Summary
Dit protocol beschrijft de voorbereiding van het hele heupzenuwweefsel van ratten voor ex vivo elektrofysiologische stimulatie en registratie in een milieugereguleerd, tweecompartimenten, doordrenkt zoutoplossingsbad.
Abstract
Ex vivo preparaten maken de studie van vele neurofysiologische processen in isolatie van de rest van het lichaam mogelijk met behoud van de lokale weefselstructuur. Dit werk beschrijft de voorbereiding van heupzenuwen bij ratten voor ex vivo neurofysiologie, inclusief buffervoorbereiding, dierprocedures, apparatuuropstelling en neurofysiologische registratie. Dit werk geeft een overzicht van de verschillende soorten experimenten die mogelijk zijn met deze methode. De geschetste methode is gericht op het bieden van 6 uur stimulatie en registratie op geëxtraheerd perifeer zenuwweefsel in strak gecontroleerde omstandigheden voor optimale consistentie in resultaten. Resultaten verkregen met behulp van deze methode zijn A-fibre compound action potentials (CAP) met piek-tot-piek amplitudes in het millivolt bereik over de gehele duur van het experiment. CAP-amplitudes en -vormen zijn consistent en betrouwbaar, waardoor ze nuttig zijn om nieuwe elektroden te testen en te vergelijken met bestaande modellen, of de effecten van interventies op het weefsel, zoals het gebruik van chemicaliën, chirurgische veranderingen of neuromodulerende stimulatietechnieken. Zowel conventionele in de handel verkrijgbare manchetelektroden met platina-iridiumcontacten als op maat gemaakte geleidende elastomeerelektroden werden getest en gaven vergelijkbare resultaten in termen van zenuwstimulussterkte-duurrespons.
Introduction
Het huidige begrip van de fundamentele zenuwfunctie zoals gemodelleerd in silico ontbreekt in verschillende aspecten, met name met betrekking tot de effecten van zenuwweefselcompartimentalisatie buiten de soma, axon en dendrieten. Axon-myeline-interacties worden nog steeds slecht begrepen, zoals blijkt uit het feit dat zelfs gedetailleerde computationele zenuwmodellen zoals MRG1 (voor zoogdierzenuwen) die de conventionele elektrische stimulatierespons adequaat vastleggen, geen ander experimenteel waargenomen gedrag vastleggen, zoals hoogfrequent blokoverdracht2 of secundaire aanvangsrespons3.
Dit protocol biedt een methode om neurofysiologische processen op zenuwniveau efficiënt te onderzoeken in een acuut klein proefdiermodel, met behulp van een gestandaardiseerd voorbereidingsprotocol om de zenuw te isoleren, de omgeving te beheersen en deze uit een in vivo context naar een ex vivo context te verwijderen. Dit voorkomt andere lichaamsprocessen of anesthetica die worden gebruikt door in vivo zenuwstimulatieprotocollen om het zenuwgedrag te veranderen en de gemeten resultaten of hun interpretatie te verstoren 4,5. Dit maakt de ontwikkeling mogelijk van meer realistische modellen die zich uitsluitend richten op effecten die specifiek zijn voor zenuwweefsels die slecht worden begrepen. Dit protocol is ook nuttig als testbed voor nieuwe zenuwstimulatie en opname-elektrodematerialen en geometrieën, evenals nieuwe stimulatieparadigma's zoals hoogfrequent blok 2,3. Variaties van deze techniek zijn eerder gebruikt om de zenuwfysiologie te bestuderen in strak gecontroleerde omstandigheden6, bijvoorbeeld om de dynamiek en eigenschappen van ionkanalen of de effecten van lokale anesthetica te meten7.
Deze techniek biedt verschillende voordelen ten opzichte van alternatieven zoals acute in vivo experimenten met kleine dieren8. De techniek voorkomt de noodzaak om de anesthesiediepte te behouden, omdat het weefsel uit het lichaam is geëxtraheerd, waardoor de hoeveelheid benodigde apparatuur zoals een verdovingsverspreider, zuurstofconcentrator en verwarmingspad wordt verminderd. Dit vereenvoudigt het experimentele protocol, waardoor het risico op fouten wordt verkleind. Omdat anesthetica mogelijk de zenuwfunctie kunnen veranderen4, zorgt deze techniek ervoor dat maatregelen niet worden verstoord door bijwerkingen van deze anesthetische verbindingen. Ten slotte is deze techniek geschikter dan acute in vivo experimenten bij het bestuderen van de effecten van neurotoxische verbindingen zoals tetrodotoxine, die een verdoofd dier door verlamming zouden doden.
Perifere zenuwsecties zijn een uniek ex vivo systeem omdat er een grote kans is dat de vezels die verantwoordelijk zijn voor geregistreerde neurale signalen geen soma bevatten. Omdat deze zich normaal gesproken zouden bevinden, kan voor motorneuronen in de wervelkolom en voor sensorische neuronen in de dorsale wortelganglia naast de wervelkolom, de voorbereiding van een deel van de zoogdierzenuw ruwweg worden gemodelleerd als een verzameling buisvormige membranen met ionkanalen, open aan beide uiteinden9. Het metabolisme wordt in stand gehouden door de mitochondriën in het axon op het moment van weefseldissectie10. Het hechten van de open uiteinden van het axolemma wordt na extractie aangemoedigd om ze te sluiten en daardoor bestaande ionische gradiënten over het membraan te behouden, die essentieel zijn voor de normale zenuwfunctie.
