Summary
该协议描述了小鼠尿路上皮类器官的产生和表征过程，这些类器官在感兴趣的基因中具有缺失。这些方法包括收获小鼠尿路上皮细胞，用腺病毒用CMV启动子驱动Cre表达的 离体 转导，以及 体外 和 体内 表征。
Abstract
膀胱癌是一个研究不足的领域，特别是在基因工程小鼠模型（GEMMs）中。具有组织特异性Cre和loxP位点的自交GEMM一直是条件或诱导基因靶向的黄金标准。为了提供更快，更有效的实验模型，使用腺病毒Cre和携带肿瘤抑制因子Trp53，Pten和Rb1的多个loxP等位基因的正常尿路上皮细胞开发了离体类器官培养系统。正常的尿路上皮细胞与三重 floxed 小鼠的四个膀胱酶解脱（Trp53f / f：Ptenf / f：Rb1f / f）。尿路上皮细胞通过CMV启动子（Ad5CMVCre）驱动的腺病毒-Cre进行体外转导。将转导的膀胱类器官在体外和体内进行培养、繁殖和表征。PCR 用于确认 Trp53、Pten 和 Rb1 中的基因缺失。类器官的免疫荧光 （IF） 染色显示尿路上皮谱系标志物（CK5 和 p63）的阳性表达。将类器官皮下注射到宿主小鼠中以进行肿瘤扩张和连续传代。异种移植物的免疫组化（IHC）表现出CK7，CK5和p63的阳性表达以及CK8和Uroplakin 3的阴性表达。总之，腺病毒介导的基因从具有loxP位点工程化的小鼠尿路上皮细胞中缺失是快速测试已定义遗传改变的致瘤潜力的有效方法。
Introduction
膀胱癌是男性中第四大常见癌症，每年在美国影响超过80，000人1。三十多年来，基于铂金的化疗一直是晚期膀胱癌患者的标准护理。最近美国食品和药物管理局（FDA）批准了免疫疗法（抗PD-1和抗PD-L1免疫检查点抑制剂），厄达非替尼（一种成纤维细胞生长因子受体抑制剂）和enfortumab vedotin（一种抗体 - 药物偶联物）2，3，4，2，4，从而彻底改变了膀胱癌治疗的前景。然而，没有临床批准的生物标志物可用于预测对化疗或免疫治疗的反应。迫切需要生成信息丰富的临床前模型，以提高对驱动膀胱癌进展的机制的理解，并为不同的治疗方式开发预测性生物标志物。
膀胱转化研究的一个主要障碍是缺乏临床前模型来概括人类膀胱癌的发病机制和治疗反应5，6。已经开发了多种临床前模型，包括 体外 2D模型（细胞系或有条件重编程细胞）， 体外 3D模型（类器官，3D打印）和 体内 模型（异种移植物，致癌物诱导，基因工程模型和患者来源的异种移植物）2，6。基因工程小鼠模型（GEMMs）可用于膀胱癌生物学中的许多应用，包括肿瘤表型分析，候选基因和/或信号通路的机制研究以及治疗反应的临床前评估6，7。GEMM可以利用位点特异性重组酶（Cre-loxP）来控制一个或多个肿瘤抑制基因中的遗传缺失。生成具有多个基因缺失的所需GEMM的过程非常耗时，费力且昂贵5.该方法的总体目标是开发一种快速有效的 离体 Cre递送方法，用于从携带三重 floxed 等位基因（Trp53，Pten 和 Rb1）的正常小鼠尿路上皮细胞建立膀胱三重敲除（TKO）模型8。 离体 方法的主要优点是快速的工作流程（1-2周而不是多年的小鼠育种）。本文描述了在免疫功能正常的C57 BL / 6J小鼠中收获具有浮选等位基因的正常尿路上皮细胞， 离体 腺病毒转导，类器官培养以及 体外 和 体内 表征的方案。该方法可进一步用于在含有任何絮状等位基因组合的免疫功能小鼠中产生临床相关的膀胱癌类器官。
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Protocol
所有动物程序均由纽约州布法罗罗斯威尔公园综合癌症中心的机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准（1395M，生物安全180501和180502）。
注意：在同一天执行步骤 1-3。
1. 小鼠膀胱解剖
- 解剖准备
