Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Direkte måling af kræfter i rekonstituerede aktive mikrotubulusbundter

Published: May 10, 2022 doi: 10.3791/63819
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Biological Sciences and Center for Biotechnology and Interdisciplinary Studies, Rensselaer Polytechnic Institute
* These authors contributed equally

Summary

Her præsenterer vi en protokol til rekonstituering af mikrotubulusbundter in vitro og direkte kvantificering af de kræfter, der udøves i dem ved hjælp af samtidig optisk fangst og total intern refleksionsfluorescensmikroskopi. Dette assay muliggør måling på nanoskala-niveau af de kræfter og forskydninger, der genereres af proteinensembler inden for aktive mikrotubulinetværk.

Abstract

Mikrotubulusnetværk anvendes i celler til at udføre en bred vifte af opgaver, lige fra at fungere som spor til vesikeltransport til at arbejde som specialiserede arrays under mitose for at regulere kromosomadskillelse. Proteiner, der interagerer med mikrotubuli, omfatter motorer som kinesiner og dynein, som kan generere aktive kræfter og retningsbestemt bevægelse samt ikke-motoriske proteiner, der tværbinder filamenter i højere ordens netværk eller regulerer filamentdynamik. Hidtil har biofysiske undersøgelser af mikrotubuli-associerede proteiner overvældende fokuseret på rollen som enkeltmotorproteiner, der er nødvendige for vesikeltransport, og der er gjort betydelige fremskridt med at belyse de kraftgenererende egenskaber og mekanokemisk regulering af kinesiner og dyneiner. For processer, hvor mikrotubuli fungerer både som last og spor, såsom under filamentglidning i den mitotiske spindel, forstås der imidlertid meget mindre om den biofysiske regulering af ensembler af de involverede tværbindingsproteiner. Her beskriver vi vores metode til direkte sondering af kraftgenerering og respons inden for tværbundne mikrotubulus minimale netværk rekonstitueret fra oprensede mikrotubuli og mitotiske proteiner. Mikrotubulipar er tværbundet af proteiner af interesse, en mikrotubuli er immobiliseret til et mikroskop dækslip, og den anden mikrotubuli manipuleres af en optisk fælde. Samtidig total intern refleksionsfluorescensmikroskopi muliggør multikanalvisualisering af alle komponenterne i dette mikrotubulinetværk, når filamenterne glider fra hinanden for at generere kraft. Vi demonstrerer også, hvordan disse teknikker kan bruges til at undersøge skubbekræfter, der udøves af kinesin-5-ensembler, og hvordan viskøse bremsekræfter opstår mellem glidende mikrotubuluspar tværbundet af den mitotiske MAP PRC1. Disse assays giver indsigt i mekanismerne for spindelsamling og funktion og kan tilpasses mere bredt til at studere tæt mikrotubulusnetværksmekanik i forskellige sammenhænge, såsom axon- og dendritter af neuroner og polære epitelceller.

Introduction

Celler anvender mikrotubulusnetværk til at udføre en lang række mekaniske opgaver, lige fra vesikeltransport 1,2,3 til kromosomadskillelse under mitose 4,5,6. Mange af de proteiner, der interagerer med mikrotubuli, såsom de molekylære motorproteiner kinesin og dynein, genererer kræfter og reguleres af mekaniske belastninger. For bedre at forstå, hvordan disse kritiske molekyler fungerer, har forskere anvendt enkeltmolekyle biofysiske metoder, såsom optisk fangst og TIRF-mikroskopi, til direkte at overvåge kritiske parametre såsom ubelastede trinhastigheder, processivitet og krafthastighedsforhold for individuelle proteiner. Den mest almindeligt anvendte eksperimentelle geometri har været at fastgøre motorproteiner direkte til fangstperler, hvis sfæriske geometri og størrelse efterligner vesikler, der gennemgår motordrevet transport. Talrige kinesiner, herunder kinesin-1 7,8,9, kinesin-2 10,11,12, kinesin-3 13,14,15,16 kinesin-517,18, kinesin-8 19,20 samt dynein- og dyneinkomplekser21,22, 23,24,25, er blevet undersøgt med disse metoder.

I mange cellulære processer bruger motoriske og ikke-motoriske proteiner imidlertid mikrotubuli både som spor og last26,27. Desuden fungerer disse proteiner i disse scenarier, hvor mikrotubulifilamenter er tværbundet i højere ordens bundter, som ensembler snarere end enkeltenheder. For eksempel inden for delende somatiske celler organiserer tætte filamentnetværk sig selv for at opbygge det mitotiske spindelapparat28,29,30. Det interpolære spindelmikrotubulinetværk er meget dynamisk og er stort set arrangeret med minusender, der peger mod spindelpolerne og plus-ender overlapper nær spindelækvator. Filamenter i spindlen er tværbundet af motorproteiner såsom kinesin-5 31,32,33, kinesin-12 34,35,36 og kinesin-1437,38,39 eller af ikke-motoriske proteiner såsom PRC1 40,41,42,43 eller NuMA 44,45, 46. De bevæger sig ofte eller oplever mekanisk belastning under processer som polflux eller mens de koordinerer kromosomcentrering under metafase eller kromosomadskillelse under anafase 47,48,49,50,51,52. Integriteten af spindelapparatet i mikronskala gennem mitose er derfor afhængig af en omhyggeligt reguleret balance mellem skubbe- og trækkræfter, der genereres og opretholdes af dette netværk af interagerende filamenter. Imidlertid er de nødvendige værktøjer til at undersøge denne mekaniske regulering og forklare, hvordan proteinensembler arbejder sammen for at koordinere mikrotubulusbevægelser og producere de kræfter, der er nødvendige for korrekt at samle spindlen, først for nylig blevet udviklet, og vi er lige begyndt at forstå de biofysiske regler, der definerer dynamiske mikrotubulusnetværk.

Målet med dette manuskript er at demonstrere de trin, der kræves for at rekonstituere tværbundne mikrotubulipar in vitro, immobilisere disse bundter i et mikroskopikammer, der muliggør samtidig fluorescensvisualisering af både mikrotubuli og tværbindingsproteiner og nanoskala kraftmåling og behandle disse data robust. Vi beskriver de trin, der er nødvendige for stabilt at polymerisere fluorescensmærkede mikrotubuli, forberede mikroskopdæksler til fastgørelse, forberede polystyrenperler til optiske fangsteksperimenter og samle tværbundne filamentnetværk, der bevarer deres in vivo-funktionalitet , samtidig med at de giver mulighed for direkte biofysisk manipulation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fremstilling af mikrotubuli

BEMÆRK: Ved anvendelse af GFP-mærkede tværbindingsproteiner, rød (f.eks. Rhodamin) og far-rød (f.eks. Biotinyleret HiLyte647, kaldet biotinyleret langt rød i resten af teksten) fungerer organisk fluoroformærkning af mikrotubuli godt. Minimal krydstale mellem alle tre kanaler kan opnås under billeddannelse ved hjælp af et højkvalitets quad band total intern refleksionsfluorescens (TIRF) filter.

