Summary
Se realizaron inyecciones intravítreas en el ojo de oveja con el objetivo de administrar terapia génica mediada por virus a la retina.
Abstract
Existen varios métodos para la administración de agentes terapéuticos a la retina, incluida la administración intravítrea (IVT), subretiniana, supracoroidea, periocular o tópica. La administración de fármacos IVT implica una inyección en el humor vítreo del ojo, una sustancia gelatinosa que llena la cámara posterior del ojo y mantiene la forma del globo ocular. Aunque la vía IVT es menos específica que la administración subretiniana, es mucho menos invasiva y se usa ampliamente en entornos clínicos para una variedad de enfermedades oculares.
Anteriormente demostramos la eficacia de la administración intravítrea de un producto de terapia génica mediado por virus adenoasociados (AAV) (AAV9). CLN5) en ovejas con una forma CLN5 natural de lipofuscinosis neuronal ceroidea (NCL). Las ovejas afectadas recibieron terapia génica IVT en un ojo, con el otro ojo no tratado sirviendo como control interno. La estructura y función de la retina se mantuvieron en el ojo tratado hasta 15 meses después del tratamiento, mientras que el ojo no tratado mostró una función progresivamente decreciente y atrofia severa durante el examen postmortem. Sobre la base de los estudios con ovejas, el producto de terapia génica CLN5 fue aprobado como un nuevo fármaco candidato en investigación (IND) por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos en septiembre de 2021. Este artículo detalla el protocolo quirúrgico para la administración de IVT de un vector viral terapéutico al ojo ovino.
Introduction
Se pueden usar varios métodos para administrar agentes terapéuticos a la retina, incluida la administración intravítrea (IVT), subretiniana, supracoroidea, periocular o tópica. Cada vía de administración implica superar barreras como la barrera sangre-retina o las membranas limitantes internas y externas y tiene tasas variables de eficacia dependiendo del fármaco que se administra y del objetivo retiniano específico 1,2.
La administración de fármacos IVT implica una inyección en el humor vítreo del ojo, una sustancia gelatinosa que ocupa la cámara posterior del ojo. La función principal del humor vítreo es mantener la forma del globo ocular y mantener los tejidos oculares, como el cristalino y la retina, en su lugar. El humor vítreo está compuesto principalmente de agua, con pequeñas cantidades de colágeno, ácido hialurónico y otras proteínas no colágenas3. La inyección de IVT es un procedimiento simple y común utilizado rutinariamente para tratar una amplia gama de afecciones oculares, incluida la degeneración macular relacionada con la edad, el edema macular diabético, la retinopatía diabética, la oclusión de la vena retiniana y varias distrofias retinianas hereditarias 4,5.
Lipofuscinosis neuronal ceroidea (NCL; Enfermedad de Batten) son un grupo de enfermedades mortales de almacenamiento lisosomal que causan una degeneración grave del cerebro y la retina. Actualmente hay 13 variantes conocidas de NCL resultantes de mutaciones en diferentes genes (CLN1-8, CLN10-14) que afectan predominantemente a los niños, pero tienen diferentes edades de inicio y gravedad de la enfermedad6. Las NCL comparten síntomas progresivos comunes, que incluyen deterioro cognitivo y motor, convulsiones y pérdida de la visión. No hay cura para la NCL; sin embargo, la terapia de reemplazo enzimático dirigida al cerebro se encuentra actualmente en ensayos clínicos para la enfermedad CLN27,8, y la terapia génica mediada por AAV ha demostrado ser muy prometedora en estudios preclínicos, con un ensayo clínico para la terapia génica CLN5 que se espera que comience en 2022 9,10.
Muchas otras especies desarrollan formas naturales de NCL, incluyendo gatos, perros, ovejas y vacas. Dos modelos ovinos de NCL están actualmente en estudio activo en Nueva Zelanda: un modelo de enfermedad CLN5 en ovejas de Borderdale y un modelo de enfermedad CLN6 en ovejas de South Hampshire. Las ovejas afectadas presentan muchas de las características clínicas y patológicas de la enfermedad humana, incluyendo atrofia retiniana y pérdida de visión10,11. Aunque la terapia génica CLN5 dirigida al cerebro en ovejas con enfermedad CLN5 puede prevenir o detener la atrofia cerebral y el deterioro clínico, las ovejas tratadas aún pierden su visión9. Esto puso de manifiesto la necesidad de tratar la retina para preservar la visión y mantener una mejor calidad de vida, lo que llevó al establecimiento de un protocolo para la terapia génica ocular en ovejas.
El ojo de oveja representa un buen modelo del ojo humano debido a su similitud en las dimensiones del globo ocular, volumen vítreo y estructura retiniana10,12,13. Este artículo detalla el protocolo quirúrgico para la administración de IVT de un pequeño volumen (≤100 μL) de vector viral terapéutico al ojo ovino.
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Protocol
Todos los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Lincoln y están en línea con las directrices de los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos para el cuidado y uso de animales en la investigación y la Ley de Bienestar Animal de Nueva Zelanda (1999). Las ovejas Borderdale fueron diagnosticadas al nacer14 años y mantenidas en granjas de investigación de la Universidad de Lincoln. Tres ovejas homocigotas de 3 meses de edad (CLN5-/-) recibieron una sola inyección de IVT en el ojo izquierdo, con el ojo derecho no tratado actuando como control interno. Los datos de electrorretinografía y patología se compararon con los datos históricos de control sanos y afectados. El vector viral utilizado en este estudio fue un virus adenoasociado autocomplementario serotipo 9, que contiene el promotor de la acción beta del pollo (CBh) y CLN5 ovino optimizado para codón (scAAV9 / CBh-oCLN5opt). El vector viral fue proporcionado por la Universidad de Carolina del Norte Vector Core, NC, EE.UU.
