Summary
يصف هذا البروتوكول عملية توليد وتوصيف المواد العضوية البولية الفئران التي تؤوي عمليات حذف في الجينات ذات الاهتمام. وتشمل الطرق حصاد الخلايا البولية الثيلية للفئران ، والنقل خارج الجسم الحي مع الفيروس الغدي الذي يقود تعبير Cre مع مروج CMV ، وفي المختبر وكذلك في توصيف الجسم الحي .
Abstract
سرطان المثانة هو مجال غير مدروس ، خاصة في نماذج الفئران المهندسة وراثيا (GEMMs). كانت GEMMs المولودة مع مواقع Cre و loxP الخاصة بالأنسجة هي المعايير الذهبية لاستهداف الجينات المشروطة أو المستحثة. لتوفير نماذج تجريبية أسرع وأكثر كفاءة ، تم تطوير نظام زراعة عضوي خارج الجسم الحي باستخدام الفيروس الغدي Cre والخلايا البولية الطبيعية التي تحمل أليلات loxP متعددة من مثبطات الورم Trp53 و Pten و Rb1. يتم فصل الخلايا البولية الطبيعية إنزيميا عن أربع مثانات من الفئران الثلاثية المفلطحة (Trp53 f/f: Pten f/f: Rb1 f/f). يتم نقل الخلايا البولية خارج الجسم الحي مع الفيروس الغدي-Cre مدفوعا بمروج CMV (Ad5CMVCre). يتم استزراع عضويات المثانة المحولة ونشرها وتمييزها في المختبر وفي الجسم الحي. يستخدم PCR لتأكيد حذف الجينات في Trp53 و Pten و Rb1. يوضح تلطيخ التألق المناعي (IF) للعضويات تعبيرا إيجابيا عن علامات النسب البولي (CK5 و p63). يتم حقن المواد العضوية تحت الجلد في الفئران المضيفة لتوسيع الورم والممرات التسلسلية. تظهر الكيمياء النسيجية المناعية (IHC) ل xenografts تعبيرا إيجابيا عن CK7 و CK5 و p63 وتعبيرا سلبيا عن CK8 و Uroplakin 3. باختصار ، يعد حذف الجينات بوساطة الفيروس الغدي من الخلايا البولية اللولبية للفئران المصممة بمواقع loxP طريقة فعالة لاختبار الإمكانات السرطانية للتغيرات الجينية المحددة بسرعة.
Introduction
سرطان المثانة هو رابع أكثر أنواع السرطان شيوعا لدى الرجال ويصيب أكثر من 80000 شخص سنويا في الولايات المتحدة1. كان العلاج الكيميائي القائم على البلاتين هو معيار الرعاية للمرضى الذين يعانون من سرطان المثانة المتقدم لأكثر من ثلاثة عقود. لقد تم إحداث ثورة في مشهد علاج سرطان المثانة من خلال الموافقة الأخيرة لإدارة الغذاء والدواء (FDA) على العلاج المناعي (مثبطات نقاط التفتيش المناعية المضادة ل PD-1 و PD-L1) ، و erdafitinib (مثبط مستقبلات عامل نمو الخلايا الليفية) و enfortumab vedotin (اقتران الأجسام المضادة والأدوية) 2،3،4. ومع ذلك، لا تتوفر مؤشرات حيوية معتمدة سريريا للتنبؤ بالاستجابات للعلاج الكيميائي أو العلاج المناعي. هناك حاجة ماسة إلى إنشاء نماذج ما قبل السريرية غنية بالمعلومات يمكنها تحسين فهم الآليات التي تدفع تطور سرطان المثانة وتطوير مؤشرات حيوية تنبؤية لطرق العلاج المختلفة.