Om weefselhomeostase buiten het lichaam te behouden, moeten verschillende omgevingsvariabelen strak worden gecontroleerd. Dit zijn temperatuur11, oxygenatie12, osmolariteit, pH13,14 en toegang tot glucose om het metabolisme te behouden. Voor dit protocol is de aanpak om een gemodificeerde Krebs-Henseleit buffer15,16 (mKHB) te gebruiken die continu wordt belucht met een mengsel van zuurstof en koolstofdioxide. De mKHB behoort tot de familie van cardioplege buffers 6,17 die worden gebruikt om ontleed weefsel buiten het lichaam te bewaren, bijvoorbeeld in ex vivo experimenten. Deze buffers bevatten geen hemoglobine, antibiotica of antischimmelmiddelen en zijn daarom alleen geschikt voor preparaten waarbij gedurende een beperkte tijd kleine hoeveelheden weefsel betrokken zijn. pH-controle werd bereikt met het carbonaat- en koolstofdioxide-redoxpaar, waardoor constante beluchting van de buffer met koolstofdioxide nodig was om het pH-evenwicht te behouden. Dit is om het gebruik van andere veel voorkomende buffermiddelen zoals HEPES te vermijden, die de zenuwcelfunctie kunnen wijzigen18. Om de buffer van zuurstof te voorzien en de pH-regeling te regelen, werd een mengsel van 5% koolstofdioxide in zuurstof genaamd carbogen (95% O2, 5% CO2) gebruikt. Een verwarmingsroerder werd gebruikt voor temperatuurregeling van een buffercontainer en de buffer werd door een zenuwbad gedrenkt en vervolgens gerecirculeerd naar de startcontainer. Een typisch experiment zou 6-8 uur duren voordat de zenuw zijn levensvatbaarheid verliest en niet langer voldoende reageert op stimulatie om maatregelen representatief te maken voor gezond weefsel.
Om de signaal-ruisverhouding te optimaliseren, werden zilverchloride-elektroden gebruikt voor opname, die werden bereid volgens eerder beschreven methoden19. Voor stimulatie kan een combinatie van commerciële kant-en-klare platina manchetelektroden en op maat gemaakte geleidende polymeermanchetelektroden worden gebruikt. Geleidende polymeermanchetelektroden hebben aanzienlijk hogere laadcapaciteiten, die nuttig zijn bij het stimuleren van de zenuw met behulp van golfvormen met hoge amplitude20.
De stimulator die in dit protocol wordt gebruikt, is eerder beschreven20. Documentatie, ontwerpbestanden en softwarescripts om het te gebruiken zijn openbaar beschikbaar21. Andere stimulatoren kunnen worden gebruikt om dit protocol uit te voeren; de aangepaste stimulator is echter ook in staat tot hoogfrequente alternatieve stroom (HFAC) blok 2,20, wat een breder scala aan neurofysiologische experimenten mogelijk maakt. Om HFAC-blok te gebruiken, worden geleidende elastomeermanchetten aanbevolen om schade aan de zenuw te voorkomen. Geleidende elastomeerzenuwmanchetten zijn zachte en volledig polymere elektrode-arrays geproduceerd uit geleidende elastomeren als geleidende component en polydimethylsiloxaan als isolatie22. Apparaten werden vervaardigd in een bipolaire configuratie met behulp van conventionele lasermicrofabricagetechnieken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierverzorging en -procedures werden uitgevoerd onder de juiste licenties uitgegeven door het Britse ministerie van Binnenlandse Zaken onder de Animals (Scientific Procedures) Act (1986) en werden goedgekeurd door de Animal Welfare and Ethical Review Board van Imperial College London.
1. Bereiding van buffers
OPMERKING: Dit deel van het protocol kan ruim voor de rest van het protocol worden uitgevoerd, met uitzondering van de laatste stappen met betrekking tot de bereiding van gemodificeerde Krebs-Henseleit Buffer (mKHB) bij 1x concentratie.
- Bereid 1 M CaCl2 stockoplossing
- Voeg 14,701 g CaCl2 dihydraat toe aan een schoon bekerglas van 100 ml. Voeg ~ 75 ml gedeïoniseerd water toe en roer totdat het zout volledig is opgelost.
- Breng de oplossing over in een maatkolf van 100 ml en voeg gedeïoniseerd water toe totdat het volume van 100 ml is bereikt. Breng de oplossing over in een fles en bewaar deze in de koelkast bij 4 °C.
- Bereid 10x geconcentreerde mKHB voorraad
- Voeg 66,03 g natriumchloride (NaCl), 3,57 g kaliumchloride (KCl), 1,63 g kaliumdiwaterstoffosfaat (KH2PO4) en 1,44 g magnesiumsulfaat toe aan een bekerglas van 2 l.
- Voeg ~ 750 ml gedeïoniseerd water toe aan het bekerglas en roer totdat de zouten zijn opgelost (er kunnen kleine zoutkristallen op de bodem achterblijven). Voeg 25 ml 1 M CaCl2 stamoplossing (stap 1.1) toe en roer; zorg ervoor dat dit het laatste zout is dat is toegevoegd.
- Breng de oplossing over in een maatkolf van 1 L en voeg gedeïoniseerd water toe om een totaal volume van 1 L te bereiken. Breng de oplossing over naar een fles van 1 L. Bewaar geconcentreerd 10x mKHB bij 4 °C in de koelkast.
LET OP: Geconcentreerde mKHB-voorraad kan ongeveer 1 maand worden bewaard voordat deze wordt vervangen.
- Bereid dissectie Petrischaaltje (coating)
- Bereid een schone glazen petrischaal (120 mm diameter) voor op coating door de schaal zorgvuldig te wassen en te drogen.
- Volg de instructies van de fabrikant voor het gebruik en het uitharden van de conformale alkoxy-coating en bekleed de bodem van de petrischaal met ~ 3-5 mm coating door het conformale coatingmengsel voorzichtig in de schaal te gieten totdat de gewenste dikte is bereikt.
- Hard de coating uit in een oven op 60 °C tot deze stevig aanvoelt. De snij petrischaal is nu klaar.
OPMERKING: Een voorzichtige reiniging van de schaal na elk gebruik zorgt ervoor dat de coating jaren meegaat voordat vervanging nodig is. Zorg er bij het vervangen van de coating voor dat u al het coatingmateriaal verwijdert voordat u een nieuwe coating aanbrengt. Merk op dat de conformale alkoxycoating (Tabel van Materialen) die in dit protocol wordt gebruikt, korter dan een jaar houdbaar is.
2. Predissectiepreparaten
OPMERKING: Met deze stap wordt het experiment gestart. De onderstaande stappen moeten op dezelfde dag worden uitgevoerd, in deze volgorde.
- Bereid 1x mKHB voor
- Maak een schoon bekerglas van 2 L klaar voor de buffer. Breng 200 ml 10x mKHB voorraad over op het bekerglas van 2 L. Voeg 2,1 g natriumcarbonaat (NaHCO3) en 0,99 g watervrije Dextrose (D-glucose) toe aan het bekerglas van 2 L.