1. Precirugía
- Autoclave del kit quirúrgico (Figura 1).
- Ayunar las ovejas durante 24 h antes de la cirugía.
- Registre los pesos vivos antes de la cirugía.
Figura 1: Botiquín de cirugía intravítrea. Los instrumentos necesarios para la cirugía de IVT incluyen (1) un espéculo para mantener los párpados abiertos y (2) un par de pinzas de nariz curva para agarrar la conjuntiva bulbar y rotar el ojo. (3) También se incluye un hemostático de nariz recta como instrumento alternativo para agarrar la conjuntiva bulbar y mantener el ojo en su lugar si ha retrocedido a la órbita del ojo. Este kit se esteriliza en autoclave antes de la cirugía. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
2. Procedimiento quirúrgico
- Sujete al animal y, usando cortapelos electrónicos, afeite la lana de un lado del cuello sobre la vena yugular.
- Ocluya la vena yugular aplicando presión en la base del surco yugular y visualice la vena elevada.
- Extraiga la cantidad adecuada de diazepam (0,3 mg/kg) y ketamina (7,5 mg/kg) en una jeringa estéril y coloque una aguja estéril de 20 G. Inserte la aguja en la vena yugular y retire suavemente el émbolo para asegurarse de que la sangre ingrese al cubo y la aguja esté dentro de la vena. Una vez confirmado, inducir a través de la administración intravenosa (yugular).
- Inmediatamente después de la inducción, coloque al animal en decúbito dorsal, extienda el cuello y sostenga la lengua hacia arriba y hacia adelante, usando un laringoscopio para visualizar la laringe. Realizar la intubación endotraqueal insertando suavemente un tubo endotraqueal (tamaño 6.0-9.0 dependiendo del tamaño de la oveja) entre las cuerdas vocales cuando el animal exhala. Infle el manguito endotraqueal inmediatamente y asegure el tubo con un lazo alrededor de la mandíbula inferior. Confirme el flujo de aire a través del tubo.
- Transfiera la oveja a la mesa quirúrgica y colóquela en decúbito lateral.
- Conecte inmediatamente el tubo endotraqueal a las mangueras de la máquina anestésica para la administración de isoflurano en oxígeno al 100%. Inicialmente comience con 3% -4% de isoflurano y luego reduzca a 2% -3% para el mantenimiento. Observar la ventilación espontánea de las ovejas.
- Controle la frecuencia cardíaca (pulso), la frecuencia respiratoria, la saturación de oxígeno, los niveles deCO2 al final de la espiración y la temperatura corporal rectal durante todo el procedimiento. Ver Tabla 1 para los valores fisiológicos para estos parámetros en ovejas anestesiadas (variable, pero usar como guía).
- Coloque una cortina grande, estéril y cuadrada en un carro quirúrgico, seguido de los instrumentos estériles.
- Coloque una cortina quirúrgica estéril y fenestrada sobre el ojo que se inyectará.
- Desinfecte asépticamente el ojo con una jeringa estéril de 20 ml para irrigar el ojo con una solución de povidona yodada al 1-5%.
- Aplique 1-2 gotas de solución oftálmica Alcaine 0.5% W/V, como anestésico local, en el ojo.
- Coloque un espéculo de ojo de Nopa Barraquer-Colibrí (10 mm) en los párpados para mantener el ojo abierto.
- Agarre la conjuntiva bulbar en la cara dorsolateral del ojo con fórceps y gire el globo ocular ventromedialmente.
| Consciente | Anestesiado | Punto crítico de intervención recomendado | |
| Frecuencia cardíaca (latidos/min) | 50-80 (descanso) a 280 (activo) | 50-80 | <50, >100 |
| Frecuencia respiratoria (respiraciones/min) | 15-40 (reposo) a 350 (sobrecalentado) | 10-30 | <8, >40 |
| Saturación de oxígeno (mm Hg) | 95-100 | 98-100 | <90 |
| CO2 al final de la marea (mm Hg) | 35-45 | 35-45 | >55 |
| Temperatura corporal (°C) | 38.5-39.5 | 38.5-39.5 | <36, >40 |
Tabla 1: Valores fisiológicos de los parámetros a monitorizar en ovejas anestesiadas.
3. Preparación viral
- Conservar las alícuotas vectoriales AAV a −80 °C hasta su uso.
- El día de la cirugía, descongele el número requerido de viales para la administración de IVT en hielo.
- Inmediatamente antes de la administración, vórtice la alícuota del vector viral y centrifugar a 400 × g durante 10 s para recoger el contenido.
- Diluir cada alícuota del vector viral en solución salina tamponada con fosfato (PBS) estéril filtrada 1x hasta la dosis deseada en un volumen final de 100 μL. Preparar diluciones vectoriales en un tubo estéril de microcentrífuga de baja unión a proteínas de 1,5 ml utilizando puntas de pipeta de filtro estériles. Deseche todos los consumibles que hayan estado en contacto con el vector viral en solución desinfectante (consulte la Tabla de materiales).