- 准备所有无菌器械，包括剪刀，镊子，35毫米培养皿中的无菌DPBS，70%乙醇，无菌纱布和干净的纸巾。清洁解剖区域的所有表面。生成雄性三重浮选小鼠 Trp53f / f：Ptenf / f：Rb1f / f （4只小鼠，10周大），如Goodrich博士的实验室 8所述。
- 安乐死和切口
- 使用2.0 L / min流速通过CO 2窒息对小鼠实施安乐死，然后进行宫颈脱位。用70%乙醇清洁解剖区域，并用干净的纸巾盖住。
- 将鼠标放在解剖区域的纱布上。将70%乙醇喷洒在小鼠腹部，并使用无菌解剖剪刀制作下中线腹部切口，露出膀胱。
- 解剖膀胱
- 使用镊子抓住膀胱并轻轻拉起，以便识别双侧输尿管卵巢连接处。使用剪刀沿着两个输尿管开口之间的边界线切除膀胱底。
- 将膀胱转移到装有2 mL DPBS的无菌培养皿中。去除脂肪和结缔组织，并将膀胱放入装有无菌2毫升DPBS的新培养皿中。此时，将腺病毒从-80°C储存中取出并保持在冰上。
2. 尿路上皮细胞的解离
- 细胞解离的制备
- 准备所有无菌器械，包括镊子，手术刀（带手柄的10号刀片），35mm培养皿中的无菌DPBS，没有木炭剥离的FBS（定义为CCM（-），胶原酶/透明质酸酶混合物，胰蛋白酶替代品的重组酶，DPBS中10%木炭剥离的FBS与10μM新鲜Y-27632，100μm无菌细胞过滤器和15mL离心管。
注意：完整的培养基（CCM）包括乳腺上皮细胞生长培养基，补充有提供的生长因子和5%木炭剥离的FBS，1%L-谷氨酰胺替代品，100μg/ mL蛋白黄素和10μM新鲜Y-27632。
- 准备所有无菌器械，包括镊子，手术刀（带手柄的10号刀片），35mm培养皿中的无菌DPBS，没有木炭剥离的FBS（定义为CCM（-），胶原酶/透明质酸酶混合物，胰蛋白酶替代品的重组酶，DPBS中10%木炭剥离的FBS与10μM新鲜Y-27632，100μm无菌细胞过滤器和15mL离心管。
- 切碎和消化膀胱
- 在生物安全柜中的35毫米培养皿中，用2毫升无菌DPBS转移并再次清洗膀胱。
- 将四只小鼠的膀胱组织收集到装有1mLCCM（-）的培养皿中，并使用手术刀片将每个膀胱切成四个相等的碎片。使用镊子展开膀胱，将尿路上皮表面暴露在介质中。
- 将气囊碎片和培养基转移到15 mL离心管中。用2 mL CCM（-）2x洗涤培养皿，并将其收集在离心管中至总体积为5 mL。
- 将胶原酶/透明质酸酶混合物加入终浓度为300 U / mL胶原酶和100 U / mL透明质酸酶，并将管水平置于37°C轨道孵育振荡器中，以200rpm振荡30分钟。
- 组织消化后，将等体积（5mL）的10%木炭剥离的FBS加入DPBS中，并将其管以200× g 离心5分钟。
- 取出并丢弃上清液。将2mL胰蛋白酶替代品加入细胞沉淀中并充分混合。将管置于37°C和5%CO2 的细胞培养箱中4分钟。
- 孵育后，用标准P1000吸头上下移液10倍。在DPBS中加入5毫升10%木炭剥离的FBS。
- 通过100μm无菌细胞过滤器过滤分离的细胞。收集细胞悬浮液并以200× g 离心5分钟。
- 计数和重悬细胞
- 取出并丢弃上清液。用1mLCCM重悬细胞沉淀。
- 使用血细胞计数器计数细胞数量，并且仅将0.5 x 106 个细胞放入装有0.5mL新鲜CCM的24孔板的孔中。此时，从-20°C储存中取出Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤细胞的基质提取物（见 材料表）并在冰上解冻。在37°C细胞培养箱中预热6孔板。
注意：剩余的细胞可以离心并冷冻为细胞沉淀，用于非病毒转导控制。
3. 腺病毒转导和电镀类器官
注意：处理腺病毒时请小心。实验室人员应遵循生物安全2级做法，并用10%漂白剂对腺病毒进行消毒。
- 将2μL腺病毒（Ad5CMVCre;1 x 107 PFU / μL）加入24孔板中。与解离的尿路上皮细胞充分混合。
