Summary
Bu protokol, "Bir Çanakta SCar benzeri doku" veya SCAD olarak adlandırılan bir cilt-fasya eksplantının oluşumunu tanımlar. Bu model, skar oluşumu sırasında tek fibroblastların benzeri görülmemiş bir şekilde görselleştirilmesini sağlar.
Abstract
Memelilerin derin doku yaralarının kapatılmasına verdiği küresel yanıt, özel fasya fibroblastlarının aracılık ettiği skar oluşumu ve doku kasılması yoluyladır. Yara izi oluşumunun ve bozulmuş yara iyileşmesinin klinik önemine rağmen, yara iyileşmesinde fasya fibroblast dinamiklerini anlamamız, fibroblast koreografisinin ve dinamiklerinin cilt yaraları gibi karmaşık ortamlarda doğrudan görselleştirilmesini sağlayan ilgili testlerin bulunmaması nedeniyle üstünkörüdür. Bu yazıda, cilt yaralarının karmaşık ortamını taklit eden SCAD veya "Bir Çanakta SCar benzeri doku" kullanılarak ex-situ cilt izleri oluşturmak için bir protokol sunulmaktadır. Bu tahlilde, 2 mm tam kalınlıkta cilt eksize edilir ve 5 gün boyunca ortamda baş aşağı kültürlenir, bu süre zarfında yara izleri ve cilt kontraktürleri eşit olarak gelişir. Bu metodoloji, fibroblast soyuna özgü transgenik fare modelleri ile birleştiğinde, tüm yara onarım süreci boyunca bireysel fibroblast soylarının görselleştirilmesini sağlar. Genel olarak, bu protokol araştırmacıların yara onarımının temel süreçlerini ve mekanizmalarını anlamalarına, modülatörlerin yara iyileşmesi sonuçları üzerindeki etkilerini doğrudan keşfetmelerine yardımcı olur.
Introduction
Yara iyileşmesi, ihlal edilen yaraların restorasyonu sürecidir. Omurgasızlarda doku yaralanmaları kısmi veya tam rejenerasyonla sonuçlanır. Buna karşılık, memeliler derin yaralanmalara yara izi bırakarak yanıt verirler; bu, ihlal edilen alanı en aza indiren ve aynı zamanda yaralı bölgeyi kalıcı olarak deforme eden yoğun matris lifleri tıkaçları ile yaraları hızlı bir şekilde kapatmak için uyarlanmış bir süreç 1,2,3. Memelilerde büyük deri yanıkları veya derin açık yaralar, hipertrofik veya keloid skarlar gibi patolojik fenotiplere neden olur 4,5. Bu coşkulu yara izleri, klinik ve küresel sağlık sistemleri üzerinde muazzam bir yüke neden olmaktadır. Sadece ABD'de, yara izi yönetimi yıllık yaklaşık 10 milyar dolara mal oluyor 6,7. Bu nedenle, skar oluşumunda rol oynayan temel süreçleri ve mekanizmaları daha iyi anlamak için ilgili metodolojilerin geliştirilmesi gerekmektedir.
Son yıllarda, farelerde yapılan çok çeşitli çalışmalar, belirli cilt bölgelerindeki kökenlerine bağlı olarak farklı fonksiyonel potansiyellere sahip heterojen fibroblast popülasyonlarını ortaya koymuştur 8,9,10. Arka deride, Rinkevich ve ark., 2015, EPF (Engrailed pozitif fibroblast) olarak adlandırılan Engrailed-1'in (En1) erken embriyonik ekspresyonuna sahip spesifik bir fibroblast popülasyonunun, yaralanma üzerine kutanöz skarlaşmaya katkıda bulunduğunu tanımlamıştır. Tersine, engrailed ekspresyon öyküsü olmayan başka bir fibroblast soyu olan Engrailed negatif fibroblast (ENF), skar oluşumuna katkıda bulunmaz8. R26mTmG (En1Cre x R26mTmG) gibi floresan muhabir fare çizgilerine çapraz Cre-driven transgenik fare çizgileri kullanılarak bu En1 soylarının kader haritalanması, EPF ve ENF popülasyonlarının görselleştirilmesine olanak tanır.