  1. Forbered GMPCPP mikrotubulusfrølagre
    1. 1 mg umærket frysetørret tubulin suspenderes i 84 μL iskold 1x BRB80 (80 mM RØR, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA; pH 6,8), med DTT tilsat til en slutkoncentration på 1 mM lige før brug. 60 μg fluorofonmærket lyofiliseret tubulin ophænges i 6 μL kold 1x BRB80 med 1 mM DTT. Suspender 60 μg biotinmærket frysetørret tubulin i 6 μL kold 1x BRB80 med 1 mM DTT.
    2. For at forberede ikke-biotinyleret rhodaminmærket tubulinfrøbestand med et mærkningsforhold på 1:10 tilsættes 84 μL umærket tubulin, 6 μL fluorophoremærket tubulin og 10 μL 10 mM GMPCPP-stamopløsning til et 0,5 ml rør. Bland godt ved forsigtigt at pipettere og hold dig på is.
      BEMÆRK: GMPCPP-polymerisation foretrækkes til disse assays, da mikrotubuli er mere stabile og modtagelige for direkte manipulation med den optiske fælde, end hvis de polymeriseres med GTP, eller hvis taxol udelades.
    3. For at forberede biotinyleret langt rødmærket tubulinfrøbestand med et fluorescerende mærkningsforhold på 1:10 tilsættes 80 μL umærket tubulin, 6 μL fluorophoremærket tubulin, 4 μL biotinmærket tubulin og 10 μL 10 mM GMPCPP-stamopløsning i et 0,5 ml rør. Bland godt ved forsigtigt at pipettere og hold dig på is. Inkuber frøbestanden på is i 5 min.
    4. Tubulinopløsningen overføres til et polycarbonatrør, der er egnet til højhastighedscentrifugering. Centrifuger frøstammen ved ~ 350.000 x g i 5 minutter ved 2 ° C for at forhindre mikrotubulipolymerisation og genvinde supernatanten til aliquoting. Den endelige estimerede koncentration af tubulin på dette stadium er ~ 50 μM.
    5. Ved hjælp af 0,2 ml PCR-rør fremstilles 2 μL aliquots af frøbestanden og flashfryses med flydende nitrogen. Aliquots kan opbevares ved -80 °C i op til 6 måneder.
  2. Polymerisering af mikrotubuli
    1. Forbered 500 μL 1x BRB80 og læg dem på is. Placer en hver af de biotinylerede langt røde og ikke-biotinylerede rhodaminfrøbestand aliquots på is for at tø op.
    2. Inkuber frøbestandene på is i 5 min. Ved afslutningen af inkubationsperioden tilsættes straks 26 μL 1x BRB80 til hvert rør. Hvis der ønskes længere mikrotubuli, øges volumenet af BRB80 med 5-10 μL, mens volumenet til polymerisation reduceres med 5 μL for kortere mikrotubuli.
    3. Der inkuberes mikrotubulifrøbestandene i 1 time ved 37 °C i et vandbad. Kombiner 298,5 μL stuetemperatur 1x BRB80 og 1,5 μL 4 mM taxol-lageropløsning for at producere en 20 μM taxolopløsning. Forbered 300 μL 1x BRB80 og hold begge rør ved stuetemperatur.
    4. En passende højhastighedsrobor opvarmes til 30 °C. Dette kan gøres i en bordplade ultracentrifuge indstillet til 30 °C. Fjern mikrotubuli fra vandbadet og hold ved stuetemperatur på en bordplade i 10-15 min.
  3. Afklaring af mikrotubuli
    1. Tilsæt 100 μL stuetemperatur 1x BRB80 til mikrotubulivækstopløsningen og bland ved at svirpe røret ~ 10 gange eller forsigtigt pipette. Overfør mikrotubulusvækstopløsningen til et polycarbonatcentrifugerør.
    2. Marker den ene side af polycarbonatrøret, som vender udad i forhold til centrifugens rotation. Dette vil hjælpe med at lokalisere mikrotubuluspillen, som næppe vil være synlig på grund af det lille volumen materiale.
    3. Mikrotubuliopløsningen centrifugeres ved ~350.000 x g i 10 minutter ved 30 °C. Efter centrifugering inspiceres røret, der indeholder mikrotubuli, for en pille, hvis det er muligt. Fjern alle undtagen de sidste par mikroliter væske forsigtigt uden at forstyrre pelleten. Hvis pelleten ikke er tydeligt synlig, skal du bruge markeringen som vejledning for at undgå at forstyrre det område, hvor pelleten er placeret.
    4. Tilsæt straks 100 μL 1x BRB80 + 20 μM taxol til mikrotubulirøret. Dette kan tilsættes direkte på pellet; Forstyrrelse af pelleten på dette stadium påvirker ikke afklaringsprocessen væsentligt.
    5. Centrifuger mikrotubuli igen ved ~350.000 x g i 10 min., og sørg for at sikre, at den markerede del af røret igen er orienteret udad i forhold til centrifugens rotation.
    6. Fjern alle undtagen et par mikroliter opløsning som før, og vær igen forsigtig med at undgå at forstyrre mikrotubuluspillen. Gentag trin 1.3.4.-1.3.5. og suspenderer derefter mikrotubuluspillen i 20-50 μL 1x BRB80 + 20 μM taxol.
    7. Resuspender ved at pipette det meste af resuspensionsvolumenet op og forsigtigt skubbe det direkte ud på pelleten, gentage 20-30x eller indtil pelleten er fuldt resuspenderet. Dette skal gøres med forsigtighed for ikke at skære mikrotubuli ved alt for kraftig pipettering. Skæring af pipettespidsen for at øge åbningens størrelse kan også være nyttigt for at reducere mikrotubulusklipning.
    8. Opbevar mikrotubuli ved stuetemperatur ved at pakke røret ind i folie for at beskytte fluoroforerne mod lys og holde sig på bordpladen. Mikrotubuli kan generelt bruges i 2-3 dage efter afklaring.
  4. Vurdering af mikrotubuli gennem mikroskopi
    1. Der fremstilles en 1:10 fortynding af den klargjorte mikrotubuliopløsning ved at blande 1 μL mikrotubuli og 9 μL stuetemperatur 1x BRB80. Forestil dig straks denne opløsning ved at pipettere 10 μL på et mikroskopglas og derefter placere en dæksel over dråben for at danne en squash.
    2. Sørg for, at mikrotubuli i længder fra 8-25 μm ved en høj densitet (flere hundrede pr. fuldt synsfelt lagdelt i et tæt meshwork) er synlige, når de visualiseres ved hjælp af fluorescensmikroskopi og et 100x mål fokuseret på dækslipoverfladen i kontakt med mikrotubulusfortyndingen.

2. Udarbejdelse af passiverede dæksedler

  1. Vask af dæksler
    1. Anbring 18 mm x 18 mm dæksletrør i ikke-reaktive plaststativer, og placer derefter hvert stativ i et 100 ml bægerglas. Placer en dækseddel pr. spalte i stativerne, da det er nødvendigt at rengøre begge sider af dæksedlerne.
    2. Sonicat ved hjælp af en badesonikator i 5 minutter ved hjælp af 50 ml af følgende opløsninger i den rækkefølge, der er angivet for hver sonikeringscyklus: (1) deioniseret vand (med 18,3 MΩ-cm resistivitet), (2) 2% mikro-90-opløsning, (3) deioniseret vand, (4) frisklavet 0,1 M KOH, (5) deioniseret vand (figur 1A). Sørg for, at dækslikkerne er helt dækket af væske. Mellem sonikeringscyklusser skylles hvert rack af dækslips i deioniseret vand ved hjælp af pincet til at dyppe stativet op og ned 10-20x i deioniseret vand, udskift vandet og gentag skylleprocessen 2x.
    3. Skyl dækslerne 3x i vand, fyld derefter bægerglassene med 100% ethanol, og sæt stativerne tilbage til bægerglassene. Flyt bægerglassene til en stinkhætte, og læg nok servietter ud til at gøre plads til alle dækselerne. Fjern derefter stativerne med pincet og læg dem på servietterne.
    4. Brug en tør nitrogengasstrøm til at blæse ethanolen af dækslerne og deres stativer, indtil de er tørre. Bortskaf den resterende ethanol fra bægerglassene og tør dem på samme måde ved hjælp af den tørre nitrogengasstrøm (figur 1A).
  2. Aminosilan overfladefunktionalisering på dækslips
    1. Forbered (3-aminopropyl)tiethoxysilan (APTES) reagensopløsning ved at tilsætte 40 ml acetone og 400 μL APTES-reagens til et 50 ml konisk rør, tætsluttes tæt og blandes ved at invertere 10x.
    2. Flyt et rack med dæksler ind i det tilsvarende tørre bægerglas, og dyk derefter helt ned i APTES-opløsning. Inkuberes i 5 minutter (figur 1A). Flyt det APTES-behandlede stativ til et nyt tørbægerglas, og flyt et nyt stativ ind i APTES for at inkubere i 5 m.
    3. Skyl det behandlede stativ med deioniseret vand ved at dyppe stativet 10-20x som beskrevet i trin 2.1.2., og udskift vandet 5x. Gentag, indtil alle dækslikkerne er blevet behandlet og vasket.
  3. PEGylering af aminosilan overflade
    1. Forbered to PEG-opløsninger, en på ~ 100 μL med 25% w / v PEG og en anden på ~ 10 μL med 10% w / v biotin-PEG, begge suspenderet i frisklavet 0,1 M NaHCO3, tilstrækkelig til at belægge 24 dæksler. Centrifuge 25% PEG-opløsningen ved 3.000 x g i 20 s, når 0,1 M NaHCO3 er tilsat for at opløse PEG helt; Løsningen kan forblive overskyet. Biotin-PEG blandes ved blid pipettering (figur 1B).
    2. Der fremstilles en blanding af PEG- og biotin-PEG-opløsningerne med 33,3 gange volumen PEG til 1 volumen biotin-PEG (f.eks. 100 μL PEG-opløsning og 3 μL biotin-PEG-opløsning).
    3. I en røghætte skal du lægge flere sterile og fnugfrie klude. Flyt dækselerne på kludene og føntør med en tør nitrogengasstrøm som før. På flere nye og tørre klude skal du lægge de nu fuldt tørrede dæksedler arrangeret parvis og mærke hver i nederste højre hjørne med et asymmetrisk symbol som "b". Denne mærkning vil være modsat prøveoverfladen på dækslippet og vil ikke forstyrre eksperimentet (figur 1B).
    4. Vend en dækseddel i hvert par med en pincet. På hver omvendt dækseddel anbringes 6 μL PEG/biotin-PEG-blanding, og den anden dækseddel placeres ovenpå, så begge "b"-etiketter vender udad.
    5. Juster dækkanterne, og læg dem i et befugtet og lufttæt kammer for at forhindre tørring. Inkuber dækslerne i fugtighedskammeret ved stuetemperatur i 3 timer.
    6. Efter inkubation skal du fjerne dækslikkerne fra fugtighedskammeret, forsigtigt adskille dækslipparrene og placere dem tilbage i deres stativer. Vask hvert stativ i deioniseret vand som før, dypp stativerne med pincet 10-20x og udskift vandet i alt 5x.
    7. Placer alle PEGylated sider af dækslikkerne i samme retning, så ikke to PEGylated coverslip-overflader vender mod hinanden. PEGylated overfladen vil være meget klæbrig, indtil den tørrer helt, så vær ekstra forsigtig med at forhindre dækslerne i at røre ved. Tør hvert stativ og dæksler som før ved hjælp af en tør nitrogengasstrøm (figur 1B).
    8. Når dækslikkerne og deres stativer er tørret helt, opbevares de i en vakuum ekssikkator for at forhindre nedbrydning af overfladebelægningen. Opbevares korrekt under vakuum og med tørremiddel for at forhindre fugt i at forstyrre PEG-belægningen; Coverslips kan bruges i ca. 1 uge.