- 为了提高转导效率，通过在室温下以300× g 离心24孔板30分钟进行旋接。将24孔板置于37°C和5%CO2 的细胞培养箱中1小时。
- 将细胞和培养基从孔中转移到15mL管中，并以200× g 离心5分钟。除去并丢弃上清液，加入50μLCCM，并与底部的细胞充分混合。
- 加入140μL基质提取物，轻轻混合均匀，以避免气泡。将溶液快速加入预热的6孔板中，以50μL/圆顶，以创建用于类器官的圆顶。
- 将板转移到具有5%CO2 的37°C培养箱中，让圆顶凝固5分钟。将6孔板倒置，继续凝固25分钟。
- 孵育后，向每个孔中加入2.5mLCCM，并将板置于培养箱中进行类器官培养。
4. 类器官培养和传代
- 每3-4天更换一次培养基。进行类器官培养，传代和冷冻，如Lee等人9所述。使用样品加工凝胶进行类器官的包埋，如Fujii等人10所述。
- 除去培养基并向每个孔中加入1mL分散酶。轻轻打破圆顶，用P1000移液器吸头充分混合。
- 将板置于37°C培养箱中，用5%CO2 培养30分钟。然后，将所有细胞收集在15 mL离心管中，并用4 mL在DPBS中洗涤10%木炭剥离的FBS。如果类器官细胞显示为大簇，则执行步骤2.2.6。和步骤 2.2.7。以获得解离的细胞。
- 将管以200× g 离心5分钟。除去上清液并用1mLCCM洗涤细胞。
- 将细胞重悬于70%基质提取物中，并按照步骤3.4.-3.6进行操作。用于养殖。或者，通过重悬于90%木炭剥离的FBS和10%DMSO中补充10μM新鲜Y-27632来冷冻保存细胞。
5. 皮下植入C57BL/6J小鼠的类器官细胞
- 植入的准备
- 准备25G 1.5针头，1mL注射器，1mg / mL分散酶，基质提取物，10%木炭剥离的DBBS在DPBS中与10μM新鲜Y-27632，以及15mL离心管。
- 类器官细胞收集
- 在实现至少5个传代的稳定培养后，收集扩增的类器官细胞进行 体内 注射。按照步骤 4.2.-4.4 操作。并将细胞重悬于1 mLCCM中。
- 计数细胞和皮下注射
- 使用血细胞计数器计数细胞数量。以200× g 离心5分钟后，将2×106 个细胞重悬于100μLDPBS中50%基质提取物中。将悬浮液放在冰上，并将其放入动物手术室的生物安全柜中。
- 在腔室中用4%异氟醚和1 L / min O2 流麻醉两只雄性C57BL / 6J小鼠（10周龄），持续约4分钟。一旦小鼠失去了矫正反射并且它们的呼吸模式变得更深更慢，将小鼠转移到具有2%异氟醚和1 L /min O 2 流量的非再呼吸回路中。涂抹兽医软膏，以保护动物的眼睛免受创伤。
- 在小鼠右侧的注射部位周围剃除一个区域，并使用70%乙醇进行清洁，然后使用25G针头在麻醉下将100μL细胞悬浮液直接注射到右侧腹中。
- 注射后，取出吸入麻醉剂，将小鼠置于加热灯下的笼子中，直到恢复并完全动员。将小鼠送回房屋并监测肿瘤形成。
6. 肿瘤采集与 体内 繁殖
- 按照准备步骤 2.1.1 进行操作。使用2.0 L / min流速通过CO 2窒息对小鼠实施安乐死，然后在形成直径约2.0cm（近2-3周）的肿瘤后宫颈脱位。将小鼠转移到干净的解剖区域，在小鼠侧翼肿瘤区域喷洒70%乙醇，并使用无菌解剖剪刀和镊子做一个切口以分离肿瘤。
- 用5 mL DPBS在60mm培养皿中清洗肿瘤，并使用剪刀去除结缔组织。切一块新鲜肿瘤，用4%多聚甲醛在DPBS中下沉48小时，送去石蜡包埋和切片进行组织学分析。
- 处理另一半新鲜肿瘤进行细胞解离。简而言之，将新鲜肿瘤切碎成1mm3 块，在60mm培养皿中用5mLCCM（-）解离。然后，在按照步骤2.2.4.-2.2.8.之后，将解离的细胞注射到新的C57BL / 6J小鼠中，以便在步骤5.3之后进行 体内 传代。或按照步骤3.4.-3.6保持体 外 类器官培养，或使用90%木炭剥离的FBS和10%DMSO与10μM新鲜Y-27632直接在液氮中冷冻。
