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Cancer Research

एक्स वीवो माउस यूरोथेलियल कोशिकाओं में एडेनोवायरस-क्रे मध्यस्थता जीन विलोपन का ऑर्गेनोइड मॉडल

Published: May 5, 2022 doi: 10.3791/63855
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 2, 1,2
1Department of Urology, Roswell Park Comprehensive Cancer Center, 2Department of Pharmacology and Therapeutics, Roswell Park Comprehensive Cancer Center

Summary

यह प्रोटोकॉल ब्याज के जीन में विलोपन को परेशान करने वाले माउस यूरोथेलियल ऑर्गेनोइड्स की पीढ़ी और लक्षण वर्णन की प्रक्रिया का वर्णन करता है। विधियों में माउस यूरोथेलियल कोशिकाओं की कटाई, सीएमवी प्रमोटर के साथ क्रे अभिव्यक्ति ड्राइविंग एडेनोवायरस के साथ पूर्व विवो ट्रांसडक्शन, और इन विट्रो के साथ-साथ विवो लक्षण वर्णन में भी शामिल है।

Abstract

मूत्राशय का कैंसर एक अध्ययन क्षेत्र है, विशेष रूप से आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल (जीईएमएम) में। ऊतक-विशिष्ट क्रे और लोक्सपी साइटों के साथ अंतर्जात जीईएमएम सशर्त या इंड्यूसिबल जीन लक्ष्यीकरण के लिए सोने के मानक रहे हैं। तेजी से और अधिक कुशल प्रयोगात्मक मॉडल प्रदान करने के लिए, एक पूर्व विवो ऑर्गेनॉइड संस्कृति प्रणाली एडेनोवायरस क्रे और सामान्य यूरोथेलियल कोशिकाओं का उपयोग करके विकसित की जाती है जो ट्यूमर सप्रेसर्स टीआरपी 53, पीटीएन और आरबी 1 के कई लॉक्सपी एलील्स को ले जाती है। सामान्य यूरोथेलियल कोशिकाओं को एंजाइमेटिक रूप से ट्रिपल फ्लोक्स्ड चूहों (टीआरपी 53 एफ / एफ: पीटीएनएफ / एफ: आरबी 1एफ / एफ) के चार मूत्राशय से अलग किया जाता है। यूरोथेलियल कोशिकाओं को सीएमवी प्रमोटर (एडी 5 सीएमवीसीआरई) द्वारा संचालित एडेनोवायरस-क्रे के साथ पूर्व विवो को ट्रांसड्यूस किया जाता है। ट्रांसड्यूड मूत्राशय ऑर्गेनोइड्स को सुसंस्कृत, प्रचारित और इन विट्रो और विवो में विशेषता है। पीसीआर का उपयोग टीआरपी 53, पीटीएन और आरबी 1 में जीन विलोपन की पुष्टि करने के लिए किया जाता है। "ऑर्गेनोइड्स के इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) धुंधला होना यूरोथेलियल वंश मार्करों (सीके 5 और पी 63) की सकारात्मक अभिव्यक्ति को दर्शाता है". ऑर्गेनोइड्स को ट्यूमर विस्तार और धारावाहिक मार्ग के लिए मेजबान चूहों में चमड़े के नीचे इंजेक्ट किया जाता है। विद्वेष की इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) सीके 7, सीके 5, और पी 63 की सकारात्मक अभिव्यक्ति और सीके 8 और यूरोप्लाकिन 3 की नकारात्मक अभिव्यक्ति प्रदर्शित करती है। संक्षेप में, लोक्सपी साइटों के साथ इंजीनियर माउस यूरोथेलियल कोशिकाओं से एडेनोवायरस-मध्यस्थता जीन विलोपन परिभाषित आनुवंशिक परिवर्तनों की ट्यूमरजेनिक क्षमता का तेजी से परीक्षण करने के लिए एक कुशल तरीका है।

Introduction

मूत्राशय का कैंसर पुरुषों में चौथा सबसे आम कैंसर है और संयुक्त राज्य अमेरिका में सालाना 80,000 से अधिक लोगों को प्रभावित करताहै। प्लैटिनम-आधारित कीमोथेरेपी तीन दशकों से अधिक समय से उन्नत मूत्राशय के कैंसर वाले रोगियों के लिए देखभाल का मानक रहा है। मूत्राशय के कैंसर के उपचार के परिदृश्य को इम्यूनोथेरेपी (एंटी-पीडी -1 और एंटी-पीडी-एल 1 प्रतिरक्षा चेकपॉइंट इनहिबिटर), एर्डाफिटिनिब (एक फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फैक्टर रिसेप्टर इनहिबिटर) और एनफोर्टुमैब वेडोटिन (एक एंटीबॉडी-ड्रग कंजुगेट) 2,3,4 के हालिया खाद्य और औषधि प्रशासन (एफडीए) अनुमोदन द्वारा क्रांतिकारी बनाया गया है। हालांकि, कीमोथेरेपी या इम्यूनोथेरेपी की प्रतिक्रियाओं की भविष्यवाणी के लिए कोई नैदानिक रूप से अनुमोदित बायोमार्कर उपलब्ध नहीं हैं। सूचनात्मक प्रीक्लिनिकल मॉडल उत्पन्न करने की एक महत्वपूर्ण आवश्यकता है जो मूत्राशय के कैंसर की प्रगति को चलाने वाले तंत्र की समझ में सुधार कर सकते हैं और विभिन्न उपचार पद्धतियों के लिए भविष्य कहनेवाला बायोमार्कर विकसित कर सकते हैं।