- Voeg ongeveer 1 L gedeïoniseerd water toe aan het bekerglas. Roer tot de zouten volledig zijn opgelost. Breng de oplossing over in een maatkolf van 2 L en voeg gedeïoniseerd water toe om een totaal volume van 2 L te bereiken.
- Breng de oplossing over in een glazen fles van 2 L op een verwarmingsroerder met de temperatuur ingesteld op 37 °C.
OPMERKING: Kleinere verwarmingsroerder zal vaak niet in staat zijn om de beoogde temperatuur van 37 °C te bereiken vanwege de thermische traagheid van grote containers vol water. Stel de temperatuur naar boven in zodat de inhoud van de fles op 37 °C komt met al roeren. Controleer de temperatuur tijdens het experiment en verlaag de ingestelde temperatuur in geval van overschrijding. - Plaats een thermometer in de fles van 2 L om de temperatuur te controleren, gebruik grijpers om te voorkomen dat de thermometer wordt beïnvloed door de roerende vlo. Belucht de buffer met carbogen gedurende minimaal 30 minuten om de oplossing van zuurstof te voorzien. Dit zou de pH op 7,4 moeten zetten. Meet de pH met een pH-meter om ervoor te zorgen dat deze zich binnen 0,1 pH-eenheden van 7,4 (bij 37 °C) bevindt.
OPMERKING: Om de pH aan te passen aan 7,4, gebruikt u indien nodig zoutzuur of natriumhydroxide. - Vul twee centrifugebuizen van 15 ml en een fles van 100 ml met mKHB en leg ze op ijs om af te koelen.
OPMERKING: De centrifugebuizen en de fles kunnen na elk experiment worden gereinigd en hergebruikt zonder autoclaveren. - Voor latere delen van het experiment moet u de buffer in de fles van 2 L met carbogen bij 37 °C blijven beluchten met continu roeren.
OPMERKING: Onbewaakt gebruik van carbogen kan gevaarlijk zijn als er geen automatische systemen zijn om de gasstroom af te sluiten in het geval van een lek. Een geautomatiseerde sensor en elektronische afsluitklep kunnen dit verzachten; anders moet een persoon worden overgelaten om toezicht te houden op de apparatuur als de dissectie in een andere ruimte plaatsvindt. In alle gevallen moet een zuurstofsensor in de buurt van de opstelling worden gebruikt om operators te waarschuwen wanneer de zuurstofconcentratie in de omgeving boven de 25% stijgt. Gebruik indien mogelijk een ruimte met actieve ventilatie.
- Schakel het signaalacquisitieapparaat, de ruisarme voorversterker, het lijnruisfilter en de oscilloscoop in voor opname en stimulatie, zodat er voldoende tijd is voor temperatuurstabilisatie.
- Zorg ervoor dat alle elektrische opnameapparatuur correct is geconfigureerd
- Stel de ruisarme voorversterker in op AC-gekoppelde ingang met het input band-pass filter ingesteld op 6 dB roll-off per decennium, en cutoff frequenties ingesteld op 30 Hz en 3 kHz voor respectievelijk de high-pass en low-pass filters.
- Stel de versterking van de geluidsarme voorversterker in op 100.
3. Dierlijke anesthesie en euthanasie
OPMERKING: Vrouwelijke ratten tussen 250 en 330 g (tabel met materialen) werden gebruikt voor de studies.
- Bereid chirurgische gereedschappen en verbruiksartikelen voor: 12 cm rechte schaar (stomp); 2 mm schuine veerschaar; 4 cm fijne schaar, scherp of halfscherp; #7 Dumont tang; 45° schuine fijne tang en 6-0 hechten zijde of draad.
- Plaats de rat in een verdovingscontainer of kamer. Sluit zuurstof en de verdovingsdiffuser aan op de container. Stel de anesthetische concentratie (isofluraan) in op 3,5% en wacht ongeveer 10 minuten of totdat het dier tekenen van anesthesie vertoont, zoals verlies van de rechtzettingsreflex.
- Nadat de rat tekenen van anesthesie vertoont, bevestigt u het bewustzijnsverlies met een teenknijperreflextest. Ga alleen verder als er geen teenonttrekking is; Controleer anders alle aansluitingen en anesthesieniveaus in de diffuser en herhaal stap 3.2.
- Haal het dier uit de container en ga verder met cervicale dislocatie, gevolgd door incisie van een dijbeenslagader voor bevestiging van de dood.
4. Dissectieprotocol
OPMERKING: Plaats het dier met zijn buik naar beneden op de snijtafel. Herhaal de volgende stappen voor beide benen. Meestal wordt het rechterbeen eerst ontleed.
- Houd de enkel stevig tussen duim, wijsvinger en middelvinger en snijd de calcaneale pees door met een rechte stompe schaar van 12 cm.
- Maak met een fijne scherpe schaar een huidincisie van de calcaneale pees langs de achterkant van het been helemaal tot aan de basis van de wervelkolom, waarbij u ervoor zorgt dat u het spierweefsel eronder niet ontleedt.
- Maak met behulp van een fijne tang en een fijne schaar zorgvuldige incisies door de spierlagen in het midden van de achterkant van het been totdat de heupzenuw wordt blootgesteld. Zodra de heupzenuw zichtbaar is, hydrateert u de holte met behulp van ijskoude mKHB om te voorkomen dat de zenuw uitdroogt.
- Gebruik hemostaten om de huidflappen aan elke kant uit elkaar te trekken en houd de incisie open voor fijner dissectiewerk. Beginnend bij de locatie van de calcaneale peesincisie, met een fijne schaar, onderbreek je de spier aan de mediale kant van het been om de zenuw te bevrijden. Blijf het vochtgehalte in het gebied handhaven met ijskoude mKHB.
- Als de zenuw wordt blootgesteld tijdens het bewegen van het been, ontleedt u het bovenliggende spierweefsel. Bevrijd de zenuw dichter bij de wervelkolom van bindweefsels totdat de spinale spleet wordt bereikt, waarna er een knik in de zenuw is. Probeer de zenuw nog niet schoon te maken, want snelheid is in dit stadium essentieel.