- 如果需要，通过在37°C水浴中快速解冻并用CCM（-）洗涤来回收冷冻细胞。在此之后，将它们重悬于DPBS中100μL的50%基质提取物中，直接注射到小鼠体内肿瘤形成 中 。使用至少2×106 个解冻的细胞进行一 次体内 注射。
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Representative Results
小鼠尿路上皮细胞中腺病毒-Cre介导的基因缺失的工作流程如图 1A所示。随附的视频演示了尿路上皮细胞 如何与膀胱 底分离，以及如何用Ad5CMVCre转导三重浮冰细胞。 图1A 显示，酶消化后，最小的粘膜下层和肌肉细胞被解离。为了确认腺病毒 - Cre递送的效率，用腺病毒Cre转导来自三重浮冰小鼠的解离的尿路上皮细胞与膜靶向tdTomato/膜定位增强的绿色荧光蛋白（mT / mG）。在近100%的细胞中检测到绿色荧光蛋白（GFP），表明腺病毒转导效率高（图1B）。
稳定的TKO类器官按照标准类器官方案建立（体外 超过5个传代; 图 2A）。 体外 类器官切片的H&E和免疫荧光（IF）（图2A）显示高级别尿路上皮癌的形态，尿路上皮谱系标志物CK5和p6311的阳性表达。PCR分析显示TKO类器官中重组等位基因，而未重组的无组织等位基因仅在未经腺病毒处理的尿路上皮细胞中检测到（图2B）。在8周内将总共2×106 原发 性离体 类器官注射到C57BL / 6J中以进行初始皮下（SQ）肿瘤形成。然后，收集SQ肿瘤（传代1）并在小鼠中传代。一般来说，需要2-3周才能形成2cm SQ肿瘤（传代2-5）（图2C）。TKO 在体内 异种移植物的免疫组化（IHC）显示CK7（斑片状），CK5和p63的阳性表达以及CK8和Uroplakin 3的阴性表达（图2D）。为了检测间充质细胞的污染，将TKO肿瘤染色为维门汀。H&E染色显示左侧的肿瘤和右侧的胶囊由黄线划定。仅在肿瘤囊或基质中检测到阳性维门汀（图2E）。
图1：腺病毒-Cre介导的小鼠尿路上皮细胞中具有 loxP 位点的基因缺失。 （A）通过 离体 腺病毒Ad5CMVCre生成TKO类器官的工作流程。短时间30分钟的酶消化足以使尿路上皮细胞与下面的粘膜下层和固有肌层分离。将分离的尿路上皮细胞用Ad5CMVCre转导TKO类器官，随后注射到C57BL / 6J小鼠中。（B）用Ad5CMVCre转导具有mT / mG（Cre重组后转化为绿色荧光蛋白的红色荧光蛋白的组成性转基因表达）的三重絮状尿路上皮细胞。近100%的细胞GFP阳性，表明高效的转导和Cre重组。 请点击此处查看此图的大图。
图2：通过 离体 腺病毒 - Cre重组酶表征TKO类器官。 （A）分离的 Trp53f / f：Ptenf / f：Rb1f / f 尿路上皮细胞用腺病毒（Ad5CMVCre）转导以产生TKO类器官（明场）。将TKO类器官与标本加工凝胶一起染色，用于H&E和免疫荧光。（B）从三重浮黄尿路上皮细胞（泳道2）和TKO类器官（泳道4）中提取基因组DNA，并通过PCR扩增以检测 Trp53， Rb1 和 Pten的絮状等位基因或Cre重组等位基因。用溴化乙锭染色PCR条带。泳道1和泳道3是阴性和阳性重组对照。（C）在SQ注射后第17天显示大TKO SQ肿瘤（第4代）。（D）来自TKO SQ异种移植物的肿瘤组织切片用H&E，IF（CK5，CK8）或IHC（CK7，p63，Upk3）染色。缩写：CK5 = 细胞角蛋白5;CK20 = 细胞角蛋白20;CK8 = 细胞角蛋白 8;CK7 = 细胞角蛋白 7;Upk3 = Uroplakin III.（E）来自TKO SQ异种移植物的肿瘤组织切片用H&E和IF（vimentin）染色。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