मूत्राशय ट्रांसलेशनल अनुसंधान में एक बड़ी बाधा प्रीक्लिनिकल मॉडल की कमी है जो मानव मूत्राशय के कैंसर रोगजनन और उपचार प्रतिक्रियाओं 5,6 को दोहराती है। इन विट्रो 2 डी मॉडल (सेल लाइनों या सशर्त रूप से पुन: प्रोग्राम की गई कोशिकाओं), इन विट्रो 3 डी मॉडल (ऑर्गेनोइड्स, 3 डी प्रिंटिंग) और विवो मॉडल (विद्वेष, कार्सिनोजेन-प्रेरित, आनुवंशिक रूप से इंजीनियर मॉडल, और रोगी-व्युत्पन्न विद्वेष) 2,6 में कई प्रीक्लिनिकल मॉडल विकसित किए गए हैं। आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल (जीईएमएम) मूत्राशय के कैंसर जीव विज्ञान में कई अनुप्रयोगों के लिए उपयोगी होते हैं, जिसमें ट्यूमर फेनोटाइप के विश्लेषण, उम्मीदवार जीन और / या सिग्नलिंग मार्गों की यांत्रिक जांच, और चिकित्सीय प्रतिक्रियाओं 6,7 के प्रीक्लिनिकल मूल्यांकन शामिल हैं। जीईएमएम एक या एक से अधिक ट्यूमर सप्रेसर जीन में आनुवंशिक विलोपन को नियंत्रित करने के लिए साइट-विशिष्ट रिकॉम्बिनेस (क्रे-लोक्सपी) का उपयोग कर सकते हैं। कई जीन विलोपन के साथ वांछित जीईएमएम उत्पन्न करने की प्रक्रिया समय लेने वाली, श्रमसाध्य और महंगीहै 5. इस विधि का समग्र लक्ष्य सामान्य माउस यूरोथेलियल कोशिकाओं से मूत्राशय ट्रिपल नॉकआउट (टीकेओ) मॉडल स्थापित करने के लिए पूर्व विवो क्रे डिलीवरी की एक तेजी से और कुशल विधि विकसित करना है जो ट्रिपल फ्लोक्स्ड एलील्स (टीआरपी 53, पीटीएन, और आरबी 1) 8 ले जाते हैं। पूर्व विवो विधि का प्रमुख लाभ तेजी से वर्कफ़्लो (माउस प्रजनन के वर्षों के बजाय 1-2 सप्ताह) है। यह लेख फ्लोक्स्ड एलील्स, एक्स विवो एडेनोवायरस ट्रांसडक्शन, ऑर्गेनॉइड संस्कृतियों, और इन विट्रो में और इम्यूनोकॉम्पिटेंट सी 57 बीएल / 6 जे चूहों में विवो लक्षण वर्णन के साथ सामान्य यूरोथेलियल कोशिकाओं की कटाई के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। इस विधि का उपयोग आगे इम्यूनोकॉम्पीटेंट चूहों में नैदानिक रूप से प्रासंगिक मूत्राशय के कैंसर ऑर्गेनोइड्स उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है, जो फ्लोक्स्ड एलील्स के किसी भी संयोजन को परेशान करते हैं।

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Protocol

सभी पशु प्रक्रियाओं को रोसवेल पार्क व्यापक कैंसर केंद्र, बफेलो, एनवाई (1395 एम, जैव सुरक्षा 180501 और 180502) में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित किया गया था।
नोट:: एक ही दिन में चरण 1-3 निष्पादित करें।

1. माउस मूत्राशय का विच्छेदन

  1. विच्छेदन के लिए तैयारी
    1. कैंची, संदंश, 35 मिमी संस्कृति व्यंजन, 70% इथेनॉल, बाँझ धुंध, और साफ कागज तौलिए में बाँझ डीपीबीएस सहित सभी बाँझ उपकरणों को तैयार करें। विच्छेदन क्षेत्र की सभी सतहों को साफ करें। एफ: आरबी 1एफ / एफ (4 चूहों, 10 सप्ताह पुराना) उत्पन्न करें, जैसा कि पहले डॉ गुडरिच की प्रयोगशाला 8 में वर्णित है।
  2. इच्छामृत्यु और चीरा
    1. मिनट प्रवाह दर का उपयोग करके सीओ2 श्वासावरोध द्वारा चूहों को यूथेनाइज करें, इसके बाद ग्रीवा अव्यवस्था। 70% इथेनॉल के साथ विच्छेदन क्षेत्र को साफ करें और एक साफ पेपर तौलिया के साथ कवर करें।
    2. विच्छेदन क्षेत्र में धुंध पर माउस प्लेस. माउस पेट पर स्प्रे 70% इथेनॉल और बाँझ विच्छेदन कैंची का उपयोग करने के लिए एक निचले मिडलाइन पेट चीरा मूत्राशय उजागर बनाने के लिए।
  3. मूत्राशय विच्छेदन
    1. मूत्राशय को समझने के लिए संदंश का उपयोग करें और धीरे-धीरे खींचें ताकि द्विपक्षीय मूत्रवाहिनी जंक्शनों की पहचान की जा सके। दो मूत्रवाहिनी के उद्घाटन के बीच सीमा रेखा के बाद मूत्राशय फंडस को हटाने के लिए कैंची का उपयोग करें।
    2. डीपीबीएस के 2 एमएल के साथ एक बाँझ पकवान में मूत्राशय स्थानांतरण। फैटी और संयोजी ऊतक निकालें और मूत्राशय को डीपीबीएस के बाँझ 2 एमएल के साथ एक नए पकवान में डालें। इस समय, एडेनोवायरस को -80 डिग्री सेल्सियस स्टोरेज से बाहर निकालें और इसे बर्फ पर रखें।