3. Fremstilling af kinesinbelagte perler

  1. Udvælgelse og forberedelse af rigor kinesin konstruktion
    1. Ekspres og rens rigor kinesin konstruktioner i henhold til offentliggjorte protokoller53,54. Flash fryser 5 μL aliquoter af 0,02 mg/ml kinesinopløsninger og opbevares ved -80 °C i op til 1 år.
      BEMÆRK: Rigor kinesinproteiner har en G234A-punktmutation, der forhindrer ATP-hydrolyse. Når de konjugeres til mikroperler, tillader interaktioner med høj affinitet med mikrotubuli perler at opretholde belastninger på 10-20 pN i flere minutter. Strenge muterede versioner af både den almindeligt anvendte kinesin-1 homodimer K56053 og en yderligere optimeret K439 konstruktion 55 er også blevet anvendt med succes i disse assays54. Denne forbedrede K439-konstruktion indeholder et EB1-dimeriseringsdomæne for at forbedre stabiliteten og et C-terminal 6-Him-tag til specifik binding til et 6-His antistof, som beskrevet nedenfor.
  2. Binding 6-Hans antistof mod streptavidinbelagte perler
    1. Tilsæt 50 μL streptavidinbelagte polystyrenperler med en diameter på 1 μm i et 0,5 ml centrifugerør. Sonicate til 30 s.
    2. Tilsæt 10 μL 200 mM DTT til 790 μL 1x BRB80. Tilsæt 10 μL sonikerede perler til 40 μL af denne 1x BRB80 + 2,5 mM DTT-buffer.
    3. Kombiner 1 μL biotinyleret 6-His antistof og 49 μL 1x BRB80 + 2,5 mM DTT; hvirvel kort at blande.
    4. Kombiner 50 μL fortyndet perleblanding og 50 μL antistoffortynding i et nyt rør. Røret anbringes i en rørrotator ved 4 °C, og der roteres i 1 time. Drej perleblandingen ned i 10 minutter ved 3.000 x g ved 4 °C.
    5. Supernatanten pipetteres, og pelleten gensuspenderes i 100 μL 2 mg/ml kaseinopløsning i 1x BRB80. Gentag denne centrifugering og resuspension 2x.
  3. Tilsætning af rigor kinesin
    1. Den endelige pellet gensuspenderes i 100 μL 2 mg/ml kaseinopløsning. I et 0,5 ml centrifugerør kombineres 5 μL 0,02 mg / ml rigor kinesin og 5 μL perler, blandes forsigtigt ved let at svirpe røret ~ 10x.
    2. Hold både K439 G234A perleophæng og de resterende 6-Hans perler på rotoren ved 4 °C, når de ikke er i brug. Perler skal tilberedes friske og bruges samme dag til eksperimenterne, da de har tendens til at klumpe sig sammen og miste aktivitet ud over dette tidspunkt.

4. Samling af mikroskopikammeret

  1. Forberedelse af glasrutschebaner og kammerkonstruktion
    1. Skyl 75 mm x 25 mm mikroskopglasglas først med ultrarent vand, efterfulgt af ammoniakglasrens uden striber og derefter igen med ultrarent vand. Ryst for at fjerne overskydende vanddråber. Tør diasene ved hjælp af en nitrogenstrøm, så der ikke er striber tilbage, og læg diasene ned på et papirhåndklæde (figur 2A).
    2. Med saks skæres dobbeltsidet tape i strimler på ~ 2-3 mm x 2,5 cm (2 strimler pr. Enkelt kammer og 3 pr. Dobbeltkammer).
    3. Brug tang til at lægge to strimler tape på et glasglasglas, så der er ~ 0,5 cm plads imellem dem for at konstruere et enkelt kammer. Til dobbeltkamre skal du bruge den samme afstand, men med tre bånd (figur 2B). Volumenet af prøvekanalen ved anvendelse af denne metode er ca. 10 μL.
      BEMÆRK: Jo bredere kammeret /kamrene er, desto mere sandsynligt er det, at der dannes bobler, når opløsninger strømmer ind; Kamre, der er mindre end 0,5 cm brede, kan dog være udfordrende at bruge på grund af det reducerede areal til billeddannelse.
    4. Skrab over længden af hver båndstrimmel ved hjælp af tang, så båndet klæbes fast til glasglasset.
    5. Slip trykket fra ekssikkatoren, og brug tang til at fjerne en biotinyleret dæksel fra et opbevaringsstativ. Placer en biotinyleret dæksel oven på glasrutsjebanen ved hjælp af tang. Sørg for, at den biotinylerede side vender indad mod glasrutsjebanen.
    6. Brug den flade bagende af tangen til forsigtigt at trykke på glasset, hvor dækslikket berører båndet for sikkert at forsegle kamrene. Der skal anvendes let tryk for at sikre, at dækslippet ikke revner (figur 2C).
    7. Opbevar de færdige mikroskopikamre i en lufttæt beholder væk fra direkte lys indtil brug (figur 2D).
      BEMÆRK: Det anbefales at bruge kamre samme dag, som de fremstilles, da de biotinylerede dæksler nedbrydes, når de udsættes for luft.
  2. Indstrømning af mikroskopireagenser
    1. Konstruer et fugtighedskammer ved at placere et sammenfoldet fnugfrit væv fugtet med ultrarent vand i bunden af en tom pipettespidskasse. Prøvekamrene skal opbevares i denne boks mellem indstrømningstrin for at reducere fordampningen af opløsninger fra kanalen.
    2. Indfør alle reagenser ved at pipettere væsken i den ene ende af kanalen og transportere væske ud i den modsatte ende. For at væge skal du dreje den ene ende af vævet og forsigtigt placere det på udgangssiden af kammeret, hvilket giver mulighed for kapillær virkning for homogent at fordele reagenset (figur 3A). Bring alle reagenser til stuetemperatur lige før de strømmer ind for at forhindre mikrotubulusdepolymerisering.
    3. Ved hjælp af en 20 μL vinklet pipettespids, så den berører indgangssiden af et kammer, flydes langsomt i 10 μL 0,5 mg / ml streptavidin eller Neutravidin. Brug mindre pipettespidser og en langsom, konstant indstrømning af reagenser for at mindske sandsynligheden for at opnå bobler i kammeret (figur 3B).
    4. Inkuber glideren i fugtighedskammeret i 4 minutter med dækselsiden af kammeret nedad. Denne orientering gør det muligt for større genstande, såsom mikrotubuli eller perler, at synke nær PEGylated overfladen.
    5. Skyl kammeret ud ved hjælp af 20 μL 1x BRB80 ved hjælp af et fnugfrit væv til at trække væsker ud. Hvis der er en lækage til stede i kammeret, skal du kassere diaset og starte med en anden; Små bobler, der opstår i kammeret, vil ikke påvirke billeddannelsen negativt.
    6. Indstrømnings-, inkubations- og skylletrinnene gentages med 10 μL 0,5 mg/ml kaseinblokerende opløsning (figur 3C). Fortynd biotinylerede langt røde mikrotubuli ~ 1:20 og flyd 10 μL ind i kammeret. Inkuberes i 5 minutter og skylles kammeret med 20 μL 1x BRB80 (figur 3D). Den optimale tæthed af disse mikrotubuli inden for et billedsynsfelt på 100 μm x 100 μm bør være 10-20; og fortyndingen på dette stadium bør justeres for at opnå dette overfladebindingsforhold.
    7. Gentag indstrømnings-, inkubations- og skylletrinnene med 10 μL af en passende koncentration (typisk 1-10 nM) tværbindingsmotor eller ikke-motorisk protein, der skal undersøges (figur 3E).
    8. Flow i 10 μL rhodaminmikrotubuli fortyndet til en lignende koncentration som de tidligere biotinylerede farrøde mikrotubuli. Gentag inkubations- og skylletrinnene (figur 3F).
    9. Kombiner 1 μL rigor kinesinbelagte perler og 19 μL reaktionsbuffer optimeret til tværbindende proteinaktivitet. Til analyse af kinesin-5-aktivitet anvendes reaktionsbuffer med 1 mM TCEP-bindingsbryder, 0,2 mg/ml alfakasein, 70 mM KCl, iltrensningssystem (4,5 mg/ml glucose, 350 enheder/ml glucoseoxidase, 34 enheder/ml katalase), 1 mM DTT og ATP i den ønskede koncentration (f.eks. 1 mM for maksimale kinesinhastighedsbetingelser) i 1x BRB80 (figur 3G ). Til analyse af ikke-motoriske proteiner udelades ATP og varierer koncentrationen af KCl for at modulere protein-mikrotubulusinteraktionsstyrken i disse assays.
    10. Forsegl begge kanter af kammeret med klar neglelak, og vent, indtil poleringen tørrer inden billeddannelse (figur 3H). Et vellykket konstrueret kammer vil ikke have nogen lækage til stede og minimale bobler.

5. Billeddannelse mikrotubuluspakker med 3-farve TIRF

  1. Anvend et omvendt mikroskopinstrument, der har TIRF-billeddannelsesfunktioner, og hvori der er konstrueret en optisk enkeltstrålefælde (figur 4).
    BEMÆRK: Til de undersøgelser, der er beskrevet her, blev der anvendt et omvendt mikroskop med en 100x / NA1.49 olieobjektivlinse, TIRF-modul og tre lasere ved henholdsvis 488 nm, 561 nm og 640 nm til GFP-mærket protein, rhodaminmærket mikrotubuli og biotinylerede langt rødmærkede mikrotubuli.
    1. Tilsæt en dråbe nedsænkningsolie på dækslikket på prøvekammeret. Overdreven olie kan beskadige mikroskopmålet. Med dæksiden af prøvekammeret nedad anbringes prøven, der skal afbildes, på mikroskopplatformen.
    2. Bring langsomt målet op, så der er kontakt mellem både dækslen og målet gennem olien. Juster målhøjden, så prøvekammerets dæksluseflade er i fokus.
    3. Optag enkeltrammebilleder af prøven i alle tre kanaler. Til eksperimenterne her skal du bruge 100-200 ms eksponering som en optimal billeddannelsesvarighed på tværs af alle tre kanaler; længere eksponeringstider kan resultere i øget fotoblegning.
    4. Juster lasereffekten for at opnå et godt signal-støj-forhold fra prøverne, mens du minimerer fotoblegning over de 2-5 minutter, når det enkelte bundt analyseres. For den laser, der anvendes her (figur 4 og figur 5), skal du bruge en lasereffekt på 5 mW til GFP-kanalen og 3 mW til begge mikrotubuluskanaler som optimal.
      BEMÆRK: Succesfuldt monterede bundter skal bestå af en overflade-immobiliseret mikrotubuli i den langt røde kanal, en coextensive region med flere mikron med signifikant GFP-proteinsignal og en rhodaminmikrotubuli, der overlapper disse regioner og derefter strækker sig flere mikron væk fra bundtet (figur 5B, C og figur 6 ). Levende billeddannelse af rhodaminmikrotubuli skal afsløre subtile udsving i den ikke-tværbundne mikrotubulusende, hvilket indikerer, at dette filament ikke er bundet til overfladen eller andre proteiner i kammeret.
    5. Overhold hyppigheden af mikrotubulusbundter pr. Synsfelt. For en vellykket forberedt prøve skal der være ca. 3-4 mikrotubulibundter til stede pr. 100 μL x 100 μL synsfelt pr. Kammer.