GEMM一直是从正常细胞开始的癌症建模的黄金标准，允许对潜在的致癌扰动（癌基因激活和/或肿瘤抑制因子的丢失）的后果进行严格测试。在这里，提供了一种快速有效的方案，通过对正常小鼠尿路上皮细胞进行 离体 基因编辑来生成膀胱癌类器官，这些细胞携带感兴趣的基因中的浮出等位基因。H&E和IHC染色表明，TKO类器官表现出与高级尿路上皮尿路上皮一致的组织学，具有鳞状分化和基底样亚型，既作为 体外 类器官，也作为 体内 异种移植物。TKO类器官可用于 体外 研究 Trp53， Rb1 和 Pten 丢失的影响，药物筛选以及信号通路的分子评估。C57BL / 6J小鼠的快速肿瘤形成将使 体内 研究能够评估对化疗或免疫疗法等全身疗法的治疗反应。
尿路上皮由一层基底细胞（CK5和p63阳性），1-2层中间细胞（尿素蛋白和p63阳性）和伞形细胞（Uroplakins，CK8和CK20阳性）6组成。该方法的关键步骤是组织解离的有限时间（30分钟），而不是长时间（4小时）的酶消化，这使得非尿路上皮粘膜下细胞的污染最小（图1A）。较长的解离时间可能会增加基质细胞的百分比，例如内皮细胞和成纤维细胞。腺病毒的 离体 转导步骤非常有效。 在离体 腺病毒Cre转导后，GFP在具有mT / mG报告基因的近100%的尿路上皮细胞中可见（图1B）。
离体方法存在局限性。首先，在腺病毒转导之前未预先选择解离的细胞。例如，细胞不分化为尿路上皮细胞与非尿路上皮细胞，或腔细胞与基底细胞。使用EpCAM和/或CD49f进行细胞分选可用于在离体转导12，13之前对纯上皮细胞和/或干细胞进行分选。其次，驱动Cre表达的腺病毒与本方案中使用的CMV启动子靶向组织解离后的各种细胞类型（尿路上皮与非尿路上皮，基底细胞与腔内细胞）。这种非特异性靶向可能导致选择偏倚，导致具有最大致癌潜力的细胞过度生长。细胞类型特异性腺病毒载体已局部用于肺癌和膀胱癌GEMM14，15，16，17。未来使用离体细胞类型特异性腺病毒（具有CK8启动子或CK5启动子的腺病毒）的研究可以解决TKO类器官是否来自基底细胞或腔细胞的起源细胞问题18。CK20或Upk2启动子特异性腺病毒（我们所知不可用）也可以设计用于转导尿路上皮中的伞状细胞。然而，未来的研究需要检查这些启动子特异性腺病毒对离体膀胱感染的效率和特异性。由于宿主环境18，体内和离体转导之间可能存在腺病毒-Cre效率的差异。第三，离体法受肿瘤环境不足的限制，可能影响体内肿瘤发生和组织形态。尽管有这些局限性，但离体方法的一个主要优点是快速的工作流程（1-2周而不是多年的小鼠育种）。离体方法的第二个优点是腺病毒-Cre（Ad5CMVCre）是市售的，直接的，并且对病毒转导和Cre重组的效率接近100%（图1B）。相反，使用CRISPR编辑或慢病毒转导的替代离体方法需要进一步的克隆选择，因为基因组编辑效率较低5，13，19，20。
总之，所描述的 离体 腺病毒方法在利用与人类膀胱癌相关的目标基因（floxed等位基因）的任意组合生成膀胱癌模型方面是方便，快速和有效的。这些模型可以与细胞类型特异性腺病毒和细胞分选相结合，以解决原产细胞对膀胱癌表型的影响，并在确定的基因突变环境中评估对免疫疗法的治疗反应。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究工作得到了NIH Grants，K08CA252161（Q.L.），R01CA234162和R01 CA207757（D.W.G.），P30CA016056（NCI癌症中心核心支持补助金），罗斯威尔公园联盟基金会和泌尿科之友基金会的部分支持。我们感谢玛丽莎·布拉斯克和米拉·帕霍莫娃对手稿的校对。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 μm sterile cell strainer | Corning | 431752 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 25G 1.5 inches needle | EXELINT International | 26406 | |