2. यूरोथेलियल कोशिकाओं का पृथक्करण

  1. सेल पृथक्करण के लिए तैयारी
    1. संदंश, सर्जिकल स्केलपेल (हैंडल के साथ एक आकार 10 ब्लेड), 35 मिमी संस्कृति व्यंजनों में बाँझ डीपीबीएस, सीसीएम (-) के रूप में परिभाषित चारकोल-छीन एफबीएस के बिना पूर्ण संस्कृति माध्यम, कोलेजेनेज / हाइलूरोनिडेस मिश्रण, ट्रिप्सिन विकल्प के लिए पुनः संयोजक एंजाइम, डीपीबीएस में 10% चारकोल-छीन लिया गया एफबीएस सहित सभी बाँझ उपकरण तैयार करें।
      नोट: पूर्ण संस्कृति माध्यम (सीसीएम) में स्तन उपकला कोशिका विकास माध्यम प्रदान किए गए विकास कारकों और 5% चारकोल-छीन लिया गया एफबीएस, 1% एल-ग्लूटामाइन विकल्प, 100 μg / एमएल प्राइमोसिन, और 10 μM ताजा वाई -27632 के साथ पूरक होता है।
  2. मूत्राशय को कम करना और पचाना
    1. जैव सुरक्षा कैबिनेट में 35 मिमी पकवान में बाँझ डीपीबीएस के 2 एमएल के साथ मूत्राशय को फिर से स्थानांतरित करें और धोएं।
    2. सीसीएम (-) के 1 एमएल के साथ एक पकवान में चार चूहों से मूत्राशय के ऊतकों को ले लीजिए और एक सर्जिकल ब्लेड का उपयोग करके चार समान टुकड़ों में प्रत्येक मूत्राशय कीमा। माध्यम के लिए यूरोथेलियम सतह को बेनकाब करने के लिए मूत्राशय को प्रकट करने के लिए संदंश का उपयोग करें।
    3. मूत्राशय के टुकड़ों और मध्यम को 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें। पकवान को सीसीएम (-) 2 एक्स के 2 एमएल के साथ धो लें और इसे 5 एमएल की कुल मात्रा में एक अपकेंद्रित्र ट्यूब में इकट्ठा करें।
    4. एमएल कोलेजेनेज और 100 यू / एमएल हाइलूरोनिडेज़ की अंतिम एकाग्रता में कोलेजेनेस / हायलूरोनिडेज़ मिश्रण जोड़ें और ट्यूब को क्षैतिज रूप से 37 डिग्री सेल्सियस कक्षीय इनक्यूबेटिंग शेकर में 200 आरपीएम पर 30 मिनट के लिए रखें।
    5. ऊतक पाचन के बाद, ट्यूब में डीपीबीएस में 10% चारकोल-छीन एफबीएस की एक समान मात्रा (5 एमएल) जोड़ें और 5 मिनट के लिए 200 एक्स जी पर ट्यूब को अपकेंद्रित्र करें।
    6. निकालें और सतह पर तैरनेवाला त्यागें। सेल गोली में ट्रिप्सिन विकल्प के 2 एमएल जोड़ें और अच्छी तरह से मिलाएं। 37 डिग्री सेल्सियस और 4 मिनट के लिए 5% सीओ2 पर एक सेल इनक्यूबेटर में ट्यूब रखो।
    7. इनक्यूबेशन के बाद, एक मानक पी 1000 टिप के साथ 10x ऊपर और नीचे विंदुक। डीपीबीएस में 10% लकड़ी का कोयला-छीन एफबीएस के 5 एमएल जोड़ें।
    8. एक 100 μm बाँझ सेल छलनी के माध्यम से असंबद्ध कोशिकाओं तनाव। 5 मिनट के लिए 200 एक्स जी पर सेल निलंबन और अपकेंद्रित्र लीजिए।
  3. कोशिकाओं की गिनती और पुन: निलंबित करना
    1. निकालें और सतह पर तैरनेवाला त्यागें। सीसीएम के 1 एमएल के साथ सेल गोली को फिर से निलंबित करें।
    2. एक हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की संख्या की गणना करें और केवल 0.5 x 106 कोशिकाओं को 0.5 मिलीलीटर ताजा सीसीएम के साथ 24-अच्छी तरह से प्लेट के कुएं में प्लेट करें। इस समय, -20 डिग्री सेल्सियस भंडारण से एंजेलब्रेथ-होल्म-स्वार्म माउस सारकोमा कोशिकाओं ( सामग्री की तालिका देखें) के मैट्रिक्स अर्क निकालें और बर्फ पर पिघलना। 37 डिग्री सेल्सियस सेल इनक्यूबेटर में 6-अच्छी तरह से प्लेट को पूर्व-गर्म करें।
      नोट: शेष कोशिकाओं को गैर-वायरस पारगमन नियंत्रण के लिए सेल छर्रों के रूप में सेंट्रीफ्यूज और जमे हुए किया जा सकता है।

3. एडेनोवायरल ट्रांसडक्शन और चढ़ाना ऑर्गेनोइड्स

चेतावनी: कृपया एडेनोवायरस को संसाधित करते समय सतर्क रहें। प्रयोगशाला कर्मियों को जैव सुरक्षा स्तर 2 प्रथाओं का पालन करना चाहिए और 10% ब्लीच के साथ एडेनोवायरस कीटाणुरहित करना चाहिए।

  1. 24-अच्छी तरह से प्लेट में एडेनोवायरस (एडी 5 सीएमवीसीआरई; 1 एक्स 107 पीएफयू / असंबद्ध यूरोथेलियल कोशिकाओं के साथ अच्छी तरह से मिलाएं।
  2. पारगमन प्रभावकारिता को बढ़ाने के लिए, कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 300 एक्स जी पर 24-अच्छी तरह से प्लेट को केंद्रित करके स्पिनोक्यूलेशन करें। 37 डिग्री सेल्सियस पर एक सेल इनक्यूबेटर में 24-अच्छी तरह से प्लेट रखें और 1 घंटे के लिए 5% सीओ2 ।
  3. स्थानांतरण कोशिकाओं और एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में अच्छी तरह से मध्यम और 5 मिनट के लिए 200 एक्स जी पर अपकेंद्रित्र में। निकालें और सतह पर तैरनेवाला त्यागें, सीसीएम के 50 μL जोड़ें, और तल पर कोशिकाओं के साथ अच्छी तरह से मिश्रण।
  4. मैट्रिक्स निकालने के 140 μL जोड़ें और धीरे हवा के बुलबुले से बचने के लिए अच्छी तरह से मिश्रण। ऑर्गेनोइड्स के लिए गुंबद बनाने के लिए 50 μL / गुंबद पर पूर्व-गर्म 6-अच्छी तरह से प्लेट में जल्दी से समाधान जोड़ें।
  5. 5% सीओ2 के साथ धीरे से एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में प्लेट स्थानांतरण और गुंबदों 5 मिनट के लिए जमना करने के लिए अनुमति देते हैं। 6-अच्छी तरह से प्लेट को उल्टा-नीचे फ्लिप करें और अतिरिक्त 25 मिनट के लिए ठोसकरण जारी रखें।
  6. इनक्यूबेशन के बाद, प्रत्येक कुएं में 2.5 एमएल सीसीएम जोड़ें और प्लेट को ऑर्गेनॉइड संस्कृति के लिए इनक्यूबेटर में रखें।

