Summary
Этот протокол описывает процесс генерации и характеристики уротелиальных органоидов мыши, содержащих делеции в генах, представляющих интерес. Методы включают сбор уротелиальных клеток мыши, трансдукцию ex vivo с аденовирусом, стимулирующим экспрессию Cre с помощью промотора ЦМВ, и характеристику in vitro , а также in vivo .
Abstract
Рак мочевого пузыря является недостаточно изученной областью, особенно в генетически модифицированных моделях мышей (GEMM). Инбредные GEMM с тканеспецифическими сайтами Cre и loxP были золотыми стандартами для условного или индуцируемого нацеливания генов. Для обеспечения более быстрых и эффективных экспериментальных моделей разработана система культуры органоидов ex vivo с использованием аденовируса Cre и нормальных уротелиальных клеток, несущих множественные аллели loxP супрессоров опухоли Trp53, Pten и Rb1. Нормальные уротелиальные клетки ферментативно отделены от четырех мочевых пузырей мышей с тройным флоксом (Trp53f/f: Ptenf/f: Rb1f/f). Уротелиальные клетки трансдуцируются ex vivo с аденовирусом-Cre, приводимым в действие промотором ЦМВ (Ad5CMVCre). Трансдуцированные органоиды мочевого пузыря культивируются, размножаются и характеризуются in vitro и in vivo. ПЦР используется для подтверждения делеций генов в Trp53, Pten и Rb1. Иммунофлуоресцентное (ИФ) окрашивание органоидов демонстрирует положительную экспрессию маркеров уротелиальной линии (CK5 и p63). Органоиды вводятся подкожно мышам-хозяевам для расширения опухоли и последовательных проходов. Иммуногистохимия (IHC) ксенотрансплантатов демонстрирует положительную экспрессию CK7, CK5 и p63 и отрицательную экспрессию CK8 и Uroplakin 3. Таким образом, опосредованная аденовирусом делеция генов из уротелиальных клеток мыши, спроектированных с сайтами loxP, является эффективным методом быстрой проверки опухолевого потенциала определенных генетических изменений.
Introduction
Рак мочевого пузыря является четвертым наиболее распространенным раком у мужчин и ежегодно поражает более 80 000 человек в Соединенных Штатах1. Химиотерапия на основе платины была стандартом ухода за пациентами с прогрессирующим раком мочевого пузыря на протяжении более трех десятилетий. Ландшафт лечения рака мочевого пузыря был революционизирован недавним одобрением Управлением по контролю за продуктами и лекарствами (FDA) иммунотерапии (ингибиторы иммунной контрольной точки анти-PD-1 и анти-PD-L1), эрдафитиниба (ингибитор рецептора фактора роста фибробластов) и энфортумаба ведотина (конъюгат антитело-лекарство)2,3,4. Тем не менее, клинически одобренные биомаркеры недоступны для прогнозирования ответов на химиотерапию или иммунотерапию. Существует острая необходимость в создании информативных доклинических моделей, которые могут улучшить понимание механизмов, приводящих к прогрессированию рака мочевого пузыря, и разработать прогностические биомаркеры для различных методов лечения.