6. Udførelse af optiske fældeeksperimenter på mikrotubulibundter

  1. Præeksperimentel kalibrering af betingelser
    1. For at udføre disse eksperimenter skal du bruge en optisk enkeltstrålefælde med en stivhed på 0,05-0,1 pN/nm. Inkorporer fangstoptikken og den positionsfølsomme fotodetektor i et TIRF-kompatibelt omvendt mikroskop ved at indføre kortpasfiltre lige under henholdsvis målet og over kondensatoren (figur 4).
    2. Derudover skal du tilføje et nanopositioneringstrin, hvor prøven sidder, så brugeren kan flytte mikrotubuli med nanometerskala præcision på en kontrolleret måde under disse assays. Systemet, der her bruges til at indsamle repræsentative data, er beskrevet i offentliggjort arbejde 27,53,54,56,57.
      BEMÆRK: Selvom det ligger uden for rammerne af denne protokol, er der flere ressourcer til rådighed, der beskriver konstruktionen og kalibreringen af en optisk enkeltstrålefælde58,59,60.
    3. Overhold tætheden af perler i prøven ved hjælp af en brightfield- eller DIC-kanal og 100x-målet på mikroskopet. Brug kun brightfield-mikroskopi til at identificere og manipulere perler og ikke til samtidig at optage med fluorescensbilledoptagelse. Placer perlerne til at være mindst 10 μm fra hinanden i gennemsnit, og sørg for, at de er fri for enhver form for overfladeindeslutning eller fastgørelse og ikke er fastgjort til hinanden eller på anden måde klynger.
    4. Sørg for, at de biotinylerede langt røde mikrotubuli er fastgjort til overfladen af dækslippet uden synlig brownsk bevægelse, såsom bevægelser langs mikrotubuliaksen eller frie ender af mikrotubuli, der svinger i opløsning.
    5. Sørg for, at rhodaminmikrotubuli er fastgjort til biotinylerede mikrotubuli via tværbindingskortet og er synligt svingende i deres frie ender. Overfladefastgørelse af ikke-biotinylerede mikrotubuli indikerer ofte, at PEGylation kan have været mislykket, eller at PEG-belægningen er nedbrudt.
  2. Motordrevne mikrotubulus glidende målinger
    1. Udtryk og rens det motoriske protein af interesse efter offentliggjorte protokoller. For eksempel er GFP-mærkede kinesin-5-proteiner i fuld længde blevet oprenset med succes og anvendt i disse assays 53,61 samt umærket kinesin-1262 og kinesin-1463. Saml og visualiser motorprotein-tværbundne bundter som beskrevet ovenfor i trin 4 og 5.
    2. Optag med den optiske fælde en gratis enkelt perle i opløsning, der udviser brownsk bevægelse. Juster fældeoptikken efter behov for at flytte perlen til midten af synsfeltet. Sørg for, at det reflekterede interferensmønster fra fældebjælken er symmetrisk, og juster fældeoptikken for at løse eventuelle stråleasymmetrier.
    3. Flyt prøvetrinnet, så den frie ende af en rhodaminmikrotubuli i et bundt er direkte under perlen, og perlen er flere mikron væk fra overlapningsområdet, der indeholder tværbindingsproteiner for at minimere fældestråleinduceret fotoblegning. Sænk perlen i Z-aksen, indtil den kolliderer med mikrotubuli. Pas på at sænke perlen forsigtigt, og skub ikke perlen mod dækfladen, da dette kan medføre, at du klæber til dækslipoverfladen.
    4. Sluk kortvarigt fælden for med brightfieldkanalen at observere bevægeligheden af perlen, der er fastgjort til glidemikrotubuli. Når der udføres motorproteinassays, vil den vedhæftede perle bevæge sig retningsbestemt, når mikrotubuli glider fra hinanden. Genaktiver fælden og fang perlen igen.
    5. Begynd at registrere fluorescensdata i de tre (488 nm, 561 nm, 640 nm) kanaler med en hastighed på 1-2 billeder pr. s ved hjælp af lasereffekt- og eksponeringstiderne, der blev optimeret i trin 5 ovenfor.
    6. Ved hjælp af diffuseringscomputersoftwaren skal du registrere spændingsdata fra den positionsfølsomme fotodetektor (X, Y og SUM-intensitetssignaler), nanopositioneringstrinnet (X, Y og Z-koordinater) og TIRF-kameraets lukkertilstand. Begynd at digitalisere disse fældespændingsværdier ved hjælp af et dedikeret spændingsindtastningsdataindsamlingskort, der styres af passende software (såsom specialskrevet LabView-kode) med en hastighed på 1-10 kHz, afhængigt af de eksperimentelle krav.
    7. Overvåg kraftsignalet, når data indsamles, og vær meget opmærksom på eventuelle uregelmæssigheder, der kan forstyrre en vellykket dataindsamling.
      BEMÆRK: Anomalierne omfatter, men er ikke begrænset til, (1) andre perler, der bevæger sig ind i fælden, (2) perlen, der undslipper fælden for tidligt, og (3) pludselige kraftfald og efterfølgende manglende genoptagelse af kraft mod fælden, hvilket indikerer problemer med strengheden kinesinmolekyler på overfladen af perlen.
    8. Efter måling deaktiveres fælden for at frigive perlen og gentages med en ny perle og ny mikrotubuli, indtil det krævede antal eksperimentelle gentagelser er opnået.
  3. Passive tværbindingsmodstandsmålinger
    1. Udtryk og rens de ikke-motoriske tværbindingsproteiner af interesse efter offentliggjorte protokoller. For eksempel er GFP-mærket PRC1 43,54,57 i fuld længde og en dimerisk NuMA-afkortet konstruktion 56 med succes blevet anvendt i disse assays. Saml og visualiser de tværbundne bundter som beskrevet ovenfor i trin 4 og 5.
    2. Identificer et egnet mikrotubulusbundt, der kun indeholder to mikrotubuli, et biotinyleret med fuld overfladefastgørelse og et ikke-biotinyleret mikrotubuli, der er delvist frit i opløsning; dette giver en fri ende til at fastgøre en perle og garanterer, at perlen ikke er fastgjort til den overfladebundne mikrotubuli og er justeret på enten X- eller Y-aksen, således at scenebevægelsen kun vil være langs en akse.
    3. Brug den optiske fælde til at fange en fri perle, der gennemgår brownsk bevægelse. Når perlen er fanget, skal du forsigtigt flytte perlen over til det valgte mikrotubulibundt, hvilket sikrer, at ingen andre perler trækkes i fælden i processen. Sørg for, at perlen er flere mikron væk fra overlapningsområdet, der indeholder tværbindingsproteiner for at minimere fotoblegning af GFP-mærket.
    4. Sænk forsigtigt perlen i Z-aksen, indtil den kommer i kontakt med kanten af det frie segment af rhodaminmikrotubuli. Træk forsigtigt op, og bevæg dig vinkelret på mikrotubulaksen, for at kontrollere, om der er fastgørelse ved at observere rhodaminmikrotubulusbøjningen og følge perlepositionen. Hvis den ikke er fastgjort, skal du gentage perlens blide stødning på mikrotubuli, indtil den er fastgjort.
    5. Juster omhyggeligt rhodaminmikrotubuli langs mikrotubuliaksen i den overfladebundne mikrotubuli ved at flytte nanopositioneringstrinnet og indstille parametrene til automatiseret træk af mikrotubulusbundtet. Indstil retningen langs mikrotubuli parallelle akse, indstil den ønskede trækhastighed (25-200 nm / s er et nyttigt hastighedsområde) og ønsket træktid (ca. 30 s til 2 minutter) afhængigt af overlapningslængden.
    6. Begynd at registrere fluorescensdata i de tre (488 nm, 561 nm, 640 nm) kanaler med en hastighed på 1-2 billeder i sekundet. Brug laserkræfter og eksponeringstider optimeret i trin 5 ovenfor.
    7. Start automatiseret scenebevægelse, og optag diffuseringsdata fra den positionsfølsomme detektor, scene og TIRF-kameratilstand. Overvåg for eventuelle faktorer, der kan forstyrre dataindsamlingen, som omfatter, men ikke er begrænset til, (1) en anden perle, der kommer ind i fælden, (2) for tidligt tab af mikrotubuluskrydsbinding eller (3) perleløsrivelse fra rhodaminmikrotubuli.
    8. Deaktiver fælden for at frigøre perlen, og gentag eksperimentet efter ønske. Et typisk prøvekammer kan bruges i ca. 30 minutter, før nedbrydning af bundterne og tab af proteinaktivitet opstår.
      BEMÆRK: Nedbrydningseffekter vil variere efter anvendt tværbinding, men kan manifestere sig som dannelse af statisk puncta på enten mikrotubuli eller overflade, tab af mikrotubulusudsving, der indikerer ikke-specifik binding, eller manglende evne til stabilt at fastgøre perler til mikrotubuli.

7. Analyse af data og korrelation af fluorescensbilleder med optiske fældeoptegnelser

BEMÆRK: For at optimere dataindsamlingen er det fordelagtigt at anvende to separate computerstyringssystemer: et til den optiske fangstsoftware og et andet til fluorescensbilleddannelsen. Denne opsætning giver mulighed for højhastighedsdataindsamling i både eksperimentelle modaliteter og eliminerer nano- og mikrosekundforsinkelser i driftsudførelsen, der introduceres til dataene, som kan opstå, når du bruger en enkelt CPU.