4. ऑर्गेनॉइड संवर्धन और पासिंग

  1. हर 3-4 दिनों में माध्यम बदलें। ली एट अल में रिपोर्ट के अनुसार ऑर्गेनॉइड कल्चरिंग, पासिंग और फ्रीजिंग करें। फुजी एट अल में वर्णित नमूना प्रसंस्करण जेल का उपयोग करके ऑर्गेनोइड्स के एम्बेडिंग का प्रदर्शन करें।
  2. माध्यम निकालें और प्रत्येक अच्छी तरह से 1 एमएल डिस्पेस जोड़ें। धीरे से गुंबद को तोड़ने और एक P1000 विंदुक टिप के साथ अच्छी तरह से मिश्रण।
  3. 30 मिनट के लिए 5% सीओ2 के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में प्लेट रखें। फिर, 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में सभी कोशिकाओं को इकट्ठा करें और डीपीबीएस में 10% चारकोल-छीन एफबीएस के 4 एमएल के साथ अच्छी तरह से धो लें। यदि ऑर्गेनोइड कोशिकाएं बड़े समूहों के रूप में दिखाई देती हैं, तो चरण 2.2.6 करें। और चरण 2.2.7। असंबद्ध कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए।
  4. 5 मिनट के लिए 200 एक्स जी पर ट्यूब अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला निकालें और सीसीएम के 1 एमएल के साथ कोशिकाओं को धो लें।
  5. 70% मैट्रिक्स निकालने में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और चरण 3.4.-3.6 का पालन करें। संवर्धन के लिए। वैकल्पिक रूप से, क्रायोप्रिजर्व 90% चारकोल-स्ट्रिप्ड एफबीएस और 10% डीएमएसओ में 10 μM ताजा वाई -27632 के साथ पूरक में फिर से निलंबित करके कोशिकाओं को संरक्षित करें।

5. सी 57 बीएल / 6 जे माउस में ऑर्गेनॉइड कोशिकाओं का आरोपण चमड़े के नीचे

  1. आरोपण के लिए तैयारी
    1. एमएल डिसपेस, मैट्रिक्स निकालने, डीपीबीएस में 10% लकड़ी का कोयला-छीन लिया गया एफबीएस 10 μM ताजा वाई -27632, और एक 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब के साथ तैयार करें।
  2. ऑर्गेनॉइड सेल संग्रह
    1. कम से कम 5 मार्गों के लिए एक स्थिर संस्कृति को प्राप्त करने के बाद, विवो इंजेक्शन में विस्तारित ऑर्गेनॉइड कोशिकाओं को इकट्ठा करें। चरण 4.2.-4.4 का पालन करें। और सीसीएम के 1 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
  3. कोशिकाओं और चमड़े के नीचे इंजेक्शन की गिनती
    1. हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की संख्या की गणना करें। 5 मिनट के लिए 200 एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, डीपीबीएस में 50% मैट्रिक्स निकालने के 100 μL में 2 एक्स 106 कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। बर्फ पर निलंबन रखें और इसे एक पशु प्रक्रिया कक्ष में जैव सुरक्षा कैबिनेट में ले जाएं।
    2. 6 जे चूहों (10 सप्ताह पुराना) को 4% आइसोफ्लुरेन और 1 एल / मिनट ओ2 प्रवाह के साथ एक कक्ष में लगभग 4 मिनट के लिए एनेस्थेटाइज़ करें। एक बार चूहों ने अपना सही पलटा खो दिया है और उनका श्वास पैटर्न गहरा और धीमा हो गया है, चूहों को 2% आइसोफ्लुरेन और 1 एल / मिनट ओ2 प्रवाह के साथ एक गैर-पुनर्जन्म सर्किट में स्थानांतरित करें। जानवरों की आंखों को दर्दनाक चोट से बचाने के लिए पशु चिकित्सक मरहम लागू करें।
    3. माउस के दाहिने फ्लैंक पर इंजेक्शन साइट के चारों ओर एक क्षेत्र को दाढ़ी दें और शुद्ध करने के लिए 70% इथेनॉल का उपयोग करें, और फिर संज्ञाहरण के तहत दाएं फ्लैंक में सीधे 100 μL सेल निलंबन को इंजेक्ट करने के लिए 25 जी सुई का उपयोग करें।
    4. इंजेक्शन के बाद, साँस लेना संज्ञाहरण को हटा दें और चूहों को एक गर्मी दीपक के नीचे एक पिंजरे में रखें जब तक कि पुनर्प्राप्त न हो जाए और पूरी तरह से जुटाया जाए। आवास के लिए चूहों को वापस करें और ट्यूमर गठन की निगरानी करें।