تتمثل إحدى العقبات الرئيسية في الأبحاث الانتقالية للمثانة في عدم وجود نماذج ما قبل السريرية تلخص التسبب في سرطان المثانة البشري واستجابات العلاج 5,6. تم تطوير نماذج متعددة قبل السريرية ، بما في ذلك نماذج 2D في المختبر (خطوط الخلايا أو الخلايا المعاد برمجتها بشكل مشروط) ، في نماذج 3D المختبرية (المواد العضوية ، الطباعة ثلاثية الأبعاد) ، وفي نماذج الجسم الحي (xenograft ، النماذج المستحثة بالمواد المسرطنة ، المهندسة وراثيا ، و xenograft المشتقة من المريض) 2,6. تعد نماذج الفئران المهندسة وراثيا (GEMMs) مفيدة للعديد من التطبيقات في بيولوجيا سرطان المثانة ، بما في ذلك تحليلات الأنماط الظاهرية للورم ، والتحقيقات الميكانيكية للجينات المرشحة و / أو مسارات الإشارات ، والتقييم قبل السريري للاستجابات العلاجية 6,7. يمكن ل GEMMs استخدام المؤتلفات الخاصة بالموقع (Cre-loxP) للتحكم في الحذف الجيني في واحد أو أكثر من الجينات المثبطة للورم. عملية توليد GEMMs المطلوبة مع حذف الجينات المتعددة تستغرق وقتا طويلا وشاقة ومكلفة5. الهدف العام من هذه الطريقة هو تطوير طريقة سريعة وفعالة لتسليم Cre خارج الجسم الحي لإنشاء نماذج خروج المغلوب الثلاثي للمثانة (TKO) من الخلايا البولية العادية للفأر التي تحمل أليلات ثلاثية مفعول (Trp53 و Pten و Rb1)8. الميزة الرئيسية لطريقة ex vivo هي سير العمل السريع (1-2 أسابيع بدلا من سنوات من تربية الماوس). توضح هذه المقالة بروتوكول حصاد الخلايا البولية الطبيعية مع الأليلات المفلطحة، ونقل الفيروس الغدي خارج الجسم الحي، والثقافات العضوية، والتوصيف في المختبر وفي الجسم الحي في الفئران C57 BL/6J المناعية. يمكن استخدام هذه الطريقة بشكل أكبر لتوليد عضويات سرطان المثانة ذات الصلة سريريا في الفئران ذات الكفاءة المناعية التي تؤوي أي مزيج من الأليلات المفلطحة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) في مركز روزويل بارك الشامل للسرطان ، بوفالو ، نيويورك (1395M ، 180501 السلامة البيولوجية 180502).
ملاحظة: تنفيذ الخطوات من 1 إلى 3 في نفس اليوم.
1. تشريح المثانة الفأر
- التحضير للتشريح
- قم بإعداد جميع الأدوات المعقمة بما في ذلك المقص والملقط و DPBS المعقمة في أطباق استزراع 35 مم والإيثانول بنسبة 70٪ والشاش المعقم والمناشف الورقية النظيفة. تنظيف جميع أسطح منطقة التشريح. توليد ذكور الفئران الثلاثية المفلطخة Trp53 f/f: Pten f/f: Rb1 f/f (4 فئران، عمرها 10 أسابيع)، كما هو موضح سابقا في مختبر الدكتور جودريتش 8.
- القتل الرحيم والشق
- القتل الرحيم للفئران عن طريق الاختناق CO 2 باستخدام معدل تدفق2.0 لتر / دقيقة ، يليه خلع عنق الرحم. نظف منطقة التشريح بنسبة 70٪ من الإيثانول وقم بتغطيتها بمنشفة ورقية نظيفة.
- ضع الماوس على الشاش في منطقة التشريح. رش 70٪ من الإيثانول على بطن الفأر واستخدم مقص تشريح معقم لإجراء شق أسفل خط الوسط في البطن يعرض المثانة.
- تشريح المثانة
- استخدم الملقط للإمساك بالمثانة وسحبها بلطف حتى يتم تحديد تقاطعات الحالب الثنائية. استخدم المقص لإزالة قاع المثانة باتباع خط الحدود بين فتحتي الحالب.
- انقل المثانة إلى طبق معقم مع 2 مل من DPBS. إزالة الأنسجة الدهنية والضامة ووضع المثانة في طبق جديد مع 2 مل معقمة من DPBS. في هذا الوقت ، أخرج الفيروس الغدي من تخزين -80 درجة مئوية واحتفظ به على الجليد.
2. تفكك الخلايا البولية
- التحضير لتفكك الخلايا
- قم بإعداد جميع الأدوات المعقمة، بما في ذلك الملقط، والمشارط الجراحية (بحجم 10 شفرات مع مقبض)، وDPBS المعقمة في أطباق الثقافة مقاس 35 مم، ووسط الاستزراع الكامل بدون FBS المجردة من الفحم والتي تعرف بأنها CCM(-)، وخليط الكولاجيناز/الهيالورونيداز، والإنزيم المؤتلف لبديل التربسين، وFBS المجردة من الفحم بنسبة 10٪ في DPBS مع Y-27632 الطازج 10 ميكرومتر، ومصفاة الخلايا المعقمة 100 ميكرومتر، وأنبوب طرد مركزي 15 مل.
ملاحظة: يتكون وسط الاستزراع الكامل (CCM) من وسط نمو الخلايا الظهارية الثديية المكمل بعوامل النمو المقدمة و 5٪ FBS المجردة من الفحم ، و 1٪ L-glutamine ، و 100 ميكروغرام / مل بريموسين ، و 10 ميكرومتر طازج Y-27632.