NOTA: En la publicación original15 la dosis del agente terapéutico (AAV9. CLN5) fue 1,9 x 1010 genomas virales. La dosis recomendada variará dependiendo del agente terapéutico que se administre; Por lo tanto, no se ha incluido una dosis en el protocolo estándar presentado aquí. - Extraiga los 100 μL completos de la preparación del vector AAV en una jeringa estéril de 1 ml de espacio muerto bajo con una aguja de 28 G x 1/2 en permanentemente unida para inyección inmediata. Asegúrese de que el tiempo transcurrido desde la preparación hasta la inyección sea inferior a 2 minutos.
4. Administración viral
- Inserte la aguja aproximadamente 7 mm posterior a la esclerótica en la cara lateral del ojo y en ángulo posterior para evitar la lente (Figura 2 y Figura 3). Administrar la inyección única de 100 μL como bolo lo más cerca posible de la retina sin alterar la superficie de la retina.
- Enjuague el ojo con aproximadamente 10-15 ml de solución de povidona yodada al 1-5% seguida de 10 ml de solución salina antes de retirar el espéculo y la cortina.
- Voltee las ovejas y repita con el otro ojo si es necesario.
Figura 2: Rotación ventromedial del globo ocular . (A) Agarre la conjuntiva bulbar con fórceps no dentados y (B) gire ventromedialmente (es decir, hacia abajo y hacia el hocico) para exponer la superficie dorsolateral del ojo para la inyección. Abreviaturas: V = ventral, D = dorsal, M = medial, L = lateral. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Ubicación y profundidad de la inyección. La aguja se inyecta en la cara dorsolateral del globo ocular y la longitud completa del eje de la aguja (0,5 pulgadas/12,7 mm) se inserta en el ojo. Tenga en cuenta el ángulo de la aguja hacia la parte posterior del ojo para evitar la lente e inyecte lo más cerca posible de la retina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
5. Manejo postoperatorio
- Al finalizar el procedimiento, detenga la anestesia por inhalación de gas isoflurano, enjuague la línea con oxígeno al 100%, desconecte la manguera del tubo endotraqueal y transfiera las ovejas a la sala de recuperación.
- Coloque las ovejas en decúbito esternal, con las patas metidas debajo, y monitoree hasta su recuperación completa. Asegúrese de que la boca del animal esté libre de obstrucciones.
- Cuando se observe el reflejo de deglución, desinfle parcialmente el manguito del tubo endotraqueal y retire suavemente el tubo de la boca.
- Administre un antiinflamatorio no esteroideo intramuscular en el músculo bíceps femoral de la extremidad posterior, antibióticos subcutáneos en el lado del cuello o detrás del hombro y gotas oftálmicas de cloranfenicol al 0,5% en la superficie del globo ocular.
- Proporcione agua y comida (pellets de alfalfa y paja) una vez que las ovejas puedan pararse sin ayuda.
- Administrar gotas oftálmicas de cloranfenicol al 0,5% 2-3 por día durante 7 días después de la cirugía.
- Mantenga las ovejas en el interior durante la noche antes de regresar al prado al aire libre aproximadamente 24 h después de la cirugía.
- Registre las temperaturas rectales diariamente durante 3 semanas. Controle cualquier cambio en el pulso o la frecuencia respiratoria, el consumo de alimentos, el neurocomportamiento, la temperatura corporal, el peso, la postura, la salud ocular y los signos clínicos de mala salud. Busque tratamiento veterinario apropiado si hay indicios de eventos adversos.
6. Evaluación de la eficacia in vivo
- Si el objetivo de la inyección de IVT es preservar la visión, monitoree la eficacia in vivo mediante métodos como la prueba de laberinto o la electrorretinografía (ERG) para evaluar la función de las células de la retina o la tomografía de coherencia óptica (OCT) para evaluar la estructura de la retina.
NOTA: Estas medidas de eficacia han sido bien descritas después de la terapia génica IVT11,15,16.
7. Análisis de tejido postmortem
- Realizar la eutanasia ovina por un método aprobado en un punto final apropiado después de la cirugía de inyección intravítrea.
NOTA: Los métodos de eutanasia sugeridos, como los medicamentos de eutanasia veterinaria intravenosa o un perno cautivo penetrante en la columna cervical seguido de una rápida exanguinación, se detallan en otra parte15,16. - Coseche globos oculares de oveja usando tijeras curvas quirúrgicas afiladas / romas. Corte el canto lateral y medial para aumentar la abertura de la cuenca del ojo y luego corte sistemáticamente a través de los pliegues conjuntivales, el tejido conectivo, los músculos y el nervio óptico para liberar el globo ocular de la cuenca.
- Fijación por inmersión de globos oculares intactos y enucleados en formalina al 10% durante 2 h, seguido de postfijación en la solución de Bouin durante 4 h, haciendo un corte pequeño (0,5 cm) en la esclerótica para permitir una perfusión suficiente. Alternativamente, fije por inmersión los globos oculares en la solución de Davidson durante 48 h.
- Procesar secciones de tejido ocular a través de la incrustación y seccionamiento rutinario de cera de parafina a 3-5 μm.
NOTA: Los procedimientos de tinción para la tinción de hematoxilina y eosina (H&E) y el análisis inmunohistoquímico se han descrito previamente15,16. - Evaluar la eficacia en el tejido postmortem mediante medidas como el grosor total de la retina, el grosor de la capa retiniana, los recuentos de filas celulares de la capa nuclear externa y la tinción inmunohistoquímica para los tipos de células de la retina, la glía retiniana o las proteínas de interés.