6. ट्यूमर संग्रह और विवो प्रसार में

  1. तैयारी चरण 2.1.1 का पालन करें। मिनट प्रवाह दर का उपयोग करके चूहों को ~2.0 सेमी व्यास (लगभग 2-3 सप्ताह) के ट्यूमर के बाद ग्रीवा अव्यवस्था के बाद बनाया जाता है। एक साफ विच्छेदन क्षेत्र के लिए चूहों हस्तांतरण, माउस फ्लैंक ट्यूमर क्षेत्र पर 70% इथेनॉल स्प्रे, और बाँझ विच्छेदन कैंची और संदंश का उपयोग करने के लिए ट्यूमर को अलग करने के लिए एक चीरा बनाने के लिए।
  2. डीपीबीएस के 5 एमएल के साथ 60 मिमी पकवान में ट्यूमर धोलें और संयोजी ऊतक को हटाने के लिए कैंची का उपयोग करें। ताजा ट्यूमर के एक टुकड़े को काटें और इसे 48 घंटे के लिए डीपीबीएस में 4% पैराफॉर्मल्डेहाइड के साथ सिंक करें और हिस्टोलॉजी विश्लेषण के लिए पैराफिन एम्बेडिंग और सेक्शनिंग के लिए भेजें।
  3. सेल विघटन के लिए ताजा ट्यूमर के दूसरे आधे हिस्से को संसाधित करें। संक्षेप में, सीसीएम (-) के 5 एमएल के साथ 60 मिमी पकवान में पृथक्करण के लिए 1 मिमी3 टुकड़ों में ताजा ट्यूमर को कीमा दें। फिर, चरण 2.2.4.-2.2.8.का पालन करने के बाद, चरण 5.3 के बाद विवो पासिंग के लिए नए सी 57 बीएल / 6 जे चूहों में असंबद्ध कोशिकाओं को इंजेक्ट करें। या चरण 3.4.-3.6 के बाद इन विट्रो ऑर्गेनॉइड संस्कृति के रूप में रखें, या 90% चारकोल-छीन एफबीएस और 10% डीएमएसओ का उपयोग करके तरल नाइट्रोजन में सीधे फ्रीज करें 10 μM ताजा वाई -27632 के साथ।
  4. यदि आवश्यक हो, तो जमे हुए कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में तेजी से पिघलाकर और सीसीएम (-) के साथ धोने से पुनर्प्राप्त करें। इसके बाद, विवो ट्यूमर गठन के लिए चूहों में सीधे इंजेक्शन के लिए डीपीबीएस में 50% मैट्रिक्स निकालने के 100 μL में उन्हें फिर से निलंबित कर दिया। विवो इंजेक्शन में एक के लिए कम से कम 2 x 106 पिघला हुआ कोशिकाओं का उपयोग करें।

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Representative Results

माउस यूरोथेलियल कोशिकाओं में एडेनोवायरस-क्रे मध्यस्थता जीन विलोपन का वर्कफ़्लो चित्रा 1 ए में दिखाया गया है। साथ में वीडियो दर्शाता है कि मूत्राशय की फंडस से यूरोथेलियल कोशिकाओं को कैसे अलग किया जाता है और कैसे ट्रिपल फ्लोक्स्ड कोशिकाओं को एडी 5 सीएमवीसीआरई के साथ पूर्व विवो ट्रांसड्यूड किया जाता है। चित्रा 1 ए से पता चला है कि एंजाइम पाचन के बाद न्यूनतम सबम्यूकोसा और मांसपेशियों की कोशिकाओं को अलग कर दिया गया था। एडेनोवायरस-क्रे डिलीवरी की दक्षता की पुष्टि करने के लिए, झिल्ली-लक्षित टीडीटोमैटो / झिल्ली-स्थानीयकृत बढ़ाया हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन (एमटी / एमजी) के साथ ट्रिपल फ्लोक्स चूहों से अलग यूरोथेलियल कोशिकाओं को एडेनोवायरस क्रे के साथ ट्रांसड्यूस किया गया था। ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) लगभग 100% कोशिकाओं में पाया गया था, जो एडेनोवायरस ट्रांसडक्शन (चित्रा 1 बी) की उच्च दक्षता का संकेत देता है।

स्थिर टीकेओ ऑर्गेनोइड्स को मानक ऑर्गेनॉइड प्रोटोकॉल (5 से अधिक मार्गों के साथ इन विट्रो में ; चित्रा 2 ए)। इन विट्रो ऑर्गेनॉइड वर्गों (चित्रा 2 ए) के एच एंड ई और इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) ने यूरोथेलियल वंश मार्कर सीके 5 और पी 6311 की सकारात्मक अभिव्यक्ति के साथ उच्च ग्रेड यूरोथेलियल कार्सिनोमा की एक आकृति विज्ञान का प्रदर्शन किया। पीसीआर विश्लेषण से टीकेओ ऑर्गेनोइड्स में पुन: संयोजित एलील्स का पता चला, जबकि असंबद्ध फ्लोक्स्ड एलील्स केवल एडेनोवायरस (चित्रा 2 बी) के साथ अनुपचारित यूरोथेलियल कोशिकाओं में पाए गए थे। 8 सप्ताह में प्रारंभिक चमड़े के नीचे (एसक्यू) ट्यूमर गठन के लिए कुल 2 एक्स10 6 प्राथमिक पूर्व विवो ऑर्गेनोइड्स को सी 57 बीएल / 6 जे में इंजेक्ट किया गया था। फिर, एसक्यू ट्यूमर (मार्ग 1) एकत्र किया गया था और चूहों में पारित किया गया था। सामान्य तौर पर, 2 सेमी एसक्यू ट्यूमर (मार्ग 2-5) (चित्रा 2 सी) बनाने के लिए 2-3 सप्ताह की आवश्यकता होती थी। विवो विद्वेष में टीकेओ के इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) ने सीके 7 (पैची), सीके 5, और पी 63 की सकारात्मक अभिव्यक्ति और सीके 8 और यूरोप्लाकिन 3 (चित्रा 2 डी) की नकारात्मक अभिव्यक्ति प्रदर्शित की। मेसेंकाइम कोशिकाओं के संदूषण का पता लगाने के लिए, टीकेओ ट्यूमर को विमेंटिन के लिए दाग दिया गया था। एच एंड ई दाग ने बाईं ओर ट्यूमर और दाईं ओर कैप्सूल को पीली रेखा द्वारा सीमांकित दिखाया। सकारात्मक विमेंटिन केवल ट्यूमर कैप्सूल या स्ट्रोमा (चित्रा 2 ई) में पाया गया था।

Figure 1
चित्रा 1: लोक्सपी साइटों के साथ माउस यूरोथेलियल कोशिकाओं में एडेनोवायरस-क्रे मध्यस्थता जीन विलोपन। (ए) पूर्व विवो एडेनोवायरस एडी 5 सीएमवीसीआरई के माध्यम से टीकेओ ऑर्गेनोइड पीढ़ी का वर्कफ़्लो। एक अल्पकालिक 30 मिनट एंजाइम पाचन अंतर्निहित सबम्यूकोसा और मांसपेशियों के प्रोप्रिया से यूरोथेलियल कोशिकाओं को अलग करने के लिए पर्याप्त था। असंबद्ध यूरोथेलियल कोशिकाओं को टीकेओ ऑर्गेनोइड्स के लिए एडी 5 सीएमवीसीआरई के साथ ट्रांसड्यूस किया गया था और बाद में सी 57 बीएल / 6 जे चूहों में इंजेक्ट किया गया था। एमजी (लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन की संवैधानिक ट्रांसजीन अभिव्यक्ति जो क्रे पुनर्संयोजन के बाद हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन में परिवर्तित हो जाती है) के साथ ट्रिपल फ्लोक्स्ड यूरोथेलियल कोशिकाओं को एडी 5 सीएमवीसीआरई के साथ ट्रांसड्यूस किया गया था। लगभग 100% कोशिकाएं जीएफपी सकारात्मक थीं, जो अत्यधिक कुशल पारगमन और क्रे पुनर्संयोजन का संकेत देती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: पूर्व विवो एडेनोवायरस-क्रे रिकॉम्बिनेज के माध्यम से टीकेओ ऑर्गेनोइड्स की विशेषता। (ए) अलग-अलग टीआरपी 53एफ / एफ: पीटीएनएफ / एफ: आरबी 1एफ / एफ यूरोथेलियल कोशिकाओं को टीकेओ ऑर्गेनोइड्स (उज्ज्वल क्षेत्र) उत्पन्न करने के लिए एडेनोवायरस (एडी 5 सीएमवीसीआरई) के साथ ट्रांसड्यूस किया गया था। टीकेओ ऑर्गेनोइड्स को नमूना प्रसंस्करण जेल के साथ एम्बेडेड किया गया था और एच एंड ई और इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए दाग दिया गया था। (बी) जीनोमिक डीएनए को ट्रिपल फ्लोक्स्ड यूरोथेलियल कोशिकाओं (लेन 2) और टीकेओ ऑर्गेनोइड्स (लेन 4) से निकाला गया था और टीआरपी 53, आरबी 1 और पीटीएन के फ्लोक्स्ड एलील्स या क्रे रीकॉम्बिन्ड एलील्स का पता लगाने के लिए पीसीआर द्वारा प्रवर्धित किया गया था। पीसीआर बैंड को एथिडियम ब्रोमाइड के साथ दाग दिया गया था। लेन 1 और लेन 3 नकारात्मक और सकारात्मक पुन: संयोजित नियंत्रण थे। (सी) एसक्यू इंजेक्शन के बाद दिन 17 पर एक सकल टीकेओ एसक्यू ट्यूमर (मार्ग 4) दिखाया गया था। (डी) टीकेओ एसक्यू विद्वेष से ट्यूमर ऊतक वर्गों को एच एंड ई, आईएफ (सीके 5, सीके 8), या आईएचसी (सीके 7, पी 63, यूपीके 3) के साथ दाग दिया गया था। संक्षेप: सीके 5 = साइटोकेराटिन 5; सीके 20 = साइटोकेराटिन 20; सीके 8 = साइटोकेराटिन 8; सीके 7 = साइटोकेराटिन 7; यूपीके 3 = उरोप्लाकिन तृतीय। (ई) टीकेओ एसक्यू विद्वेष से ट्यूमर ऊतक वर्गों को एच एंड ई और आईएफ (विमेंटिन) के साथ दाग दिया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

जीईएमएम सामान्य कोशिकाओं से शुरू किए गए कैंसर मॉडलिंग के लिए सोने के मानक रहे हैं, जिससे संभावित ऑन्कोजेनिक गड़बड़ी (ऑन्कोजीन सक्रियण और / या ट्यूमर सप्रेसर्स के नुकसान) के परिणामों का कड़ाई से परीक्षण किया जा सकता है। यहां, एक तेजी से और कुशल प्रोटोकॉल सामान्य माउस यूरोथेलियल कोशिकाओं के पूर्व विवो जीन संपादन के माध्यम से मूत्राशय के कैंसर ऑर्गेनोइड्स उत्पन्न करने के लिए प्रदान किया जाता है जो ब्याज के जीन में फ्लोक्स्ड एलील्स ले जाते हैं। एच एंड ई और आईएचसी धुंधला दर्शाता है कि टीकेओ ऑर्गेनोइड्स उच्च ग्रेड यूरोथेलियल यूरोथेलियम के अनुरूप ऊतक विज्ञान का प्रदर्शन करते हैं, स्क्वैमस भेदभाव और बेसल-जैसे उपप्रकार दोनों के साथ इन विट्रो ऑर्गेनोइड्स और विवो विद्वेष के रूप में। टीकेओ ऑर्गेनोइड्स का उपयोग टीआरपी 53, आरबी 1, और पीटीएन हानि, दवा स्क्रीनिंग और सिग्नलिंग मार्गों के आणविक मूल्यांकन के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए इन विट्रो में किया जा सकता है। 6 जे चूहों में तेजी से ट्यूमर गठन कीमोथेरेपी या इम्यूनोथेरेपी जैसे प्रणालीगत उपचारों के लिए उपचार प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन करने के लिए डिज़ाइन किए गए विवो अध्ययनों में सक्षम होगा।