- قم بإعداد جميع الأدوات المعقمة، بما في ذلك الملقط، والمشارط الجراحية (بحجم 10 شفرات مع مقبض)، وDPBS المعقمة في أطباق الثقافة مقاس 35 مم، ووسط الاستزراع الكامل بدون FBS المجردة من الفحم والتي تعرف بأنها CCM(-)، وخليط الكولاجيناز/الهيالورونيداز، والإنزيم المؤتلف لبديل التربسين، وFBS المجردة من الفحم بنسبة 10٪ في DPBS مع Y-27632 الطازج 10 ميكرومتر، ومصفاة الخلايا المعقمة 100 ميكرومتر، وأنبوب طرد مركزي 15 مل.
- فرم وهضم المثانة
- انقل المثانة واغسلها مرة أخرى باستخدام 2 مل من DPBS المعقم في طبق 35 مم في خزانة السلامة الأحيائية.
- جمع أنسجة المثانة من أربعة فئران في طبق مع 1 مل من CCM(-) وفرم كل المثانة إلى أربع قطع متساوية باستخدام شفرة جراحية. استخدم الملقط لكشف المثانة لتعريض سطح اليوروثيليوم إلى الوسط.
- انقل قطع المثانة والمتوسطة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل. اغسل الطبق ب 2 مل من CCM (-) 2x وقم بجمعه في أنبوب طرد مركزي بحجم إجمالي قدره 5 مل.
- أضف خليط الكولاجيناز / الهيالورونيداز إلى تركيز نهائي من 300 U / mL collagenase و 100 U / mL hyaluronidase ووضع الأنبوب أفقيا في شاكر حاضن مداري 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة عند 200 دورة في الدقيقة.
- بعد هضم الأنسجة، أضف حجما متساويا (5 مل) من 10٪ من FBS المجردة من الفحم في DPBS إلى الأنبوب وقم بالطرد المركزي للأنبوب عند 200 × g لمدة 5 دقائق.
- قم بإزالة وتجاهل supernatant. أضف 2 مل من بديل التربسين إلى حبيبة الخلية واخلطها جيدا. ضع الأنبوب في حاضنة الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 4 دقائق.
- بعد الحضانة ، ماصة لأعلى ولأسفل 10x مع طرف P1000 قياسي. أضف 5 مل من FBS المجردة من الفحم بنسبة 10٪ في DPBS.
- قم بتصفية الخلايا المنفصلة من خلال مصفاة خلايا معقمة 100 ميكرومتر. اجمع تعليق الخلية وأجهزة الطرد المركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق.
- عد الخلايا وتعليقها
- قم بإزالة وتجاهل supernatant. أعد تعليق بيليه الخلية مع 1 مل من CCM.
- عد عدد الخلايا باستخدام مقياس الدم ولوحة فقط 0.5 × 106 خلايا في بئر من صفيحة 24 بئر مع 0.5 مل من CCM الطازجة. في هذا الوقت ، أخرج مقتطفات المصفوفة من خلايا ساركوما الفئران Engelbreth-Holm-Swarm (انظر جدول المواد) من تخزين -20 درجة مئوية وتذوب على الجليد. قم بتسخين صفيحة من 6 آبار مسبقا في حاضنة خلايا 37 درجة مئوية.
ملاحظة: يمكن طرد الخلايا المتبقية وتجميدها ككريات خلوية للتحكم في النقل غير الفيروسي.
3. نقل الفيروسات الغدية وطلاء المواد العضوية
تحذير: يرجى توخي الحذر عند معالجة الفيروس الغدي. وينبغي لموظفي المختبرات اتباع ممارسات السلامة الأحيائية من المستوى 2 وتطهير الفيروس الغدي باستخدام 10 في المائة من المبيضات.
- أضف 2 ميكرولتر من الفيروس الغدي (Ad5CMVCre؛ 1 × 107 PFU/μL) إلى الصفيحة المكونة من 24 بئرا. تخلط جيدا مع الخلايا البولية الحمامية غير المرتبطة.
- لتعزيز فعالية التوصيل، قم بإجراء الدوران عن طريق الطرد المركزي للصفيحة المكونة من 24 بئرا عند 300 × g لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ضع الصفيحة المكونة من 24 بئرا في حاضنة الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 1 ساعة.
- انقل الخلايا والمتوسطة من البئر إلى أنبوب 15 مل وأجهزة طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق. قم بإزالة والتخلص من supernatant ، وإضافة 50 ميكرولتر من CCM ، وتخلط جيدا مع الخلايا في الأسفل.
- أضف 140 ميكرولتر من مستخلص المصفوفة واخلطها جيدا بلطف لتجنب فقاعات الهواء. أضف المحلول بسرعة إلى صفيحة 6 آبار المسخنة مسبقا عند 50 ميكرولتر / قبة لإنشاء قباب للعضويات.
- انقل اللوحة إلى حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 بلطف واسمح للقباب بالتصلب لمدة 5 دقائق. اقلب الصفيحة المكونة من 6 آبار رأسا على عقب واستمر في التصلب لمدة 25 دقيقة إضافية.
