Summary
Dit protocol beschrijft methoden voor het doorsnijden, kleuren en afbeelden van vrij zwevende weefselsecties van de muizenhersenen, gevolgd door een gedetailleerde beschrijving van de analyse van het astrocytengebiedvolume en astrocytengebied overlap of tegels.
Abstract
Astrocyten bezitten een verbazingwekkende mate van morfologische complexiteit die hen in staat stelt om te interageren met bijna elk type cel en structuur in de hersenen. Door deze interacties reguleren astrocyten actief veel kritieke hersenfuncties, waaronder synapsvorming, neurotransmissie en ionhomeostase. In de hersenen van knaagdieren groeien astrocyten in grootte en complexiteit tijdens de eerste drie postnatale weken en vestigen ze verschillende, niet-overlappende gebieden om de hersenen te betegelen. Dit protocol biedt een gevestigde methode voor het analyseren van astrocytengebiedvolume en astrocytentetettegels met behulp van vrij zwevende weefselsecties uit het muizenbrein. Ten eerste beschrijft dit protocol de stappen voor weefselverzameling, cryosectie en immunostaining van vrij zwevende weefselsecties. Ten tweede beschrijft dit protocol beeldacquisitie en analyse van astrocytengebiedvolume en territoriumoverlappingsvolume, met behulp van commercieel beschikbare beeldanalysesoftware. Ten slotte bespreekt dit manuscript de voordelen, belangrijke overwegingen, veelvoorkomende valkuilen en beperkingen van deze methoden. Dit protocol vereist hersenweefsel met schaarse of mozaïek fluorescerende labeling van astrocyten en is ontworpen om te worden gebruikt met gemeenschappelijke laboratoriumapparatuur, confocale microscopie en in de handel verkrijgbare beeldanalysesoftware.
Introduction
Astrocyten zijn uitgebreid vertakte cellen die veel belangrijke functies in de hersenen vervullen1. In de cortex van de muis geven radiale gliastamcellen aanleiding tot astrocyten tijdens de late embryonale en vroege postnatale stadia2. Tijdens de eerste drie postnatale weken groeien astrocyten in omvang en complexiteit en ontwikkelen ze duizenden fijne takken die rechtstreeks interageren met synapsen1. Tegelijkertijd interageren astrocyten met naburige astrocyten om discrete, niet-overlappende gebieden vast te stellen om de hersenen te betegelen3, terwijl de communicatie via gap junction kanalen4 behouden blijft. Astrocytenmorfologie en organisatie zijn verstoord in veel ziektetoestanden na belediging of verwonding5, wat het belang van deze processen voor een goede hersenfunctie aangeeft. Analyse van de morfologische eigenschappen van astrocyten tijdens normale ontwikkeling, veroudering en ziekte kan waardevolle inzichten bieden in de biologie en fysiologie van astrocyten. Bovendien is de analyse van de morfologie van astrocyten na genetische manipulatie een waardevol hulpmiddel voor het onderscheiden van de cellulaire en moleculaire mechanismen die de oprichting en het onderhoud van de morfologische complexiteit van astrocyten regelen.
Analyse van astrocytenmorfologie in het muizenbrein wordt bemoeilijkt door zowel astrocytenvertakkingscomplexiteit als astrocytentetegels. Antilichaamkleuring met behulp van het intermediaire filament gliale fibrillaire zure eiwit (GFAP) als een astrocytenspecifieke marker vangt alleen de belangrijkste takken en onderschat de morfologische complexiteit van astrocyten enorm1. Andere celspecifieke markers zoals glutamaattransporter 1 (GLT-1; slc1a2), glutaminesynthetase of S100β doen beter werk bij het labelen van astrocytentakken6, maar introduceren een nieuw probleem. Astrocytengebieden zijn grotendeels niet-overlappend, maar er bestaat een kleine mate van overlap aan de perifere randen. Vanwege de complexiteit van vertakkingen, wanneer naburige astrocyten dezelfde kleur krijgen, is het onmogelijk om te onderscheiden waar de ene astrocyt eindigt en de andere begint. Schaarse of mozaïeketikettering van astrocyten met endogene fluorescerende eiwitten lost beide problemen op: de fluorescerende marker vult de cel om alle takken te vangen en maakt beeldvorming van individuele astrocyten mogelijk die kunnen worden onderscheiden van hun buren. Verschillende strategieën zijn gebruikt om schaarse fluorescerende etikettering van astrocyten te bereiken, met of zonder genetische manipulatie, waaronder virale injectie, plasmidelektroporatie of transgene muislijnen. Details over de uitvoering van deze strategieën worden beschreven in eerder gepubliceerde studies en protocollen 1,7,8,9,10,11,12,13.
Dit artikel beschrijft een methode voor het meten van het astrocytengebiedvolume van muizenhersenen met fluorescerende labeling in een schaarse populatie astrocyten (figuur 1). Omdat de gemiddelde diameter van een astrocyt in de cortex van de muis ongeveer 60 μm is, worden 100 μm dikke secties gebruikt om de efficiëntie bij het vastleggen van individuele astrocyten in hun geheel te verbeteren. Immunostaining is niet vereist, maar wordt aanbevolen om het endogene fluorescerende signaal voor confocale beeldvorming en analyse te verbeteren. Immunostaining kan ook een betere detectie van fijne astrocytentakken mogelijk maken en fotobleaching van endogene eiwitten tijdens beeldacquisitie verminderen. Om de penetratie van antilichamen in de dikke secties te verbeteren en om het weefselvolume te beschermen tegen secties door beeldvorming, worden vrij zwevende weefselsecties gebruikt. Analyse van het astrocytengebiedvolume wordt uitgevoerd met behulp van in de handel verkrijgbare beeldanalysesoftware. Bovendien beschrijft dit protocol een methode voor analyse van astrocytentegels in weefselsecties met mozaïeketikettering, waarbij naburige astrocyten verschillende fluorescerende labels uitdrukken. Dit protocol is met succes gebruikt in verschillende recente studies 1,8,9 om astrocytengroei tijdens normale hersenontwikkeling te karakteriseren, evenals de impact van genetische manipulatie op de ontwikkeling van astrocyten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle muizen werden gebruikt in overeenstemming met de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) aan de Universiteit van North Carolina in Chapel Hill en de afdeling Vergelijkende Geneeskunde (IACUC-protocolnummer 21-116.0). Muizen van beide geslachten op postnatale dag 21 (P21) werden gebruikt voor deze experimenten. CD1-muizen werden commercieel verkregen (Tabel van materialen) en MADM9 WT: WT- en MADM9 WT: KO-muizen werden eerder beschreven9.
OPMERKING: Dit protocol vereist hersenen met fluorescerende eiwitexpressie in een schaarse populatie van astrocyten. Fluorescerende eiwitexpressie kan genetisch, viraal of door elektroporatie worden geïntroduceerd. Details van methoden om astrocyten spaarzaam te labelen worden beschreven in eerder gepubliceerde studies en protocollen 1,7,8,9,10,11,12,13.
1. Weefselverzameling en -voorbereiding
LET OP: Paraformaldehyde (PFA) is een gevaarlijke chemische stof. Voer alle stappen uit met PFA in een chemische zuurkast.
- Verdoof muizen met een injecteerbaar verdovingsmiddel (bijv. Avertin; 0,8 mg/kg) en zorg voor diepte van de anesthesie met een teenknufje. Gebruik een peristaltische pomp om intracardiale perfusie uit te voeren met ijskoude Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) + Heparine met een snelheid van ~ 3 ml / min totdat de lever helder is (meestal 3-5 min), gevolgd door ijskoude 4% PFA bij TBS met een snelheid van ~ 3 ml / min gedurende 5 minuten.