यूरोथेलियम बेसल कोशिकाओं (सीके 5 और पी 63 के लिए सकारात्मक), मध्यवर्ती कोशिकाओं की 1-2 परतों (यूरोप्लाकिन्स और पी 63 सकारात्मक), और छाता कोशिकाओं (यूरोप्लाकिन्स, सीके 8 और सीके 20 सकारात्मक) 6 की एक परत से बना है। विधि में एक महत्वपूर्ण कदम एक लंबे समय तक (4 घंटे) एंजाइम पाचन के बजाय ऊतक विघटन का सीमित समय (30 मिनट) है, जो गैर-यूरोथेलियल सबम्यूकोसा कोशिकाओं (चित्रा 1 ए) के न्यूनतम संदूषण की अनुमति देता है। एक लंबे समय तक विघटन का समय स्ट्रोमल कोशिकाओं के प्रतिशत को बढ़ा सकता है, जैसे कि एंडोथेलियल कोशिकाएं और फाइब्रोब्लास्ट कोशिकाएं। एडेनोवायरस का पूर्व विवो ट्रांसडक्शन चरण अत्यधिक प्रभावी है। पूर्व विवो एडेनोवायरस क्रे ट्रांसडक्शन के बाद, जीएफपी को एमटी / एमजी रिपोर्टर एलील (चित्रा 1 बी) के साथ लगभग 100% यूरोथेलियल कोशिकाओं में कल्पना की गई थी।

पूर्व विवो विधि के लिए सीमाएं हैं। सबसे पहले, एडेनोवायरस ट्रांसडक्शन से पहले असंबद्ध कोशिकाओं को पूर्व-चयनित नहीं किया जाता है। उदाहरण के लिए, कोशिकाओं को यूरोथेलियल कोशिकाओं बनाम गैर-यूरोथेलियल कोशिकाओं, या ल्यूमिनल कोशिकाओं बनाम बेसल कोशिकाओं के लिए विभेदित नहीं किया जाता है। ईपीसीएएम और / या सीडी 4 9 एफ के साथ सेल सॉर्टिंग का उपयोग पूर्व विवो ट्रांसडक्शन12,13 से पहले शुद्ध उपकला कोशिकाओं और / या स्टेम कोशिकाओं को सॉर्ट करने के लिए किया जा सकता है। दूसरा, इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले सीएमवी प्रमोटर के साथ एडेनोवायरस ड्राइविंग क्रे अभिव्यक्ति ऊतक विघटन (यूरोथेलियल बनाम गैर-यूरोथेलियल, बेसल बनाम ल्यूमिनल कोशिकाओं) के बाद सेल प्रकारों की एक विस्तृत श्रृंखला को लक्षित करती है। यह गैर-विशिष्ट लक्ष्यीकरण एक चयन पूर्वाग्रह का कारण बन सकता है जिससे सबसे अधिक ऑन्कोजेनिक क्षमता वाली कोशिकाओं की अतिवृद्धि हो सकती है। सेल प्रकार-विशिष्ट एडेनोवायरस वैक्टर का उपयोग फेफड़ों के कैंसर और मूत्राशय के कैंसर जीईएमएम14,15,16,17 दोनों में शीर्ष रूप से किया गया है। पूर्व विवो सेल प्रकार-विशिष्ट एडेनोवायरस (सीके 8 प्रमोटर या सीके 5 प्रमोटर के साथ एडेनोवायरस) का उपयोग करके भविष्य के अध्ययन सेल-ऑफ-ओरिजिन प्रश्नों को संबोधित कर सकते हैं कि क्या टीकेओ ऑर्गेनोइड्स बेसल या ल्यूमिनल कोशिकाओं18 से प्राप्त होते हैं। सीके 20 या यूपीके 2 प्रमोटर-विशिष्ट एडेनोवायरस (हमारे ज्ञान के लिए उपलब्ध नहीं) को यूरोथेलियम में छाता कोशिकाओं को ट्रांसड्यूस करने के लिए भी डिज़ाइन किया जा सकता है। हालांकि, पूर्व विवो मूत्राशय संक्रमण के लिए इन प्रमोटर-विशिष्ट एडेनोवायरस की दक्षता और विशिष्टता की जांच करने के लिए भविष्य के अध्ययन की आवश्यकता है। मेजबान वातावरण18 के कारण विवो और पूर्व विवो पारगमन के बीच एडेनोवायरस-क्रे दक्षता में विसंगति हो सकती है। तीसरा, पूर्व विवो विधि ट्यूमर वातावरण की कमी से सीमित है, जो विवो ट्यूमरजेनेसिस और हिस्टोमोर्फोलॉजी में प्रभावित हो सकती है। इन सीमाओं के बावजूद, पूर्व विवो विधि का एक प्रमुख लाभ तेजी से वर्कफ़्लो (माउस प्रजनन के वर्षों के बजाय 1-2 सप्ताह) है। पूर्व विवो दृष्टिकोण का दूसरा लाभ यह है कि एडेनोवायरस-क्रे (एडी 5 सीएमवीसीआरई) व्यावसायिक रूप से उपलब्ध, सीधा, और वायरल ट्रांसडक्शन और क्रे पुनर्संयोजन (चित्रा 1 बी) के लिए लगभग 100% कुशल है। इसके विपरीत, सीआरआईएसपीआर संपादन या लेंटिवायरल ट्रांसडक्शन का उपयोग करके वैकल्पिक पूर्व विवो विधियों को कम कुशल जीनोमिक संपादन 5,13,19,20 के कारण आगे क्लोन चयन की आवश्यकता होती है।