- بعد الحضانة ، أضف 2.5 مل من CCM إلى كل بئر وضع اللوحة في حاضنة للثقافة العضوية.
4. زراعة العضوية والمرور
- تغيير الوسط كل 3-4 أيام. إجراء زراعة الأعضاء ، والمرور ، والتجميد كما ورد في Lee et al.9. أداء تضمين المواد العضوية باستخدام جل معالجة العينات كما هو موضح في Fujii et al.10.
- قم بإزالة الوسط وإضافة 1 مل من التفكيك إلى كل بئر. اكسر القبة بلطف واخلطها جيدا بطرف ماصة P1000.
- ضع اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، اجمع جميع الخلايا في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل واغسل البئر ب 4 مل من FBS المجردة من الفحم بنسبة 10٪ في DPBS. إذا ظهرت الخلايا العضوية كمجموعات كبيرة، فقم بتنفيذ الخطوة 2.2.6. والخطوة 2.2.7. للحصول على خلايا غير مرتبطة.
- جهاز طرد مركزي للأنبوب عند 200 × جم لمدة 5 دقائق. إزالة supernatant وغسل الخلايا مع 1 مل من CCM.
- أعد تعليق الخلايا في مستخلص مصفوفة 70٪ واتبع الخطوات من 3.4.-3.6. للزراعة. بدلا من ذلك ، حافظ على الخلايا بالتبريد عن طريق التعليق في 90٪ FBS المجردة من الفحم و 10٪ DMSO مع استكمال 10 ميكرومتر طازج Y-27632.
5. زرع الخلايا العضوية في الفأر C57BL / 6J تحت الجلد
- التحضير للزرع
- قم بإعداد 25G 1.5 في الإبر ، حقنة 1 مل ، 1 mg / mL dispase ، مستخلص المصفوفة ، FBS المجردة من الفحم بنسبة 10٪ في DPBS مع 10 ميكرومتر طازجة Y-27632 ، وأنبوب طرد مركزي 15 مل.
- جمع الخلايا العضوية
- بعد تحقيق ثقافة مستقرة لمدة 5 ممرات على الأقل ، قم بجمع الخلايا العضوية الموسعة للحقن في الجسم الحي . اتبع الخطوات من 4.2.إلى 4.4. وإعادة تعليق الخلايا في 1 مل من CCM.
- عد الخلايا والحقن تحت الجلد
- احسب عدد الخلايا باستخدام مقياس الدم. بعد الطرد المركزي عند 200 × g لمدة 5 دقائق ، أعد تعليق 2 × 106 خلايا في 100 ميكرولتر من مستخلص مصفوفة 50٪ في DPBS. ضع التعليق على الجليد وخذه إلى خزانة السلامة البيولوجية في غرفة إجراءات الحيوانات.
- تخدير اثنين من الفئران C57BL/6J الذكور (10 أسابيع من العمر) مع 4٪ من الإيسوفلوران وتدفق 1 لتر / دقيقة O2 لمدة 4 دقائق تقريبا في الغرفة. بمجرد أن تفقد الفئران رد فعلها التصحيحي ويصبح نمط تنفسها أعمق وأبطأ ، انقل الفئران إلى دائرة غير قابلة لإعادة التنفس مع تدفق 2٪ من الأيزوفلوران و 1 لتر / دقيقة O2 . تطبيق مرهم الطبيب البيطري لحماية عيون الحيوانات من الإصابة المؤلمة.
- احلق منطقة واحدة حول موقع الحقن في الجناح الأيمن للفأر واستخدم 70٪ من الإيثانول للتطهير ، ثم استخدم إبرة 25 جم لحقن تعليق الخلايا 100 ميكرولتر مباشرة في الجناح الأيمن تحت التخدير.
- بعد الحقن ، قم بإزالة التخدير الاستنشاقي ووضع الفئران في قفص تحت مصباح حراري حتى تتعافى وتعبئتها بالكامل. إعادة الفئران للسكن ومراقبة تكوين الورم.
6. جمع الورم وانتشاره في الجسم الحي
- اتبع خطوة التحضير 2.1.1. القتل الرحيم للفئران عن طريق الاختناق CO 2 باستخدام معدل تدفق 2.0 لتر / دقيقة متبوعا بخلع عنق الرحم بعد تشكيل ورم قطره ~2.0 سم (ما يقرب من 2-3 أسابيع). انقل الفئران إلى منطقة تشريح نظيفة ، ورش 70٪ من الإيثانول على منطقة ورم جناح الفأر ، واستخدم مقص تشريح معقم وملقط لإجراء شق لفصل الورم.
- اغسل الورم في طبق 60 مم مع 5 مل من DPBS واستخدم المقص لإزالة النسيج الضام. قطع قطعة واحدة من الورم الطازج وإغراقها مع 4٪ بارافورمالدهيد في DPBS لمدة 48 ساعة وإرسالها لتضمين البارافين وتقسيمها لتحليل الأنسجة.