OPMERKING: De stroomsnelheid en -tijden zijn geoptimaliseerd voor postnatale dag 21 (P21) muizen. Aanpassingen aan de stroomsnelheid en perfusietijd kunnen nodig zijn voor muizen van verschillende leeftijden. - Gebruik na de perfusie een operatieschaar om het hoofd los te maken en de huid te verwijderen om de schedel bloot te leggen. Gebruik vervolgens een micro-ontleedschaar om de bovenkant van de schedel te verwijderen om de hersenen bloot te leggen. Gebruik een tang of een kleine spatel om de hersenen te verwijderen en breng deze over naar een buis met ijskoude 4% PFA en incubeer 's nachts bij 4 °C.
OPMERKING: Zorg ervoor dat u een buis met een platte bodem gebruikt, zoals een scintillatieflacon van 7 ml, zodat de hersenen niet ingeklemd raken in de bodem van de buis, wat het weefsel kan comprimeren en het astrocytenvolume kan veranderen. - Giet de volgende dag de PFA uit de buis. Voeg 5 ml 1x TBS toe aan de buis om de hersenen te spoelen en resterende PFA te verwijderen. Giet de TBS uit en herhaal dit proces nog twee keer voor een totaal van drie spoelingen.
- Voeg 4-5 ml sucrose toe aan TBS en incubeer de hersenen bij 4 °C gedurende 1-2 dagen, of totdat de hersenen naar de bodem van de buis zinken.
OPMERKING: Hersenen zijn klaar om te bevriezen zodra ze zijn gezonken, maar kunnen enkele weken worden bewaard in sucrose-oplossing bij 4 ° C. - Bereid het vriesmedium in een buis van 50 ml door 15 ml 100% optimale snijtemperatuurverbinding (OCT) te mengen met 30 ml sucrose in TBS. Meng op een nutator of een orbitale shaker gedurende ten minste 1 uur om ervoor te zorgen dat de oplossing volledig gemengd is. Houd de buis nog een uur rechtop om eventuele bubbels naar de oppervlakte te laten stijgen.
OPMERKING: Het vriesmedium kan van tevoren worden bereid en enkele weken bij kamertemperatuur worden bewaard. - Gebruik een serologische pipet om vriesmedium toe te voegen aan een vierkante inbeddingsmal (Materiaaltafel). Zorg ervoor dat u geen bubbels in het medium introduceert. Voor een P21 muizenbrein is 3 ml voldoende. Pas het volume indien nodig aan voor verschillende leeftijden, zodat de hersenen volledig ondergedompeld zijn.
- Voeg de hersenen toe aan het medium en gebruik een paar # 5-tangen om elke hersenstam te verwijderen die mogelijk voorkomt dat de hersenen plat in de mal zitten. Lijn de voorkant van de hersenen uit met één rand van de mal.
- Breng de mal over op een plat oppervlak gekoeld met droogijs. Een metalen lunchblik gevuld met droogijs werkt goed voor dit doel. Omring de schimmel met droogijskorrels om langzaam en gelijkmatig bevriezen te garanderen.
- Zodra het vriesmedium volledig wit en stevig is, bewaart u de mal bij -80 °C.
OPMERKING: Hersenen kunnen meerdere jaren bij -80 °C worden bewaard.
2. Cyrosectioneren
OPMERKING: Deze sectiemethode is bedoeld om te werken met veel verschillende in de handel verkrijgbare cryostaten. Met de hier gebruikte cryostaat (Materiaaltabel) is de optimale snijtemperatuur van de monsterkop -23 °C, met een omgevingstemperatuur tussen -23 °C en -25 °C.
LET OP: Het cryostaatblad is extreem scherp. Wees voorzichtig bij het manipuleren van het mes en het bedienen van de cryostaat.
- Bereid het sectiemedium door 25 ml 1x TBS en 25 ml glycerol in een buis van 50 ml te mengen. Het is het gemakkelijkst om de glycerol toe te voegen door deze rechtstreeks in de buis te gieten en de markers op de buis te gebruiken voor meting. Schud/vortex de buis om te mengen. Deze oplossing kan enkele weken bij kamertemperatuur worden bewaard.
- Bereid je voor op het verzamelen van weefselsecties door 2 ml sectiemedium per put toe te voegen aan een 12-wellsplaat. Label de boven- en onderkant van de plaat met voorbeeldinformatie. Plaats de plaat, samen met andere benodigdheden (cryostaatmesje, scheermesje, klauwplaten en verfborstels), rechtstreeks in de cryostaat en laat ze gedurende ~ 5 minuten aan de temperatuur wennen.
- Verplaats de hersenen naar de cryostaatkamer en laat ze samen met de voorraden wennen aan de temperatuur.
- Verwijder het bevroren weefselblok uit de mal door twee hoeken van de mal af te snijden met een scheermesje en de mal van het weefsel af te pellen. Oriënteer het blok zo dat de voorkant van de hersenen naar boven is gericht.
- Voeg OCT toe aan de klauwplaat, zodat ~ 2/3 van de klauwplaat bedekt is met OCT en plaats onmiddellijk het weefselblok op de klauwplaat, met behoud van de hierboven beschreven oriëntatie. Druk het blok in de OCT zodat het plat op het oppervlak van de klauwplaat ligt.
- Zodra de OCT volledig is bevroren en het weefselblok stevig op zijn plaats zit, klemt u de klauwplaat vast aan de kop van het monster. Plaats het cryostaatblad en breng het mes dicht bij het monster.
- Snijd door de hersenen met intervallen van 100 μm tot vlak voordat het hersengebied van belang wordt bereikt. Om de hoeveelheid OCT die oplost in de sectiemedia te verminderen, gebruikt u een scheermesje om overtollig vriesmedium van de zijkanten van het weefselblok te snijden.
- Zodra het interessegebied is bereikt, begint u met het verzamelen van 100 μm dikke secties. Verzamel secties met behulp van de anti-rolplaat of door de cryostaat langzaam met één hand te verplaatsen terwijl u een penseel in de andere hand gebruikt om het gedeelte van het blok af te leiden terwijl het het mes ontmoet. Als het cryostaatmodel een pedaal heeft, gebruik dan het pedaal om de cryostaat vooruit te helpen, zodat beide handen kunnen worden gebruikt om het gedeelte van het blok te leiden.
- Breng de secties over op de 12-well plaat met behulp van een penseel of tang. Elke put kan minstens 10-12 secties bevatten. Bij het toevoegen van de sectie aan het medium, is het meestal voldoende om de onderrand van de sectie aan te raken aan het sectiemedium en de sectie in het medium te laten smelten zonder de borstel of tang nat te maken. Als de borstel het medium raakt, zorg er dan voor dat u het droogt met een papieren handdoek of tissue, omdat een te natte borstel het moeilijk maakt om weefselsecties over te brengen.
- Zet de plaat vast door deze in te pakken met folie of paraffinefolie. Zorg ervoor dat u het duidelijk labelt en bewaar het vervolgens bij -20 °C.
OPMERKING: Voor de meeste kleuringsprotocollen kunnen secties ten minste 1-2 jaar bij -20 °C worden bewaard zonder aanzienlijk signaalverlies.
3. Immunostaining
OPMERKING: Voer alle wasbeurten en incubaties uit op een orbitale platformschudder die is ingesteld op ongeveer 100 tpm. Alle stappen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur, behalve de primaire antilichaamincubatie, die wordt uitgevoerd bij 4 °C. Bereid montagemedia van tevoren voor door de ingrediënten in een buis van 50 ml te combineren en 's nachts op een moerator te mengen. Bescherm tegen licht en bewaar bij 4 °C gedurende maximaal 2 maanden. Als het endogene fluorescerende signaal voldoende is voor beeldvorming en analyse zonder dat immunostaining nodig is, kunnen stappen 3.1-3.9 worden overgeslagen. Als u immunostaining overslaat, voert u drie wasbeurten van 10 minuten uit bij TBS en gaat u verder met stap 3.10.