- Snijd de zenuw zo dicht mogelijk bij de wervelkolom met een fijne schaar. Om de dissectie gemakkelijker te maken, trekt u heel voorzichtig aan het uiteinde van de zenuw in de buurt van de enkel met behulp van een tang. Knijp nooit de zenuw in het midden, maar alleen de uiteinden. Trek nooit een zenuw strak.
OPTIONEEL: Op dit punt, als de tijd het toelaat, kan het hechten van beide uiteinden van de zenuw worden uitgevoerd om de levensvatbaarheid te helpen behouden. Beperk de behandeling tot een minimum om schade te voorkomen. Als er onvoldoende tijd is (zie stap 4.5), slaat u deze stap over en volgt u stap 5.2 later. - Plaats de ontlede zenuw in de centrifugebuis van 15 ml gevuld met mKHB (stap 2.1.5), sluit de buis en plaats de buis weer op ijs tot het begin van de reinigingsprocedure.
- Herhaal stap 4.1-4.7 voor het andere been. Idealiter zou elke zenuw 5-10 minuten nodig hebben om te extraheren, om de levensvatbaarheid van het weefsel te maximaliseren.
5. Zenuwreinigingsprocedure
- Vul de gecoate petrischaal ongeveer halverwege met gekoelde zuurstofrijke mKHB. Plaats een van de ontleedde heupzenuwen in de schaal en pin beide uiteinden van de zenuw vast aan de schaal, zodat de zenuw recht is zonder knikken, torsie of verdraaiingen. Pin de zenuw zo dicht mogelijk bij de uiteinden.
- Gebruik 6-0 zijden hechtingen of fijne draad en bind een dubbele knoop rond elk uiteinde van de zenuw om cytosollekkage in de buffer te voorkomen. Plaats de knopen net naast de insectenpennen aan de kant dichter bij het midden van de zenuw, omdat dit lekkage van zenuwweefsel in de buffer voorkomt. Voer deze stap niet uit als de zenuw eerder is geligeerd.
- Gebruik de microscoop voor precisie en de 2 mm schuine veerschaar, verwijder vet, bloedvaten en spierweefsel van de zenuw. Snoei zenuwtakken die niet worden gebruikt in het stimulatie- en opnameprotocol.
- Vervang elke 5 minuten reiniging de buffer door vers gekoelde zuurstofrijke mKHB. Gebruik een fijne tang om aan bindweefsels, vet en bloedvaten te trekken om de dissectie te vergemakkelijken.
- Plaats de zenuwen terug in de transportbuizen gevuld met vers zuurstofrijk gekoeld mKHB en plaats de buizen op ijs.
6. Apparatuur instellen
OPMERKING: De opstelling van de apparatuur die wordt gebruikt om experimenten uit te voeren, wordt geïllustreerd in figuur 1. Kortom, het bestaat uit een zenuwbad met twee compartimenten, een fles van 2 L die op een verwarmingsroerder wordt geplaatst, een bron van carbogen voor bufferbeluchting en slangen om de buffer van de fles naar het bad te laten stromen en terug naar de fles met behulp van een peristaltische pomp. Het bad kan worden bewerkt uit plexiglas of 3D-geprint van waterdichte materialen. Het heeft een diepte van ongeveer 2 cm en de scheidingswand die de twee kamers van het bad scheidt, heeft een gat met een diameter van 1,5 mm om het rijgen van een perifere zenuw over beide kamers mogelijk te maken. Eén kamer is groot, moet minstens 4 of 5 cm lang zijn en wordt gevuld met buffer. De andere kamer moet minstens 3 cm lang zijn en zal worden gevuld met siliconen of minerale olie. Het bad mag niet te groot worden gemaakt, omdat dit de controle van perfusie, temperatuur en pH zal verminderen. Verschillende badgroottes kunnen nodig zijn, afhankelijk van de grootte van het zenuwweefsel dat wordt bestudeerd.
- Bereid een schoon zenuwbad met twee kamers voor (zie aanvullend bestand voor ontwerpspecificaties). Plaats het zenuwbad onder het niveau van de fles van 2 L die op de verwarmingsroerder is geplaatst, met behulp van standaard laboratoriumbaaskoppen en grijpers. Sluit de afvoer van het bad aan op de peristaltische pompinlaat.
- Sluit de uitlaat van de peristaltische pomp aan op een buis die terugleidt naar de bufferfles van 2 L. Sluit de badinlaat aan op een buis met een instelbare stroomklep en plaats de buis in de fles van 2 L. Gebruik een driewegklep met een spuit aangesloten op de middelste uitlaat om te helpen bij het aanzuigen van de buis als een sifon voor zwaartekrachtondersteunde bufferinstroom.
- Bereid de sifon voor door de spuit te trekken totdat er een buffer in stroomt. Configureer de klep zodanig dat het debiet van de buffer in het bad ~5-6 ml·min-1 is. De stroom kan in eerste instantie worden verhoogd om het bad te vullen. Zodra het badbufferniveau de afvoer heeft bereikt, plaatst u de zenuwen in het bad.
- Bevestig met behulp van een insectenspeld het uiteinde van de zenuw op de hoek van de met buffer gevulde badkamer. Gebruik een 45° schuine fijne tang en knijp de zenuw alleen aan de uiteinden, rijg de zenuw voorzichtig door het gat in de scheidingswand tussen de twee badkamers.
- Beveilig het andere uiteinde van de zenuw in de oliekamer van het bad met een insectenpen, zodat de zenuw recht is zonder te worden uitgerekt en vrij is van knikken en draaien. Maak met siliconenvet een afdichting om bufferlekkage uit de bufferkamer in de oliekamer te voorkomen. Vul de oliekamer met siliconen of minerale olie.
- Plaats de Ag/AgCl-opname-elektrodehaken in de oliebadkamer en bevestig ze met baaskoppen en grijpers. Drapeer het deel van de zenuw in het oliebad over de haken zonder de zenuw strak te trekken. Knijp de zenuw niet; gebruik een schuine tang om de zenuw op te tillen zonder te knijpen.
- Pas de siliconen vetafdichting aan of repareer deze als er lekkage wordt waargenomen na het verplaatsen van de zenuw.
- Sluit de referentie Ag/AgCl-elektrode aan op de massa van de versterker en plaats de elektrode in de met buffer gevulde badkamer door deze vast te zetten met een laboratoriumgrijper.