- معالجة النصف الآخر من الورم الطازج لفصل الخلايا. باختصار ، قم بفرم الورم الطازج إلى 1 مم3 قطع للتفكك في طبق 60 مم مع 5 مل من CCM (-). ثم، بعد اتباع الخطوات 2.2.4.-2.2.8.، حقن الخلايا غير المرتبطة في الفئران C57BL/6J الجديدة للمرور في الجسم الحي بعد الخطوة 5.3. أو احتفظ بها في ثقافة عضوية في المختبر باتباع الخطوات 3.4.-3.6 ، أو قم بتجميدها مباشرة في النيتروجين السائل باستخدام 90٪ FBS المجردة من الفحم و 10٪ DMSO مع 10 ميكرومتر طازجة Y-27632.
- إذا لزم الأمر ، استرجع الخلايا المجمدة عن طريق إذابتها بسرعة في حمام مائي 37 درجة مئوية وغسلها باستخدام CCM (-). بعد ذلك ، أعد تعليقها في 100 ميكرولتر من مستخلص المصفوفة 50٪ في DPBS للحقن المباشر في الفئران لتشكيل الورم في الجسم الحي . استخدم ما لا يقل عن 2 × 106 خلايا مذابة لحقن واحد في الجسم الحي .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يظهر سير عمل عمليات حذف الجينات بوساطة الفيروس الغدي-Cre في الخلايا البولية الثيلية للفئران في الشكل 1A. يوضح الفيديو المصاحب كيفية انفصال الخلايا البولية عن قاع المثانة وكيف يتم نقل الخلايا الثلاثية المفلطحة خارج الجسم الحي باستخدام Ad5CMVCre. أظهر الشكل 1A أن الحد الأدنى من الخلايا تحت المخاطية وخلايا العضلات تم فصلها بعد هضم الإنزيم. ولتأكيد كفاءة توصيل الفيروس الغدي-كري، تم نقل الخلايا البولية المنفصلة عن الفئران الثلاثية المفلطخة ببروتين الفلورسنت الأخضر المعزز المستهدف بالغشاء / الغشاء الموضعي (mT/mG) باستخدام الفيروس الغدي Cre. تم الكشف عن بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) في ما يقرب من 100 ٪ من الخلايا ، مما يشير إلى كفاءة عالية لنقل الفيروس الغدي (الشكل 1B).
تم إنشاء عضويات TKO مستقرة وفقا لبروتوكولات عضوية قياسية (في المختبر مع أكثر من 5 ممرات. الشكل 2 ألف). أظهر H & E والتألق المناعي (IF) للأقسام العضوية في المختبر (الشكل 2A) مورفولوجيا سرطان المسالك البولية عالي الجودة مع تعبير إيجابي عن علامات النسب البولي CK5 و p6311. كشف تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل عن أليلات معاد تجميعها في عضويات TKO ، في حين تم اكتشاف الأليلات المفلطحة غير المعاد دمجها فقط في الخلايا البولية اللثولية غير المعالجة بالفيروس الغدي (الشكل 2B). تم حقن ما مجموعه 2 × 106 من المواد العضوية الأولية خارج الجسم الحي في C57BL/6J لتشكيل الورم الأولي تحت الجلد (SQ) في 8 أسابيع. ثم ، تم جمع ورم SQ (المقطع 1) ومروره في الفئران. بشكل عام ، كانت هناك حاجة إلى 2-3 أسابيع لتشكيل ورم SQ 2 سم (الممرات 2-5) (الشكل 2C). أظهرت الكيمياء النسيجية المناعية (IHC) ل TKO في الجسم الحي xenograft تعبيرا إيجابيا عن CK7 (غير مكتمل) و CK5 و p63 وتعبيرا سلبيا عن CK8 و Uroplakin 3 (الشكل 2D). للكشف عن تلوث خلايا اللحمة المتوسطة ، تم تلطيخ أورام TKO للفيمنتين. أظهرت بقعة H & E الورم على اليسار والكبسولة على اليمين التي تم ترسيمها بواسطة الخط الأصفر. تم الكشف عن فيمنتين إيجابي فقط في كبسولة الورم أو السدى (الشكل 2E).