Fibroblast göçünü birkaç gün boyunca in vivo olarak incelemek, etik ve teknik kısıtlamalarla sınırlıdır. Ayrıca, skarlaşmada rol oynayan yolları modüle etmek için bileşik, viral ve nötralize edici antikor kütüphanesi ekranları teknik olarak zordur. Daha önce kullanılan in vitro veya ex vivo modeller, gerçek cilt mikro ortamlarında fibroblast göçünü ve skar oluşumunu, skar gelişiminde homojenliği ve in vivo cilt ortamlarını taklit eden doku karmaşıklığını görselleştirme yeteneğinden yoksundur 11,12. Yukarıdaki sınırlamaların üstesinden gelmek için, SCAD (Bir Çanakta SCar benzeri doku) 13,14 olarak adlandırılan bir ex vivo skar testi geliştirdik. Bu basit tahlil, epidermis, dermis ve deri altı fasya bölgelerini içeren 2 mm tam kalınlıkta cildin eksize edilmesi ve serum takviyeli DMSO ortamında 5 güne kadar kültürlenmesiyle gerçekleştirilebilir. SCAD'den üretilen skarlar, in vivo skarların transkriptomik ve proteomik özelliklerini güvenilir bir şekilde çoğaltır. Ek olarak, floresan muhabir fare çizgileriyle kesişen ilgili transgenik fare çizgilerinden (örneğin, En1 fareler) üretilen SCAD'ler, fibroblast göç dinamiklerinin ve yara izi gelişiminin benzeri görülmemiş bir çözünürlükte görselleştirilmesine izin verir. Ayrıca, bu model herhangi bir yüksek verimli uygulama için kolayca uyarlanabilir (örneğin, bileşik kütüphanesi, antikor kütüphanesi veya viral tarama)13,14. Bu makalede, skar gelişiminde hücresel ve matris dinamiklerini incelemek için SCAD'ler ve ardından aşağı akış işleme uygulamaları oluşturmak için optimize edilmiş bir protokolü açıklıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Aşağıda sunulan model, Jiang ve ark., 202013'te kısaca açıklandığı gibi SCAD testinin oluşturulmasının ayrıntılı bir adım adım açıklamasını sunmaktadır. SCAD numune hazırlıkları, uluslararası ve Yukarı Bavyera Hükümeti yönergelerine uygun olarak hayvanlar kurban edildikten sonra gerçekleştirilmiştir. Hayvanlar, Münih Helmholtz Merkezi'nin hayvan tesisinde barındırıldı. Odalar, 12 saatlik bir ışık döngüsü ile optimum nem ve sabit sıcaklık ile korunmuştur. Hayvanlara yiyecek ve su ad libitum sağlandı.
1. SCAD doku hazırlığı
- Yenidoğan yavruları doğum sonrası gün 0 veya 1. günde (P0 veya P1) kurban edin.
- Steril bir cerrahi neşter kullanarak iskelet kası tabakasına kadar en az 1,5 cm x 1,5 cm tam kalınlıkta dorsal sırt derisini dikkatlice tüketin.
- Steril kavisli forseps kullanarak cildi soyun ve yüzeysel fasyanın altta yatan panniculus karnoz kası ile bozulmamış olmasını sağlayın.
- Kirletici kanı temizlemek için eksize edilen dokuyu 50-100 mL soğuk DMEM/F-12 ortamı ile yıkayın.
- Doku ve hücre canlılığını korumak için Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) ile bir kez yıkayın.
- Cildi baş aşağı (üstte yüzeysel fasya) DMEM/F12 ortamı içeren 10 cm'lik bir Petri kabına yerleştirin.
- Tek kullanımlık 2 mm'lik bir biyopsi punch kullanarak, tam kalınlıkta yuvarlak deri parçalarını tüketin, yüzeysel fasyanın SCAD dokuları oluşturmak için epidermise kadar altta yatan panniculus karnozus kası ile bozulmamış olmasını sağlayın.
- % 10 FBS, 1x GlutaMAX, 1x MEM esansiyel olmayan amino asitler ve 1x Penisilin / streptomisin ile desteklenmiş 200 μL DMEM / F12 (fenol kırmızısı olmadan) komple medya-DMEM / F12 ortamını hazırlayın ve 96 delikli bir plakanın bireysel kuyucuklarına doldurun.