NOTA: Para los protocolos para estos análisis, ver publicaciones anteriores15,16.
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Representative Results
La eficacia de la administración de IVT de un vector de terapia génica CLN5 en la atenuación de la disfunción retiniana y la degeneración en ovejas con CLN5 NCL ha sido previamente demostrada por este grupo de investigación15. Las ovejas afectadas recibieron una única inyección IVT de 100 μL de CLN5 empaquetada en un vector AAV serotipo 9 (AAV9) (AAV9). CLN5) en un ojo, con el ojo contralateral sirviendo como un control interno no tratado. La visión se evaluó mensualmente desde la edad de inyección (3 meses) hasta la enfermedad terminal (18 meses). El análisis postmortem de la histología retiniana se realizó en ojos tratados y no tratados, así como en controles sanos y afectados por CLN5 de la misma edad.
El análisis de electrorretinografía (ERG) demostró la preservación de la función retiniana en el ojo tratado, mientras que el ojo no tratado disminuyó de manera similar a los animales afectados por CLN5 (Figura 4)15. La histología retiniana estaba casi normalizada en el ojo tratado, con un grosor retiniano total comparable al de los animales de control sanos en la retina central. En contraste, el grosor de la retina no tratada fue comparable al de los animales afectados por CLN5 (Figura 5)15. El almacenamiento lisosomal, una característica patológica distintiva de NCL, no se observó en el ojo tratado, pero estaba presente en el ojo no tratado15. Estos resultados demuestran que el vector de terapia génica administrado a través de la inyección de IVT fue capaz de detener la patogénesis de la enfermedad en el ojo de oveja afectado por CLN5. La expresión de la proteína ácida fibrilar glial (GFAP), un marcador de estrés retiniano y astroglia, fue menor en los ojos tratados que en los no tratados, lo que indica que la inflamación asociada a la enfermedad se atenuó después del tratamiento (Figura 6)15.
Figura 4: Respuestas ERG adaptadas a la oscuridad de ovejas CLN5-/- después de la administración intravítrea de AAV9. CLN5. (A) Amplitudes medias (± SEM) de ERG a lo largo del tiempo en los ojos tratados (verde oscuro, n = 3) y no tratados (verde claro, n = 3) de ovejas CLN5-/- , así como ovejas de control sanas (azul, n = 6) y afectadas por CLN5 (rojo, n = 6). (B) Trazas representativas de ERG de los ojos tratados y no tratados y controles sanos y ovejas afectadas a los 5 (línea negra) y 17 (línea gris) meses de edad. * indica P < 0,05. Esta figura reproducida es de Murray et al.15 con permiso de Elsevier. Abreviaturas: ERG = electrorretinografía; AAV = virus adenoasociado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Grosor retiniano de las ovejas CLN5-/- tras la administración intravítrea de AAV9. CLN5. Micrografías representativas de tinción histológica H&E en los ojos tratados y no tratados de ovejas CLN5-/- en comparación con controles de la misma edad. Las imágenes y las mediciones de espesor se tomaron en dos lugares; retina central (A-E) y retina periférica (F-J). (E) Grosor medio (± SEM) de la retina (μm) en la retina central de los ojos tratados (verde oscuro, n = 3) y no tratados (verde claro, n = 3) en comparación con la retina de control sana (azul, n = 4) y afectada por CLN5 (rojo, n = 4). (J) Grosor retiniano medio (± SEM) (μm) en la retina periférica de los ojos tratados y no tratados de ovejas CLN5-/- en comparación con el control sano y la retina afectada por CLN5. * indica P < 0.05, **** indica P < 0.0001. Barras de escala = 50 μm. Esta figura se reproduce de Murray et al.15 con permiso de Elsevier. Abreviaturas: NFL = capa de fibra nerviosa; GCL = capa de células ganglionares; IPL = capa plexiforme interna; INL = capa nuclear interna; OPL = capa plexiforme externa; ONL = capa nuclear externa; IS/OS = segmentos internos y externos de fotorreceptores; EPR = epitelio pigmentario de la retina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Inmunorreactividad GFAP en la retina de ovejas CLN5-/- tras la administración intravítrea de AAV9. CLN5. Imágenes confocales representativas de inmunorreactividad GFAP en los ojos tratados y no tratados de ovejas CLN5-/- en comparación con los controles. (A-D) Inmunorreactividad GCAP, (E-H) Marcador nuclear DAPI, (I-L) Imágenes combinadas de los dos canales. Barra de escala = 20 μm. Esta figura se reproduce de Murray et al.15 con permiso de Elsevier. Abreviaturas: NFL = capa de fibra nerviosa; GCL = capa de células ganglionares; INL = capa nuclear interna; ONL = capa nuclear externa; IS/OS = segmentos internos y externos de fotorreceptores; GFAP = proteína ácida fibrilar glial; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Las inyecciones intravítreas son uno de los procedimientos quirúrgicos más comunes en oftalmología humana y han demostrado ser eficaces en la administración de terapias génicas mediadas por AAV a la retina de las ovejas. Anteriormente habíamos demostrado la eficacia de AAV9. La terapia génica CLN5 administrada intravítreamente atenuando la disfunción retiniana y la degeneración en ovejas con CLN5 NCL15. Se espera que la traducción de esta vía de administración a pacientes humanos con NCL también resulte beneficiosa.