الشكل 1: حذف الجينات بوساطة الفيروس الغدي-Cre في الخلايا البولية الوثيلية للفئران مع مواقع loxP . (أ) سير عمل توليد الأعضاء TKO عن طريق الفيروس الغدي خارج الجسم الحي Ad5CMVCre. كان هضم الإنزيم لمدة 30 دقيقة لفترة قصيرة كافيا لفصل الخلايا البولية عن الغشاء المخاطي السفلي الأساسي والعضلات البروبريا. تم نقل الخلايا البولية الظهارية غير المرتبطة مع Ad5CMVCre للعضويات TKO وتم حقنها لاحقا في الفئران C57BL / 6J. (ب) تم نقل الخلايا البولية الثلاثية المفلطحة مع mT / mG (التعبير الجيني الجيني التأسيسي للبروتين الفلوري الأحمر الذي يتحول إلى بروتين فلورسنت أخضر بعد إعادة تركيب Cre) باستخدام Ad5CMVCre. ما يقرب من 100 ٪ من الخلايا كانت إيجابية GFP ، مما يشير إلى نقل عالي الكفاءة وإعادة تركيب Cre. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: توصيف المواد العضوية TKO عن طريق الفيروس الغدي خارج الجسم الحي - Cre recombinase. (أ) تم نقل الخلايا البولية الظهارية المنفصلة Trp53 f/f: Pten f/f: Rb1 f/f الخلايا البولية مع الفيروس الغدي (Ad5CMVCre) لتوليد عضويات TKO (حقل ساطع). تم تضمين المواد العضوية TKO مع جل معالجة العينات وملطخة ل H & E والتألق المناعي. (ب) تم استخراج الحمض النووي الجيني من الخلايا البولية الثلاثية المفلطحة (الحارة 2) و TKO العضوية (الحارة 4) وتم تضخيمها بواسطة PCR للكشف عن الأليلات المفلطحة أو الأليلات المعاد دمجها Cre من Trp53 و Rb1 و Pten. وكانت أشرطة تفاعل البوليميراز المتسلسل ملطخة ببروميد الإيثيديوم. كان الحارة 1 والمسار 3 عناصر تحكم سلبية وإيجابية أعيد دمجها. (ج) ظهر ورم إجمالي من نوع TKO SQ (المقطع 4) في اليوم 17 بعد حقن SQ. (د) كانت أقسام أنسجة الورم من XENOGRAFTS TKO SQ ملطخة ب H & E ، إذا (CK5 ، CK8) ، أو IHC (CK7 ، p63 ، Upk3). الاختصارات: CK5 = سيتوكيراتين 5; CK20 = سيتوكيراتين 20; CK8 = سيتوكيراتين 8; CK7 = سيتوكيراتين 7; Upk3 = أوروبلاكين الثالث. (ه) كانت أقسام أنسجة الورم من xenografts TKO SQ ملطخة ب H & E و IF (vimentin). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
كانت GEMMs هي المعايير الذهبية لنمذجة السرطان التي بدأت من الخلايا الطبيعية ، مما يسمح باختبار عواقب الاضطرابات السرطانية المحتملة (تنشيط الجينات الورمية و / أو فقدان مثبطات الورم) بدقة. هنا ، يتم توفير بروتوكول سريع وفعال لتوليد عضويات سرطان المثانة عن طريق تحرير الجينات خارج الجسم الحي للخلايا البولية الثيلية الطبيعية للفئران التي تحمل أليلات مفلطخة في الجينات ذات الاهتمام. يوضح تلطيخ H&E و IHC أن المواد العضوية TKO تظهر الأنسجة بما يتفق مع الظهارة البولية عالية الجودة ، مع التمايز الحرشفية ونوع فرعي يشبه القاعدية كما هو الحال في المواد العضوية المختبرية وكما هو الحال في xenografts في الجسم الحي . يمكن استخدام TKO organoids في المختبر لدراسة آثار فقدان Trp53 و Rb1 و Pten ، وفحص الأدوية ، والتقييم الجزيئي لمسارات الإشارات. سيمكن التكوين السريع للورم في الفئران C57BL/6J في الجسم الحي من إجراء دراسات مصممة لتقييم استجابات العلاج للعلاجات الجهازية مثل العلاج الكيميائي أو العلاج المناعي.
يتكون urothelium من طبقة من الخلايا القاعدية (إيجابية ل CK5 و p63) ، و 1-2 طبقات من الخلايا الوسيطة (Uroplakins و p63 إيجابية) ، وخلايا مظلة (Uroplakins ، CK8 و CK20 إيجابية)6. الخطوة الحاسمة في هذه الطريقة هي الوقت المحدود (30 دقيقة) لتفكك الأنسجة بدلا من هضم الإنزيم لفترات طويلة (4 ساعات) ، مما يسمح بالحد الأدنى من تلوث الخلايا تحت المخاطية غير البولية (الشكل 1A). قد يؤدي وقت الانفصال الأطول إلى زيادة النسبة المئوية للخلايا اللحمية ، مثل الخلايا البطانية والخلايا الليفية الليفية. خطوة نقل خارج الجسم الحي للفيروس الغدي فعالة للغاية. بعد نقل الفيروس الغدي الكري خارج الجسم الحي ، تم تصور GFP في ما يقرب من 100 ٪ من الخلايا البولية الثيلية مع أليلات مراسل mT / mG (الشكل 1B).