- Steril forseps kullanarak, bireysel SCAD dokusunu dikkatlice aktarın ve 96 delikli bir plakanın kuyularına baş aşağı (fasyaya bakacak şekilde) tamamen batırın.
- Plakayı standart koşullar altında tutulan bir hücre kültürü inkübatörüne aktarın (37 ° C,% 21 (v / v) oksijen,% 5 (v / v) C02 ve% 95 nem).
2. SCAD - Doku kültürü
- Kültür SCAD'leri bir inkübatörde 5 güne kadar.
- Kültürün 2. ve 4. günlerinde, hücre ve doku canlılığı koşullarının devam etmesini sağlamak için medyayı 200μl taze önceden ısıtılmış DMEM / F12 komple medya ile değiştirin. Her ortam değişikliği sırasında arıtma bileşiklerini değiştirin.
NOT: Dokuların kuyucuklara yapışmasını önlemek için kuyuda 10 μL ortam bıraktığınızdan emin olun. - SCAD'leri aşağıdaki deneyler için hazırlayın: Canlı görüntüleme (bölüm 3) ve Doku Toplama ve 2D / 3D immünofloresan boyama (bölüm 4).
3. SCAD'lerin canlı görüntülenmesi
- Bir cam şişede PBS'de en az 30 mL% 2-3% (w / v) düşük erime noktalı agaroz çözeltisini, kaynayana kadar bir mikrodalgada ısıtarak hazırlayın.
- Hemen şişeyi aktarın ve sıvı agaroz çözeltisini 40 ° C'lik bir su banyosunda soğutun.
- SCAD dokusunu fasya/yara izi yukarı bakacak şekilde 35 mm'lik bir kabın ortasına aktarın.
- SCAD'yi oda sıcaklığında (RT) 40 °C sıvı agarozu bir Pasteur pipet kullanarak 35 mm'lik kabın üzerine yavaşça aktararak yerleştirin. Agaroz 2 dakika içinde polimerize olur.
- 2 mL önceden ısıtılmış DMEM / F12 tam ortam ekleyin (fenol kırmızı göstergesi olmadan).
- 37 °C, %21 (v/v) oksijen, %5 (v/v) C0 2 ve %95 neme ayarlanmış uygun bir inkübasyon sistemi ile donatılmış bir konfokal veya çoklu foton mikroskop kullanarak 48 saate kadar 0. gün SCAD'lerinin hızlandırılmış görüntülerini eldeedin.
4. Doku hasadı ve 2D / 3D immünofloresan boyama
- Ortamı steril PBS ile değiştirerek dokuları ilgili zaman noktalarında yıkayın.
- Steril forseps kullanarak, dokuları gece boyunca 4 ° C'de sabitlemek için bireysel SCAD'leri 500 μL% 2 paraformaldehit içeren 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerine dikkatlice aktarın.
- Dokuları PBS ile üç kez yıkayın ve 2D / 3D immünofloresan boyama işlemine devam edin.
- 3D immünofloresan boyama
- RT'de 24 saat boyunca% 0.2 jelatin,% 0.5 Triton-X100 ve% 0.01 Thimerosal (PBSGT) ile desteklenmiş 500 μL PBS içeren 1.5 mL mikrosantrifüj tüpünde inkübe ederek dokuları geçirgenleştirin.
- Üreticinin talimatlarına göre yeterli miktarda birincil antikor hazırlayın ve SCAD dokularını RT'de 24 saat boyunca 150 μL PBSGT çözeltisinde inkübe edin.
NOT: İmmün floresan için optimal antikor konsantrasyonu üretici tarafından bildirilmemişse, kontrol dokularında farklı konsantrasyonlar kullanılarak (örneğin, 1:50, 1:200, 1:500, 1:1000) önceden antikor titrasyonu yapılmalıdır. - İlişkisiz primer antikoru çıkarmak için SCAD'leri PBS ile üç kez nazikçe yıkayın.
- RT'de bir gecede PBS'de 1:1000 ilgili Alexa Fluor sekonder antikorları ile dokuyu inkübe edin.