  1. Digitaliser de optiske fangstdata med en hastighed, der er optimeret til de anvendte motoriske eller ikke-motoriske tværbindingsproteiner og deres forventede trinhastigheder (f.eks. typisk mellem 1-10 kHz).
  2. Optag X, Y- og SUM-spændingssignaler fra den positionsfølsomme fotodetektor samt X, Y- og Z-positionsdataene i nanopositioneringstrinnet ved hjælp af dedikeret software til styring af den optiske fælde og prøveudtagning af de digitale spændingssignaler fra disse komponenter.
  3. Optag det digitale signal i lukkeråben tilstand fra kameraet med en ekstra spændingsindgangskanal på det optiske opsamlingsdataindsamlingskort. Dette giver mulighed for korrelation af fluorescensbilleddataene med de optiske fangsttidsspor. Begynd dataindsamling med den optiske fælde inden initiering af billeddannelse, så kamerasignalet fra det første billede optages korrekt.
  4. Gennemsnit de rå tidsseriedata, der er erhvervet ved høje prøveudtagningshastigheder ved hjælp af en passende filtreringsmetode, såsom glidende vindue, medianfilter eller gaussisk filter, afhængigt af behov.
  5. Kvantificer fluorescensbilledets tidsseriedata ved hjælp af metoder som linecan-analyse, hvor pixelintensitetsværdien langs længden af mikrotubulusområdet beregnes. Fra disse linjerkan baner, identificere mikrotubuluskanterne og derfor overlapningsregionerne. Derudover skal du bruge fluorescensintensiteten fra crosslinker-proteinkanalen til at beregne proteinlokalisering, koncentration og densitet.
  6. Korrelation af kraft- og billeddata er et væsentligt output af dette eksperimentelle system. Vælg og gennemsnit alle kraftdatapunkter inden for et givet kameraeksponeringsområde (angivet med den tilsvarende digitale signalspids i kamerakanalen) for direkte at sammenligne med den tilsvarende fluorescensbilledramme. Derefter ekstraheres forholdet mellem kraftstørrelse og antallet af tværbindingsproteiner, overlapningslængde eller tværbindingsfordeling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Fremstillingen af mikrotubulusbundter, der er egnede til biofysisk analyse, betragtes som vellykket, hvis flere af nøglekriterierne er opfyldt. For det første skal billeddannelse i tre farver afsløre to justerede mikrotubuli med en koncentration af tværbindingsprotein, der fortrinsvis dekorerer overlapningsområdet (figur 5B, C og figur 6B). Ideelt set bør afstanden mellem overlapningskanten og den frie ende af rhodaminmikrotubuli være mindst 5 μm for at give tilstrækkelig fysisk plads mellem fangststrålen og de fluorescensmærkede proteiner. For det andet bør der være minimalt baggrundsfluorescenssignal i regioner, der mangler biotinylerede langt røde mikrotubuli, især fra den samme kanal, som det tværbindende protein er mærket med. Høj baggrundsfluorescens er tegn på dårlig coverslip-passivering og en høj koncentration af glasbundne proteiner, som sandsynligvis vil interagere ikke-specifikt med mikrotubuli eller fangstperle. Derudover antyder tilstedeværelsen af små runde puncta eller korte fragmenter set i en af mikrotubulusbilledkanalerne, at mikrotubuluspolymerisation og afklaring ikke lykkedes, eller at mikrotubuli var ældet eller beskadiget.

For det tredje skal de perler, der bruges til fældefangst, fremstå som enkeltperler og ikke i klumper, der indeholder mange perler. Det er sandsynligt, at en lille brøkdel af perler irreversibelt klæber til overfladen, men en betydelig brøkdel skal observeres som individuelle partikler, der diffunderes i prøvekammeret. Overdreven klumpning kan ofte lindres ved at sonikere perlerne i mindst 10 minutter, før de strømmer ind i kammeret. For det fjerde bør fastgørelse af en perle til en mikrotubuli resultere i god fastgørelse, hvor perlen forbliver bundet, når det fældende laserlys er lukket. Perlerne bør ikke klæbe uspecifikt, når de kommer i kontakt med overfladen, og når en perle er fastgjort til mikrotubuli, skal det være muligt let at manipulere (f.eks. Bøje eller bøje) filamentet let inden måling. Endelig bør det være muligt at observere ændringer i overlapningslængden, når der anvendes kraft, eller motorisk aktivitet får lov til at fortsætte. For eksempel, hvis man observerer motorisk proteindrevet glidning, skal overlapningslængden falde med en hastighed, der er i overensstemmelse med hastigheden af motorproteintrin. Hvis man undersøger passive tværbindinger, bør anvendelsen af magt resultere i en ændring i overlapningslængden. Disse output indikerer, at rhodaminmikrotubuli kun er bundet til den overfladebundne mikrotubuli via tværbindende proteiner, snarere end ikke-specifikt klæbende til dækslipoverfladen.

Når disse kriterier alle er opfyldt, er det muligt at udføre en bred vifte af eksperimenter for at udtrække de væsentlige biofysiske parametre, der definerer ensemblemekanik. Dette assay eller lignende assays er blevet brugt i vid udstrækning til at undersøge mitotiske tværbindingsproteiner i tidligere undersøgelser. For eksempel har vi vist, at ensembler af det essentielle mitotiske motoriske protein kinesin-5 kan regulere mikrotubuliglidning ved at generere både skubbe- og bremsekræfter, der skaleres lineært med overlapningslængde64 (figur 5). Mikrotubuli i enten en antiparallel eller parallel geometri blev tværbundet af et lille ensemble af kinesin-5 molekyler. Da disse motorproteiner trådte mod mikrotubulus plus-enderne, blev filamenterne enten gledet fra hinanden (antiparallelle) eller svingede hurtigt frem og tilbage (parallelt). Ved at overvåge mekanikken i denne mini-spindelgeometri fandt vi størrelsen af kraft skaleret både med længden af filamentoverlapning såvel som antallet af tværbindende motorproteiner. Når mikrotubuli blev bevæget med en hastighed, der var hurtigere end kinesin-5's aflæste trinhastighed, gav motorproteinerne en resistiv bremsekraft. Det blev også konstateret, at C-terminal haledomænet er nødvendigt for effektiv tværbinding og kraftgenerering61 (figur 5B, C). Proteinet i fuld længde er i stand til at generere vedvarende kræfter, der plateau, når alle motorproteiner når deres individuelle stallkraft (figur 5D). Kinesin-5-motoren, der mangler sin C-terminalhale, genererer imidlertid maksimale kræfter, der er næsten fem gange mindre i størrelse (figur 5E, F). Sammen afslører disse resultater, hvordan kinesin-5-proteiner arbejder i ensembler for at skubbe mikrotubuli polen under spindelsamling og belyse den biofysiske funktion af essentielle regulatoriske proteindomæner i molekylet.

Vi har også demonstreret, at ensembler af det ikke-motoriske mitotiske protein PRC1 fungerer som en mekanisk dashpot for at modstå mikrotubuliglidning i anafasespindelmidtzoner54 (figur 6A-C). PRC1 genererer friktionsmodstand, der skaleres lineært med trækhastighed, ligesom en mekanisk dashpot producerer hastighedsafhængige resistive kræfter. Disse resistive kræfter afhænger ikke af længden af overlappende regioner mellem mikrotubulipar eller den lokale tværbindingstæthed, men de afhænger stærkt af den samlede koncentration af engagerede PRC1-molekyler (figur 6D, E). Fra disse resultater foreslås det, at PRC1-ensembler fungerer som et utæt stempel, hvor kompression af diffusive tværbindinger producerer en hastighedsafhængig modstand, men tabet af tværbindinger ved mikrotubuli plus-ender lindrer store trykkræfter.

Lignende assaygeometrier blev også brugt til at undersøge det mitotiske kinesin-12 protein Kif1562. Ved at måle den kraft, der blev produceret, da mikrotubuli blev skubbet fra hinanden, fandt Reinemann et al.62 , at Kif15-ensembler kan skubbe filamenter fra hinanden op til en kritisk plateaukraft og kræve proteinets C-terminale halebindingsområde for effektivt at krydse mikrotubuli og opbygge vedvarende belastninger. Reinemann et al. demonstrerede også elegant, at kinesin-14 HSET, en minus-end rettet kinesin, på samme måde kan glide fra hinanden antiparallelle mikrotubuli63. Når HSET blandes med lige store mængder af det plus-end rettede kinesin-5 Eg5-protein, tjener HSET til at hæmme Eg5-glideaktiviteten og deltager i et tovtrækkeri for mikrotubuli-glidende bevægelse inden for overlapningsområdet. Tilsammen demonstrerer disse resultater alle kraften i direkte kraftmåling på tværs af aktive mikrotubulusbundter og tydeliggør behovet for at karakterisere proteinfunktionen i den biologisk passende netværksgeometri.