Основным препятствием в трансляционных исследованиях мочевого пузыря является отсутствие доклинических моделей, которые резюмируют патогенез рака мочевого пузыря человека и ответы на лечение 5,6. Было разработано несколько доклинических моделей, включая 2D-модели in vitro (клеточные линии или условно перепрограммированные клетки), 3D-модели in vitro (органоиды, 3D-печать) и модели in vivo (ксенотрансплантат, канцероген-индуцированные, генно-инженерные модели и ксенотрансплантат, полученные от пациента)2,6. Генетически модифицированные мышиные модели (GEMM) полезны для многих применений в биологии рака мочевого пузыря, включая анализ фенотипов опухолей, механистические исследования генов-кандидатов и / или сигнальных путей и доклиническую оценку терапевтических ответов 6,7. GEMM могут использовать сайт-специфические рекомбиназы (Cre-loxP) для контроля генетических делеций в одном или нескольких генах-супрессорах опухолей. Процесс генерации желаемых GEMM с множественными делециями генов является трудоемким, трудоемким и дорогостоящим5. Общей целью этого метода является разработка быстрого и эффективного метода доставки ex vivo Cre для создания моделей тройного нокаута мочевого пузыря (TKO) из нормальных уротелиальных клеток мыши, несущих тройные флоксированные аллели (Trp53, Pten и Rb1)8. Основным преимуществом метода ex vivo является быстрый рабочий процесс (1-2 недели вместо лет разведения мышей). В этой статье описывается протокол сбора нормальных уротелиальных клеток с флокированными аллелями, трансдукцией аденовируса ex vivo, органоидными культурами, а также характеристикой in vitro и in vivo у иммунокомпетентных мышей C57 BL/6J. Этот метод может быть дополнительно использован для получения клинически значимых органоидов рака мочевого пузыря у иммунокомпетентных мышей, имеющих любую комбинацию флоксированных аллелей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры для животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Комплексном онкологическом центре Розуэлл-Парка, Буффало, штат Нью-Йорк (1395M, 180501 и 180502).
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните шаги 1–3 в тот же день.
1. Рассечение мочевого пузыря мыши
- Подготовка к рассечению
- Приготовьте все стерильные инструменты, включая ножницы, щипцы, стерильные DPBS в 35-миллиметровой посуде для культивирования, 70% этанол, стерильную марлю и чистые бумажные полотенца. Очистите все поверхности области рассечения. Генерируйте самцов тройных мышей Trp53f/f: Ptenf/f: Rb1f/f (4 мыши, 10 недель), как описано ранее в лаборатории доктора Гудрича 8.
- Эвтаназия и разрез
- Усыпляют мышей путем удушьяCO2 , используя скорость потока 2,0 л / мин, с последующим вывихом шейки матки. Очистите область рассечения 70% этанолом и накройте чистым бумажным полотенцем.
- Поместите мышь на марлю в область рассечения. Распылите 70% этанола на брюшную полость мыши и используйте стерильные ножницы для рассечения, чтобы сделать нижний средний разрез брюшной полости, обнажающий мочевой пузырь.
- Рассечение мочевого пузыря
- Используйте щипцы, чтобы схватить мочевой пузырь и осторожно подтянуть вверх, чтобы были выявлены двусторонние мочеточниковые соединения. Используйте ножницы для удаления глазного дна мочевого пузыря после пограничной линии между двумя отверстиями мочеточника.
- Переведите мочевой пузырь в стерильную посуду с 2 мл DPBS. Удалить жировую и соединительную ткань и поместить мочевой пузырь в новую посуду со стерильными 2 мл DPBS. В это время выньте аденовирус из хранилища -80 °C и держите его на льду.
2. Диссоциация уротелиальных клеток
- Подготовка к диссоциации клеток
- Подготовьте все стерильные инструменты, включая щипцы, хирургические скальпели (лезвие размером 10 с ручкой), стерильные DPBS в 35-миллиметровых чашках для культивирования, полную культуральную среду без FBS, очищенную от древесного угля, определяемую как CCM(-), смесь коллагеназы / гиалуронидазы, рекомбинантный фермент для заменителя трипсина, 10% очищенный от древесного угля FBS в DPBS с 10 мкм свежего Y-27632, стерильный клеточный сетчатый фильтр 100 мкм и центрифужную трубку объемом 15 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Полная культуральная среда (CCM) содержит среду роста эпителиальных клеток молочной железы, дополненную предоставленными факторами роста и 5% FBS, очищенным от древесного угля, 1% заменителем L-глутамина, 100 мкг / мл примоцина и 10 мкМ свежего Y-27632.
- Подготовьте все стерильные инструменты, включая щипцы, хирургические скальпели (лезвие размером 10 с ручкой), стерильные DPBS в 35-миллиметровых чашках для культивирования, полную культуральную среду без FBS, очищенную от древесного угля, определяемую как CCM(-), смесь коллагеназы / гиалуронидазы, рекомбинантный фермент для заменителя трипсина, 10% очищенный от древесного угля FBS в DPBS с 10 мкм свежего Y-27632, стерильный клеточный сетчатый фильтр 100 мкм и центрифужную трубку объемом 15 мл.