संक्षेप में, वर्णित पूर्व विवो एडेनोवायरस दृष्टिकोण मानव मूत्राशय के कैंसर से संबंधित ब्याज के जीन (फ्लोक्स्ड एलील्स) के किसी भी संयोजन का उपयोग करके मूत्राशय के कैंसर मॉडल उत्पन्न करने में सुविधाजनक, तेज़ और कुशल है। मूत्राशय के कैंसर फेनोटाइप पर उत्पत्ति की कोशिका के प्रभाव को संबोधित करने और परिभाषित आनुवंशिक उत्परिवर्तनों की सेटिंग में इम्यूनोथेरेपी के उपचार प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन करने के लिए इन मॉडलों को सेल प्रकार-विशिष्ट एडेनोवायरस और सेल सॉर्टिंग के साथ जोड़ा जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस शोध कार्य को एनआईएच अनुदान, के 08 सीए 252161 (क्यूएल), आर 01 सीए 234162, और आर 01 सीए 207757 (डीडब्ल्यूजी), पी 30 सीए 016056 (एनसीआई कैंसर सेंटर कोर सपोर्ट ग्रांट), रोसवेल पार्क एलायंस फाउंडेशन और फ्रेंड्स ऑफ यूरोलॉजी फाउंडेशन द्वारा भाग में समर्थित किया गया था। हम पांडुलिपि को प्रूफरीडिंग करने के लिए मारिसा ब्लास्क और मिला पाखोमोवा को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 μm sterile cell strainer Corning 431752
1 mL syringe BD 309659
25G 1.5 inches needle EXELINT International 26406
Adenovirus (Ad5CMVCre High Titer, 1E11 pfu/ml) UI Viral Vector Core VVC-U of Iowa-5-HT
C57 BL/6J Jackson Lab 000664
Charcoal-stripped FBS Gibco A3382101
Collagenase/hyaluronidase Stemcell Technologies 07912
Dispase Stemcell Technologies 07913
DPBS, 1x Corning 21-031-CV
L-glutamine substitute (GlutaMAX) Gibco 35-050-061
Mammary Epithelial Cell Growth medium Lonza CC-3150
Matrix extracts from Engelbreth–Holm–Swarm mouse sarcomas (Matrigel) Corning CB-40234
Monoclonal mouse anti-CK20 DAKO M7019 IF 1:100
Monoclonal mouse anti-CK7 Santa Cruz Biotechnology SC-23876 IHC 1:50
Monoclonal mouse anti-p63 Abcam ab735 IHC 1:100, IF 1:50
Monoclonal mouse anti-Upk3 Fitzgerald 10R-U103A IHC 1:50
Monoclonal mouse anti-Vimentin Santa Cruz Biotechnology SC-6260 IF 1:100
Monoclonal rat anti-CK8 Developmental Studies Hybridoma Bank TROMA-I-s IF 1:100
HERAcell vios 160i CO2 incubator Thermo Fisher 51033557
Polyclonal chicken anti-CK5 Biolegend 905901 IF 1:500
Primocin InvivoGen ant-pm-1
Recombinant enzyme of trypsin substitute (TrypLE Express Enzyme) Thermo Fisher 12605036
Signature benchtop shaking incubator Model 1575 VWR 35962-091
Specimen Processing Gel (HistoGel) Thermo Fisher HG-4000-012
Surgical blade size 10 Integra Miltex 4-110
Sorvall Legend RT Thermo Fisher 75004377
Sorvall T1 centrifuge Thermo Fisher 75002383
Y-27632 Selleckchem S1049

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References

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. Cancer statistics, 2021. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (1), 7-33 (2021).
  2. Zhu, S., et al. Preclinical models for bladder cancer research. Hematology/Oncology Clinics of North America. 35 (3), 613-632 (2021).
  3. DeGraff, D. J., et al. Current preclinical models for the advancement of translational bladder cancer research. Molecular Cancer Therapeutics. 12 (2), 121-130 (2013).
  4. Andreev-Drakhlin, A. Y., et al. The evolving treatment landscape of advanced urothelial carcinoma. Current Opinion in Oncology. 33 (3), 221-230 (2021).
  5. Mullenders, J., et al. Mouse and human urothelial cancer organoids: A tool for bladder cancer research. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4567-4574 (2019).
  6. Kobayashi, T., Owczarek, T. B., McKiernan, J. M., Abate-Shen, C. Modelling bladder cancer in mice: opportunities and challenges. Nature Reviews. Cancer. 15 (1), 42-54 (2015).
  7. Kersten, K., de Visser, K. E., van Miltenburg, M. H., Jonkers, J. Genetically engineered mouse models in oncology research and cancer medicine. EMBO Molecular Medicine. 9 (2), 137-153 (2017).
  8. Ku, S. Y., et al. Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance. Science. 355 (6320), 78-83 (2017).
  9. Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
  10. Fujii, E., et al. A simple method for histopathological evaluation of organoids. Journal of Toxicologic Pathology. 31 (1), 81-85 (2018).
  11. Georgas, K. M., et al. An illustrated anatomical ontology of the developing mouse lower urogenital tract. Development. 142 (10), 1893-1908 (2015).
  12. Santos, C. P., et al. Urothelial organoids originating from Cd49f(high) mouse stem cells display Notch-dependent differentiation capacity. Nature Communication. 10 (1), 4407 (2019).
  13. Wang, L., et al. A genetically defined disease model reveals that urothelial cells can initiate divergent bladder cancer phenotypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 563-572 (2020).
  14. Yang, D., et al. Intertumoral heterogeneity in SCLC is influenced by the cell type of origin. Cancer Discovery. 8 (10), 1316-1331 (2018).
  15. Sutherland, K. D., et al. Cell of origin of small cell lung cancer: inactivation of Trp53 and Rb1 in distinct cell types of adult mouse lung. Cancer Cell. 19 (6), 754-764 (2011).
  16. Bottger, F., et al. Tumor heterogeneity underlies differential cisplatin sensitivity in mouse models of small-cell lung cancer. Cell Reports. 27 (11), 3345-3358 (2019).
  17. Puzio-Kuter, A. M., et al. Inactivation of p53 and Pten promotes invasive bladder cancer. Genes & Development. 23 (6), 675-680 (2009).
  18. Park, S., et al. Novel mouse models of bladder cancer identify a prognostic signature associated with risk of disease progression. Cancer Research. 81 (20), 5161-5175 (2021).
  19. Hawley, S. P., Wills, M. K., Jones, N. Adenovirus-mediated genetic removal of signaling molecules in cultured primary mouse embryonic fibroblasts. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (43), e2160 (2010).
  20. Feng, W., et al. Rapid interrogation of cancer cell of origin through CRISPR editing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (32), 2110344118 (2021).

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कैंसर अनुसंधान अंक 183
<em>एक्स वीवो</em> माउस यूरोथेलियल कोशिकाओं में एडेनोवायरस-क्रे मध्यस्थता जीन विलोपन का ऑर्गेनोइड मॉडल
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Xu, D., Wang, L., Wieczorek, K.,… More

Xu, D., Wang, L., Wieczorek, K., Wang, Y., Zhang, X., Goodrich, D. W., Li, Q. Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells. J. Vis. Exp. (183), e63855, doi:10.3791/63855 (2022).

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