Figure 1
Figur 1: Passivering af glasslips. (A) Skematisk afbildning af de sekventielle vasketrin, tørring og bøjning af nr. 1.5 glasdæksler til aminosilankonjugation. (B) Skematisk afbildning af protokollen for kovalent sammenkædning af PEG- og biotin-PEG-grupper med glasdækslet, vask og tørring og forsegling af dækslikkerne under vakuum til kortvarig opbevaring. Nogle dele af skemaet er modificerede billeder fra 65. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Samling af et prøvekammer. (A) Skematisk, der viser samlingen af et prøvestrømskammer ved hjælp af passiverede dækslips og en standard 3 i mikroskopglas. (B) Samling og typiske dimensioner af enkelt- og dobbeltkanals flowkamre, der er optimeret til optisk fangst og fluorescensbilleddannelse af mikrotubulibundter. Nogle dele af skemaet er modificerede billeder fra 65. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Generering af overflade-immobiliserede mikrotubulibundter til optisk fangst og TIRF-baseret billeddannelse. Skemaer, der viser den trinvise samling af optisk fældelige mikrotubulibundter. (A) Reagenser strømmer ind fra kammerets indgangsport, og væske ledes ud fra udgangskanalen. (B) Streptavidin (blå) binder først til biotin-PEG-stederne på dækslippen, og (C) kasein (rød) indføres som et yderligere blokeringsmiddel. (D) Biotinylerede langt rødmærkede mikrotubuli (magenta) introduceres og får lov til at inkubere i ~ 5 minutter efterfulgt af tilsætning af (E) tværbindingsprotein (grønt), (F) ikke-biotinyleret rhodaminmærket mikrotubuli (rød) og endelig (G) strengkinesinbelagte mikrosfærer suspenderet i den passende reaktionsbuffer til fastgørelse til bundtet og optisk fældebaseret manipulation. (H) Kammeret er forseglet med klar neglelak for at forhindre fordampning af prøvebufferen under forsøg. Nogle dele af skemaet er modificerede billeder fra 65. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Skematisk over den optiske pincet/TIRF-mikroskopsystem. En enkeltstråle optisk fælde indføres i den optiske bane i et objektivbaseret TIRF-billeddannelsessystem i et omvendt mikroskop. Et kort passfilter indsat lige under målet gør det muligt at dirigere fældestrålen ind i målets bagåbning, hvor den vil blive fokuseret lige over overfladen af prøvedækslet og danne en optisk fælde. En positionsfølsom fotodetektor opsamler det transmitterede lys, hvilket giver mulighed for positions- og kraftdetektion af perlen. Flere kanaler med fluorescensdata kan erhverves via TIRF-billeddannelse og optages på et højfølsomt EMCCD- eller sCMOS-kamera. En bredspektret lyskilde bruges til at afbilde fangstperler under opsætningen af eksperimenterne. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Repræsentativt eksempel på måling af kraftproduktion ved kinesin-5. (A) Skematisk afbildning af den eksperimentelle geometri, der viser mikrotubuli tværbundet af kinesin-5 motorproteiner, der genererer kraft, når de glider filamenterne fra hinanden, som måles med en optisk fælde. Repræsentative fluorescensbilleder af bundter sammensat af overflade-immobiliserede mikrotubuli, GFP-kinesin-5 og rhodaminmærkede transportmikrotubuli. (B) Fuld længde og (C) C-terminal hale afkortede kinesin-5 konstruktioner blev anvendt. Skala søjler = 5 μm. Prøveregistreringer af kraftproduktion for (D) fuld længde og (E) haleløs vises, med gennemsnitlig kraft plottet som en funktion af tiden. (F) Der vises plots af den maksimale plateaukraft og tilsvarende overlapningslængde for begge konstruktioner, hvilket afslører, at kinesinkonstruktionen i fuld længde genererer overlapningslængdeafhængige kræfter, der er væsentligt større i størrelse end den haleløse kinesinkonstruktion. Dette tal er ændret fra61. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Repræsentativt eksempel på måling af friktionskræfter ved PRC1. (A) Skematisk afbildning af den eksperimentelle geometri, der viser mikrotubuli tværbundet af GFP-PRC1 (proteinregulator af cytokinesis) tværbindingsproteiner, der genererer resistens, når filamenterne glider fra hinanden ved at flytte dækslippet med konstant hastighed. (B) Repræsentative tidsseriefluorescensbilleder, der viser de bevægelige overflade-immobiliserede langt røde mikrotubuli, GFP-PRC1-molekyler, der kondenserer inden for krympende overlapning, og den frie rhodaminmikrotubuli, der holdes med perlen. Tidsinterval mellem rammer = 6 s; Skalabjælke = 5 μm. (C) Eksempel på kraftsporing, der viser friktionskraft under glidehændelsen, med forstyrrelseshændelse og kraftfald til nul (~ 55 sek.), når overlapningen nåede 0 μm. (D) Korrelation af middelkraft og integreret GFP-intensitet inden for overlapningen ved fire forskellige glidehastigheder. (E) Gennemsnitlige hældninger og beregnede tilpasningsfejl af spor i (D) afslører, at kraften pr. PRC1-molekyle øges lineært som en funktion af glidehastigheden. Dette tal er ændret fra66. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mikrotubulusnetværk anvendes af utallige celletyper til at udføre en bred vifte af opgaver, der grundlæggende er mekaniske. For at beskrive, hvordan celler fungerer i både sunde og sygdomstilstande, er det afgørende at forstå, hvordan disse mikronskalanetværk er organiseret og reguleret af de nanometerstore proteiner, der kollektivt bygger dem. Biofysiske værktøjer såsom optisk pincet er velegnede til at undersøge mekanokemien af nøgleproteiner i denne skala. Afspejler mangfoldigheden af mikrotubulusnetværksfunktion er komplekse eksperimentelle geometrier, der anvender optisk pincet, blevet udforsket, herunder kraftafhængige analyser af mikrotubulusspidsdynamik67,68, generering af kræfter af kinetochore-komponenter69,70,71 og to-stråle håndvægtsfældegeometrier til sonde mikrotubulifilamentmekanik72,73 . I denne protokol har vi beskrevet nye metoder til rekonstituering af grundlæggende mikrotubulusnetværksmotiver såsom bundter og anvendelse af de biofysiske værktøjer til enkeltmolekylefluorescensmikroskopi og optisk fangst til vurdering af kritisk information om cellulær funktion.

Mens de fleste individuelle trin i denne protokol er teknisk ligetil, er der tilsammen mange potentielle fejlpunkter, der kan opstå, og der skal udvises betydelig omhu på hvert punkt for at sikre vellykkede målinger. For det første, som med mange mikroskopbaserede eksperimentelle assays med et enkelt molekyle, er korrekt overfladepassivering nøglen, da ikke-specifik binding af proteiner eller perler til dækslipoverfladen næsten altid forhindrer en vellykket gennemførelse af disse eksperimenter. For det andet skal ekspressionen og oprensningen af det eller de tværbindende proteiner af interesse optimeres for at sikre enkeltartsprodukter af høj kvalitet, da forurenende stoffer kan forstyrre analysen på mange måder, såsom at inducere overskydende bundtning af filamenter eller forstyrre perle- og mikrotubulifastgørelse, for ikke at nævne at indføre kompleksiteter i fortolkningen af kraftdata. For det tredje kræver opretholdelse af robust perlemikrotubuli fastgørelse af høj kvalitet rigor kinesinmotorer bundet ved høj densitet til fangstperlen, således at der kan laves flere kinesin-filamentfastgørelsespunkter. Disse bindinger kan modstå 10 s pN kraft i flere minutter, hvilket er velegnet til en bred vifte af potentielle studiesystemer, der anvender denne teknik.

Vi bemærker også, at der er mange måder, hvorpå denne protokol kan ændres, så den passer bedst til slutbrugerens instrumenterings- eller biologiske systembehov. Mens vi har beskrevet eksperimenter, der anvender GFP-mærkede tværbindingsproteiner og røde / langt rødmærkede mikrotubuli, er det også muligt at bytte fluorescerende mærkning efter behov. For eksempel, hvis brugeren ikke har nok laserlinjer til at udføre trefarvet TIRF-mikroskopi, er det muligt at få data af høj kvalitet ved differentieret mærkning af mikrotubuli med den samme fluorofor, men ved hjælp af forskellige koncentrationer (f.eks. Svag vs. lys) for hver art mikrotubuli. På samme måde er det måske ikke altid muligt eller fordelagtigt at tilføje en fluorescerende etiket til det tværbindende protein. I denne situation ville visse eksperimentelle oplysninger såsom tværbindingskoncentration eller lokalisering ikke være tilgængelige, men bestemmelsen af parametre såsom mikrotubulusoverlapningslængde kunne stadig foretages. Vi forventer, at denne protokol er meget tilpasningsdygtig til mange forskellige typer og kombinationer af mikrotubulusiske tværbindingsproteiner. Indførelsen af flere tværbindingsproteiner vil sandsynligvis nødvendiggøre enten fjernelse af fluorescensmærker fra et af proteinerne eller udelukkelse af fluorescerende etiketter fra en af de to mikrotubulityper for at frigøre billeddannelsesfunktioner i en passende båndbredde (f.eks. ved hjælp af en rød eller langt rød proteinkodet etiket til tværbindingsproteinet). Det er usandsynligt, at mere end tre fluorescerende kanaler kunne anvendes med dette TIRF-baserede assay, selvom der bestemt er fleksibilitet i, hvordan de fordeles, hvilket bør overvejes nøje, når man planlægger et eksperiment. Endelig er det sandsynligt, at dette assay kan ændres til at studere forskellige netværksgeometrier og typer af cytoskeletal filament. Analysen af mekanikken i mikrotubuliforgrening, medieret af augmin og gamma-tubulinringkomplekset, kunne let undersøges og afbildes. Derudover ville andre tværbundne cytoskeletale netværk, såsom dem, der involverer actin, septiner eller mellemliggende filamenter, være ganske modtagelige for at studere med disse værktøjer, forudsat at der foretages korrekte ændringer og ortogonale fastgørelsesstrategier til dækslip og fangstperle.