- Fazla bağlanmamış ikincil antikorları çıkarmak için dokuyu PBS'de 30 dakika boyunca üç kez nazikçe yıkayın.
- Konfokal veya multifoton görüntüleme için dokuyu 35 mm'lik cam tabanlı bir kaba aktarın.
NOT: Suya daldırma hedeflerini kullanırken, görüntü elde etme sırasında sürüklenmeyi önlemek amacıyla dokuyu hareketsiz hale getirmek için SCAD'leri %2 düşük erime noktası agarozuna yerleştirin
- 2D immünofloresan boyama
- Dokuyu bir kriyo-kalıba aktarın ve dokuyu tamamen daldırmak için optimum kesme sıcaklığı (OCT) bileşiği ile yavaşça doldurun.
- Dokunun yönünü yavaşça ayarlayın, bir enine kesit veya dikey bir bölüm elde etmek için hava kabarcıklarının olmamasını sağlayın.
- Kalıbı 20-30 dakika kuru buz üzerine yerleştirin ve bloğu gece boyunca -80 ° C'de inkübe edin.
- Bıçak sıcaklığını -25 °C'ye ve numune bloğu sıcaklığını -17 °C'ye ayarlayın. Bir kriyostat kullanarak 6 μm kriyoseksiyon hazırlayın, bölümleri bir yapışma slaydına aktarın ve slaytları -20 °C dondurucuda saklayın.
- Slaytları PBS'de üç kez durulayın ve slaytları PBST'de (% 0.05 Ara ile desteklenmiş PBS) 1 saat boyunca% 5 Sığır Serum Albümini (BSA) ile inkübe edin.
- 150μl PGST'ye uygun miktarda birincil antikor ekleyin ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin
NOT: İmmün floresan için optimal antikor konsantrasyonu üretici tarafından bildirilmemişse, kontrol bölümlerinde farklı konsantrasyonlar kullanılarak (örneğin, 1:50, 1:200, 1:500, 1:1000, 1:1000) önceden antikor titrasyonu yapılmalıdır. - İlişkisiz birincil antikoru çıkarmak için bölümleri PBS ile üç kez nazikçe yıkayın.
- PBS'de 1:1000 ilgili Alexa Fluor sekonder antikorları ile dokuyu RT'de 2 saat boyunca gece boyunca inkübe edin.
- Fazla bağlanmamış ikincil antikorları çıkarmak için dokuyu PBS'de 5 dakika boyunca üç kez nazikçe yıkayın.
- Slaytları DAPI içeren bir montaj ortamıyla monte edin ve slaytları RT'de karanlıkta kurulayın.
- Bölümleri bir floresan mikroskobu kullanarak görüntüleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SCAD'lerin üretimi üç temel adıma ayrılabilir: P0-P1 farelerinden arka cildin toplanması, tam kalınlıkta biyopsi punchlarının üretilmesi ve ardından 96 kuyucuklu plakalarda 5 güne kadar bireysel scads kültürü. Bir okuma olarak, bu tahlil yara izinin mekansal ve zamansal yönlerini analiz etmek için daha fazla uygulanabilir. Uzamsal analiz, gelişmekte olan skar dokusundaki hücresel ve matris bileşenlerinin mekansal lokalizasyonunu incelemek için dokuların 2D ve 3D bağışıklık etiketlemesini kullanır. Mekansal zamansal çalışmalar, ilgili 3D hızlandırılmış görüntüleme modaliteleri kullanılarak görselleştirilebilen doku intrinsik veya ekstrinsik floresan proteinleri kullanılarak bu ex-situ skarların görselleştirilmesine izin verir.
Bu tahlildeki en önemli adımlar, tam kalınlıkta biyopsi punch'larını dikkatlice üreterek, fasyal bir "jöle" tabakasının varlığını sağlayarak ve dokuyu tamamen baş aşağı batırarak (epidermis, 96 kuyucuklu plakaların dibine bakacak şekilde) şekillendirerek deneyi kurmaktır. Bu, düzgün yara izlerinin, ilgili fibroblast popülasyonlarının karşılaştırılabilir göç dinamiklerinin ve SCAD'ler arasında cilt kasılmasının gelişmesine izin verir (Şekil 1A). SCAD testinin çok yönlülüğü, skar gelişiminin tüm spektrumunda dokunun toplanmasına izin verir. Örneğin, deneyin amacı yara izinin erken dinamiklerini incelemekse, mekansal ve mekansal zamansal analiz SCAD kültürünün D1 veya D2'si ile sınırlandırılabilir (Şekil 1B).