- Bereid een verse oplossing van TBST (0,2% Triton in TBS) door 1 ml 10% Triton-X toe te voegen aan een buis van 50 ml en de buis te vullen tot 50 ml met 1x TBS. Bereid 2 ml blokkerende en antilichaamoplossingen (10% geitenserum in TBST) voor elk brein.
OPMERKING: Voor de beste resultaten maakt u verse TBST voor elk nieuw kleuringsexperiment en gebruikt u een hoogwaardige bron van 10% waterige Triton-X (Materiaaltabel). - Label een plaat met 24 putten volgens het schema (figuur 1). Plaats verschillende monsters in verschillende rijen en verschillende oplossingen in verschillende kolommen. Voeg 1 ml TBST toe aan de eerste drie kolommen ('Wash 1', 'Wash 2' en 'Wash 3'). Voeg 1 ml blokkeringsoplossing toe aan de vierde kolom.
- Bereid een glazen plectrum voor door het uiteinde van een 5,75 in Pasteur pipet te smelten tot een kleine haak met behulp van een Bunsen-brander. Gebruik deze pik om weefselsecties van de 12-well plaat over te brengen naar de Wash 1 kolom van de 24-well plaat.
OPMERKING: Voor de beste resultaten schermt u de secties af voordat u begint met kleuren. Om secties te screenen, breng je de secties één voor één over naar een petrischaal gevuld met 1x TBS en onderzoek je de secties met een fluorescerende microscoop met een 5x of 10x objectief om ervoor te zorgen dat er voldoende fluorescerend gelabelde cellen aanwezig zijn. Het wordt aanbevolen om vier tot zes secties per put te beitsen, hoewel er indien nodig maximaal acht per put kunnen worden gekleurd. - Was de secties gedurende 10 minuten elk in Wash 1, 2 en 3 putten, gevolgd door het incuberen van de secties gedurende 1 uur in de blokkerende oplossing. Gebruik de glazen plectrum om de secties van de ene put naar de volgende over te brengen. De pick kan worden gebruikt om meerdere hersensecties tegelijk over te brengen.
- Bereid 1 ml primaire antilichaamoplossing voor elk monster (bijv. Rabbit RFP 1:2000 of Chicken GFP 1:2000). Voeg het antilichaam toe aan de antilichaamoplossing, vortex kort en centrifugeer vervolgens gedurende 5 minuten bij ≥ 4.000 x g bij 4 °C. Incubeer de secties in primair antilichaam gedurende twee tot drie nachten bij 4 °C tijdens het schudden.
- Na primaire antilichaamincubatie, aspirateer de dag 1 TBST uit de wasputten, voeg 1 ml nieuwe TBST toe aan elke wasput en verplaats de secties naar de eerste wasput. Was de secties 3x gedurende 10 minuten elk.
OPMERKING: Gebruik voor aspiratie een 9 in Pasteur pipet verbonden met buizen op een vacuümfles. Huisvacuümleidingen of een elektrische vacuümpomp kunnen als vacuümbron worden gebruikt. - Terwijl de secties worden gewassen, bereidt u secundaire antilichaamoplossingen in een concentratie van 1:200 door antilichamen toe te voegen aan de antilichaamoplossing (bijv. Geitenantikonijn 594 of geitenantikip 488). Vortex kort, en draai dan gedurende 5 minuten op ≥ 4.000 x g bij 4 °C.
- Incubeer secties in secundair antilichaam gedurende 3 uur bij kamertemperatuur. Bescherm de secties tegen licht tijdens deze stap en alle volgende stappen om het bleken van de secundaire antilichamen te verminderen.
- Na secundaire antilichaamincubatie, aspirateer de Dag 2 TBST uit de wasputten, voeg 1 ml nieuwe TBST toe aan elke wasput en verplaats de secties in de eerste wasput. Was de secties 3x in TBST gedurende 10 minuten elk.
- Haal tijdens de laatste wasbeurt het montagemedium uit 4 °C en laat het opwarmen tot kamertemperatuur. Bereid een 2:1 mengsel van 1x TBS:dH2O en voeg dit toe aan een petrischaaltje. Bereid een microscoopglaasje voor door 800 μL van 2:1 TBS:dH2O aan het oppervlak toe te voegen.
OPMERKING: Het gebruik van niet-uithardende bevestigingsmedia wordt sterk aanbevolen. Verhardende montagemedia kunnen het volume van het weefsel veranderen, wat de analyse van het astrocytengebiedvolume kan verstoren. Een recept voor een eenvoudig en goedkoop zelfgemaakt montagemedium is te vinden in de tabel met materialen. - Breng met een fijne kwast de secties één voor één over van de Wash 3-put naar de petrischaal. Deze stap verwijdert triton en helpt de secties af te vlakken. Breng vervolgens de secties van de petrischaal over in de vloeistof op de dia.
- Gebruik een penseel om de secties zo te rangschikken dat ze plat op de dia liggen. Verwijder voorzichtig overtollige vloeistof van de glijbaan met een P1000-pipet, gevolgd door vacuümaspiratie.
OPMERKING: Voeg een P200 pipetpunt toe aan het uiteinde van de Pasteur pipet voor een fijnere controle van de vacuümaspiratie. - Zodra alle overtollige vloeistof uit de dia is verwijderd, gebruikt u een transferpipet om onmiddellijk één druppel montagemedia aan elke sectie toe te voegen en legt u voorzichtig een coverslip over de dia. Laat montagemedia zich een paar minuten verspreiden en verwijder vervolgens overtollige bevestigingsmedia die door vacuümaspiratie onder de afdekplaat vandaan komen.
OPMERKING: Laat de secties niet drogen voordat u het montagemedium toevoegt. Als de secties beginnen te drogen voordat montagemedia worden toegevoegd, kan dit het weefselvolume beïnvloeden en nauwkeurige gegevensverzameling belemmeren. - Sluit alle vier de randen van de coverslip af met heldere nagellak. Laat de glaasjes bij kamertemperatuur 30 minuten drogen en bewaar ze vervolgens vlak bij 4 °C. Wacht ten minste 2 uur voordat u de volgende dag beeld krijgt.
OPMERKING: Secties gekleurd met antilichamen tegen GFP en RFP kunnen tot 2 weken vóór beeldvorming worden bewaard, op voorwaarde dat ze volledig zijn verzegeld met nagellak.
4. Confocale beeldvorming
OPMERKING: Dit protocol geeft algemene richtlijnen voor beeldacquisitie die op grote schaal toepasbaar zijn op verschillende confocale microscopen, in plaats van specifieke details voor een bepaalde confocale en software-interface.
- Gebruik een 10x-objectief om individuele cellen te lokaliseren voor beeldvorming, waarbij rekening wordt gehouden met het specifieke hersengebied of subgebied (bijvoorbeeld laag 5 van de visuele cortex) zoals relevant is voor het experiment. Gebruik de scherpstelknop om te proberen te bepalen of de hele astrocyt zich in de sectie bevindt.
- Schakel over naar een olieobjectief met een hogere vergroting (bijvoorbeeld 40x, 60x of 63x) en breng de cel in beeld. Terwijl u door het oculair kijkt, gebruikt u de focusknop om van de bovenkant naar de onderkant van de cel te gaan.
- Inspecteer de cel visueel om er zeker van te zijn dat de hele cel zich in de sectie bevindt. Als de cel abrupt onscherp wordt en aan de rand van de sectie wordt afgesneden, sluit u deze cel uit en zoekt u een andere cel.