Afslutningsvis har vi beskrevet en protokol til rekonstitution af aktive kraftgenererende mikrotubulusnetværk, som kan afbildes ved hjælp af enkeltmolekyle fluorescensmikroskopiværktøjer og manipuleres via en optisk enkeltstrålefælde. Vi har demonstreret nytten af denne metode med datasæt, der afslører ensemblemekanikken i både et mitotisk motorisk og ikke-motorisk protein. Vi forventer, at mange typer højt organiserede mikrotubulusnetværk, såsom dem, der findes i neuroner, epitelvæv eller kardiomyocytter, kan analyseres med disse værktøjer og afsløre nye principper for biofysisk funktion for det dynamiske cytoskelet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker at anerkende støtte fra R21 AG067436 (til JP og SF), T32 AG057464 (til ET) og Rensselaer Polytechnic Institute School of Science Startup Funds (til SF).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10W Ytterbium Fiber Laser, 1064nm IPG Photonics YLR-10-1064-LP
405/488/561/640nm Laser Quad Band Set for TIRF applications Chroma TRF89901v2
6x His Tag Antibody, Biotin Conjugate Invitrogen #MA1-21315-BTIN
Acetone, HPLC grade Fisher Scientific 18-608-395
Alpha casein from bovine milk Sigma 1002484390
ATP Fisher Scientific BP413-25
Benzonase Novagen 70746-3
Biotin-PEG-SVA-5000 Laysan Bio, Inc. NC0479433
BL21 (DE3) Rosetta Cells Millipore Sigma 71-400-3
Catalase MP Biomedicals LLC 190311
CFI Apo 100X/1.49NA oil immersion TIRF objective Nikon N/A
Chloramphenicol ACROS Organics 227920250
Coverslip Mini-Rack, for 8 coverslips Fisher Scientific C14784
Delicate Task Wipers Kimberly-Clark 34120
Dextrose Anhydrous Fisher Scientific BP3501
D-Sucrose Fisher Scientific BP220-1
DTT Fisher Scientific BP172-25
Ecoline Immersion Thermostat E100 with 003 Bath LAUDA-Brinkmann 27709
EDTA Fisher Scientific BP118-500
EGTA Millipore Corporation 32462-25GM
FIJI / Image J https://fiji.sc/ N/A
Frosted Microscope Slides Corning 12-553-10 75mmx25mm, with thickness of 0.9-1.1mm
Glucose Oxidase MP Biomedicals LLC 195196 Type VII, without added oxygen
GMPCPP Jena Biosciences JBS-NU-405S Can be stored for several months at -20 °C and up to a year at -80 °C
Gold Seal-Cover Glass Thermo Scientific 3405
HEPES Fisher Scientific BP310-500
Imidazole Fisher Scientific 03196-500
IPTG Fisher Scientific BP1755-10
Laboratory dessicator Bel-Art 999320237 190mm plate size
Kanamycin Sulfate Fischer Scientific BP906-5
KIF5A K439 (aa:1-439)-6His Gilbert Lab, RPI N/A doi.org/10.1074/jbc.RA118.002182
Kimwipe Kimberley Clark Z188956 lint-free tissue
Immersion Oil, Type B Cargille 16484
Lens Tissue ThorLabs MC-5
LuNA Laser launch (4 channel: 405, 488, 561, 640nm) Nikon N/A
Lysozyme MP Biomedicals LLC 100834
Magnesium Acetate Tetrahydrate Fisher Scientific BP215-500
Microfuge 18 Beckman Coulter 367160
MPEG-SVA MW-5000 Laysan Bio, Inc. NC0107576
Neutravadin Invitrogen PI31000
Nikon Ti-E inverted microscope Nikon N/A Nikon LuN4 Laser
Ni-NTA Resin Thermo Scientific 88221
Oligonucleotide - CACCTATTCTGAGTTTGCGCGA
GAACTTTCAAAGGC		 IDT N/A
Oligonucleotide - GCCTTTGAAAGTTCTCGCGCAA
ACTCAGAATAGGTG		 IDT N/A
Open-top thickwall polycarbonate tube, 0.2 mL, 7 mm x 22 mm Beckman Coulter 343755
Optima-TLX Ultracentrifuge Beckman Coulter 361544
Paclitaxel (Taxol equivalent) Thermo Fisher Scientific P3456
PIPES ACROS Organics 172615000
PMSF Millipore 7110-5GM
Porcine Tubulin, biotin label Cytoskeleton, Inc. T333P
Porcine Tubulin, HiLyte 647 Fluor Cytoskeleton, Inc. TL670M far red labelled
Porcine Tubulin, Rhodamine Cytoskeleton, Inc. TL590M
Porcine Tubulin, Tubulin Protein Cytoskeleton, Inc. T240
Potassium Acetate Fisher Scientific BP364-500
Prime 95B sCMOS camera Photometric N/A
Quadrant Detector Sensor Head ThorLabs PDQ80A
Quikchange Lightning Kit Agilent Technologies 210518
Sodium Bicarbonate Fisher Scientific S233-500
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous Fisher Scientific BP332-500
Square Cover Glasses Corning 12-553-450 18 mm x 18 mm, with thickness of 0.13-0.17 mm
Streptavidin Microspheres Polysciences Inc. 24162-1
Superose-6 Column GE Healthcare 29-0915--96
TCEP Thermo Scientific 77720
TLA-100 Fixed-Angle Rotor Beckman Coulter 343840
Ultrasonic Cleaner (Sonicator) Vevor JPS-08A(DD) 304 stainless steel, 40 kHz frequency, 60 W power
Vectabond APTES solution Vector Laboratories SP-1800-7
Windex Powerized Glass Cleaner with Ammonia-D S.C. Johnson SJN695237