| Adenovirus (Ad5CMVCre High Titer, 1E11 pfu/ml) | UI Viral Vector Core | VVC-U of Iowa-5-HT | |
| C57 BL/6J | Jackson Lab | 000664 | |
| Charcoal-stripped FBS | Gibco | A3382101 | |
| Collagenase/hyaluronidase | Stemcell Technologies | 07912 | |
| Dispase | Stemcell Technologies | 07913 | |
| DPBS, 1x | Corning | 21-031-CV | |
| L-glutamine substitute (GlutaMAX) | Gibco | 35-050-061 | |
| Mammary Epithelial Cell Growth medium | Lonza | CC-3150 | |
| Matrix extracts from Engelbreth–Holm–Swarm mouse sarcomas (Matrigel) | Corning | CB-40234 | |
| Monoclonal mouse anti-CK20 | DAKO | M7019 | IF 1:100 |
| Monoclonal mouse anti-CK7 | Santa Cruz Biotechnology | SC-23876 | IHC 1:50 |
| Monoclonal mouse anti-p63 | Abcam | ab735 | IHC 1:100, IF 1:50 |
| Monoclonal mouse anti-Upk3 | Fitzgerald | 10R-U103A | IHC 1:50 |
| Monoclonal mouse anti-Vimentin | Santa Cruz Biotechnology | SC-6260 | IF 1:100 |
| Monoclonal rat anti-CK8 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-I-s | IF 1:100 |
| HERAcell vios 160i CO2 incubator | Thermo Fisher | 51033557 | |
| Polyclonal chicken anti-CK5 | Biolegend | 905901 | IF 1:500 |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| Recombinant enzyme of trypsin substitute (TrypLE Express Enzyme) | Thermo Fisher | 12605036 | |
| Signature benchtop shaking incubator Model 1575 | VWR | 35962-091 | |
| Specimen Processing Gel (HistoGel) | Thermo Fisher | HG-4000-012 | |
| Surgical blade size 10 | Integra Miltex | 4-110 | |
| Sorvall Legend RT | Thermo Fisher | 75004377 | |
| Sorvall T1 centrifuge | Thermo Fisher | 75002383 | |
| Y-27632 | Selleckchem | S1049 |
References
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