7. Elektrode-implantatie op de zenuw in het bad
- Bereid een schone zenuwmanchetelektrode voor stimulatie volgens referentie21. Plaats de elektrode in de met buffer gevulde badkamer. Gebruik een tang of een fijn pincet met stompe of schuine uiteinden om de elektrode in het bad te openen om de binnenkant van de manchet nat te maken.
- Als er bubbels achterblijven, gebruik dan een fijne spuit om buffer uit het bad te halen en de bubbels uit de manchet te dwingen. Met een pincet onder de zenuw, open voorzichtig de manchet en schuif deze onder de zenuw. Sluit de manchet rond de zenuw en zorg ervoor dat knikken of draaien van de zenuw wordt voorkomen.
- Sluit de stimulatie-elektrode aan op de stimulator en bevestig de stimulatie-elektrodekabel met tape. Sluit de stroomretourelektrode aan op de stimulator en bevestig het lood met tape. Als u een vierkant platina vel als de huidige retourelektrode gebruikt, plaatst u het vel weg van de zenuw in het bad.
8. Stimulatie en opname
- Sluit de TTL-signaaluitgang van de stimulator aan op kanaal 4 van de oscilloscoop, die zal worden gebruikt om de oscilloscoop te activeren. Druk op het scherm van de oscilloscoop op het tabblad Triggerkanaal en geef Kanaal 4 op als het triggerkanaal. Stel het triggerniveau in op 1 V met behulp van de Level-knop .
- Stel op de oscilloscoop de tijdresolutie in op 1 ms/deling en de spanningsresolutie op 10 mV/deling. Centreer de triggerreferentie in de tijd en stel het triggerniveau in op 1 V.
OPMERKING: Volg de stappen 8.3 tot en met 8.6 als u de aangepaste stimulator gebruikt (zie materiaaltabel). Er wordt aangenomen dat de MATLAB-software en apparaatstuurprogramma's op de laboratoriumcomputer zijn geïnstalleerd met behulp van instructies die vrij online worden verstrekt voor de aangepaste neurale stimulator21. Volg anders de instructies van de fabrikant voor het gebruik van een in de handel verkrijgbare stimulator als alternatief. - Sluit de stimulator aan op de laboratoriumcomputer. Schakel de stimulator in door de batterijvoeding aan te sluiten op de voedingsingang. Start de MATLAB-software op de laboratoriumcomputer.
- Voer het aangepaste MATLAB-script uit: HFAC_4ch_Stimulator_Initialization.m (Materiaaltabel).
OPMERKING: De USB-communicatiekabel tussen de computer en de stimulator moet groen knipperen. Als dit niet het geval is, is er een configuratiefout en moeten de voeding en verbindingen worden geverifieerd. - Open het MATLAB-script: HFAC_4ch_Monophasic_Stimulation (Materiaaltafel). Door het MATLAB-script rechtstreeks te bewerken, stelt u de parameters als volgt in: stimulatorpulsamplitude = -300 μA, stimulatorpulsbreedte = 300 μs, stimulatoraantal pulsen = 10 en stimulatortijd tussen pulsen = 1 s.
- Start het stimulatieprotocol door te klikken op Uitvoeren in de MATLAB-software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representatieve resultaten die met dit protocol kunnen worden verkregen, zijn de consistente samengestelde actiepotentialen van A-type zenuwvezels in de heupzenuw. Deze actiepotentialen hebben doorgaans een piek-tot-piek amplitude van ongeveer 1 mV aan de elektrode en dus 100 mV eenmaal versterkt (figuur 2). Vergelijkbare stimulatieamplitudes en pulsbreedtes moeten vergelijkbare CAP-amplitudes opleveren. Geleidende elastomeer manchetelektroden vereisen over het algemeen iets hogere stimulatieamplitudes om dezelfde CAP-amplitude te verkrijgen in vergelijking met in de handel verkrijgbare platina manchetelektroden. Dit verschil is over het algemeen klein in vergelijking met de variatie in stimulatieamplitude die nodig is om zenuwen van verschillende dieren te stimuleren. Dit komt omdat kleine verschillen in zenuwgrootte en manchetfitting een groot effect hebben op de vereiste stimulatieamplitude om een specifieke CAP-amplitude te verkrijgen, ongeacht het manchetmateriaal. Dit kan worden gebruikt om de effecten van verschillende buffersamenstellingen te testen, zoals verschillende ionenconcentraties of de toevoeging van zenuwexcitatoire of remmende stoffen zoals tetrodotoxine. Als de bufferafvalpijp naar een extra container wordt geleid, kan de toevoeging van zenuwexcitabiliteitsveranderende stoffen tijdelijk worden gemaakt voor het experiment, met uitspoelsnelheden afhankelijk van de snelheid van bufferinstroom.
De minimale stroomdichtheid, berekend als de stimulatieamplitude gedeeld door het oppervlak van de stimulatie-elektroden, die nodig is om de A-type vezels te activeren en een waarneembaar samengesteld actiepotentiaal van de oscilloscoop te verkrijgen, werd in figuur 3 uitgezet versus pulsbreedte. De resultaten in figuur 3 vertegenwoordigen de typische prikkelbaarheid van de zenuwen voor zowel in de handel verkrijgbare standaard platina zenuwmanchetten als op maat gemaakte geleidende elastomeerzenuwmanchetten.
De geëxtraheerde zenuwen moeten ongeveer 6 uur na extractie levensvatbaar blijven en daarom moeten experimenten binnen dit tijdsbestek passen. Verlies van levensvatbaarheid van de zenuw leidt tot een progressieve afname van de CAP-amplitude en geleidingssnelheid. Nadat de actiepotentiaalamplitude afneemt tot minder dan 50% van de initiële amplitude (aan het begin van de opname), moet de zenuw als niet langer levensvatbaar worden beschouwd omdat de resultaten aanzienlijk scheef zullen zijn. Representatieve resultaten met betrekking tot de levensduur van de zenuwen zijn weergegeven in figuur 4. De rechter- en linker heupzenuwen werden op een bepaalde dag tussen 10:00 en 11:00 uur uit één dier gehaald. Initiële CAP's werden verkregen van de rechter heupzenuw tijdens de eerste tests vóór experimenten, en standaard CAP's werden verkregen van zowel linker- als rechter heupzenuwen, die in leven waren gehouden met behulp van dit protocol, aan het einde van de experimenten. Minimale CAP-amplitudereductie werd waargenomen met de rechter heupzenuw, terwijl de CAP-amplitude van de linker heupzenuw bij ongeveer 3 mV vergelijkbaar was met die van de rechter heupzenuw aan het begin van het experiment meer dan 6 uur na zenuwextractie.