El protocolo para las inyecciones de IVT de pequeño volumen en un ojo de oveja es relativamente sencillo y no invasivo, fácilmente reproducible y fácil de aprender para un no experto. El éxito depende de las células diana dentro de la retina, la terapia que se administra y la ubicación y dirección de la inyección en sí. Aunque a menudo se piensa que las inyecciones de IVT son más efectivas para atacar las capas internas de la retina, muchos investigadores han demostrado la eficacia de las inyecciones de IVT en enfermedades donde la retina externa es la ubicación principal de la patogénesis de la enfermedad15,17,18,19. Las diferencias en los resultados funcionales y patológicos después de las inyecciones de IVT probablemente también se relacionen con el tipo de terapia administrada. Por ejemplo, la terapia génica para administrar genes que codifican proteínas solubles (por ejemplo, CLN5) ha demostrado ser mucho más efectiva que las terapias génicas para administrar genes que codifican proteínas intracelulares o unidas a la membrana (por ejemplo, CLN6)15. Independientemente del objetivo y el tipo de terapia, es fundamental obtener el sitio de inyección y el ángulo correctos para maximizar la eficacia. Como se describe en el protocolo, el lugar de inyección para ovejas debe ser aproximadamente 7 mm posterior a la esclerótica en la cara lateral del ojo y en ángulo posterior para apuntar al vítreo posterior. La inclinación de la aguja es tanto para evitar la lente como para dirigir el medicamento inyectado lo más cerca posible de la retina. El uso de una jeringa de seguridad con una aguja de 28 G (o más pequeña) x 0,5 en espacio muerto permanente es crucial para minimizar las molestias relacionadas con la inyección y el volumen muerto que queda en la aguja o el cubo. Esta aguja de longitud se puede insertar completamente en el ojo de oveja en un ángulo posterior sin un microscopio quirúrgico y / o el riesgo de perforar la retina. Los investigadores que tienen acceso a un microscopio quirúrgico pueden usar esto para proporcionar un nivel adicional de certeza sobre cómo evitar la alteración de la retina. De lo contrario, el uso de jeringas de seguridad y el conocimiento de las dimensiones del globo ocular de oveja a la edad tratada es suficiente para realizar este procedimiento de manera segura15.
Al agarrar el ojo para rotarlo medialmente y exponer el lugar de la inyección, es esencial utilizar instrumentos atraumáticos no dentados para evitar dañar el delicado tejido del ojo. Si el ojo está colocado centralmente, es relativamente sencillo agarrar la conjuntiva bulbar en el borde de la esclerótica y el iris y rotar con una mano, mientras se inyecta con la otra mano. Sin embargo, si el ojo ha girado fuera del centro, lo que puede ocurrir bajo anestesia general, a menudo es necesario usar un hemostático para sujetar la conjuntiva bulbar y rotar el ojo en su posición, dejando el hemostático en su lugar para continuar con el procedimiento.
Los ojos de oveja son robustos y se recuperan bien después del tratamiento de IVT con AAV9 portador de CLN5 ovino, con solo una oveja desarrollando uveítis en el ojo tratado 1 semana después de la inyección15. En este caso, la uveítis se resolvió en 1 semana y no tuvo impacto a largo plazo en la visión. Aparte de este caso, no se informaron efectos negativos de las inyecciones de IVT en el primer estudio publicado15, o en los >30 animales adicionales en el programa de investigación inyectados a los 3 meses, 6 meses o 9 meses de edad siguiendo el protocolo descrito aquí. Sin embargo, existen medidas cuantitativas adicionales de seguridad de la inyección que los investigadores pueden considerar agregar a sus evaluaciones postoperatorias. Estos incluyen medidas de presión intraocular (PIO), imágenes de fondo de ojo u OCT. Las imágenes del fondo de ojo antes y después de la inyección pueden resaltar si ha habido alguna interrupción de la retina debido a la inyección y, a largo plazo, pueden proporcionar una visión general de la salud de la retina en general.
En el caso de que se inyecte un marcador fluorescente, las imágenes de fluorescencia del fondo de ojo pueden ayudar a visualizar la propagación del marcador inyectado16,20. La OCT se puede utilizar para visualizar la retina en sección transversal in vivo para identificar cualquier daño estructural potencial después de la inyección y medir el grosor de la retina a lo largo del tiempo en respuesta al tratamiento. La función visual posterior a la inyección también puede evaluarse mediante ERG o pruebas de laberinto15,16. En el caso de la terapia génica mediada por virus IVT, se debe considerar el impacto de la respuesta inmune y la presencia de anticuerpos neutralizantes contra los vectores AAV. Aunque no forma parte del protocolo aquí descrito para ovejas, se sugiere que los sujetos sean examinados para detectar la presencia de anticuerpos neutralizantes anti-AAV antes de la terapia génica, independientemente de la vía de administración, para aumentar la eficiencia de la transducción16,21. Se remite a los lectores a una discusión más exhaustiva sobre el tema de las respuestas inmunes a la VAA por Whitehead et al.22.