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bentley, M., Banker, G. The cellular mechanisms that maintain neuronal polarity. Nature Reviews Neuroscience. 17 (10), 611-622 (2016).
  2. Yang, R., et al. A novel strategy to visualize vesicle-bound kinesins reveals the diversity of kinesin-mediated transport. Traffic. 20 (11), 851-866 (2019).
  3. Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. Molecular motors in neurons: Transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease. Neuron. 68 (4), 610-638 (2010).
  4. Helmke, K. J., Heald, R., Wilbur, J. D. Interplay between spindle architecture and function. International Review of Cell and Molecular Biology. 306, (2013).
  5. Elting, M. W., Suresh, P., Dumont, S. The spindle: integrating architecture and mechanics across scales. Trends in Cell Biology. 28 (11), 896-910 (2018).
  6. Kapoor, T. Metaphase spindle assembly. Biology. 6 (1), 8 (2017).
  7. Svoboda, K., Block, S. M. Force and velocity measured for single kinesin molecules. Cell. 77 (5), 773-784 (1994).
  8. Svoboda, K., Schmidt, C. F., Schnapp, B. J., Block, S. M. Direct observation of kinesin stepping by optical trapping interferometry. Nature. 365 (6448), 721-727 (1993).
  9. Schnitzer, M. J., Visscher, K., Block, S. M. Force production by single kinesin motors. Nature Cell Biology. 2 (10), 718-723 (2000).
  10. Andreasson, J. O. L., Shastry, S., Hancock, W. O., Block, S. M. The mechanochemical cycle of mammalian kinesin-2 KIF3A/B under load. Current Biology. 25 (9), 1166-1175 (2015).
  11. Bensel, B. M. The mechanochemistry of the kinesin-2 kif3ac heterodimer is related to strain-dependent kinetic properties of kif3a and kif3c. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (27), 15632-15641 (2020).
  12. Gilbert, S. P., Guzik-Lendrun, S., Rayment, I. Kinesin-2 motors: kinetics and biophysics. Journal of Biological Chemistry. 293 (12), 4510-4518 (2018).
  13. Okada, Y., Higuchi, H., Hirokawa, N. Processivity of the single-headed kinesin KIF1A through binding to tubulin. Nature. 424 (6948), 574-577 (2003).
  14. Budaitis, B. G., et al. Pathogenic mutations in the kinesin-3 motor KIF1A diminish force generation and movement through allosteric mechanisms. Journal of Cell Biology. 220 (4), 202004227 (2021).
  15. Tomishige, M., Klopfenstein, D. R., Vale, R. D. Conversion of Unc104/KIF1A kinesin into a processive motor after dimerization. Science. 297 (5590), 2263-2267 (2002).
  16. Siddiqui, N., et al. Force generation of KIF1C is impaired by pathogenic mutations. bioRxiv. , (2021).
  17. Valentine, M. T., Fordyce, P. M., Krzysiak, T. C., Gilbert, S. P., Block, S. M. Individual dimers of the mitotic kinesin motor Eg5 step processively and support substantial loads in vitro. Nature Cell Biology. 8 (5), 470-476 (2006).
  18. Valentine, M. T., Gilbert, S. P. To step or not to step? How biochemistry and mechanics influence processivity in Kinesin and Eg5. Current Opinion in Cell Biology. 19 (1), 75-81 (2007).
  19. Jannasch, A., Bormuth, V., Storch, M., Howard, J., Schäffer, E. Kinesin-8 is a low-force motor protein with a weakly bound slip state. Biophysical Journal. 104 (11), 2456-2464 (2013).
  20. Bormuth, V., Varga, V., Howard, J., Schäffer, E. Protein friction limits diffusive and directed movements of kinesin motors on microtubules. Science. 325 (5942), 870-873 (2009).
  21. Gennerich, A., Carter, A. P., Reck-Peterson, S. L., Vale, R. D. Force-induced bidirectional stepping of cytoplasmic dynein. Cell. 131 (5), 952-965 (2007).
  22. Mallik, R., Carter, B. C., Lex, S. A., King, S. J., Gross, S. P. Cytoplasmic dynein functions as a gear in response to load. Nature. 427 (6975), 649-652 (2004).
  23. Redwine, W. B., et al. The human cytoplasmic dynein interactome reveals novel activators of motility. eLife. 6, 28257 (2017).
  24. Belyy, V., Hendel, N. L., Chien, A., Yildiz, A. Cytoplasmic dynein transports cargos via load-sharing between the heads. Nature Communications. 5 (1), 5544 (2014).
  25. Belyy, V., et al. The mammalian dynein-dynactin complex is a strong opponent to kinesin in a tug-of-war competition. Nature Cell Biology. 18 (9), 1018-1024 (2016).
  26. Subramanian, R., Kapoor, T. M. Building complexity: insights into self-organized assembly of microtubule-based architectures. Developmental Cell. 23 (5), 874-885 (2012).
  27. Forth, S., Kapoor, T. M. The mechanics of microtubule networks in cell division. Journal of Cell Biology. 216 (6), 1525-1531 (2017).
  28. Dumont, S., Mitchison, T. J. Force and length in the mitotic spindle. Current Biology. 19 (17), 749-761 (2009).
  29. McIntosh, J. R., Molodtsov, M. I., Ataullakhanov, F. I. Biophysics of mitosis. Quarterly Reviews of Biophysics. 45 (2), 147-207 (2012).
  30. McIntosh, J., Hays, T. A brief history of research on mitotic mechanisms. Biology. 5 (4), 55 (2016).
  31. Ferenz, N. P., Gable, A., Wadsworth, P. Mitotic functions of kinesin-5. Seminars in Cell and Developmental Biology. 21 (3), 255-259 (2010).
  32. Kapitein, L. C., et al. The bipolar mitotic kinesin Eg5 moves on both microtubules that it crosslinks. Nature. 435 (7038), 114-118 (2005).
  33. Vukušić, K., Ponjavić, I., Buđa, R., Risteski, P., Tolić, I. M. Microtubule-sliding modules based on kinesins EG5 and PRC1-dependent KIF4A drive human spindle elongation. Developmental Cell. 56 (9), 1253-1267 (2021).
  34. Sturgill, E. G., Ohi, R. Kinesin-12 differentially affects spindle assembly depending on its microtubule substrate. Current Biology. 23 (14), 1280-1290 (2013).
  35. Drechsler, H., McHugh, T., Singleton, M. R., Carter, N. J., McAinsh, A. D. The Kinesin-12 Kif15 is a processive track-switching tetramer. eLife. 3, 01724 (2014).
  36. Tanenbaum, M. E., et al. Kif15 Cooperates with Eg5 to promote bipolar spindle assembly. Current Biology. 19 (20), 1703-1711 (2009).
  37. Mountain, V., et al. Cross-links microtubules in the mammalian mitotic spindle. Journal of Cell Biology. 147 (2), 351-365 (1999).
  38. Norris, S. R., et al. Microtubule minus-end aster organization is driven by processive HSET-tubulin clusters. Nature Communications. 9 (1), 2659 (2018).
  39. Cai, S., Weaver, L. N., Ems-McClung, S. C., Walczak, C. E. Proper organization of microtubule minus ends is needed for midzone stability and cytokinesis. Current Biology. 20 (9), 880-885 (2010).
  40. Pamula, M. C., et al. High-resolution imaging reveals how the spindle midzone impacts chromosome movement. Journal of Cell Biology. 218 (8), 2529-2544 (2019).
  41. Bieling, P., Telley, I. A., Surrey, T. A minimal midzone protein module controls formation and length of antiparallel microtubule overlaps. Cell. 142 (3), 420-432 (2010).
  42. Zhu, C., Lau, E., Schwarzenbacher, R., Bossy-Wetzel, E., Jiang, W. Spatiotemporal control of spindle midzone formation by PRC1 in human cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (16), 6196-6201 (2006).
  43. Subramanian, R., et al. Insights into antiparallel microtubule crosslinking by PRC1, a conserved nonmotor microtubule binding protein. Cell. 142 (3), 433-443 (2010).
  44. Elting, M. W., Prakash, M., Udy, D. B., Dumont, S. Mapping load-bearing in the mammalian spindle reveals local kinetochore fiber anchorage that provides mechanical isolation and redundancy. Current Biology. 27 (14), 2112-2122 (2017).
  45. Fant, X., Merdes, A., Haren, L. Cell and molecular biology of spindle poles and NuMA. International Review of Cytology. 238, 1-57 (2004).
  46. Merdes, A., Heald, R., Samejima, K., Earnshaw, W. C., Cleveland, D. W. Formation of spindle poles by dynein/dynactin-dependent transport of NuMA). Journal of Cell Biology. 149 (4), 851-861 (2000).
  47. Maddox, P., Straight, A., Coughlin, P., Mitchison, T. J., Salmon, E. D. Direct observation of microtubule dynamics at kinetochores in Xenopus extract spindles: Implications for spindle mechanics. Journal of Cell Biology. 162 (3), 377-382 (2003).
  48. Maddox, P., Desai, A., Oegema, K., Mitchison, T. J., Salmon, E. D. Poleward microtubule flux is a major component of spindle dynamics and anaphase A in mitotic Drosophila embryos. Current Biology. 12 (19), 1670-1674 (2002).
  49. LaFountain, J. R., Cohan, C. S., Siegel, A. J., LaFountain, D. J. Direct visualization of microtubule flux during metaphase and anaphase in crane-fly spermatocytes. Molecular Biology of the Cell. 15 (12), 5724-5732 (2004).
  50. Pavin, N., Tolić, I. M. Mechanobiology of the mitotic spindle. Developmental Cell. 56 (2), 192-201 (2021).
  51. Vukušić, K., Tolić, I. M. Anaphase B: Long-standing models meet new concepts. Seminars in Cell and Developmental Biology. 117, 127-139 (2021).
  52. Vukušić, K., et al. Microtubule sliding within the bridging fiber pushes kinetochore fibers apart to segregate chromosomes. Developmental Cell. 43 (1), 11-23 (2017).
  53. Shimamoto, Y., Forth, S., Kapoor, T. M. Measuring pushing and braking forces generated by ensembles of kinesin-5 crosslinking two microtubules. Developmental Cell. 34 (6), 669-681 (2015).
  54. Gaska, I., Armstrong, M. E., Alfieri, A., Forth, S. The mitotic crosslinking protein PRC1 acts like a mechanical dashpot to resist microtubule sliding. Developmental Cell. 54 (3), 367-378 (2020).
  55. Woll, K. A., et al. An allosteric propofol-binding site in kinesin disrupts kinesin-mediated processive movement on microtubules. Journal of Biological Chemistry. 293 (29), 11283-11295 (2018).
  56. Forth, S., Hsia, K. C., Shimamoto, Y., Kapoor, T. M. Asymmetric friction of nonmotor MAPs can lead to their directional motion in active microtubule networks. Cell. 157 (2), 420-432 (2014).
  57. Alfieri, A., Gaska, I., Forth, S. Two modes of PRC1-mediated mechanical resistance to kinesin-driven microtubule network disruption. Current Biology. 31 (12), 2495-2506 (2021).
  58. Koch, M. D., Shaevitz, J. W. Introduction to optical tweezers. Methods in Molecular Biology. 1486, 3-24 (2017).
  59. Sarshar, M., Wong, W. T., Anvari, B. Comparative study of methods to calibrate the stiffness of a single-beam gradient-force optical tweezers over various laser trapping powers. Journal of Biomedical Optics. 19 (11), 115001 (2014).
  60. Van Mameren, J., Wuite, G. J. L., Heller, I. Introduction to optical tweezers: Background, system designs, and commercial solutions. Methods in Molecular Biology. 783, 1-20 (2011).
  61. Bodrug, T., et al. The kinesin-5 tail domain directly modulates the mechanochemical cycle of the motor domain for anti-parallel microtubule sliding. eLife. 9, 51131 (2020).
  62. Reinemann, D. N., et al. Collective force regulation in anti-parallel microtubule gliding by dimeric Kif15 kinesin motors. Current Biology. 27 (18), 2810-2820 (2017).
  63. Reinemann, D. N., Norris, S. R., Ohi, R., Lang, M. J. Processive kinesin-14 HSET exhibits directional flexibility depending on motor traffic. Current Biology:CB. 28 (14), 2356-2362 (2018).
  64. Shimamoto, Y., Forth, S., Kapoor, T. M. Measuring pushing and braking forces generated by ensembles of kinesin-5 crosslinking two microtubules. Developmental Cell. 34 (6), 669-681 (2015).
  65. SMART - Servier Medical ART. , Available from: https://smart.servier.com/ (2022).
  66. Gaska, I., Armstrong, M., Alfieri, A., Forth, S. The mitotic crosslinking protein PRC1 acts as a mechanical dashpot to resist microtubule sliding. Developmental Cell. 54 (3), 1-14 (2020).
  67. Janson, M. E., De Dood, M. E., Dogterom, M. Dynamic instability of microtubules is regulated by force. Journal of Cell Biology. 161 (6), 1029-1034 (2003).
  68. Kerssemakers, J. W. J., et al. Assembly dynamics of microtubules at molecular resolution. Nature. 442 (7103), 709-712 (2006).
  69. Powers, A. F., et al. The Ndc80 kinetochore complex forms load-bearing attachments to dynamic microtubule tips via biased diffusion. Cell. 136 (5), 865-875 (2009).
  70. Akiyoshi, B., et al. Tension directly stabilizes reconstituted kinetochore-microtubule attachments. Nature. 468 (7323), 576-579 (2010).
  71. Fong, K. K., et al. Direct measurement of the strength of microtubule attachment to yeast centrosomes. Molecular Biology of the Cell. 28 (14), 1853-1861 (2017).
  72. Kikumoto, M., Kurachi, M., Tosa, V., Tashiro, H. Flexural rigidity of individual microtubules measured by a buckling force with optical traps. Biophysical Journal. 90 (5), 1687-1696 (2006).
  73. Memet, E., et al. Microtubules soften due to cross-sectional flattening. eLife. 7, 34695 (2018).

Tags

Biologi udgave 183 mikrotubuli optisk fangst mitose enkeltmolekyle spindel mekanik kinesin mikrotubuli-associerede proteiner fluorescensmikrosopi
Direkte måling af kræfter i rekonstituerede aktive mikrotubulusbundter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Palumbo, J., Tai, E., Forth, S.… More

Palumbo, J., Tai, E., Forth, S. Directly Measuring Forces Within Reconstituted Active Microtubule Bundles. J. Vis. Exp. (183), e63819, doi:10.3791/63819 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter