Summary
Este protocolo describe la preparación de tejido nervioso ciático entero de rata para la estimulación electrofisiológica ex vivo y el registro en un baño salino perfundido de dos compartimentos, regulado ambientalmente.
Abstract
Las preparaciones ex vivo permiten el estudio de muchos procesos neurofisiológicos de forma aislada del resto del cuerpo, preservando al mismo tiempo la estructura del tejido local. Este trabajo describe la preparación de los nervios ciáticos de rata para la neurofisiología ex vivo, incluida la preparación tampón, los procedimientos en animales, la configuración del equipo y el registro neurofisiológico. Este trabajo proporciona una visión general de los diferentes tipos de experimentos posibles con este método. El método descrito tiene como objetivo proporcionar 6 h de estimulación y registro en el tejido nervioso periférico extraído en condiciones estrechamente controladas para una consistencia óptima en los resultados. Los resultados obtenidos utilizando este método son potenciales de acción compuestos de fibra A (CAP) con amplitudes de pico a pico en el rango de milivoltios durante toda la duración del experimento. Las amplitudes y formas de CAP son consistentes y confiables, lo que las hace útiles para probar y comparar nuevos electrodos con modelos existentes, o los efectos de las intervenciones en el tejido, como el uso de productos químicos, alteraciones quirúrgicas o técnicas de estimulación neuromoduladora. Se probaron tanto electrodos de manguito convencionales disponibles comercialmente con contactos de platino-iridio como electrodos de elastómero conductor hechos a medida y dieron resultados similares en términos de respuesta de fuerza-duración del estímulo nervioso.
Introduction
La comprensión actual de la función nerviosa fundamental según lo modelado in silico carece de varios aspectos, especialmente con respecto a los efectos de la compartimentación del tejido nervioso fuera del soma, el axón y las dendritas. Las interacciones axon-mielina todavía son poco conocidas, como lo demuestra el hecho de que incluso los modelos nerviosos computacionales detallados como MRG1 (para nervios de mamíferos) que capturan adecuadamente la respuesta de estimulación eléctrica convencional, no capturan otros comportamientos observados experimentalmente, como el arrastre de bloque de alta frecuencia2 o la respuesta de inicio secundario3.
Este protocolo proporciona un método para investigar eficientemente los procesos neurofisiológicos a nivel nervioso en un modelo animal de laboratorio pequeño agudo, utilizando un protocolo de preparación estandarizado para aislar el nervio, controlar su entorno y eliminarlo de un contexto in vivo a un contexto ex vivo. Esto evitará otros procesos corporales o anestésicos utilizados por los protocolos de estimulación nerviosa in vivo para alterar el comportamiento nervioso y confundir los resultados medidos o su interpretación 4,5. Esto permite el desarrollo de modelos más realistas que se centran únicamente en los efectos específicos de los tejidos nerviosos que son poco conocidos. Este protocolo también es útil como banco de pruebas para la nueva estimulación nerviosa y el registro de materiales y geometrías de electrodos, así como nuevos paradigmas de estimulación como el bloque de alta frecuencia 2,3. Las variaciones de esta técnica se han utilizado previamente para estudiar la fisiología nerviosa en condiciones estrictamente controladas6, por ejemplo, para medir la dinámica y las propiedades de los canales iónicos o los efectos de los anestésicos locales7.
Esta técnica aporta varias ventajas frente a alternativas como la experimentación aguda in vivo con pequeños animales8. La técnica evita la necesidad de mantener la profundidad de la anestesia a medida que el tejido se ha extraído del cuerpo, reduciendo la cantidad de equipo requerido, como un difusor anestésico, un concentrador de oxígeno y una almohadilla térmica. Esto simplifica el protocolo experimental, reduciendo el riesgo de errores. Como los anestésicos pueden alterar potencialmente la función nerviosa4, esta técnica garantiza que las medidas no se vean confundidas por los efectos secundarios de estos compuestos anestésicos. Finalmente, esta técnica es más apropiada que los experimentos agudos in vivo a la hora de estudiar los efectos de compuestos neurotóxicos como la tetrodotoxina, que mataría a un animal anestesiado por parálisis.
Las secciones nerviosas periféricas son un sistema ex vivo único, ya que existe una alta probabilidad de que las fibras responsables de las señales neuronales registradas no contengan ningún soma. Como estos normalmente se ubicarían, para las neuronas motoras, en la columna vertebral y para las neuronas sensoriales en los ganglios de la raíz dorsal junto a la columna vertebral, la preparación de una sección del nervio de los mamíferos se puede modelar aproximadamente como una colección de membranas tubulares con canales iónicos, abiertos en ambos extremos9. El metabolismo es mantenido por las mitocondrias localizadas en el axón en el momento de la disección tisular10. Se recomienda la sutura de los extremos abiertos del axolemma después de la extracción para cerrarlos y, por lo tanto, ayudar a mantener los gradientes iónicos existentes a través de la membrana, que son esenciales para la función nerviosa normal.
Para mantener la homeostasis tisular fuera del cuerpo, varias variables ambientales deben ser estrictamente controladas. Estos son la temperatura11, la oxigenación12, la osmolaridad, el pH13,14 y el acceso a la glucosa para mantener el metabolismo. Para este protocolo, el enfoque es utilizar un tampón Krebs-Henseleitmodificado 15,16 (mKHB) continuamente aireado con una mezcla de oxígeno y dióxido de carbono. El mKHB pertenece a la familia de tampones cardiopléjicos 6,17 utilizados para preservar tejidos disecados fuera del cuerpo, por ejemplo, en experimentos ex vivo. Estos tampones no contienen hemoglobina, antibióticos o antifúngicos y, por lo tanto, solo son adecuados para preparaciones que involucran pequeñas cantidades de tejido durante un tiempo limitado. El control del pH se logró con el par redox de carbonato y dióxido de carbono, requiriendo una aireación constante del tampón con dióxido de carbono para mantener el equilibrio del pH. Esto es para evitar el uso de otros agentes amortiguadores comunes como HEPES, que puede modificar la función de las células nerviosas18. Para oxigenar el tampón y proporcionar control del pH, se utilizó una mezcla de 5% de dióxido de carbono en oxígeno llamada carbógeno (95% O2, 5% CO2). Se utilizó un agitador de calentamiento para el control de la temperatura de un recipiente tampón, y el tampón se perfundió a través de un baño nervioso y luego se recirculó al recipiente inicial. Un experimento típico duraría 6-8 h antes de que el nervio pierda su viabilidad y ya no responda lo suficiente a la estimulación para que las medidas sean representativas del tejido sano.
Para optimizar la relación señal-ruido, se utilizaron electrodos de cloruro de plata para la grabación, que se prepararon de acuerdo con los métodos descritos anteriormente19. Para la estimulación, se puede utilizar una combinación de electrodos de manguito de platino comerciales listos para usar y electrodos de manguito de polímero conductor hechos a medida. Los electrodos conductores de manguito de polímero tienen capacidades de carga notablemente más altas, que son útiles cuando se estimula el nervio utilizando formas de onda de alta amplitud20.
El estimulador utilizado en este protocolo ha sido descrito previamente20. La documentación, los archivos de diseño y los scripts de software para usarlo están disponibles públicamente21. Se pueden utilizar otros estimuladores para ejecutar este protocolo; sin embargo, el estimulador personalizado también es capaz de bloquearel bloque 2,20 de corriente alternativa de alta frecuencia (HFAC), lo que permite una gama más amplia de experimentos de neurofisiología. Para usar el bloque HFAC, se recomiendan manguitos de elastómero conductor para evitar daños en el nervio. Los manguitos nerviosos de elastómero conductor son matrices de electrodos blandos y totalmente poliméricos producidos a partir de elastómeros conductores como componente conductor y polidimetilsiloxano como aislamiento22. Los dispositivos se fabricaron en una configuración bipolar utilizando técnicas convencionales de microfabricación láser.
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Protocol
Todos los cuidados y procedimientos de los animales se realizaron bajo licencias apropiadas emitidas por el Ministerio del Interior del Reino Unido en virtud de la Ley de Animales (Procedimientos Científicos) (1986) y fueron aprobados por la Junta de Bienestar Animal y Revisión Ética del Imperial College de Londres.
1. Preparación de tampones
NOTA: Esta parte del protocolo se puede llevar a cabo mucho antes que el resto del protocolo, excepto para los pasos finales que implican la preparación de Krebs-Henseleit Buffer modificado (mKHB) a una concentración de 1x.
- Preparar una solución de stock deCaCl 2 de 1 M
- Añadir 14.701 g de CaCl2 dihidratado a un vaso de precipitados limpio de 100 ml. Agregue ~ 75 ml de agua desionizada y revuelva hasta la disolución completa de la sal.
- Transfiera la solución a un matraz graduado de 100 ml y agregue agua desionizada hasta que se hayan alcanzado los 100 ml de volumen. Transfiera la solución a una botella y guárdela en un refrigerador a 4 °C.
- Preparar 10x stock concentrado de mKHB
- Agregue 66.03 g de cloruro de sodio (NaCl), 3.57 g de cloruro de potasio (KCl), 1.63 g de fosfato de dihidrógeno de potasio (KH2PO4) y 1.44 g de sulfato de magnesio a un vaso de precipitados de 2 L.
- Agregue ~ 750 ml de agua desionizada al vaso de precipitados y revuelva hasta que las sales se hayan disuelto (puede haber pequeños cristales de sal en la parte inferior). Añadir 25 ml de solución madre de CaCl2 de 1 M (paso 1.1) y remover; asegúrese de que esta sea la última sal añadida.
- Transfiera la solución a un matraz graduado de 1 L y agregue agua desionizada para alcanzar un volumen total de 1 L. Transfiera la solución a una botella de 1 L. Guarde el concentrado 10x mKHB a 4 °C en un refrigerador.
NOTA: El stock concentrado de mKHB se puede almacenar durante aproximadamente 1 mes antes del reemplazo.
- Preparar la placa de Petri de disección (recubrimiento)
- Prepare una placa de Petri de vidrio limpio (120 mm de diámetro) para cubrir lavando y secando la placa cuidadosamente.
- Siguiendo las instrucciones del fabricante para el uso y curado del recubrimiento alcoxi conformado, cubra la parte inferior de la placa de Petri con ~ 3-5 mm de recubrimiento vertiendo cuidadosamente la mezcla de recubrimiento conformado en el plato hasta que se haya alcanzado el grosor deseado.
- Curar el recubrimiento en horno a 60 °C hasta que quede firme al tacto. La placa de Petri de disección ya está lista.
NOTA: La limpieza suave del plato después de cada uso asegurará que el recubrimiento dure años antes de que se necesite el reemplazo. Al reemplazar el recubrimiento, asegúrese de eliminar todo el material de recubrimiento antes de aplicar un nuevo recubrimiento. Tenga en cuenta que el recubrimiento alcoxi conformado (Tabla de Materiales) utilizado en este protocolo tiene una vida útil inferior a un año.
2. Preparaciones previas a la disección
NOTA: Este paso inicia el experimento. Los siguientes pasos deben llevarse a cabo el mismo día, en este orden.
- Preparar 1x mKHB
- Prepare un vaso de precipitados limpio de 2 L para el tampón. Transfiera 200 mL de stock de 10x mKHB al vaso de precipitados de 2 L. Añadir 2,1 g de carbonato de sodio (NaHCO3) y 0,99 g de dextrosa anhidra (D-glucosa) al vaso de precipitados de 2 L.
- Agregue aproximadamente 1 L de agua desionizada al vaso de precipitados. Revuelva hasta que las sales se hayan disuelto por completo. Transfiera la solución a un matraz graduado de 2 L y agregue agua desionizada para alcanzar un volumen total de 2 L.
- Transfiera la solución a una botella de vidrio de 2 L colocada en un agitador de calefacción con la temperatura establecida en 37 ° C.
NOTA: El agitador de calefacción más pequeño a menudo no podrá alcanzar la temperatura objetivo de 37 ° C debido a la inercia térmica de grandes recipientes llenos de agua. Ajuste la temperatura hacia arriba para que el contenido de la botella alcance los 37 ° C con agitación. Controle la temperatura durante el experimento y baje la temperatura establecida en caso de rebasamiento. - Coloque un termómetro en la botella de 2 L para controlar la temperatura, utilizando pinzas para evitar que el termómetro se vea afectado por la pulga agitadora. Airear el tampón con carbógeno durante un mínimo de 30 min para oxigenar la solución. Esto debería establecer el pH en 7.4. Mida el pH con un medidor de pH para asegurarse de que está dentro de 0.1 unidades de pH de 7.4 (a 37 ° C).
NOTA: Para ajustar el pH a 7.4, use ácido clorhídrico o hidróxido de sodio cuando sea necesario. - Llene dos tubos de centrífuga de 15 ml y una botella de 100 ml con mKHB y colóquelos sobre hielo para que se enfríen.
NOTA: Los tubos de la centrífuga y la botella se pueden limpiar y reutilizar después de cada experimento sin autoclave. - Para las partes posteriores del experimento, continúe aireando el tampón en la botella de 2 L con carbógeno a 37 ° C con agitación continua.
NOTA: El uso no supervisado de carbógeno puede ser peligroso si no existen sistemas automáticos para cortar el flujo de gas en caso de fuga. Un sensor automatizado y una válvula de cierre electrónico pueden mitigar esto; de lo contrario, se debe dejar que una persona supervise el equipo si la disección se lleva a cabo en una habitación diferente. En todos los casos, se debe usar un sensor de oxígeno cerca de la configuración para advertir a los operadores cuando la concentración de oxígeno ambiental se eleva por encima del 25%. Use una habitación con ventilación activa si es posible.
- Encienda el dispositivo de adquisición de señal, el preamplificador de bajo ruido, el filtro de ruido de línea y el osciloscopio para la grabación y la estimulación, para permitir suficiente tiempo para la estabilización de la temperatura.
- Asegúrese de que todos los aparatos de control eléctricos estén configurados correctamente
- Ajuste el preamplificador de bajo ruido a la entrada acoplada a CA con el filtro de paso de banda de entrada establecido en 6 dB de roll-off por década, y las frecuencias de corte establecidas en 30 Hz y 3 kHz para los filtros de paso alto y paso bajo, respectivamente.
- Establezca la ganancia del preamplificador de bajo ruido en 100.
3. Anestesia animal y eutanasia
NOTA: Para los estudios se utilizaron ratas hembras entre 250 y 330 g (Tabla de Materiales).
- Preparar herramientas quirúrgicas y consumibles: tijeras rectas de 12 cm (romas); Tijeras de resorte en ángulo de borde de corte de 2 mm; Tijeras finas de 4 cm, afiladas o semiafiladas; #7 Pinzas Dumont; Fórceps finos en ángulo de 45° y seda o hilo de sutura 6-0.
- Coloque la rata en un recipiente o cámara de anestesia. Conecte el oxígeno y el difusor anestésico al recipiente. Establezca la concentración de anestésico (isoflurano) al 3,5% y espere aproximadamente 10 minutos o hasta que el animal muestre signos de anestesia, como la pérdida del reflejo de enderezamiento.
- Después de que la rata muestre signos de anestesia, confirme la pérdida de conciencia con una prueba de reflejo de abstinencia de pellizco en el dedo del pie. Proceda solo cuando no haya retiro del dedo del pie; de lo contrario, compruebe todas las conexiones y los niveles de anestésico en el difusor y repita el paso 3.2.
- Saque al animal del recipiente y proceda con la dislocación cervical, seguida de una incisión de una arteria femoral para confirmar la muerte.
4. Protocolo de disección
NOTA: Coloque el animal con el vientre hacia abajo en la mesa de disección. Repita los siguientes pasos para ambas piernas. Por lo general, la pierna derecha se disecciona primero.
- Sosteniendo el tobillo firmemente entre el pulgar, el dedo índice y el dedo medio, corte el tendón calcáneo con tijeras romas rectas de 12 cm.
- Con tijeras finas y afiladas, haga una incisión en la piel desde el tendón calcáneo a lo largo de la parte posterior de la pierna hasta la base de la columna vertebral, teniendo cuidado de no diseccionar el tejido muscular debajo.
- Usando fórceps finos y tijeras finas, haga incisiones cuidadosas a través de las capas musculares cerca de la mitad de la parte posterior de la pierna hasta que el nervio ciático esté expuesto. Tan pronto como el nervio ciático sea visible, hidrate la cavidad usando mKHB helado para evitar que el nervio se seque.
- Usando hemostáticos, separe los colgajos de piel de cada lado y mantenga la incisión abierta para un trabajo de disección más fino. A partir de la ubicación de la incisión del tendón calcáneo, con tijeras finas, interrumpe el músculo en el lado medial de la pierna para liberar el nervio. Continúe manteniendo los niveles de humedad en el área con mKHB helado.
- A medida que el nervio está expuesto mientras se mueve hacia arriba de la pierna, diseccione el tejido muscular suprayacente. Libere el nervio más cercano a la columna vertebral de los tejidos conectivos hasta llegar a la hendidura espinal, momento en el que hay una torcedura en el nervio. No intente limpiar el nervio todavía, ya que la velocidad es esencial en esta etapa.
- Corte el nervio lo más cerca posible de la columna vertebral con tijeras finas. Para facilitar la disección, tire muy suavemente del extremo del nervio cerca del tobillo con fórceps. Nunca pellizque el nervio en el medio, sino solo los extremos. Nunca tire de un nervio tenso.
OPCIONAL: En este punto, si el tiempo lo permite, se puede realizar la sutura de ambos extremos del nervio para ayudar a mantener la viabilidad. Mantenga el manejo al mínimo para evitar daños. Si no hay tiempo suficiente (consulte el paso 4.5), omita este paso y siga el paso 5.2 más adelante. - Coloque el nervio diseccionado en el tubo centrífugo de 15 ml lleno de mKHB (paso 2.1.5), cierre el tubo y vuelva a colocar el tubo sobre hielo hasta el inicio del procedimiento de limpieza.
- Repita los pasos 4.1-4.7 para la otra pierna. Idealmente, cada nervio debe tardar de 5 a 10 minutos en extraerse, con el fin de maximizar la viabilidad del tejido.
5. Procedimiento de limpieza de nervios
- Llene la placa de Petri recubierta aproximadamente hasta la mitad con mKHB oxigenado refrigerado. Coloque uno de los nervios ciáticos disecados en el plato y fije ambos extremos del nervio al plato de modo que el nervio esté recto sin torceduras, torsiones o giros. Fije el nervio lo más cerca posible de los extremos.
- Usando suturas de seda 6-0 o hilo fino, ate un nudo doble alrededor de cada extremo del nervio para evitar la fuga de citosol en el tampón. Coloque los nudos justo al lado de los alfileres de insectos en el lado más cercano al centro del nervio, ya que esto evitará la fuga de tejido nervioso en el tampón. No realice este paso si el nervio ha sido previamente ligado.
- Usando el microscopio para mayor precisión y las tijeras de resorte en ángulo de 2 mm, elimine la grasa, los vasos sanguíneos y el tejido muscular del nervio. Pode cualquier rama nerviosa que no se utilizará en el protocolo de estimulación y registro.
- Cada 5 minutos de limpieza, reemplace el tampón con mKHB oxigenado fresco y refrigerado. Use fórceps finos para tirar de los tejidos conectivos, la grasa y los vasos sanguíneos para facilitar la disección.
- Coloque los nervios de nuevo en los tubos de transporte llenos de mKHB fresco oxigenado refrigerado y coloque los tubos sobre hielo.
6. Configuración del equipo
NOTA: La configuración del equipo utilizada para llevar a cabo experimentos se ilustra en la Figura 1. Brevemente, consiste en un baño nervioso de doble compartimento, una botella de 2 L colocada en un agitador de calefacción, una fuente de carbógeno para la aireación tampón, y un tubo para permitir que el tampón fluya de la botella al baño, y de regreso a la botella usando una bomba peristáltica. El baño se puede mecanizar con plexiglás o imprimir en 3D a partir de materiales estancos. Tiene una profundidad de aproximadamente 2 cm, y la partición que separa las dos cámaras del baño cuenta con un orificio de 1,5 mm de diámetro para permitir el enhebrado de un nervio periférico a través de ambas cámaras. Una cámara es grande, debe tener al menos 4 o 5 cm de largo y se llenará con tampón. La otra cámara debe tener al menos 3 cm de largo y se llenará con silicona o aceite mineral. El baño no debe hacerse demasiado grande, ya que esto degradará el control de la perfusión, la temperatura y el pH. Se pueden requerir diferentes tamaños de baño dependiendo del tamaño del tejido nervioso que se está estudiando.
- Prepare un baño nervioso limpio de doble cámara (consulte el Archivo complementario para conocer las especificaciones de diseño). Coloque el baño de nervios por debajo del nivel de la botella de 2 L colocada en el agitador de calefacción, utilizando cabezales y pinzas de jefe de laboratorio estándar. Conecte el desagüe del baño a la entrada de la bomba peristáltica.
- Conecte la salida de la bomba peristáltica a un tubo que conduce de vuelta a la botella tampón de 2 L. Conecte la entrada del baño a un tubo con una válvula de flujo ajustable y coloque el tubo dentro de la botella de 2 L. Use una válvula de tres vías con una jeringa conectada a la salida central para ayudar a cebar el tubo como un sifón para la entrada de búfer asistida por gravedad.
- Prepare el sifón extrayendo la jeringa hasta que el tampón fluya hacia él. Configure la válvula de tal manera que el caudal de amortiguación en el baño sea ~ 5-6 mL·min-1. El flujo se puede aumentar inicialmente para llenar el baño. Una vez que el nivel del amortiguador del baño haya alcanzado el drenaje, coloque los nervios en el baño.
- Usando un alfiler de insecto, asegure el extremo del nervio en la esquina de la cámara de baño llena de tampón. Usando fórceps finos en ángulo de 45 ° y pellizcando el nervio solo en los extremos, enhebra cuidadosamente el nervio para ser estimulado a través del orificio en la partición entre las dos cámaras de baño.
- Asegure el otro extremo del nervio en la cámara de aceite del baño con un alfiler de insecto, asegurándose de que el nervio esté recto sin estirarse y esté libre de torceduras y giros. Usando grasa de silicona, haga un sello para evitar la fuga de amortiguación de la cámara de amortiguación a la cámara de aceite. Llene la cámara de aceite con silicona o aceite mineral.
- Coloque los ganchos de electrodo de grabación Ag/AgCl en la cámara del baño de aceite y asegúrelos con cabezales de jefe y pinzas. Cubra la porción del nervio en el baño de aceite sobre los ganchos sin tirar del nervio tenso. No pellizque el nervio; use pinzas en ángulo para levantar el nervio sin pellizcar.
- Ajuste o repare el sello de grasa de silicona si se observa alguna fuga después de mover el nervio.
- Conecte el electrodo ag/AgCl de referencia a la toma a tierra del amplificador y colóquelo en la cámara de baño llena de tampón asegurándolo con una pinza de laboratorio.
7. Implantación de electrodos en el nervio en el baño
- Prepare un electrodo limpio del manguito nervioso para la estimulación de acuerdo con la referencia21. Coloque el electrodo en la cámara de baño llena de tampón. Usando pinzas o pinzas finas con puntas romas o en ángulo, abra el electrodo en el baño para mojar el interior del manguito.
- Si quedan burbujas, use una jeringa fina para extraer el tampón del baño y forzar las burbujas a salir del manguito. Con una pinza debajo del nervio, abra suavemente el manguito y deslícelo debajo del nervio. Cierre el manguito alrededor del nervio, teniendo cuidado de evitar cualquier torcedura o torsión del nervio.
- Conecte el electrodo de estimulación al estimulador y asegure el cable del electrodo de estimulación con cinta adhesiva. Conecte el electrodo de retorno de corriente al estimulador y asegure el cable con cinta adhesiva. Si usa una lámina de platino cuadrada como electrodo de retorno de corriente, coloque la hoja lejos del nervio en el baño.
8. Estimulación y grabación
- Conecte la salida de señal TTL del estimulador al canal 4 del osciloscopio, que se utilizará para activar el osciloscopio. En la pantalla del osciloscopio, presione la pestaña Canal de activación y especifique el Canal 4 como canal de activación. Ajuste el nivel del gatillo a 1 V usando la perilla Nivel .
- En el osciloscopio, establezca la resolución de tiempo a 1 ms/división y la resolución de voltaje a 10 mV/división. Centrar la referencia del desencadenador en el tiempo y establecer el nivel del disparador en 1 V.
NOTA: Siga los pasos 8.3 a 8.6 si utiliza el estimulador personalizado (consulte la Tabla de materiales). Se supone que el software de MATLAB y los controladores de dispositivo se han instalado en el ordenador del laboratorio utilizando instrucciones proporcionadas libremente en línea para el estimulador neuronal personalizado21. De lo contrario, siga las instrucciones del fabricante para el uso de un estimulador disponible comercialmente como alternativa. - Conecte el estimulador a la computadora del laboratorio. Encienda el estimulador conectando la fuente de alimentación de la batería a la entrada de alimentación. Inicie el software MATLAB en el equipo del laboratorio.
- Ejecute el script personalizado de MATLAB: HFAC_4ch_Stimulator_Initialization.m (Tabla de materiales).
NOTA: El cable de comunicación USB entre la computadora y el estimulador debe parpadear en verde. Si no lo hace, entonces hay un error de configuración y se deben verificar la fuente de alimentación y las conexiones. - Abra el script de MATLAB: HFAC_4ch_Monophasic_Stimulation.m (Tabla de materiales). Editando directamente el script de MATLAB, establezca los parámetros de la siguiente manera: amplitud del pulso del estimulador = -300 μA, ancho del pulso del estimulador = 300 μs, número de pulsos del estimulador = 10 y tiempo del estimulador entre pulsos = 1 s.
- Inicie el protocolo de estimulación haciendo clic en Ejecutar en el software MATLAB.
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Representative Results
Los resultados representativos que se pueden obtener con este protocolo son los potenciales de acción compuestos consistentes de las fibras nerviosas de tipo A dentro del nervio ciático. Estos potenciales de acción suelen tener una amplitud de pico a pico de aproximadamente 1 mV en el electrodo y, por lo tanto, 100 mV una vez amplificados (Figura 2). Las amplitudes de estimulación y los anchos de pulso similares deben producir amplitudes CAP similares. Los electrodos conductores del manguito de elastómero generalmente requerirán amplitudes de estimulación ligeramente más altas para obtener la misma amplitud CAP en comparación con los electrodos de manguito de platino disponibles comercialmente. Esta diferencia es generalmente pequeña en comparación con la variación en la amplitud de estimulación requerida para estimular los nervios provenientes de diferentes animales. Esto se debe a que las pequeñas diferencias en el tamaño del nervio y el ajuste del manguito tienen un gran efecto en la amplitud de estimulación requerida para obtener una amplitud CAP específica, independientemente del material del manguito. Esto se puede utilizar para probar los efectos de diferentes composiciones tampón, como diferentes concentraciones de iones o la adición de sustancias excitadoras o inhibitorias nerviosas como la tetrodotoxina. Si la tubería de desecho del tampón se dirige a un contenedor adicional, la adición de sustancias que alteran la excitabilidad nerviosa se puede hacer temporal para el experimento, con tasas de lavado que dependen de la tasa de entrada del amortiguador.
La densidad de corriente mínima, calculada como la amplitud de estimulación dividida por el área de superficie de los electrodos de estimulación, requerida para activar las fibras de tipo A y obtener un potencial de acción compuesto observable del osciloscopio se trazuló frente al ancho de pulso en la Figura 3. Los resultados que se muestran en la Figura 3 representan la excitabilidad nerviosa típica tanto para los manguitos nerviosos de platino estándar disponibles comercialmente como para los manguitos nerviosos de elastómero conductores hechos a medida.
Los nervios extraídos deben permanecer viables durante aproximadamente 6 h después de la extracción y, por lo tanto, los experimentos deben encajar dentro de esta ventana de tiempo. La pérdida de viabilidad nerviosa conduce a una disminución progresiva de la amplitud cap y la velocidad de conducción. Después de que la amplitud potencial de acción disminuya por debajo del 50% de la amplitud inicial (al comienzo de la grabación), el nervio debe considerarse ya no viable ya que los resultados estarán significativamente sesgados. Los resultados representativos con respecto a la longevidad nerviosa se muestran en la Figura 4. Los nervios ciáticos derecho e izquierdo se extrajeron de un animal entre las 10:00 a.m. y las 11:00 a.m. en un día determinado. Los CAP iniciales se obtuvieron del nervio ciático derecho durante las pruebas iniciales antes de los experimentos, y los CAP estándar se obtuvieron de los nervios ciáticos izquierdo y derecho, que se habían mantenido vivos utilizando este protocolo, al final de los experimentos. Se observó una reducción mínima de la amplitud de la CAP con el nervio ciático derecho, mientras que la amplitud de la CAP del nervio ciático izquierdo a aproximadamente 3 mV fue similar a la del nervio ciático derecho al inicio del experimento más de 6 h después de la extracción del nervio.
Figura 1: Representación esquemática de la configuración experimental utilizada en el protocolo. Esta cifra ha sido modificada a partir de Rapeaux, A. et al. (2020)20. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: CAP representativos obtenidos ex vivo tras la estimulación mediante matrices de manguitos nerviosos elastómeros metálicos y conductores. Reproducido con modificaciones de Cuttaz, E. A. et al. (2021)22. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Umbral de activación de fibra A de matrices de manguitos de elastómero metálicos y conductores. Las barras de error representan la desviación estándar ±1 de la media. Reproducido con modificaciones de Cuttaz, E. A. et al. (2021)22. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: CAP representativos obtenidos ex vivo durante un día de experimentos y utilizando ambos nervios ciáticos de un animal. (A) CAP de fibra de tipo A obtenida cerca del mediodía del nervio ciático derecho. (B) CAP de fibra tipo A obtenida a media tarde del nervio ciático izquierdo. (C) CAP de fibra de tipo A obtenida al final de los experimentos con el mismo nervio ciático izquierdo en (B). El eje x corresponde a la hora del día en la que se tomaron las grabaciones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Expediente complementario. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
En este trabajo, describimos un protocolo para preparar los nervios ciáticos de rata para la neurofisiología ex vivo. La extracción de tejidos toma aproximadamente 30 minutos, incluida la manipulación de animales, la anestesia, el sacrificio y la disección, mientras que la limpieza de los nervios, la colocación en el baño y la implantación de electrodos deben requerir 30 minutos adicionales antes de que se pueda iniciar el registro. La preparación del búfer se puede llevar a cabo en 30 minutos, aunque esto se puede hacer antes del resto del experimento. Este tipo de preparación y experimento se ha utilizado y descrito en los últimos 7,12, utilizando tampones similares y para el mismo tipo de tejido. Sin embargo, según el conocimiento de los autores, esta es la primera vez que se proporciona una descripción de la preparación del búfer, la disección, la configuración del equipo y el registro posterior en el mismo documento.
Este protocolo puede permitir una amplia variedad de experimentos en neurofisiología que no serían posibles ni en contextos in vitro ni in vivo . Por ejemplo, una ventaja de las preparaciones ex vivo es que preservan la macro y microestructura del tejido extraído mientras aíslan este tejido del resto del cuerpo. Esto da como resultado una configuración más simple, ya que la anestesia no tiene que mantenerse, lo que de lo contrario es un requisito en los experimentos in vivo . En cuanto a la habilitación de experimentos, los preparados ex vivo permiten el uso de sustancias como la tetrodotoxina, que son difíciles de justificar en un contexto in vivo 23 ya que conllevan un alto riesgo para el animal. Cuando el uso de tales sustancias beneficia la investigación, son más fáciles de usar en preparaciones ex vivo . El uso del estimulador personalizado20 permite experimentos con el bloque HFAC para neuromodulación utilizando esta configuración experimental.
El paso más crítico en el protocolo es el paso de disección, porque incluso un pequeño error al usar las tijeras de disección puede dañar el nervio si no se tiene suficiente cuidado. La velocidad en esta etapa también es esencial, ya que el tejido debe extraerse rápidamente del cuerpo y colocarse en un tampón refrigerado para maximizar la viabilidad al comienzo de la grabación. Después de la extracción del tejido, si bien se debe tener cuidado al limpiar el nervio e implantar cualquier electrodo, el protocolo es más flexible con respecto al tiempo y, por lo tanto, el riesgo de error del operador es menor. Como los diámetros de los nervios y la colocación de los fascículos dentro de los nervios variarán de un animal a otro, se debe esperar cierta variabilidad en los resultados, incluso si se usan los mismos electrodos y el mismo protocolo de estimulación. El efecto de esta variabilidad se puede ver en las barras de error para los umbrales de estimulación en la Figura 3. Es importante no pellizcar el nervio en ninguna etapa de la preparación, ya que esto puede causar daños irreversibles en el tejido. Maneje el nervio solo por sus extremos usando fórceps y con mucho cuidado para no tirar del nervio tenso.
Varios aspectos del protocolo en su forma actual se pueden mejorar aumentando la cantidad de equipo y el tiempo de configuración. Para ayudar con el diagnóstico de posibles problemas con esta configuración experimental, las mediciones automatizadas de pH y oxígeno disuelto en el baño podrían ser útiles, pero no se han implementado aquí. Ambas mediciones pueden realizarse mediante métodos amperométricos o potenciométricos12,19. El equipo que requerirá un mantenimiento regular es el tubo y la cristalería, que acumula depósitos de sal con el tiempo. Los ganchos de grabación AgCl también requerirán un re-recubrimiento o reemplazo regular, junto con la referencia AgCl. Los electrodos de estimulación deben limpiarse después de cada uso, pero generalmente no requerirán reemplazo para muchos experimentos.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses.
DECLARACIÓN DE ACCESO ABIERTO:
A los efectos del acceso abierto, el autor ha aplicado una licencia creative common Attribution (CC BY) (cuando lo permita UKRI, 'Open Government License' o 'Creative Commons Attribution No-derivatives (CC BY-ND) license may be stated instead) a cualquier versión de Manuscrito Aceptado por el Autor que surja.
INTERCAMBIO DE DATOS:
Los datos brutos utilizados en las figuras de este artículo serán puestos a disposición por los autores, sin reservas indebidas.
Acknowledgments
Los autores reconocen al Dr. Gerald Hunsberger de GlaxoSmithKline Pharmaceuticals, King of Prussia, PA, EE.UU., y Galvani Bioelectronics (Stevenage, Reino Unido) por compartir su técnica original de preparación nerviosa con nosotros. Los autores reconocen a Robert Toth por el diseño del baño nervioso de doble cámara. Los autores reconocen la financiación de la subvención Healthcare Technologies Challenge Awards (HTCA) del Consejo de Investigación de Ingeniería y Ciencias Físicas (EPSRC). Los autores reconocen al High Performance Embedded and Distributed Systems Centre for Doctoral Training (HiPEDS CDT) del Imperial College de Londres por financiar a Adrien Rapeaux (EP/L016796/1). Adrien Rapeaux está financiado actualmente por el Instituto de Investigación de la Demencia del Reino Unido, Centro de Investigación y Tecnología de la Atención. Los autores agradecen a Zack Bailey del Imperial College, en el Departamento de Bioingeniería, por su ayuda con los experimentos y el acceso a los tejidos animales durante la producción del artículo de video de JoVE.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 L Glass bottle | VWR International Ltd | 215-1595 | Borosilicate glass |
| 1 L Glass graduated flask | VWR International Ltd | 612-3626 | Borosilicate glass |
| 2 L Glass bottle | VWR International Ltd | 215-1596 | Borosilicate glass |
| 2 L Glass graduated flask | VWR International Ltd | BRND937254 | Borosilicate glass |
| Adaptor, pneumatic, 8 mm to 1/4 NPT | RS UK | 536-2599 | push-to-fit straight adaptor between oxygen hose and gas dispersion tube |
| Alkoxy conformal coating | Farnell | 1971829 | ACC15 Alkoxy conformal coating for dissection petri dish preparation |
| Anesthetic | Chanelle | N/A | Isoflurane inhalation anesthetic, 250 mL bottle |
| Beaker, 2 L | VWR International Ltd | 213-0469 | Borosilicate glass |
| Bipolar nerve cuff | Cortec GMBH | N/A | 800 micron inner diameter, perpendicular lead out, no connector termination |
| Bossheads | N/A | N/A | Standard wet laboratory bossheads for attaching grippers to rods |
| Calcium Chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C7902-500g | 500 g in plastic bottle |
| Carbogen canister | BOC | N/A | F-size canister |
| Centrifuge Tubes, 15 mL volume | VWR International Ltd | 734-0451 | Falcon tubes |
| Conductive elastomer nerve cuff | N/A | N/A | high charge capacity nerve cuff for stimulation, see protocol for fabrication reference |
| Connector, Termimate | Mouser UK | 538-505073-1100-LP | These should be soldered to wire terminated with crocodile clips (see entry 11) |
| Crocodile clip connectors | RS UK | 212-1203 | These should be soldered to wire terminated with TermiMate connectors (see entry 10) |
| Deionized Water | N/A | N/A | Obtained from deionized water dispenser |
| Forceps angled 45 degrees | InterFocus Ltd | 91110-10 | Fine forceps, student range |
| Forceps standard Dumont #7 | InterFocus Ltd | 91197-00 | Student range forceps |
| Gas Disperson Tube, Porosity 3 | Merck | 12547866 | N/A |
| Glucose anhydrous, powder | VWR International Ltd | 101174Y | 500 g in plastic bottle |
| Grippers | N/A | N/A | Standard wet laboratory rod-mounted grippers |
| Heating Stirrer | RS UK | 768-9672 | Stuart US152 |
| Hemostats | N/A | N/A | Any hemostat >12 cm in length is suitable |
| Insect Pins, stainless steel, size 2 | InterFocus Ltd | 26001-45 | N/A |
| Laptop computer | N/A | N/A | Any laboratory-safe portable computer with at least 2 unused USB ports is suitable |
| Line Noise Filter | Digitimer | N/A | Humbug noise eliminator (50 Hz line noise filter) |
| Low-Noise Preamplifier, SR560 | Stanford Research Systems | SR560 | Low-noise voltage preamplifier |
| Magnesium Sulphate salt | VWR International Ltd | 291184P | 500g in plastic bottle |
| MATLAB scripts | Github | https://github.com/Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch | Initialization, calibration and stimulation scripts for the custom stimulator |
| MATLAB software | Mathworks | N/A | Standard package |
| Microscope Light, PL-2000 | Photonic | N/A | Light source with swan necks. Product may be obtained from third party supplier |
| Microscope, SMZ 745 | Nikon | SM745 | Stereoscopic Microscope |
| Mineral oil, non-toxic | VWR International Ltd | 31911.A1 | Oil for nerve bath |
| Nerve Bath | N/A | N/A | Plexiglas machined nerve bath, see protocol for details. |
| Oscilloscope | LeCroy | N/A | 434 Wavesurfer. Product may be obtained from 3rd party suppliers |
| Oxygen Hose, 1 meter | BOC | N/A | 1/4" NPT terminations |
| Oxygen Regulator | BOC | C106X/2B:3.5BAR-BS3-1/4"NPTF 230Bar | N/A |
| Peristaltic Pump P-1 | Pharmacia Biotech | N/A | Product may be obtained from third party supplier |
| Petri Dish, Glass | VWR International Ltd | 391-0580 | N/A |
| Potassium Chloride salt | Sigma Aldrich | P5405-250g | 250 g in plastic bottle |
| Potassium Dihydrogen Sulphate salt | Merck | 1.04873.0250 | 250 g in plastic bottle |
| Rat | Charles River Laboratories | N/A | Sprague Dawley, 250-330 grams, female |
| Reference electrode, ET072 | eDaQ (Australia) | ET072-1 | Silver silver-chloride reference electrode |
| Rod | N/A | N/A | Standard wet laboratory rods with fittings for stands |
| Scale | Sartorius | N/A | M-Power scale, for weighing powders. Product may be obtained from third-party suppliers |
| Scissors straight 12 cm edge | InterFocus Ltd | 91400-12 | blunt-blunt termination, student range |
| Signal Acquisition Device | Cambridge Electronic Design | Micro3-1401 | Micro3-1401 Multichannel ADC |
| Silicone grease, non-toxic | Farnell | 3821559 | for sealing of bath partition |
| Silicone tubing, 2 mm inner diameter | N/A | N/A | N/A |
| Silicone tubing, 5 mm inner diameter | N/A | N/A | N/A |
| Silver wire | Alfa Aesar | 41390 | 0.5 mm, annealed |
| Sodium Bicarbonate salt | Sigma Aldrich | S5761-500g | 500 g in plastic bottle |
| Sodium Chloride salt | VWR International Ltd | 27810.295 | 1 kg in plastic bottle |
| Spring scissors angled 2 mm edge | InterFocus Ltd | 15010-09 | N/A |
| Stand | N/A | N/A | Standard wet laboratory stands with sockets for rods |
| Stimulator | Digitimer | DS3 | DS3 or Custom Stimulator (see references) |
| Stirring flea | VWR International Ltd | 442-0270 | For use with the heating stirrer |
| Syringe tip, blunt, 1 mm diameter | N/A | N/A | N/A |
| Syringe tip, blunt, 2 mm diameter | N/A | N/A | N/A |
| Syringe, plastic, 10 mL volume | N/A | N/A | syringe should have luer lock fitting |
| Tape, water-resistant | N/A | N/A | For securing tubing and wiring to workbench |
| Thermometer | VWR International Ltd | 620-0806 | glass thermometer |
| USB Power Bank | RS UK | 135-1000 | Custom Stimulator power supply, fully charge before experiment. Not needed if using DS3 |
| Valve, Leuer Lock, 3-Way | VWR International Ltd | 229-7440 | For attaching syringe to bath feed tube and priming siphon |
References
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