Una complicación común durante los procedimientos de IVT es la hemorragia subconjuntival (SCH)23, que puede ocurrir si los capilares de la conjuntiva bulbar se perforan durante la inserción de la aguja. Afortunadamente, SCH es generalmente inofensivo y se resuelve en unos pocos días; Sin embargo, es mejor evitar los capilares conjuntivales al insertar la aguja. Después de la inyección de IVT, es importante tratar los ojos inyectados con gotas antibióticas para los ojos (por ejemplo, cloranfenicol) y controlar los ojos para detectar cualquier signo de infección o inflamación (uveítis). Otro evento común durante los procedimientos de IVT es un aumento en la PIO. Estos aumentos son más comúnmente picos transitorios de presión en los minutos posteriores a la inyección y no causan daños duraderos24,25. Sin embargo, hay casos en los que la PIO debe ser considerada y monitoreada. Cuando existen condiciones oculares preexistentes como glaucoma, o cuando se inyectan volúmenes mayores (≥100 μL), se debe monitorizar estrechamente la PIO y se debe considerar la paracentesis profiláctica de la cámara anterior para reducir la presión en el globo ocular 4,16. Además, los picos repetidos en la PIO en el caso de inyecciones repetidas de IVT pueden ser una preocupación y deben atenuarse como arriba4. Aquí, estamos demostrando IVT para los propósitos de una sola terapia génica mediada por AAV; Por lo tanto, las consecuencias a largo plazo de las inyecciones repetidas no son una consideración importante.
Las limitaciones de las inyecciones de IVT incluyen la necesidad de penetrar las barreras anatómicas y la menor especificidad del objetivo en comparación con los métodos más invasivos. Primero, la sustancia inyectada se diluirá en el vítreo y luego tiene una distancia para difundirse a través de la cavidad vítrea y el tejido retiniano a las células diana. Esto significa que la retina interna se transduce más fácilmente que la retina externa después de la inyección de IVT, y pueden ser necesarias dosis más altas para contrarrestar la dilución26. El protocolo descrito aquí enfatiza la importancia de inyectar lo más cerca posible de la retina para mitigar los efectos de la dilución y difusión a través del cuerpo vítreo. Por lo tanto, la longitud completa del eje de la aguja de 0,5 pulgadas / 12,7 mm se inserta en el ojo. La ventaja adicional de insertar toda la longitud de la aguja es la menor probabilidad de reflujo de líquido durante la inyección 4,27.
Aunque este protocolo actual lo omite, se recomienda retrasar la extracción de la aguja durante varios minutos después de la inyección para reducir aún más las posibilidades de reflujo de líquidos. Además, la inyección debe hacerse lentamente para asegurar que el chorro de líquido inyectado no interrumpa la retina o cause un pico rápido en la PIO, y un aumento de la velocidad de inyección no afecte las tasas de difusión a través del vítreo28,29. La membrana limitante interna (ILM) es la barrera primaria entre el vítreo y la retina, que funciona para restringir el movimiento de moléculas en la retina30. Sin embargo, la permeabilidad de la ILM puede aumentar mediante digestión o peeling quirúrgico y es probable que aumente en el ojo enfermo, lo que facilita la penetración de moléculas terapéuticas.
En cuanto a la especificidad diana, la administración de IVT es la menor en comparación con otras vías intraoculares como la subretiniana y la supracoroideo, como se discutió anteriormente y en otros lugares10. Sin embargo, las nuevas generaciones de AAV se están desarrollando rutinariamente para contener modificaciones, que mejoran la orientación a tipos de células particulares o superan de manera más eficiente las barreras como el ILM31. El uso de tales cápsides modificadas ha aumentado la eficiencia de la transducción después de la administración de IVT en varias especies modelo 5,32,33.
El objetivo de la terapia génica detallada por Murray et al.15 era entregar una copia funcional del gen CLN5 ; por lo tanto, una medida de eficacia es la presencia de células transducidas que expresan la proteína CLN5. Hemos intentado utilizar la inmunohistoquímica para detectar células transducidas por CLN5 en la retina, como lo hacemos habitualmente en el tejido cerebral de las ovejas; Sin embargo, el anticuerpo que normalmente usamos en el tejido cerebral que flota libremente no funciona en el tejido retiniano incrustado en parafina. La resolución de problemas y la investigación de formas alternativas de detectar el gen o la proteína de interés en la retina están en marcha para aumentar la evaluación de la eficacia. Una forma potencial de lograr esto es inyectando un vector viral que contenga un gen reportero (como la proteína fluorescente verde; GFP) y evaluar la expresión de GFP mediante inmunohistoquímica. Otra forma de evaluar la eficacia es usar PCR cuantitativa para evaluar los niveles de expresión transgénica.