Figuur 1: Schematische weergave van de experimentele opstelling die in het protocol wordt gebruikt. Dit cijfer is aangepast van Rapeaux, A. et al. (2020)20. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Representatieve CAP's ex vivo verkregen na stimulatie door metallische en geleidende elastomeer zenuwmanchet arrays. Gereproduceerd met wijzigingen uit Cuttaz, E. A. et al. (2021)22. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Activeringsdrempel van A-vezel van metalen en geleidende elastomeermanmanmanchetarrays. Foutbalken vertegenwoordigen ±1 standaardafwijking van het gemiddelde. Gereproduceerd met wijzigingen uit Cuttaz, E. A. et al. (2021)22. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Representatieve CAP's verkregen ex vivo gedurende een dag van experimenten en met behulp van beide heupzenuwen van één dier. (A) A-type vezel CAP verkregen rond het middaguur van de rechter heupzenuw. (B) A-type vezel CAP verkregen halverwege de middag van de linker heupzenuw. (C) A-type vezel CAP verkregen aan het einde van experimenten met dezelfde linker heupzenuw in (B). De x-as komt overeen met het tijdstip van de dag waarop de opnames zijn gemaakt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullend dossier. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit werk beschreven we een protocol om heupzenuwen van ratten voor te bereiden op ex vivo neurofysiologie. Weefselextractie duurt ongeveer 30 minuten, inclusief het hanteren van dieren, anesthesie, ruimen en dissectie, terwijl zenuwreiniging, plaatsing in het bad en elektrode-implantatie nog eens 30 minuten nodig hebben voordat de opname kan worden gestart. Buffervoorbereiding kan in 30 minuten worden uitgevoerd, hoewel dit vóór de rest van het experiment kan worden gedaan. Dit type voorbereiding en experiment is in de afgelopen 7,12 gebruikt en beschreven, met behulp van vergelijkbare buffers en voor hetzelfde weefseltype. Voor zover de auteurs weten, is dit echter de eerste keer dat een beschrijving van de buffervoorbereiding, dissectie, apparatuuropstelling en daaropvolgende registratie in hetzelfde document is gegeven.
Dit protocol kan een breed scala aan experimenten in de neurofysiologie mogelijk maken die niet mogelijk zouden zijn in in vitro of in vivo contexten. Een voordeel van ex vivo preparaten is bijvoorbeeld dat ze de macro- en microstructuur van het geëxtraheerde weefsel behouden terwijl ze dit weefsel isoleren van de rest van het lichaam. Dit resulteert in een eenvoudigere opstelling omdat anesthesie niet hoeft te worden onderhouden, wat anders een vereiste is in in vivo experimenten. Wat experimenten mogelijk maakt, maken ex-vivopreparaten het gebruik van stoffen zoals tetrodotoxine mogelijk, die in een in vivo context moeilijk te rechtvaardigen zijn23 omdat zij een hoog risico voor het dier inhouden. Wanneer het gebruik van dergelijke stoffen ten goede komt aan onderzoek, zijn ze gemakkelijker te gebruiken in ex vivo preparaten. Het gebruik van de aangepaste stimulator20 maakt experimenten mogelijk met behulp van HFAC-blok voor neuromodulatie met behulp van deze experimentele opstelling.
De meest kritische stap in het protocol is de dissectiestap, omdat zelfs een kleine fout met behulp van de dissectieschaar de zenuw kan beschadigen als er niet voldoende zorg wordt besteed. De snelheid in dit stadium is ook essentieel omdat het weefsel snel uit het lichaam moet worden geëxtraheerd en in een gekoelde buffer moet worden geplaatst om de levensvatbaarheid aan het begin van de opname te maximaliseren. Na weefselextractie, terwijl voorzichtigheid moet worden betracht bij het reinigen van de zenuw en het implanteren van eventuele elektroden, is het protocol flexibeler met betrekking tot de tijd en is het risico op fouten van de operator daarom lager. Aangezien zenuwdiameters en plaatsing van fascikels in de zenuwen van dier tot dier zullen variëren, moet enige variabiliteit in resultaten worden verwacht, zelfs als dezelfde elektroden en hetzelfde stimulatieprotocol worden gebruikt. Het effect van deze variabiliteit is te zien in de foutbalken voor stimulatiedrempels in figuur 3. Het is belangrijk om de zenuw in geen enkel stadium van het preparaat te beknijpen, omdat dit onomkeerbare schade aan het weefsel kan veroorzaken. Behandel de zenuw alleen aan de uiteinden met behulp van een tang en met grote zorg om de zenuw niet strak te trekken.
Verschillende aspecten van het protocol in zijn huidige vorm kunnen worden verbeterd door de hoeveelheid apparatuur en de insteltijd te vergroten. Om te helpen bij de diagnose van mogelijke problemen met deze experimentele opstelling, kunnen geautomatiseerde metingen van pH en opgeloste zuurstof in het bad nuttig zijn, maar zijn hier niet geïmplementeerd. Beide metingen kunnen worden uitgevoerd met behulp van amperometrische of potentiometrische methoden12,19. Apparatuur die regelmatig onderhoud vereist, is de buizen en het glaswerk, dat in de loop van de tijd zoutafzettingen accumuleert. De AgCl-opnamehaken moeten ook regelmatig opnieuw worden gecoat of vervangen, samen met de AgCl-referentie. Stimulatie-elektroden moeten na elk gebruik worden gereinigd, maar hoeven over het algemeen niet te worden vervangen voor veel experimenten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten.
OPEN ACCESS VERKLARING:
Met het oog op open access heeft de auteur een Creative Common Attribution (CC BY)-licentie (waar toegestaan door UKRI, 'Open Government License' of 'Creative Commons Attribution No-derivatives (CC BY-ND) licentie kan in plaats daarvan worden vermeld) toegepast op elke author accepted manuscript-versie die ontstaat.
