samlet sett tar screening for Fv / Fm i denne analysen omtrent 30 s per plate av planteplanter, noe som muliggjør screening av over 1000 frøplanter per dag. Klorofyllfluorescensanalyse gjør det mulig å identifisere fotorespiratoriske mutanter ved bruk av lav CO_2-screening , noe som er viktig for å opprettholde fotorespiratorisk effektivitet. Gitt det store antallet ukjente transportører som er teoretisert for å være i fotorespirasjonsveien³, kan denne metoden brukes til raskt å evaluere effekten genotypen har på fotosyntetisk effektivitet. I tillegg kan fluorometre måle andre aspekter av fotosyntetisk effektivitet som ikke-fotokjemisk slukking og fotosystem II driftseffektivitet. Disse tilleggsprotokollene tar lengre tid per frøplanteplate, men kan brukes til videre og mer sensitiv analyse i motsetning til denne raske høyhastighetsskjermen av mutanter. Denne metoden er ikke begrenset til Arabidopsis og kan også justeres for å skjerme for T-DNA-mutanter i en rekke andre abiotiske stressforhold som høye og lave temperaturer, høyt lysspenning og tørkeforhold for å identifisere gener som er viktige for fotosyntese og fotorespirasjon. Eventuelle ytterligere modifikasjoner må optimaliseres på individuell basis.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tube	VWR	10810-070	container for seed sterilization
agarose	VWR	9012-36-6	chemical used to suspend seeds for ease of plating
Arabidopsis thaliana seeds (abcb26)	ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_085232	arabidopsis seeds used as experimental group
Arabidopsis thaliana seeds (plgg1-1)	ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_053469C	parental arabidopsis seeds
Arabidopsis thaliana seeds (WT)	ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org	Col-0	arabidopsis wild type seeds used as a control group
bleach	clorox	generic bleach	chemical used to sterilize seeds
Carbolime absorbent	Medline products	S232-104-001	CO2 absorbent
Closed FluorCam	Photon Systems Instruments	FC 800-C	Fluorescence imager
FluoroCam FC 800-C	Photon Systems Instruments	Closed FluorCam FC 800-C/1010-S	Fluorescence imager
FluoroCam7	Photon Systems Instruments	Closed FluorCam FC 800-C/1010-S	Fluorescence image analysis software
Gelzan (plant agar)	Phytotech labs	71010-52-1	chemical used to solidify MS media as plates
glass flask 1 L	Fisherbrand	FB5011000	container for making and autoclaving MS media
growth chamber	caron	7317-50-2	growth chamber used to grow plants
Murashige & Skoog Basal Medium with Vitamins & 1.0 g/L MES (MS)	Phytotech labs	M5531	growth media for arabidopsis seedlings
potassium Hydroxide (KOH)	Phytotech labs	1310-58-3	make as 1 M solution for ph adjustment
spider lights	Mean Well Enterprises	XLG-100-H-AB	lights used in the light assay
Square Petri Dish with Grid, sterile	Simport Scientific	D21016	used to hold MS media for arabidopsis seedlings
surgical tape	3M	1530-1	tape used to seal plates
tween 20	biorad	9005-64-5	surfactant used to assist seed sterilization