El desarrollo de protocolos para las inyecciones de IVT en animales grandes es un paso crucial hacia el tratamiento de enfermedades degenerativas de la retina, particularmente enfermedades con un componente genético, ya que la terapia génica IVT es una terapéutica potencial prometedora. Para las enfermedades degenerativas donde la retina ya es frágil, el tratamiento de IVT presenta menos riesgo de desprendimiento o desgarro de retina. Dadas las similitudes en tamaño y estructura de los ojos de ovejas y humanos, la optimización de la dosis y el volumen de las inyecciones de IVT en ovejas es un paso relevante hacia la traducción a la clínica. Este documento detalla el protocolo para la inyección de IVT en el ojo de oveja, que es seguro y muestra una tasa muy baja de respuestas inflamatorias oculares. Este método también demuestra la eficacia de la terapia génica ocular mediada por AAV9 para tratar el componente retiniano de NCL en ovejas.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer al Dr. Steve Heap (BVSc, CertVOphthal) por su ayuda en el establecimiento de este protocolo y la realización de las inyecciones descritas por Murray et al.15. Los autores también reconocen la financiación de CureKids New Zealand, la Fundación de Investigación Médica de Canterbury, Neurogene Inc y la Asociación de Apoyo e Investigación de la Enfermedad de Batten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL low dead-space safety syringe with permanently attached 0.5 inch needle | Fisher Scientific, Auckland, New Zealand | 05-561-28 | Covidien Monoject Tuberculin Safety syringe or similar |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Sigma Aldrich | HS4323 | Autoclave tubes to sterilise prior to use |
| Anesthesia machine with gas bench and monitor | Hyvet Anesthesia, Christchurch, New Zealand | ||
| Antibiotic eye drops | Teva Pharma Ltd, Auckland, New Zealand | Commercial name: Chlorafast (0.5% chloramphenicol) | |
| BrightMount plus anti-fade mounting medium | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab103748 | |
| DAPI (4′ ,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | 10236276001 | |
| Diazepam sedative | Ilium, Troy Laboratories Pty Ltd, Tauranga, New Zealand | 5 mg/mL | |
| Endotracheal tubes | Flexicare Medical Ltd, Mountain Ash, United Kingdom | Standard, cuffed. Sizes 7, 7.5, or 8 depending on sheep size | |
| Eye speculum | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | KP151/14 | Nopa Barraquer-Colibri (10 mm) |
| Fenestrated surgical drape | Amtech Medical Ltd, Whanganui, New Zealand | DI583 | Or similar |
| Filter Tips | Interlab, Auckland, New Zealand | 10, 200, and 1,000 µL | |
| Formaldehyde solution (37%) | Fisher Scientific, Auckland, New Zealand | AJA809-2.5PL | Make up to 10% in distilled water with 0.9% NaCl |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 594 | Invitrogen Carlsbad, CA, USA | A-11012 | Use at a dilution of 1:500 |
| Isoflurane anesthetic | Attane, Bayer Animal Health, Auckland, New Zealand | ||
| Ketamine HCl anesthetic/analgesic | PhoenixPharm Distributors Ltd, Auckland, New Zealand | 100 mg/mL | |
| Laryngoscope (veterinary) | KaWe Medical, Denmark | Miller C blade, size 2 | |
| Needles | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | 302025 | BD Hypodermic Needles, or similar |
| Non-steroidal anti-inflammatory | Boehringer Ingelheim (NZ) Ltd, Auckland, New Zealand | 49402/008 | Commercial name: Metacam 20 (20 mg/mL meloxicam) |
| Non-toothed forceps | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | AB864/16 | Or similar |
| Non-toothed hemostat | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | AA150/12 | Or similar |
| Normal goat serum | Thermo Fisher Scientific, Christchurch, New Zealand | 16210072 | |
| Oxygen (medical) | BOC Gas, Christchurch, New Zealand | D2 cylinder, gas code 180 | |
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific, Christchurch, New Zealand | 10010023 | Sterile, filtered |
| Povidone-Iodine solution | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | 005835 | Commercial name: Betadine (10% povidone-iodine) |
| Rabbit anti-cow glial fibrillary acidic protein (GFAP) | Dako, Glostrup, Denmark | Z0334 | Use at a dilution of 1:2,500 |
| Self-complementary adeno-associated virus serotype 9, containing the chicken beta action (CBh) promoter and codon-optimized ovine CLN5 | University of North Carolina Vector Core, NC, USA. | scAAV9/CBh-oCLN5opt | |
| Sodium Chloride 0.9% IV Solution | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | AHB1322 | Commercial name: Saline solution |
| Subcutaneous antibiotics | Intervet Schering Plough Animal Health Ltd, Wellington, New Zealand | Commercial name: Duplocillin LA (150,000 IU/mL procaine penicillin and 115,000 IU/mL benzathine penicillin) | |
| Surgical sharp blunt curved scissors | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | SSSHBLC130 | |
| Terumo Syringe Luer Lock | Amtech Medical Ltd, Whanganui, New Zealand | SH159/SH160 | Sterile syringes; 10 mL for drawing up induction drugs, 20 mL for drawing up saline |
| Virkon Disinfectant Powder | EBOS Group Ltd, Christchurch, NZ | 28461115 |
References
- Himawan, E., et al. Drug delivery to retinal photoreceptors. Drug Discovery Today. 24 (8), 1637-1643 (2019).
- Murray, S. J., Mitchell, N. L. Ocular therapies for neuronal ceroid lipofuscinoses: More than meets the eye. Neural Regeneration Research. 17 (8), 1755-1756 (2022).
- Bishop, P. N. Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel. Progress in Retinal and Eye Research. 19 (3), 323-344 (2000).
- Grzybowski, A., et al. update on intravitreal injections: Euretina expert consensus recommendations. Ophthalmologica. 239 (4), 181-193 (2018).
- Pavlou, M., et al. Novel AAV capsids for intravitreal gene therapy of photoreceptor disorders. EMBO Molecular Medicine. 13 (4), 13392 (2021).
- Kousi, M., Lehesjoki, A. -E., Mole, S. E. Update of the mutation spectrum and clinical correlations of over 360 mutations in eight genes that underlie the neuronal ceroid lipofuscinoses. Human Mutation. 33 (1), 42-63 (2012).
- Wibbeler, E., et al. Cerliponase alfa for the treatment of atypical phenotypes of CLN2 disease: A retrospective case series. Journal of Child Neurology. 36 (6), 468-474 (2021).
- Schulz, A., et al. Study of intraventricular cerliponase alfa for CLN2 disease. The New England Journal of Medicine. 378 (20), 1898-1907 (2018).