هناك قيود على طريقة خارج الجسم الحي. أولا ، لا يتم اختيار الخلايا المنفصلة مسبقا قبل نقل الفيروس الغدي. على سبيل المثال ، لا يتم تمييز الخلايا للخلايا البولية مقابل الخلايا غير البولية ، أو الخلايا اللمعية مقابل الخلايا القاعدية. يمكن استخدام فرز الخلايا باستخدام EpCAM و / أو CD49f لفرز الخلايا الظهارية النقية و / أو الخلايا الجذعية قبل النقل خارج الجسم الحي 12,13. ثانيا ، يستهدف الفيروس الغدي الذي يقود تعبير Cre مع مروج CMV المستخدم في هذا البروتوكول مجموعة واسعة من أنواع الخلايا بعد انفصال الأنسجة (الخلايا البولية الظهارية مقابل الخلايا غير البولية ، القاعدية مقابل الخلايا اللمنية). قد يؤدي هذا الاستهداف غير المحدد إلى تحيز في الاختيار مما يسبب فرط نمو الخلايا ذات الإمكانات الأكثر وراثيا. تم استخدام ناقلات الفيروس الغدي الخاصة بنوع الخلايا موضعيا في كل من سرطان الرئة وسرطان المثانة GEMMs14،15،16،17. قد تتناول الدراسات المستقبلية باستخدام الفيروس الغدي الخاص بنوع الخلايا خارج الجسم الحي (الفيروس الغدي مع مروج CK8 أو مروج CK5) أسئلة خلية المنشأ حول ما إذا كانت عضويات TKO مشتقة من الخلايا القاعدية أو اللمعانية18. يمكن أيضا تصميم الفيروس الغدي الخاص ب CK20 أو Upk2 (غير متوفر على حد علمنا) لنقل الخلايا المظلة في الظهارة البولية. ومع ذلك ، هناك حاجة إلى دراسات مستقبلية لفحص كفاءة وخصوصية هذه الفيروسات الغدية الخاصة بالمروجين لعدوى المثانة خارج الجسم الحي. قد يكون هناك تباين في كفاءة الفيروس الغدي-Cre بين النقل في الجسم الحي وخارج الجسم الحي بسبب البيئة المضيفة18. ثالثا ، طريقة خارج الجسم الحي محدودة بسبب عدم وجود بيئة الورم ، والتي قد تؤثر على تكوين الأورام في الجسم الحي وعلم الأنسجة النسيجية. على الرغم من هذه القيود ، فإن الميزة الرئيسية لطريقة خارج الجسم الحي هي سير العمل السريع (1-2 أسابيع بدلا من سنوات من تربية الفئران). الميزة الثانية لنهج خارج الجسم الحي هي أن الفيروس الغدي-Cre (Ad5CMVCre) متاح تجاريا ومباشرا وفعالا بنسبة 100٪ تقريبا للنقل الفيروسي وإعادة تركيب Cre (الشكل 1B)". وعلى النقيض من ذلك، تتطلب الطرق البديلة خارج الجسم الحي التي تستخدم تحرير كريسبر أو النقل الفيروسي الوراثي مزيدا من اختيار النسخ بسبب التحرير الجينومي الأقل كفاءة5،13،19،20.
باختصار ، فإن نهج الفيروس الغدي خارج الجسم الحي الموصوف مريح وسريع وفعال في توليد نماذج سرطان المثانة باستخدام أي مزيج من الجينات ذات الأهمية (الأليلات المفلطحة) المتعلقة بسرطان المثانة البشري. يمكن دمج هذه النماذج مع الفيروس الغدي الخاص بنوع الخلية وفرز الخلايا لمعالجة تأثير الخلية الأصلية على النمط الظاهري لسرطان المثانة وتقييم استجابات العلاج للعلاجات المناعية في مجموعة من الطفرات الجينية المحددة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل البحثي جزئيا من قبل NIH Grants و K08CA252161 (Q.L.) و R01CA234162 و R01 CA207757 (D.W.G.) و P30CA016056 (منحة الدعم الأساسية لمركز NCI للسرطان) ومؤسسة روزويل بارك ألاينس ومؤسسة أصدقاء المسالك البولية. نشكر ماريسا بلاسك وميلا باكهوموفا على التدقيق اللغوي للمخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 μm sterile cell strainer | Corning | 431752 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 25G 1.5 inches needle | EXELINT International | 26406 | |
| Adenovirus (Ad5CMVCre High Titer, 1E11 pfu/ml) | UI Viral Vector Core | VVC-U of Iowa-5-HT | |
| C57 BL/6J | Jackson Lab | 000664 | |
| Charcoal-stripped FBS | Gibco | A3382101 | |
| Collagenase/hyaluronidase | Stemcell Technologies | 07912 | |
| Dispase | Stemcell Technologies | 07913 | |
| DPBS, 1x | Corning | 21-031-CV | |
| L-glutamine substitute (GlutaMAX) | Gibco | 35-050-061 | |
| Mammary Epithelial Cell Growth medium | Lonza | CC-3150 | |
| Matrix extracts from Engelbreth–Holm–Swarm mouse sarcomas (Matrigel) | Corning | CB-40234 | |
| Monoclonal mouse anti-CK20 | DAKO | M7019 | IF 1:100 |
| Monoclonal mouse anti-CK7 | Santa Cruz Biotechnology | SC-23876 | IHC 1:50 |
| Monoclonal mouse anti-p63 | Abcam | ab735 | IHC 1:100, IF 1:50 |
| Monoclonal mouse anti-Upk3 | Fitzgerald | 10R-U103A | IHC 1:50 |
| Monoclonal mouse anti-Vimentin | Santa Cruz Biotechnology | SC-6260 | IF 1:100 |
| Monoclonal rat anti-CK8 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-I-s | IF 1:100 |
| HERAcell vios 160i CO2 incubator | Thermo Fisher | 51033557 | |
| Polyclonal chicken anti-CK5 | Biolegend | 905901 | IF 1:500 |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| Recombinant enzyme of trypsin substitute (TrypLE Express Enzyme) | Thermo Fisher | 12605036 | |
| Signature benchtop shaking incubator Model 1575 | VWR | 35962-091 | |
| Specimen Processing Gel (HistoGel) | Thermo Fisher | HG-4000-012 | |
| Surgical blade size 10 | Integra Miltex | 4-110 | |
| Sorvall Legend RT | Thermo Fisher | 75004377 | |
| Sorvall T1 centrifuge | Thermo Fisher | 75002383 | |
| Y-27632 | Selleckchem | S1049 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A.
- Zhu, S., et al. Preclinical models for bladder cancer research. Hematology/Oncology Clinics of North America. 35 (3), 613-632 (2021).
- DeGraff, D. J., et al. Current preclinical models for the advancement of translational bladder cancer research. Molecular Cancer Therapeutics. 12 (2), 121-130 (2013).
- Andreev-Drakhlin, A. Y., et al. The evolving treatment landscape of advanced urothelial carcinoma. Current Opinion in Oncology. 33 (3), 221-230 (2021).
- Mullenders, J., et al. Mouse and human urothelial cancer organoids: A tool for bladder cancer research. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4567-4574 (2019).
- Kobayashi, T., Owczarek, T. B., McKiernan, J. M., Abate-Shen, C. Modelling bladder cancer in mice: opportunities and challenges. Nature Reviews. Cancer. 15 (1), 42-54 (2015).
- Kersten, K., de Visser, K. E., van Miltenburg, M. H., Jonkers, J. Genetically engineered mouse models in oncology research and cancer medicine. EMBO Molecular Medicine. 9 (2), 137-153 (2017).
- Ku, S. Y., et al. Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance. Science. 355 (6320), 78-83 (2017).
- Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
- Fujii, E., et al. A simple method for histopathological evaluation of organoids. Journal of Toxicologic Pathology. 31 (1), 81-85 (2018).
- Georgas, K. M., et al. An illustrated anatomical ontology of the developing mouse lower urogenital tract. Development. 142 (10), 1893-1908 (2015).
- Santos, C. P., et al. Urothelial organoids originating from Cd49f(high) mouse stem cells display Notch-dependent differentiation capacity. Nature Communication. 10 (1), 4407 (2019).
- Wang, L., et al. A genetically defined disease model reveals that urothelial cells can initiate divergent bladder cancer phenotypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 563-572 (2020).
- Yang, D., et al. Intertumoral heterogeneity in SCLC is influenced by the cell type of origin. Cancer Discovery. 8 (10), 1316-1331 (2018).
- Sutherland, K. D., et al. Cell of origin of small cell lung cancer: inactivation of Trp53 and Rb1 in distinct cell types of adult mouse lung. Cancer Cell. 19 (6), 754-764 (2011).
- Bottger, F., et al. Tumor heterogeneity underlies differential cisplatin sensitivity in mouse models of small-cell lung cancer. Cell Reports. 27 (11), 3345-3358 (2019).
- Puzio-Kuter, A. M., et al. Inactivation of p53 and Pten promotes invasive bladder cancer. Genes & Development. 23 (6), 675-680 (2009).
- Park, S., et al. Novel mouse models of bladder cancer identify a prognostic signature associated with risk of disease progression. Cancer Research. 81 (20), 5161-5175 (2021).
- Hawley, S. P., Wills, M. K., Jones, N. Adenovirus-mediated genetic removal of signaling molecules in cultured primary mouse embryonic fibroblasts. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (43), e2160 (2010).
- Feng, W., et al. Rapid interrogation of cancer cell of origin through CRISPR editing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (32), 2110344118 (2021).