GEGEVENS DELEN:
De ruwe gegevens die in de cijfers van dit artikel worden gebruikt, zullen door de auteurs beschikbaar worden gesteld, zonder onnodig voorbehoud.
Acknowledgments
De auteurs erkennen Dr. Gerald Hunsberger van GlaxoSmithKline Pharmaceuticals, King of Prussia, PA, USA en Galvani Bioelectronics (Stevenage, UK) voor het delen van hun originele zenuwvoorbereidingstechniek met ons. De auteurs erkennen Robert Toth voor het ontwerp van het dubbelkamerzenzenbad. De auteurs erkennen financiering van de Healthcare Technologies Challenge Awards (HTCA) subsidie van de Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC). De auteurs erkennen het High Performance Embedded and Distributed Systems Centre for Doctoral Training (HiPEDS CDT) van Imperial College London voor de financiering van Adrien Rapeaux (EP/L016796/1 ). Adrien Rapeaux wordt momenteel gefinancierd door het UK Dementia Research Institute, Care Research and Technology Centre. De auteurs bedanken Zack Bailey van Imperial College, in het Department of Bioengineering, voor hulp bij experimenten en toegang tot dierlijke weefsels tijdens de productie van het JoVE-videoartikel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 L Glass bottle | VWR International Ltd | 215-1595 | Borosilicate glass |
| 1 L Glass graduated flask | VWR International Ltd | 612-3626 | Borosilicate glass |
| 2 L Glass bottle | VWR International Ltd | 215-1596 | Borosilicate glass |
| 2 L Glass graduated flask | VWR International Ltd | BRND937254 | Borosilicate glass |
| Adaptor, pneumatic, 8 mm to 1/4 NPT | RS UK | 536-2599 | push-to-fit straight adaptor between oxygen hose and gas dispersion tube |
| Alkoxy conformal coating | Farnell | 1971829 | ACC15 Alkoxy conformal coating for dissection petri dish preparation |
| Anesthetic | Chanelle | N/A | Isoflurane inhalation anesthetic, 250 mL bottle |
| Beaker, 2 L | VWR International Ltd | 213-0469 | Borosilicate glass |
| Bipolar nerve cuff | Cortec GMBH | N/A | 800 micron inner diameter, perpendicular lead out, no connector termination |
| Bossheads | N/A | N/A | Standard wet laboratory bossheads for attaching grippers to rods |
| Calcium Chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C7902-500g | 500 g in plastic bottle |
| Carbogen canister | BOC | N/A | F-size canister |
| Centrifuge Tubes, 15 mL volume | VWR International Ltd | 734-0451 | Falcon tubes |
| Conductive elastomer nerve cuff | N/A | N/A | high charge capacity nerve cuff for stimulation, see protocol for fabrication reference |
| Connector, Termimate | Mouser UK | 538-505073-1100-LP | These should be soldered to wire terminated with crocodile clips (see entry 11) |
| Crocodile clip connectors | RS UK | 212-1203 | These should be soldered to wire terminated with TermiMate connectors (see entry 10) |
| Deionized Water | N/A | N/A | Obtained from deionized water dispenser |
| Forceps angled 45 degrees | InterFocus Ltd | 91110-10 | Fine forceps, student range |
| Forceps standard Dumont #7 | InterFocus Ltd | 91197-00 | Student range forceps |
| Gas Disperson Tube, Porosity 3 | Merck | 12547866 | N/A |
| Glucose anhydrous, powder | VWR International Ltd | 101174Y | 500 g in plastic bottle |
| Grippers | N/A | N/A | Standard wet laboratory rod-mounted grippers |
| Heating Stirrer | RS UK | 768-9672 | Stuart US152 |
| Hemostats | N/A | N/A | Any hemostat >12 cm in length is suitable |
| Insect Pins, stainless steel, size 2 | InterFocus Ltd | 26001-45 | N/A |
| Laptop computer | N/A | N/A | Any laboratory-safe portable computer with at least 2 unused USB ports is suitable |
| Line Noise Filter | Digitimer | N/A | Humbug noise eliminator (50 Hz line noise filter) |
| Low-Noise Preamplifier, SR560 | Stanford Research Systems | SR560 | Low-noise voltage preamplifier |
| Magnesium Sulphate salt | VWR International Ltd | 291184P | 500g in plastic bottle |
| MATLAB scripts | Github | https://github.com/Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch | Initialization, calibration and stimulation scripts for the custom stimulator |
| MATLAB software | Mathworks | N/A | Standard package |
| Microscope Light, PL-2000 | Photonic | N/A | Light source with swan necks. Product may be obtained from third party supplier |
| Microscope, SMZ 745 | Nikon | SM745 | Stereoscopic Microscope |
| Mineral oil, non-toxic | VWR International Ltd | 31911.A1 | Oil for nerve bath |
| Nerve Bath | N/A | N/A | Plexiglas machined nerve bath, see protocol for details. |
| Oscilloscope | LeCroy | N/A | 434 Wavesurfer. Product may be obtained from 3rd party suppliers |
| Oxygen Hose, 1 meter | BOC | N/A | 1/4" NPT terminations |
| Oxygen Regulator | BOC | C106X/2B:3.5BAR-BS3-1/4"NPTF 230Bar | N/A |
| Peristaltic Pump P-1 | Pharmacia Biotech | N/A | Product may be obtained from third party supplier |
| Petri Dish, Glass | VWR International Ltd | 391-0580 | N/A |
| Potassium Chloride salt | Sigma Aldrich | P5405-250g | 250 g in plastic bottle |
| Potassium Dihydrogen Sulphate salt | Merck | 1.04873.0250 | 250 g in plastic bottle |
| Rat | Charles River Laboratories | N/A | Sprague Dawley, 250-330 grams, female |
| Reference electrode, ET072 | eDaQ (Australia) | ET072-1 | Silver silver-chloride reference electrode |
| Rod | N/A | N/A | Standard wet laboratory rods with fittings for stands |
| Scale | Sartorius | N/A | M-Power scale, for weighing powders. Product may be obtained from third-party suppliers |
| Scissors straight 12 cm edge | InterFocus Ltd | 91400-12 | blunt-blunt termination, student range |
| Signal Acquisition Device | Cambridge Electronic Design | Micro3-1401 | Micro3-1401 Multichannel ADC |
| Silicone grease, non-toxic | Farnell | 3821559 | for sealing of bath partition |
| Silicone tubing, 2 mm inner diameter | N/A | N/A | N/A |
| Silicone tubing, 5 mm inner diameter | N/A | N/A | N/A |
| Silver wire | Alfa Aesar | 41390 | 0.5 mm, annealed |
| Sodium Bicarbonate salt | Sigma Aldrich | S5761-500g | 500 g in plastic bottle |
| Sodium Chloride salt | VWR International Ltd | 27810.295 | 1 kg in plastic bottle |
| Spring scissors angled 2 mm edge | InterFocus Ltd | 15010-09 | N/A |
| Stand | N/A | N/A | Standard wet laboratory stands with sockets for rods |
| Stimulator | Digitimer | DS3 | DS3 or Custom Stimulator (see references) |
| Stirring flea | VWR International Ltd | 442-0270 | For use with the heating stirrer |
| Syringe tip, blunt, 1 mm diameter | N/A | N/A | N/A |
| Syringe tip, blunt, 2 mm diameter | N/A | N/A | N/A |
| Syringe, plastic, 10 mL volume | N/A | N/A | syringe should have luer lock fitting |
| Tape, water-resistant | N/A | N/A | For securing tubing and wiring to workbench |
| Thermometer | VWR International Ltd | 620-0806 | glass thermometer |
| USB Power Bank | RS UK | 135-1000 | Custom Stimulator power supply, fully charge before experiment. Not needed if using DS3 |
| Valve, Leuer Lock, 3-Way | VWR International Ltd | 229-7440 | For attaching syringe to bath feed tube and priming siphon |
References
- McIntyre, C. C., Richardson, A. G., Grill, W. M. Modeling the excitability of mammalian nerve fibers: Influence of afterpotentials on the recovery cycle. Journal of Neurophysiology. 87 (2), 995-1006 (2002).
- Pelot, N. A., Grill, W. M. In vivo quantification of excitation and kilohertz frequency block of the rat vagus nerve. Journal of Neural Engineering. 17 (2), 026005 (2020).
- Patel, Y. A., Kim, B. S., Rountree, W. S., Butera, R. J. Kilohertz electrical stimulation nerve conduction block: Effects of electrode surface area. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 25 (10), 1906-1916 (2017).
- Kortelainen, J., Al-Nashash, H., Vipin, A., Thow, X. Y., All, A. The effect of anaesthesia on somatosensory evoked potential measurement in a rat model. Laboratory Animals. 50 (1), 63-66 (2016).
- Oh, S. S., Hayes, J. M., Sims-Robinson, C., Sullivan, K. A., Feldman, E. L. The effects of anesthesia on measures of nerve conduction velocity in male C57Bl6/J mice. Neuroscience Letters. 483 (2), 127-131 (2010).
- Kuffler, S. W., Williams, E. M. V. Small-nerve junctional potentials. The distribution of small motor nerves to frog skeletal muscle, and the membrane characteristics of the fibres they innervate. The Journal of Physiology. 121 (2), 289-317 (1953).
- Brunton, E., Blau, C. W., Nazarpour, K. Separability of neural responses to standardised mechanical stimulation of limbs. Scientific Reports. 7 (1), 11138 (2017).
- Schmalbruch, H. Fiber composition of the rat sciatic nerve. The Anatomical Record. 215 (1), 71-81 (1986).
- Kagiava, A., Theophilidis, G. Assessing the permeability of the rat sciatic nerve epineural sheath against compounds with local anesthetic activity: an ex vivo electrophysiological study. Toxicology Mechanisms and Methods. 23 (8), 634-640 (2013).
- Motori, E., et al. Neuronal metabolic rewiring promotes resilience to neurodegeneration caused by mitochondrial dysfunction. Science Advances. 6 (35), 8271 (2020).
- Schwarz, J. R., Eikhof, G. Na currents and action potentials in rat myelinated nerve fibres at 20 and 37° C. Pflügers Archiv. 409 (6), 569-577 (1987).
- Cranefield, P. F., Brink, F., Bronk, D. W. The oxygen uptake of the peripheral nerve of the rat. Journal of Neurochemistry. 1 (3), 245-249 (1957).
- Lehmann, J. E. The effect of changes in pH on the action of mammalian A nerve fibers. American Journal of Physiology-Legacy Content. 118 (3), 600-612 (1937).
- Hamm, L. L., Nakhoul, N., Hering-Smith, K. S.
- Minasian, S. M., Galagudza, M. M., Dmitriev, Y. V., Kurapeev, D. I., Vlasov, T. D. Myocardial protection against global ischemia with Krebs-Henseleit buffer-based cardioplegic solution. Journal of Cardiothoracic Surgery. 8, 60 (2013).
- Bailey, L. E., Ong, S. D. Krebs-Henseleit solution as a physiological buffer in perfused and superfused preparations. Journal of Pharmacological Methods. 1 (2), 171-175 (1978).
- Miller, D. J. Sydney Ringer: physiological saline, calcium and the contraction of the heart. The Journal of Physiology. 555, Pt 3 585-587 (2004).
- Yamamoto, D., Suzuki, N., Miledi, R. Blockage of chloride channels by HEPES buffer). Proceedings of the Royal Society of London. Series B. Biological Sciences. 230 (1258), 93-100 (1987).
- Janz, G. J., Taniguchi, H. The silver-silver halide electrodes. Preparation, stability, and standard potentials in aqueous and non-aqueous media. Chemical Reviews. 53 (3), 397-437 (1953).
- Rapeaux, A., Constandinou, T. G. An HFAC block-capable and module-extendable 4-channel stimulator for acute neurophysiology. Journal of Neural Engineering. 17 (4), 046013 (2020).
- Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch. Next Generation Neural Interfaces. , Available from: https://github.com/Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch> (2021).
- Cuttaz, E. A., Chapman, C. A. R., Syed, O., Goding, J. A., Stretchable Green, R. A. fully polymeric electrode arrays for peripheral nerve stimulation. Advanced Science. 8 (8), 2004033 (2021).
- Lossi, L., Merighi, A. The use of ex vivo rodent platforms in neuroscience translational research with attention to the 3Rs philosophy. Frontiers in Veterinary Science. 5, 164 (2018).