- Mitchell, N. L., et al. Longitudinal in vivo monitoring of the CNS demonstrates the efficacy of gene therapy in a sheep model of CLN5 Batten disease. Molecular Therapy. 26 (10), 2366-2378 (2018).
- Murray, S. J., Mitchell, N. L. Natural history of retinal degeneration in ovine models of CLN5 and CLN6 neuronal ceroid lipofuscinoses. Scientific Reports. 12 (1), 3670 (2022).
- Russell, K. N., Mitchell, N. L., Wellby, M. P., Barrell, G. K., Palmer, D. N. Electroretinography data from ovine models of CLN5 and CLN6 neuronal ceroid lipofuscinoses. Data in Brief. 37, 107188 (2021).
- Shafiee, A., McIntire, G. L., Sidebotham, L. C., Ward, K. W. Experimental determination and allometric prediction of vitreous volume, and retina and lens weights in Göttingen minipigs. Veterinary Ophthalmology. 11 (3), 193-196 (2008).
- Shinozaki, A., Hosaka, Y., Imagawa, T., Uehara, M. Topography of ganglion cells and photoreceptors in the sheep retina. The Journal of Comparative Neurology. 518 (12), 2305-2315 (2010).
- Frugier, T., et al. A new large animal model of CLN5 neuronal ceroid lipofuscinosis in Borderdale sheep is caused by a nucleotide substitution at a consensus splice site (c.571+1G>A) leading to excision of exon 3. Neurobiology of Disease. 29 (2), 306-315 (2008).
- Murray, S. J., et al. Intravitreal gene therapy protects against retinal dysfunction and degeneration in sheep with CLN5 Batten disease. Experimental Eye Research. 207, 108600 (2021).
- Ross, M., et al. Outer retinal transduction by AAV2-7m8 following intravitreal injection in a sheep model of CNGA3 achromatopsia. Gene Therapy. , (2021).
- Boyd, R. F., et al. Photoreceptor-targeted gene delivery using intravitreally administered AAV vectors in dogs. Gene Therapy. 23 (2), 223-230 (2016).
- Dalkara, D., et al. In vivo-directed evolution of a new adeno-associated virus for therapeutic outer retinal gene delivery from the vitreous. Science Translational Medicine. 5 (189), (2013).
- Gearhart, P. M., Gearhart, C., Thompson, D. A., Petersen-Jones, S. M. Improvement of visual performance with intravitreal administration of 9-cis-retinal in Rpe65-mutant dogs. Archives of Ophthalmology. 128 (11), 1442-1448 (2010).
- Ross, M., et al. Evaluation of photoreceptor transduction efficacy of capsid-modified adeno-associated viral vectors following intravitreal and subretinal delivery in sheep. Human Gene Therapy. 31 (13-14), 719-729 (2020).
- Kotterman, M. A., et al. Antibody neutralization poses a barrier to intravitreal adeno-associated viral vector gene delivery to non-human primates. Gene Therapy. 22 (2), 116-126 (2015).
- Whitehead, M., Osborne, A., Yu-Wai-Man, P., Martin, K. Humoral immune responses to AAV gene therapy in the ocular compartment. Biological Reviews. 96 (4), 1616-1644 (2021).
- Yun, C., Oh, J., Hwang, S. -Y., Kim, S. -W., Huh, K. Subconjunctival hemorrhage after intravitreal injection of anti-vascular endothelial growth factor. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (9), 1465-1470 (2015).
- Christensen, L., Cerda, A., Olson, J. L. Real-time measurement of needle forces and acute pressure changes during intravitreal injections. Clinical & Experimental Ophthalmology. 45 (8), 820-827 (2017).
- Allmendinger, A., Butt, Y. L., Mueller, C. Intraocular pressure and injection forces during intravitreal injection into enucleated porcine eyes. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 166, 87-93 (2021).
- Ross, M., Ofri, R. The future of retinal gene therapy: Evolving from subretinal to intravitreal vector delivery. Neural Regeneration Research. 16 (9), 1751-1759 (2021).
- Henein, C., et al. Hydrodynamics of intravitreal injections into liquid vitreous substitutes. Pharmaceutics. 11 (8), 371 (2019).
- Park, I., Park, H. S., Kim, H. K., Chung, W. K., Kim, K. Real-time measurement of intraocular pressure variation during automatic intravitreal injections: An ex-vivo experimental study using porcine eyes. PloS One. 16 (8), 0256344 (2021).
- Willekens, K., et al. Intravitreally injected fluid dispersion: Importance of injection technique. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (3), 1434-1441 (2017).
- Peynshaert, K., Devoldere, J., De Smedt, S. C., Remaut, K. In vitro and ex vivo models to study drug delivery barriers in the posterior segment of the eye. Advanced Drug Delivery Reviews. 126, 44-57 (2018).
- Kiss, S. Vector Considerations for Ocular Gene Therapy. Adeno-associated virus vectors offer a safe and effective tool for gene delivery. Retinal Physician. 17, 40-45 (2020).
- Kleine Holthaus, S. -M., et al. Gene therapy targeting the inner retina rescues the retinal phenotype in a mouse model of CLN3 Batten disease. Human Gene Therapy. 31 (13-14), 709-718 (2020).
- Kleine Holthaus, S. -M., et al. Neonatal brain-directed gene therapy rescues a mouse model of neurodegenerative CLN6 Batten disease. Human Molecular Genetics. 28 (23), 3867-3879 (2019).