SCAD'lerin 0. gün ve 5. gündeki temsili tam montajlı parlak alan görüntüleri sırasıyla Şekil 2A ve Şekil 2A'da gösterilmiştir. 2D analiz için, kesitleme sonrası dokunun bozulmamasını sağlamak için SCAD'lerin OCT'ye hava kabarcıklarından arındırılmış dik yönde gömülmesi esastır. Bu doku kesitleri ayrıca En1Cre, R26 mTmG fare dorsal dermisinden kriyon kesitleri üzerinde histolojik analize (örneğin, Masson trikrom boyama-Şekil 2B, 2B') veya İmmünofloresan boyama (Şekil 2C, 2C') işlemine tabi tutulabilir; Yeşil renkte EPF ve erken dönemden itibaren kırmızı renkte ENF (Şekil 2D) ve geç evre skar (Şekil 2D').
Yara izlerinin 3D ve 3D hızlandırılmış görüntülemesi, dokunun derinliklerinde (400-800 μm) floresan sinyallerinin tespit edilmesini gerektirir. İki foton uyarımı kullanılarak yakın kızılötesi dalga boylarında uyarma, ışık saçılımını ve absorpsiyonunu en aza indirerek dokuyu şeffaf hale getirmek için 3D görüntülemede yaygın olarak kullanılan bir metodoloji olan doku temizlemeye gerek kalmadan bu tür ölçümleri mümkün kılar15,16,17. Ayarlanabilir bir lazerle birlikte 25x su daldırma hedefi ile donatılmış dik bir Multifoton mikroskobu kullandık. Dokular, ilgili problar kullanılarak 3D immün boyamaya tabi tutuldu. 3D görüntüleme için, doku, suya daldırma hedefi için gereken kırılma indisine uyacak şekilde PBSGT ile tepesinde dokudaki sürüklenmeyi immobilize etmek veya önlemek için% 2 düşük erime noktalı bir agaroz çözeltisine gömüldü (Şekil 3A). Şekil 3B ve Şekil 3B'deki temsili görüntü, N-Cadherin proteininin (pembe / macenta-Alexa flor 647) bir En1Cre, R26mTmG arka derisinden bir gün 5 SCAD'nin skar bölgesinde özel lokalizasyonunu göstermektedir; Yeşil renkte EPF ve kırmızı renkte ENF. 3D hızlandırılmış görüntüleme için, dokuyu PBS yerine fenol kırmızısı göstergesi olmayan DMEM / F12 ortamı ile tepesinde% 2 düşük erime noktalı bir agaroz çözeltisine gömerek yukarıdaki kurulumda hafif bir değişiklik yapıldı. Görüntüleme sırasında "canlı" SCAD dokusu için doğru koşulları sağlamak amacıyla, görüntüleme sırasında tüm fenotiplerin doğru bir şekilde kaydedilmesi için uygun bir inkübasyon odası eklenmiştir (Şekil 3C). Erken fibroblast sürülerinin temsili enstantaneleri, skar gelişiminin ilk 12 saat / erken aşamalarında Şekil 3D, Şekil 3D ve Şekil 3D '' de gösterilmiştir.
Şekil 1: SCAD testinin şematik iş akışı. (A) Doğum sonrası 0 / gün 1 yavrularından itibaren arka deri eksize edilir ve aşağıdaki dermal tabakaları içeren doku bütünlüğü sağlanır: Epidermis (E), papiller ve retiküler dermis (PD ve RD) ve Fasya tabakası (F) ve ardından 0. gün SCAD'leri elde etmek için 2 mm biyopsi punch'ları. (B) SCAD'ler daha sonra, 2. ve 4. günde bir kültür ortamı değişim adımı ile bireysel deneylerin (noktalı oklar) doğasına dayanan isteğe bağlı aralıklı bir hasat / doku fiksasyon adımı ile 5 güne kadar kültürlenebilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: 2D immünofloresan boyama. Temsili 2D okumalar, (A ve A') kullanarak erken ve geç aşamadaki yara izlerini incelemek için 0. gün (A) ve gün 5'te (A') parlak alan tam montajlı görüntü. (B ve B') Masson'un dikey doku kesitlerini trikrom boyayarak doku skarlaşması-doku kasılmasının imzalarını ortaya çıkarması ve ECM'nin skar çekirdeğinde (sarı dolgulu üçgen) 0. gün (B) ve 5. günde (B') birikmesi. (C ve C') En1 Cre,R26mTmG arka derisinden üretilen 0. gün (C) ve 5. gün (C') SCAD'lerin immünofloresan analizi. EPF'ler yeşil, ENF kırmızı ve DAPI erken (D) ve geç evre (D') skarından mavi renkte gösterilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: 3D uzaysal ve mekansal zamansal analiz için SCAD'lerin şematik kurulumu ve temsili okumaları. (A) SCAD'lerin dik bir floresan mikroskop altında% 2 düşük erime sıcaklığındaki agaroz jeline gömülmesinin şematik gösterimi ve (B) En1Cre, R26mTmG'den üretilen 3D immünofloresan lekeli gün 5 SCAD'nin temsili görüntüsü fare dermisi ve N-Kadherin antikoru (Macenta) ile bağışıklık boyalı. EPF'ler yeşil, ENF'ler kırmızı renkle gösterilir. (C) Bir inkübasyon odası ile donatılmış şematik gösterim 3D görüntüleme SCAD kurulumu: 37 °C,% 21 (v / v) oksijen,% 5 (v / v) C02 ve% 95 nem. (D) 0. günün ilk 12 saatinde fibroblast sürülerinin (beyaz kesikli daire) progresyonunun erken olaylarını gösteren canlı görüntülemenin temsili sonuçları ve 1. gün evre SCAD. (E) D, D' ve D'deki bireysel fibroblastların tek hücreli izlenen hücresel yörüngelerinin grafiksel gösterimi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yaralanma sonrası skar oluşumunu anlamak için çeşitli modeller geliştirilmiştir. Bu konuda birçok ilerleme kaydedilmesine rağmen, gerçek mekanizmalar hala net değildir. Önceki tekniğin aksine, SCAD modeli tüm hücre tiplerini ve kutanöz tabakaları içerir, böylece doğal cildin karmaşıklığını korur18,19. Bu metodoloji, skar oluşumunu yönlendiren moleküler mekanizmaları anlamada önemli olan temel veri kümeleri üretebilir. Tahlil, basit, minimalist, ancak fibroblast migrasyonunu, ECM birikimini, epidermal / kas kasılmasını anlamak için çok önemli olan temel ve fonksiyonel okumaları üretebilecek şekilde tasarlanmıştır13,14. İn vivo kurulumlardan nispeten daha az karmaşıktır ve numuneye göre sapmalar en aza indirilebilir. Ayrıca, bu tahlil yüksek verimli analiz boru hatlarıyla kolayca birleştirilebilir. Burada kimyasal bileşikler, nötralize edici antikorlar, siRNA veya skarlaşmayı azaltan veya teşvik eden viral metodolojiler gibi inhibitörlerin veya aktivatörlerin tüm spektrumu veya kütüphaneleri, eksize edilen dokuların minimum miktarlarına göreceli olarak kolaylıkla uygulanabilir. Bu ex vivo skar modelinin sınırlandırılması ile ilgili olarak, bu tahlil a) skar gelişiminde yerleşik olmayan İmmün sürülerin fenotipik veya dinamik yönlerini incelemek için uygulanamaz b) vaskülarizasyon c) doku yaralanmadan sonraki 5 günden sonra uygulanabilir olmadığından skar olgunlaşması.
Biyopsi eksizyonu delmeden önce, deneyin işlemlerine müdahale edebileceğinden, dokuda kalan kan kalmaması önemlidir. Dokudan kalan kanın elimine edildiğinden emin olmak için gerekirse dokuyu HBSS ile birden fazla kez yıkamanızı öneririz. Ayrıca, alternatif günlerde değişen ortamın özel bir dikkatle yapılması gerekir, çünkü dermal ve epidermal tabakalar dokunun küçük boyutu nedeniyle ayrılabilir. Bu nedenle, gerçek deneylere başlamadan önce prosedürü önceden düzgün bir şekilde uygulamak zorunludur. Doku katmanlarının tekrar tekrar ayrılmasını önlemek için, ortam değişimi sırasında, dokuyu stabilize etmek ve kuyuya eklenen ortamın neden olduğu doku üzerindeki yüzey gerilimindeki değişimi en aza indirmek için taze ortamla değiştirilmeden önce 10 μl artık ortamın tutulabileceğini öneriyoruz.
2D analiz boru hatları için, dokuyu bir bloğa monte etmeden önce dokuyu oda sıcaklığında sıvı optimum kesme sıcaklığı bileşiği ile birkaç dakika dengelemenizi öneririz. Bu, kesitleme sırasında buz kristali oluşumu nedeniyle doku ayrılmasını önler. 3D/3D hızlandırılmış görüntüleme boru hatları, mevcut mikroskop modalitesine göre yeterince değiştirilmelidir. Dik bir mikroskop için (suya daldırma hedefi olsun veya olmasın), dokuyu agaroz içine gömmek veya süper yapıştırıcı kullanmak, görüntüleme sırasında dokunun fiziksel olarak kaymasını önler. Suya daldırma hedefleri, PBS veya renksiz medya (fenol kırmızısı olmadan) kullanarak 3D/3D hızlandırılmış görüntülemeye izin verir. Ters çevrilmiş bir mikroskop için, doku bir cam taban / görüntüleme plakasına yerleştirilebilir ve düşük erime sıcaklığında bir damla agaroz kullanılarak hareketsiz hale getirilebilir ve canlı görüntüleme sırasında canlılığı sağlamak için uygun ortamlarla kaplanabilir. Her iki yöntemde de, görüntüleme sırasında doğru sıcaklık, nem ve gaz beslemesini sağlamak için uyumlu bir inkübasyon sistemi kullanılabilir.
Sonuç olarak, SCAD modeli, memeli yara iyileşmesinde rol oynayan yeni moleküler ipuçlarının ve mekanik yolakların tanımlanmasını ve karakterizasyonunu sağlar13,14. Protokol, SCAD'lerin oluşturulmasının ayrıntılı bir tanımını ve yara izi gelişimi hakkında fikir vermek için potansiyel aşağı akış uygulamaları ve analizi sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Tüm yazarlar rakip çıkarlar olmadığını beyan eder.
Acknowledgments
SCAD metodolojisinin geliştirilmesine katkıda bulundukları için Jiang et al. 2020'nin tüm ortak yazarlarına teşekkür ederiz13. Dr. Steffen Dietzel'e ve Ludwig-Maximilans-Universität'teki Biyogörüntüleme çekirdek tesisine Multiphoton sistemine erişim için teşekkür ederiz. Y.R., Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (2016_A21), Avrupa Araştırma Konseyi Konsolidatör Bursu (ERC-CoG 819933) ve LEO Vakfı (LF-OC-21-000835) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Tween 20, Nonionic Detergent | Biorad Laboratories | 1610781 | |
| Bovine serum albumin, Cold ethanol fract | Sigma | A4503-50G | |
| DMEM/F-12, HEPES, no phenol red-500 mL | LIFE Technologies | 11039021 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190169 | |
| Epredia Cryostar NX70 Cryostat | Thermo Scientific | ||
| Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides | Fisher scientific | J1800AMNZ | Adhesion slides |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin-500 mL | LIFE Technologies | 10500064 | |
| Fluoromount-G with DAPI | Life Technologies | 00 4959 52 | Mounting medium with DAPI |
| Forceps curved with fine points with guidepinstainless steel(tweezers)125 mm length | Fisher Scientific | 12381369 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | G2500-100G | |
| GlutaMAX Supplement-100 mL | LIFE Technologies | 35050038 | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red-500 mL | LIFE Technologies | 14025092 | |
| Ibidi Gas incubation system for CO2 and O2 | Ibidi | 11922 | |
| Ibidi Heating system | Ibidi | 10915 | |
| Leica SP8 upright microscope - Multiphoton excitation 680–1300 nm | Leica | Equipped with a 25x water-dipping objective (HC IRAPO L 25x/1.00 W) in combination with a tunable laser (Spectra-Physics, InSight DS + Single) | |
| Non Essential Amino Acids | LIFE Technologies | 11140035 | |
| NuSieve GTG Agarose ,25 g | Biozym /Lonza | 859081 | |
| OCT Embedding Matrix | Carlroth | 6478.1 | |
| Paraformaldehyde, 16% W/V AQ. 10 x10 mL | VWR International | 43368.9M | |
| Pen-Strep | Gibco | 15140122 | |
| Stiefel Biopsy-Punch 2 mm | Stiefel | 270130 | |
| Straight Sharp/Sharp Dissecting Scissors 11.4 cm | Fisher Scientific | 15654444 | |
| Thimerosal Bioxtra, 97%–101% | Sigma-Aldrich | T8784-1G | |
| Zeiss Axioimager M2 upright microscope | Zeiss |
References
- Longaker, M. T., et al. Adult skin wounds in the fetal environment heal with scar formation. Annals of Surgery. 219 (1), 65-72 (1994).
- desJardins-Park, H. E., Foster, D. S., Longaker, M. T. Fibroblasts and wound healing: an update. Regenerative Medicine. 13 (5), 491-495 (2018).
- Jiang, X., Iseki, S., Maxson, R. E., Sucov, H. M., Morriss-Kay, G. M. Tissue origins and interactions in the mammalian skull vault. Developmental Biology. 241 (1), 106-116 (2002).
- Tripathi, S., et al. Hypertrophic scars and keloids: a review and current treatment modalities. Biomedical Dermatology. 4, 11 (2020).
- Martin, P. Wound healing--Aiming for perfect skin regeneration. Science. 276 (5309), 75-81 (1997).
- Correa-Gallegos, D., et al. Patch repair of deep wounds by mobilized fascia. Nature. 576 (7786), 287-292 (2019).
- Sen, C. K. Human wounds and its burden: An updated compendium of estimates. Advances in Wound Care. 8 (2), 39-48 (2019).
- Rinkevich, Y., et al. Identification and isolation of a dermal lineage with intrinsic fibrogenic potential. Science. 348 (6232), 2151 (2015).
- Leavitt, T., et al. Prrx1 fibroblasts represent a pro-fibrotic lineage in the mouse ventral dermis. Cell Reports. 33 (6), 108356 (2020).
- Driskell, R. R., et al. Distinct fibroblast lineages determine dermal architecture in skin development and repair. Nature. 504 (7479), 277-281 (2013).
- Walmsley, G. G., et al. Live fibroblast harvest reveals surface marker shift in vitro. Tissue Engineering. Part C, Methods. 21 (3), 314-321 (2015).
- Hakkinen, K. M., Harunaga, J. S., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Direct comparisons of the morphology, migration, cell adhesions, and actin cytoskeleton of fibroblasts in four different three-dimensional extracellular matrices. Tissue Engineering. Part A. 17 (5-6), 713-724 (2011).
- Jiang, D., et al. Injury triggers fascia fibroblast collective cell migration to drive scar formation through N-cadherin. Nature Communications. 11 (1), 5653 (2020).
- Wan, L., et al. Connexin43 gap junction drives fascia mobilization and repair of deep skin wounds. Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 97, 58-71 (2021).
- Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. -L., Ertürk, A. A guidebook for DISCO tissue clearing. Molecular Systems Biology. 17 (3), 9807 (2021).
- Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).
- Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Wilhelm, K. -P., Wilhelm, D., Bielfeldt, S. Models of wound healing: an emphasis on clinical studies. Skin Research and Technology: Official Journal of International Society for Bioengineering and the Skin (ISBS) [and] International Society for Digital Imaging of Skin (ISDIS) [and] International Society for Skin Imaging (ISSI). 23 (1), 3-12 (2017).
- Grada, A., Mervis, J., Falanga, V. Research techniques made simple: Animal models of wound healing). The Journal of Investigative Dermatology. 138 (10), 2095-2105 (2018).