- Gebruik de bijbehorende acquisitiesoftware van de confocale microscoop om de acquisitieparameters aan te passen om een geschikte signaal-ruisverhouding en detailniveau te verkrijgen (512 x 512 resolutie biedt voldoende details voor territoriumanalyse en vermindert de beeldacquisitietijd). Gebruik 2x zoom als je een 40x objectief gebruikt, en geen zoom als je een 60x of 63x objectief gebruikt.
- Stel de boven- en ondergrenzen van de z-stack in. Om ervoor te zorgen dat de hele astrocyt wordt vastgelegd, mogen de eerste en laatste afbeeldingen van de z-stack geen fluorescerende labeling van de cel bevatten. Gebruik voor adequate bemonstering een stapgrootte van 0,5 μm.
5. Beeldanalyse
OPMERKING: Dit protocol beschrijft de stappen voor het uitvoeren van beeldanalyse met behulp van in de handel verkrijgbare beeldanalysesoftware (d.w.z. Imaris; zie Materiaaltabel). Andere versies van deze software kunnen worden gebruikt met kleine wijzigingen in de workflow. Dit protocol vereist ook dat MATLAB het Convex Hull XTension-bestand (Supplemental File) uitvoert.
- Voordat u met de analyse begint, installeert u het Convex Hull XTension-bestand XTSpotsConvexHull.m door het bestand in de rtmatlab-submap van de XT-map te plakken.
- Gebruik de Imaris File Converter om afbeeldingen naar het '.ims'-formaat te converteren. Open een afbeeldingsbestand in de software voor beeldanalyse en bekijk de afbeelding in de 3D-weergavemodus door de knop 3D-weergave te selecteren.
- Inspecteer de cel vóór de analyse om er zeker van te zijn dat deze voldoet aan de opnamecriteria.
- Zorg ervoor dat de hele cel aanwezig is in de afbeelding (d.w.z. dat geen enkel deel van de cel uit de afbeelding mag worden geknipt). Draai de afbeelding om de voor- en achterkant te inspecteren.
- Zorg ervoor dat de cel slechts één cellichaam heeft. Klik op de knop Slice , sleep de cursor aan de linkerkant van het scherm om door de z-stack te gaan en controleer of de gelabelde cel slechts één cellichaam bevat.
- Zorg ervoor dat er een individuele astrocyt is die kan worden onderscheiden van naburige astrocyten die met dezelfde kleur zijn gelabeld.
- Een oppervlak maken
- Terwijl de 3D-weergaveknop opnieuw is geselecteerd, maakt u een nieuw oppervlak door op het blauwe pictogram Nieuwe oppervlakken toevoegen te klikken.
- Zorg ervoor dat op het tabblad Maken dat linksonder in het softwarevenster wordt weergegeven, alleen de selectievakjes Segment alleen een interessegebied en Object-objectstatistieken zijn aangevinkt voor Algoritme-instellingen en dat het selectievakje Maken met slicerweergave starten voor Voorkeuren voor maken is uitgeschakeld. Klik op de blauwe pijl om verder te gaan.
OPMERKING: Een interessegebied is mogelijk niet nodig als er geen extra fluorescerend signaal in de afbeelding buiten de betreffende cel is. Laat in dit geval segment alleen een interessegebied uitgeschakeld en ga verder met stap 5.4.3.
- Zorg ervoor dat op het tabblad Maken dat linksonder in het softwarevenster wordt weergegeven, alleen de selectievakjes Segment alleen een interessegebied en Object-objectstatistieken zijn aangevinkt voor Algoritme-instellingen en dat het selectievakje Maken met slicerweergave starten voor Voorkeuren voor maken is uitgeschakeld. Klik op de blauwe pijl om verder te gaan.
- Maak een interessant gebied rond de cel door dimensies in te voeren in de vakken onder Grootte van het gereedschap Oppervlakte maken of door de randen van het gele vak te slepen (afbeelding 2A). Klik op de blauwe pijl om verder te gaan.
- Selecteer het juiste bronkanaal in de vervolgkeuzelijst voor analyse (bijvoorbeeld kanaal 1 of het kanaal dat de fluorescerende celvulling bevat). De waarde in het vak Surfaces Detail wordt bepaald door de software en gebaseerd op parameters voor het verkrijgen van afbeeldingen. Zorg ervoor dat deze waarde constant blijft voor alle monsters in het experiment. Klik op de blauwe pijl om verder te gaan.
- Pas de drempel (absolute intensiteit) aan door de gele balk te slepen of door waarden in het vak in te voeren, zodat het grijze oppervlak zoveel mogelijk van het signaal van de cel vult zonder de grens van de cel te overschrijden. Een kleine hoeveelheid fluorescerend signaal zal zichtbaar zijn aan de randen van het oppervlak (figuur 2B). Klik op de blauwe pijl om verder te gaan.
- In het laatste deelvenster van het gereedschap Surface-creatie wordt de minimale kwaliteitswaarde ingesteld, de standaard onderdrempelwaarde van de software. Controleer in de vervolgkeuzelijst of Aantal Voxels Img=1 is geselecteerd. Controleer of alleen de linker aan/uit-knop voor Lower Threshold groen (actief) is; de rechter aan / uit-knop moet rood (inactief) zijn. De software stelt de ondergrenswaarde standaard op 10. Laat dit ongewijzigd en klik op de groene pijl om het genereren van het oppervlak te voltooien.
- Inspecteer het nieuw gegenereerde oppervlak zorgvuldig. Verwijder alle oppervlaktestukken die geen deel uitmaken van de cel door ze te selecteren, op het gereedschap Potlood bewerken te klikken en op de optie Verwijderen te klikken.
- Verenig de resterende oppervlaktestukken door op het trechterfilterpictogram te klikken om alles te selecteren, op het potloodpictogram Bewerken te klikken en op de optie Verenigen te klikken (Figuur 2C).
OPMERKING: Met een groot afbeeldingsbestand kan de software af en toe crashen tijdens de volgende stappen van dit protocol. Het is een goed idee om het bestand op dit punt op te slaan.
- Terwijl de 3D-weergaveknop opnieuw is geselecteerd, maakt u een nieuw oppervlak door op het blauwe pictogram Nieuwe oppervlakken toevoegen te klikken.
- Genereer vlekken dicht bij het oppervlak
- Klik op het oranje pictogram Nieuwe spots toevoegen . Als de nieuwe vlekken (bijvoorbeeld 'Spots 1') op het tabblad Maken zijn geselecteerd, moet u ervoor zorgen dat alleen het vak Object-objectstatistieken is aangevinkt voor Algoritme-instellingen en dat het selectievakje Maken met slicerweergave starten voor Voorkeuren voor maken is uitgeschakeld. Klik op de blauwe pijl om verder te gaan.
- Selecteer het juiste bronkanaal in de vervolgkeuzelijst (bijvoorbeeld kanaal 1) en voer vervolgens een geschatte XY-diameterwaarde van 0,400 μm in het vak in. Zorg ervoor dat alleen het vak Achtergrondaftrek is geselecteerd. Klik op de blauwe pijl om verder te gaan.
OPMERKING: 0,400 μm is geschikt voor afbeeldingen van 1024 x 1024 of 512 x 512 met een objectief van 63x, 60x of 40x. Voor andere beeldvormingsomstandigheden moet de diameter worden bepaald op basis van beeldvormingsomstandigheden en constant blijven tijdens alle analyses. De juiste waarde creëert voldoende vlekken om alle positieve signalen te dekken, maar voegt geen vlekken toe aan het achtergrondsignaal. - Het laatste paneel van het gereedschap Spots maken stelt de minimale kwaliteitswaarde in, de standaard onderdrempelwaarde van de software; zorg ervoor dat deze waarde ongewijzigd blijft, tenzij er een merkbaar verschil is in de plaatsing/verdeling van de vlekken (bijvoorbeeld als gevolg van een kleuring van slechtere kwaliteit). Klik op de groene pijl om het maken van de vlekken te voltooien.
- Als u de vlekken beter wilt weergeven, wijzigt u de transparantie van het oppervlak door het Surface te selecteren en op het gereedschap Kleur met meerdere kleuren te klikken. Selecteer onder Materiaal het materiaal dat het oppervlak transparant genoeg maakt om vlekken in de cel te bekijken (het op één na laatste materiaal in de lijst) (figuur 2D, E).
- Selecteer de spots opnieuw, klik op het filterpictogram en selecteer Kortste afstand tot oppervlakken Oppervlakken=Oppervlakken X, waarbij 'Oppervlakken X' het oppervlak is dat wordt geanalyseerd (bijvoorbeeld Oppervlakken 1), in de vervolgkeuzelijst. Zorg ervoor dat zowel de aan/uit-knoppen onder- als bovengrens groen (actief) zijn.
- Voer een minimale afstand van -1,0 μm (afstand van de vlekken tot de binnenkant van het oppervlak) in het vak Onderste drempel in en een maximale afstand van 0,1 μm (afstand van buitenaf) in het vak Bovenste drempel . Klik op de knop Selectie dupliceren naar nieuwe spots om het genereren van vlekken dicht bij het oppervlak te voltooien.
OPMERKING: De minimale en maximale afstandswaarden kunnen variëren met verschillende parameters voor het verkrijgen van afbeeldingen, zoals objectief, zoom en resolutie. Deze aantallen moeten empirisch worden bepaald. Het transparante oppervlak helpt te beoordelen of de waarden alle vlekken vastleggen die de vorm van het oppervlak nauwkeurig weergeven.
- Voer een minimale afstand van -1,0 μm (afstand van de vlekken tot de binnenkant van het oppervlak) in het vak Onderste drempel in en een maximale afstand van 0,1 μm (afstand van buitenaf) in het vak Bovenste drempel . Klik op de knop Selectie dupliceren naar nieuwe spots om het genereren van vlekken dicht bij het oppervlak te voltooien.
- Genereer een bolle romp en verzamel territoriummetingen
- Zorg ervoor dat de nieuw gemaakte Spots zijn geselecteerd in het linkerbovenhoekvenster van het softwarevenster (bijvoorbeeld "Spots 1 Selection ['Kortste afstand...]"). Klik op het tandwiel tools icoon, en vervolgens de Convex Hull plugin. Klik slechts één keer op de plug-in en wacht tot het MATLAB-venster verschijnt en vervolgens verdwijnt (dit kan enkele seconden duren). Een solide romp verschijnt in de 3D-weergave.
- Selecteer in het linkerbovenhoekpaneel Convex Hull of Spots X Selection ['Kortste afstand...], waarbij 'Spots X Selection' de nieuw gecreëerde spots zijn (bijv. Spots 1 Selection) en klik vervolgens op de romp om deze te selecteren (Figuur 2F).
- Klik op het pictogram Grafiekstatistieken , kies het tabblad Selectie , zorg ervoor dat Specifieke waarden is geselecteerd in de bovenste vervolgkeuzelijst en kies vervolgens Volume in de onderste vervolgkeuzelijst. Noteer het volume van de romp. Sla het bestand op en ga verder met de volgende afbeelding.
- Het meten van het overlapvolume van het gebied voor naburige cellen met verschillende fluorescerende labels
OPMERKING: Dit gedeelte van het protocol kan worden gebruikt als de monsters naburige astrocyten bevatten die verschillende fluorescerende labels uitdrukken (astrocyt 1 drukt bijvoorbeeld alleen GFP uit en astrocyte 2 drukt alleen RFP uit). Deze etikettering werd bereikt met behulp van virale of genetische strategieën zoals eerder beschreven 9,10 (figuur 3A).- Gebruik de stappen die in stap 5.4-5.6 worden beschreven, het oppervlak, de vlekken dicht bij het oppervlak en de bolle romp voor elke astrocyt (figuur 3B).
- Met Convex Hull of Spots 1 Selection... geselecteerd, klikt u op het potlood Edit icoon en klikt u op Mask Selection. Controleer in het venster Maskerkanaal of Kanaal 1 (of het kanaal dat astrocyt 1 vertegenwoordigt) is geselecteerd en zorg ervoor dat het vakje naast het dubbele kanaal voordat u de maskeroptie toepast , is ingeschakeld. Klik op OK om het kanaal Masked CH1 te maken.
- Met Convex Hull of Spots 2 Selectie... geselecteerd, klik op het potlood Bewerken pictogram en klik op Masker selectie. Selecteer in het venster Maskerkanaal de optie Kanaal 2 (of het kanaal dat astrocyten 2 vertegenwoordigt) in het vervolgkeuzemenu en zorg ervoor dat het vakje naast het dubbele kanaal voordat u het masker toepast , is ingeschakeld. Klik op OK om het kanaal Masked CH2 (Figuur 3C) te maken.
- Klik op de Coloc-knop bovenaan het scherm en gebruik de Coloc-tool om een colokalisatiekanaal van de twee gemaskeerde kanalen te maken. Stel kanaal A in op kanaal 3 - gemaskeerde CH1 en kanaal B op kanaal 4 - gemaskeerde CH2 (figuur 3D).
- Sleep de gele histogrambalk naar links voor beide kanalen. Gebruik de segmentweergave hieronder om het colokalisatiesignaal te observeren, dat grijs zichtbaar is. Merk op dat aangezien de fluorescerende signalen van de twee cellen niet daadwerkelijk co-gelokaliseerd zijn, de drempel naar links moet worden verplaatst, zodat valse colokalisaties beginnen te verschijnen op punten van cel-celcontact.
- Klik op Coloc-kanaal bouwen aan de rechterkant om het proces te voltooien. Klik op de 3D-weergave om terug te keren naar de standaard 3D-weergave. Een colocalisatieresultaatkanaal is nu grijs zichtbaar en wordt weergegeven in het weergaveaanpassingsvak.
- Maak het oppervlak, de vlekken dicht bij het oppervlak en de bolle romp van het colocalisatieresultaatkanaal met behulp van de stappen beschreven in 5.4-5.7 (figuur 3E, F).
- Noteer het volume van de bolle romp. Dit is het territorium overlap volume. Deel dit getal door het territoriumvolume van een van de astrocyten om het percentage territoriumoverlapping te berekenen. Kies de controle of wild-type astrocyte als een van de astrocyten genetisch gemanipuleerd is ten opzichte van de andere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 geeft een schematisch overzicht van de belangrijkste stappen en workflow voor dit protocol. Figuur 2 toont screenshots van belangrijke stappen met behulp van de beeldanalysesoftware om een oppervlak te genereren, vlekken dicht bij het oppervlak te genereren en een bolle romp te genereren. Figuur 3 toont de toepassing van deze techniek om de overlap/tegels van astrocytengebied te bepalen. In figuur 4 tonen representatieve resultaten van een eerder gepubliceerd manuscript9 de toepassing van dit protocol aan. In figuur 4A en figuur 4B vermindert knockdown van het met astrocyten verrijkte celadhesiemolecuul hepaCAM het volume van het astrocytengebied aanzienlijk. In figuur 4C en figuur 4D werd mozaïekanalyse met dubbele markers (MADM) gebruikt om schaarse mozaïeketikettering en gelijktijdige genetische modificatie in de cortex van de muis te introduceren. Met MADM werden muizen gegenereerd waarbij wild-type astrocyten een rood fluorescerend eiwit (RFP) tot expressie brengen en Hepacam knock-out astrocyten een groen fluorescerend eiwit (GFP) tot expressie brengen. Met behulp van het hierboven beschreven protocol werd het percentage territoriumoverlapping tussen naburige RFP- en GFP-astrocytenparen (WT: KO) berekend. Als controle werd dit vergeleken met naburige RFP- en GFP-astrocytenparen bij muizen zonder genetische modificatie van Hepacam (WT: WT). WT:KO astrocytenparen vertoonden een significant verhoogd percentage van het territorium overlapvolume in vergelijking met WT:WT astrocytenparen. Gezamenlijk tonen deze resultaten aan dat hepaCAM nodig is voor een normaal astrocytengebiedvolume en astrocytentetettet.
Figuur 1: Overzicht van de workflow voor het analyseren van het astrocytenterritoriumvolume. (A) Het protocol vereist een muis met schaarse of mozaïek fluorescerende labeling van astrocyten. (B) De muis wordt doordrenkt en vervolgens worden de hersenen gereseceerd, verwerkt en bevroren. (C) De bevroren hersenen worden gesneden met behulp van een cryostaat en (D) de vrij zwevende weefselsecties worden verzameld. (E) Na het snijden worden de zwevende weefselsecties gekleurd door immunohistochemie en vervolgens (F) op dia's gemonteerd. (G) Astrocyten in de gemonteerde weefselsecties worden in beeld gebracht met behulp van confocale microscopie. (H) Ten slotte worden de territoriumvolumes van de afgebeelde cellen gekwantificeerd met behulp van beeldanalysesoftware. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Belangrijkste stappen in de beeldanalyseprocedure voor het volume van het astrocytengebied. (A) Weergave van de cel met het interessegebied dat een ander signaal in het beeld uitsluit van de analyseprocedure. (B) Een aanvaardbare relatieve drempel voor oppervlaktecreatie (grijs) met behulp van signaal (rood). (C) Voltooid oppervlak met hoofdcel geselecteerd (geel). Andere delen van het oppervlak die niet de cel zijn, worden verwijderd (rood). (D) Doorschijnend oppervlak met gecreëerde vlekken. (E) Close-up van het doorschijnende oppervlak met vlekken die zijn gecreëerd om een aanvaardbare verdeling van vlekken ten opzichte van het oppervlak te laten zien. (F) Uiteindelijke bolle romp. Schaalbalken = 20 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Belangrijkste stappen in de analyse van de overlapping van astrocytengebied. (A) Representatieve afbeelding van twee astrocyten die verschillende fluorescerende markers uitdrukken, GFP (groen) en RFP (magenta). (B) Generatie van een bolle romp voor elke astrocyt. (C) Weergave van gemaskeerde GFP- en RFP-kanalen, waarbij de oorspronkelijke kanalen zijn verwijderd. (D) Voorbeeld van drempels met behulp van de "Coloc" tool om een "Colocalization Result" kanaal te creëren. Het signaal "gecolokaliseerd" wordt grijs weergegeven. (E) Weergave van de twee gemaskeerde kanalen. (F) Een gedraaide weergave van de bolle romp van het kanaal "Colocalization Result" (grijs) dat het overlapvolume van het gebied vertegenwoordigt. Schaalbalken = 20 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Succesvolle toepassing van het protocol om het volume van het astrocytengebied en de overlap van astrocytengebied te meten. (A) Astrocyten in de visuele cortex van wild-type CD1-muizen op postnatale dag 21, waarbij mCherry-CAAX (cyaan) en een controle-shRNA (shScramble) of een shRNA gericht op hepaCAM (shHepacam) tot expressie komen. Het astrocytengebied is rood omlijnd. (B) Verlies van hepaCAM vermindert het volume van het astrocytengebied aanzienlijk. Gegevenspunten vertegenwoordigen individuele muisgemiddelden. Foutbalken zijn ± s.e.m. Geneste t-test. (C) Naburige astrocyten in de cortex van de muis op postnatale dag 21 die GFP (groen) of RFP (magenta) tot expressie brengen. Bij MADM9 WT:WT-muizen zijn beide astrocyten wildtype. Bij MADM9 WT:KO-muizen is de groene astrocyt wild-type en de magenta-astrocyt nul voor Hepacam. Het volume van de territoriumoverlapping wordt in blauw weergegeven. (MADM9 WT:WT genotype: MADM9TG/GT; EMX-CreTg/0; Hepacam+/+. MADM9 WT:KO genotype: MADM9TG/GT; EMX-CreTg/0; Hepacam+/-). D) Kwantificering van het percentage van de overlapping van het grondgebiedvolume. Gegevenspunten vertegenwoordigen individuele muisgemiddelden. Foutbalken zijn ± s.e.m. Geneste t-test. Schaalstaven = 20 μm. De panelen in deze figuur zijn met toestemming van de uitgever herdrukt uit Baldwin et al9 . Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullend bestand. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol beschrijft een gevestigde methode voor het analyseren van het astrocytengebiedvolume en astrocytentegels in de cortex van de muis, waarbij alle belangrijke stappen worden beschreven, beginnend met perfusie en eindigend met beeldanalyse. Dit protocol vereist hersenen van muizen die fluorescerende eiwitten tot expressie brengen in een schaarse of mozaïekpopulatie van astrocyten. Buiten deze vereiste kunnen muizen van elke leeftijd voor dit protocol worden gebruikt, met slechts kleine aanpassingen aan de perfusie-instellingen en het volume van de vriesmedia die aan de insluitmal zijn toegevoegd. Terwijl andere methoden zijn gepubliceerd voor de analyse van de complexiteit en het volume van astrocytenvertakkingen in hersenweefselsecties 7,11, heeft dit protocol verschillende unieke voordelen. Ten eerste beschrijft dit protocol een aangepaste code die kan worden gebruikt om het volume van het astrocytengebied te verkrijgen. Astrocytengebiedsvolume is een andere meting van astrocytencelvolume, omdat het de hele ruimte meet die door een astrocyt wordt ingenomen, ongeacht de vertakkende complexiteit. Verder beschrijft dit protocol hoe de astrocytengebiedsvolumemeting kan worden toegepast om het overlapvolume van astrocytengebied te meten, en dus het gedrag van astrocytentegels. Ten slotte biedt dit protocol een gedetailleerde bespreking van de potentiële variabelen die van invloed kunnen zijn op het volume en de gegevensverzameling van astrocytengebieden, waaronder montageomstandigheden, opslagomstandigheden van monsters en inclusie- en exclusiecriteria voor beeldvorming en analyse. Naast deze unieke kenmerken kunnen veel aspecten van dit protocol, waaronder de perfusie, cryosectie en immunostaining van vrij zwevende secties, breed worden toegepast op kleuring van hersenweefselsecties van verschillende diktes en met verschillende antilichaamcombinaties. Hieronder worden kritieke stappen, belangrijke overwegingen, probleemoplossing en beperkingen in detail besproken.
Overwegingen voor het verzamelen van monsters
Een zeer belangrijke overweging voor experimenten die zijn ontworpen om astrocytenmorfologie te onderzoeken, is het handhaven van een consistent tijdstip van de dag voor het verzamelen van monsters. Groeiend bewijs geeft aan dat functionele toestanden van astrocyten verband houden met circadiaans ritme en slaapgedrag14. Om eventuele variabiliteit te verwijderen die kan worden geïntroduceerd door monsters die op verschillende tijdstippen van de dag worden verzameld, moeten perfusies zo worden gepland dat alle monsters voor een experiment op ongeveer hetzelfde tijdstip van de dag worden verzameld, binnen een tijdsbestek van 2-3 uur. Voor consistente perfusies wordt het gebruik van een peristaltische pomp ten zeerste aanbevolen. De toevoeging van heparine aan de TBS is nuttig om de vorming van bloedstolsels te verminderen. Hoewel dit protocol niet is getest met kortere postfixatietijden, is postfixatie 's nachts mogelijk niet vereist en kan een kortere postfixatie van 4 uur worden overwogen.
Tips voor het oplossen van problemen met cryosecties
Het bevriezen van hersenen in het 2:1 Sucrose:OCT vriesmedium vermindert de hoeveelheid OCT in de verzamelputten na het snijden. Wanneer het vriesmedium wordt ingevroren, gedraagt het zich op dezelfde manier als oct zelf, maar is het minder broos. Wanneer u het weefselblok op de klauwplaat bevriest, moet u deze onmiddellijk na het toevoegen van OCT aan de klauwplaat plat op de klauwplaat drukken. Als het weefselblok tijdens het snijden van de klauwplaat afbreekt, gebruik dan een scheermesje om een nieuw plat oppervlak aan de onderkant te snijden en opnieuw in te vriezen tot de klauwplaat. Door de klauwplaat voldoende tijd te geven om af te koelen tot de temperatuur van de cryostaatkamer voordat de OCT wordt toegevoegd en ervoor te zorgen dat de klauwplaat schoon en droog is, verbetert de hechting. Raak bij het verplaatsen van weefselsecties met de kwast de kwast aan de hoekrand van de sectie aan, zodat deze de OCT raakt en niet het weefsel zelf. Met een beetje vocht blijft het gedeelte aan de borstel plakken. Plaats het weefsel voorzichtig in het sectiemedium door de tegenoverliggende rand van de sectie aan de media aan te raken en het in het medium te trekken. Als de borstel het vriesmedium raakt, veegt u het af op een papieren handdoek in de cryostaat. Een borstel die te nat is, maakt het moeilijk om secties naar de schaal over te brengen. OCT moet oplossen zodra de weefselsectie in het sectiemedium is geplaatst. Als dit niet het geval is, kan de cryostaat kamertemperatuur te laag zijn.
Belangrijke overwegingen voor het kleuren en monteren van weefselsecties
Om de kleuringskwaliteit te verbeteren, bereidt u TBST vers voor elk experiment. Gebruik een hoogwaardige 10% waterige Triton-bron (Materiaaltabel). Kies een serum dat overeenkomt met de soort waarin het secundaire antilichaam is gemaakt (gebruik bijvoorbeeld geitenserum voor een secundaire geitenantikonijn). Antilichaamoplossingen worden voorafgaand aan gebruik gecentrifugeerd om elk neergeslagen antilichaam te pelleteren en te verwijderen. Zorg ervoor dat u de pellet niet verstoort bij het overbrengen van antilichaamoplossing van de buis naar de plaat (dit kan betekenen dat u iets minder dan 1 ml antilichaamoplossing per put pipettert en dat u de onderkant van de buis niet met de pipetpunt raakt). Deze stap helpt om achtergrondvlekken te verminderen. Wanneer secties in TBS:dH2O worden geplaatst, zullen de meeste zichzelf ontvouwen/ontwarren, maar sommige kunnen gevouwen of gedraaid blijven. Wanneer u secties met een penseel naar de dia overbrengt, gebruikt u een P200-punt in de andere hand om het weefselgedeelte naar de juiste plek te leiden. Gebruik de borstel om de delen voorzichtig uit te vouwen of los te maken, zodat ze plat liggen. Secties hebben de neiging om naar de aanzuigende pipet te bewegen als de vloeistof wordt verwijderd. Gebruik de P200-tip om mobiele secties op hun plaats te houden tijdens het zuigen. Montagemedia moeten onmiddellijk aan de secties worden toegevoegd nadat alle overtollige vloeistof is verwijderd en voordat de secties de tijd hebben om te drogen. Door de secties zelfs een paar minuten te laten drogen, heeft dit een drastische invloed op het volume van de cellen in de sectie. Nadat u het bevestigingsmedium aan de dia hebt toegevoegd, gebruikt u een pipet om zichtbare bellen te verwijderen. Zorg er na het toevoegen van de coverslip voor dat u overtollige bevestigingsmedia van de zijkanten verwijdert, omdat dit het vermogen van de nagellak om te drogen zal verstoren. Laat de nagellak drogen op kamertemperatuur. Wacht minstens 2 uur of tot de volgende dag om de secties in beeld te brengen, om ervoor te zorgen dat de montagemedia voldoende tijd hebben om de dikke secties volledig te penetreren.
Volledige astrocyten in beeld brengen
Bij het afbeelden van astrocyten voor territoriumvolumeanalyse is het van cruciaal belang dat het beeld het volledige volume van de astrocyt vastlegt. Veel gelabelde astrocyten in de weefselsectie zullen onvolledige astrocyten zijn. Volledige astrocyten zullen volledig worden opgenomen in het weefselgedeelte. Om volledige astrocyten te identificeren, begin je met een brandpunt in het midden van de astrocyt. Gebruik de scherpstelknop om naar de bovenkant van de astrocyt te gaan. Wanneer de astrocyt niet langer in focus is, moeten andere kenmerken van het weefsel in focus blijven. Herhaal dit proces voor de bodem van de astrocyt. Beeld geen onvolledige astrocyten af. Vanwege de dikte van de secties is de antilichaampenetratie niet zo robuust in het midden van de sectie. Labeling kan sterker zijn rond de buitenste randen van de astrocyt en zwakker in het midden. Dit wordt vaak waargenomen en heeft geen invloed op de territoriumanalyse.
Tips voor beeldanalyse
De belangrijkste overweging voor het beeldanalysegedeelte van het protocol is ervoor te zorgen dat de bolle romp slechts één astrocyt vertegenwoordigt. Volg elke keer de opname- en uitsluitingscriteria. Soms hebben twee astrocyten hun cellichamen heel dicht bij elkaar. Dit kan moeilijk te identificeren zijn in de 3D-weergave, maar is identificeerbaar met behulp van de segmentweergave. Als er andere fluorescerend gelabelde astrocyten zijn die contact maken met de astrocyt van belang, kan dit het proces van het maken van oppervlakken bemoeilijken. Als er een redelijk duidelijke grens zichtbaar is tussen de twee cellen (ze verbinden bijvoorbeeld slechts op één klein vertakkingspunt), kan het clipgereedschap worden gebruikt om een snede in het oppervlak te maken en kan dit deel van het oppervlak worden verwijderd. Nadat u het oppervlak hebt gemaakt, roteert u de cel in de 3D-weergave om te controleren op kleine stukjes oppervlak die zich mogelijk achter de cel verbergen, maar geen deel uitmaken van de cel. Verwijder deze voordat u doorgaat. Als de bolle romp drastisch uitsteekt tot een punt buiten het astrocytengebied, is er waarschijnlijk een stuk niet-celoppervlak dat niet is verwijderd. Als de software routinematig crasht tijdens het maken van het oppervlak, kan het aantal oppervlaktedetails worden verminderd. Als het crasht tijdens het maken van vlekken, gebruikt u een interessant gebied om alleen vlekken in de buurt van het oppervlakteobject te maken.
Beperkingen van het protocol
Hoewel er veel toepassingen en voordelen zijn aan dit protocol, zijn er ook verschillende beperkingen. Dit protocol vereist muizen die al fluorescerende eiwitten tot expressie brengen in een schaarse populatie van astrocyten, maar beschrijft niet de methoden voor het introduceren van de expressie van fluorescerende eiwitten in astrocyten. De imaging- en analysepijplijnen zijn tijdrovend en niet geschikt voor high-throughput analyse. Bovendien zijn ze specifiek gericht op het meten van het volume van astrocytengebied en tegels, in plaats van het definiëren van de gedetailleerde morfologische kenmerken van individuele astrocyten. Anderen kunnen het nuttig vinden om benaderingen en strategieën van dit protocol te combineren met recent gepubliceerde protocollen die methoden beschrijven voor het meten van astrocytenmorfologische complexiteit 7,11. Ten slotte zijn de commerciële softwareplatforms die in dit protocol worden gebruikt (d.w.z. Imaris en MATLAB) duur en vereisen ze een licentie om te gebruiken. Hoewel grote instellingen vaak licenties voor deze softwareplatforms aanschaffen, kan dit onbetaalbaar zijn voor kleinere instellingen en individuele laboratoria. Vooruitgang in microscopie, open-source beeldanalysesoftware en machine learning-algoritmen kunnen helpen dit protocol breed toegankelijk te maken voor alle laboratoria en kunnen ook de efficiëntie van beeldacquisitie en -analyse verbeteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten.
Acknowledgments
Microscopie werd uitgevoerd in de UNC Neuroscience Microscopy Core (RRID: SCR_019060), gedeeltelijk ondersteund door financiering van de NIH-NINDS Neuroscience Center Support Grant P30 NS045892 en de NIH-NICHD Intellectual and Developmental Disabilities Research Center Support Grant U54 HD079124. Figuur 1 is gemaakt met BioRender.com. De afbeeldingen en gegevens in figuur 4 zijn met toestemming van de uitgever overgenomen uit een eerdere publicatie9 .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #5 forceps | Roboz | RS-5045 | |
| 1 mL TB Syringe | Becton Dickinson (BD) | 309623 | |
| 10x TBS (tris-buffered saline) | 30 g Tris, 80 g NaCl, 2 g KCl, HCl to pH 7.4, dH2O to 1 L; store at room temperature (RT) | ||
| 12-well plate | Genesee Scientific | 25-106MP | |
| 1x TBS | 100 mL 10x TBS + 900 mL dH2O; store at RT | ||
| 1x TBS + Heparin | 28.2 mg Heparin + 250 mL 1x TBS; store at 4 °C | ||
| 24-well plate | Genesee Scientific | 25-107MP | |
| 30% Sucrose in TBS | 15 g sucrose, 1x TBS to 50 mL; store at 4 °C | ||
| 4% PFA (paraformaldehyde) in TBS | 40 g PFA, 4-6 NaOH pellets, 100 mL 10x TBS, dH2O to 1 L; store at 4 °C | ||
| Avertin | 0.3125 g tri-bromoethanol, 0.625 mL methylbutanol, dH2O to 25 mL; store at 4 °C; discard 2 weeks after making | ||
| Blocking and antibody buffer | 10% goat serum in TBST; store at 4 °C | ||
| CD1 mice | Charles River | 022 | |
| Collection vial for brains | Fisher Scientific | 03-337-20 | |
| Confocal acquisition software | Olympus | FV31S-SW | |
| Confocal microscope | Olympus | FV3000RS | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12544E | |
| Cryostat | Thermo Scientific | CryoStar NX50 | |
| Cryostat blade | Thermo Scientific | 3052835 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Embedding mold | Polysciences | 18646A-1 | |
| Freezing Medium | 2:1 30% sucrose:OCT; store at RT | ||
| GFP antibody | Aves Labs | GFP1010 | |
| Glycerol | Thermo Scientific | 158920010 | |
| Goat anti-chicken 488 | Invitrogen | A-11039 | |
| Goat anti-rabbit 594 | Invitrogen | A11037 | |
| Goat Serum | Gibco | 16210064 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Imaris | Bitplane | N/A | Version 9.8.0 |
| MATLAB | MathWorks | N/A | |
| Metal lunch tin | AQUARIUS | N/A | From Amazon, "DIY Large Fun Box" |
| Methylbutanol | Sigma-Aldrich | 152463 | |
| Micro Dissecting Scissors | Roboz | RS-5921 | |
| Mounting medium | 20 mM Tris pH 8.0, 90% Glycerol, 0.5% N-propyl gallate; store at 4 °C; good for up to 2 months | ||
| Nail polish | VWR | 100491-940 | |
| N-propyl gallate | Sigma-Aldrich | 02370-100G | |
| O.C.T. | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Oil | Olympus | IMMOIL-F30CC | Specific to microscope/objective |
| Operating Scissors 6" | Roboz | RS-6820 | |
| Orbital platform shaker | Fisher Scientific | 88861043 | Minimum speed needed: 25 rpm |
| Paintbrush | Bogrinuo | N/A | From Amazon, "Detail Paint Brushes - Miniature Brushes" |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Pasteur pipet (5.75") | VWR | 14672-608 | |
| Pasteur pipet (9") | VWR | 14672-380 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541-500G | |
| Razor blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| RFP antibody | Rockland | 600-401-379 | |
| Sectioning medium | 1:1 glycerol:1x TBS; store at RT | ||
| Slides | VWR | 48311-703 | |
| Sodium chrloide | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| TBST (TBS + Triton X-100) | 0.2% Triton in 1x TBS; store at RT | ||
| Transfer Pipet | VWR | 414004-002 | |
| Tri-bromoethanol | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Thermo Scientific | 424570025 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Triton X-100 (high-quality) | Fisher Scientific | 50-489-120 | |
| XTSpotsConvexHull | N/A | N/A | custom XTension provide as supplementary material |
References
- Stogsdill, J. A., et al. Astrocytic neuroligins control astrocyte morphogenesis and synaptogenesis. Nature. 551 (7679), 192-197 (2017).
- Akdemir, E. S., Huang, A. Y., Deneen, B. Astrocytogenesis: where, when, and how. F1000Research. 9, F1000 Faculty Rev-233 (2020).
- Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).
- Houades, V., et al. Shapes of astrocyte networks in the juvenile brain. Neuron Glia Biology. 2 (1), 3-14 (2006).
- Zuchero, J. B., Barres, B. A. Glia in mammalian development and disease. Development. 142 (22), 3805-3809 (2015).
- Srinivasan, R., et al. New transgenic mouse lines for selectively targeting astrocytes and studying calcium signals in astrocyte processes in situ and in vivo. Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).
- Testen, A., Kim, R., Reissner, K. J. High-resolution three-dimensional imaging of individual astrocytes using confocal microscopy. Current Protocols in Neuroscience. 91 (1), 92 (2020).
- Takano, T., et al. Chemico-genetic discovery of astrocytic control of inhibition in vivo. Nature. 588 (7837), 296-302 (2020).
- Baldwin, K. T., et al. HepaCAM controls astrocyte self-organization and coupling. Neuron. 109 (15), 2427-2442 (2021).
- Amberg, N., Hippenmeyer, S. Genetic mosaic dissection of candidate genes in mice using mosaic analysis with double markers. STAR Protocols. 2 (4), 100939 (2021).
- Dumas, L., et al. In utero electroporation of multiaddressable genome-integrating color (MAGIC) markers to individualize cortical mouse astrocytes. Journal of visualized experiments: JoVE. (159), e61110 (2020).
- Garcia-Marques, J., Nunez-Llaves, R., Lopez-Mascaraque, L. NG2-glia from pallial progenitors produce the largest clonal clusters of the brain: time frame of clonal generation in cortex and olfactory bulb. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (6), 2305-2313 (2014).
- Clavreul, S., et al. Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels. Nature Communication. 10 (1), 4884 (2019).
- O'Donnell, J., Ding, F., Nedergaard, M. Distinct functional states of astrocytes during sleep and wakefulness: Is norepinephrine the master regulator. Current Sleep Medicine Reports. 1 (1), 1-8 (2015).