- Измельчение и переваривание мочевого пузыря
- Переложите и снова промыть мочевой пузырь 2 мл стерильного DPBS в 35-миллиметровой посуде в шкафу для биобезопасности.
- Соберите ткани мочевого пузыря от четырех мышей в чашку с 1 мл CCM (-) и измельчите каждый мочевой пузырь на четыре равные части с помощью хирургического лезвия. Используйте щипцы, чтобы развернуть мочевой пузырь, чтобы обнажить поверхность уротелия для среды.
- Переместите кусочки мочевого пузыря и среду в центрифужную трубку объемом 15 мл. Вымойте посуду 2 мл CCM(-) 2x и соберите ее в центрифужную трубку общим объемом 5 мл.
- Добавьте смесь коллагеназы/гиалуронидазы до конечной концентрации 300 Ед/мл коллагеназы и 100 Ед/мл гиалуронидазы и поместите трубку горизонтально в орбитальный инкубирующий шейкер 37 °C в течение 30 мин при 200 об/мин.
- После переваривания тканей добавьте в пробирку равный объем (5 мл) 10% FBS, очищенной от древесного угля в DPBS, и центрифугируйте пробирку при 200 х г в течение 5 мин.
- Удалите и выбросьте супернатант. Добавьте 2 мл заменителя трипсина в ячейку гранулы и хорошо перемешайте. Поместите трубку в клеточный инкубатор при 37 °C и 5% CO2 в течение 4 мин.
- После инкубации пипетка вверх и вниз 10x со стандартным наконечником P1000. Добавьте 5 мл 10% FBS, очищенного от древесного угля, в DPBS.
- Процедите диссоциированные клетки через 100 мкм стерильного клеточного ситечка. Соберите клеточную суспензию и центрифугу по 200 х г в течение 5 мин.
- Подсчет и повторное использование ячеек
- Удалите и выбросьте супернатант. Повторно суспендировать клеточную гранулу 1 мл СКК.
- Подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра и только пластины 0,5 х 106 клеток в лунку из 24-луночной пластины с 0,5 мл свежего СКК. В это время вынимают матричные экстракты клеток саркомы мыши Энгельбрета-Холма-Роя (см. Таблицу материалов) из хранения -20 °C и оттаивают на льду. Предварительно нагрейте 6-луночную пластину в клеточном инкубаторе с температурой 37 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Остальные клетки могут быть центрифугированы и заморожены в виде клеточных гранул для контроля невирусной трансдукции.
3. Аденовирусная трансдукция и гальванические органоиды
ВНИМАНИЕ: Пожалуйста, будьте осторожны при обработке аденовируса. Лабораторный персонал должен соблюдать практику биобезопасности уровня 2 и дезинфицировать аденовирус 10% отбеливателем.
- Добавьте 2 мкл аденовируса (Ad5CMVCre; 1 x 107 PFU/μL) в 24-луночную пластину. Хорошо перемешать с диссоциированными уротелиальными клетками.
- Для повышения эффективности трансдукции выполняют спинокуляцию путем центрифугирования 24-луночной пластины при 300 х г в течение 30 мин при комнатной температуре. Поместите 24-луночную пластину в клеточный инкубатор при 37 °C и 5% CO2 в течение 1 ч.
- Перенесите ячейки и среду из скважины в трубку 15 мл и центрифугу при 200 х г в течение 5 мин. Удалите и выбросьте супернатант, добавьте 50 мкл CCM и хорошо перемешайте с клетками внизу.
- Добавьте 140 мкл экстракта матрицы и аккуратно перемешайте, чтобы избежать пузырьков воздуха. Быстро добавьте раствор в предварительно нагретую 6-луночную пластину со скоростью 50 мкл/купол, чтобы создать купола для органоидов.
- Аккуратно переложите пластину в инкубатор с температурой 37 °C с 5% CO2 и дайте куполам затвердеть в течение 5 минут. Переверните 6-луночную пластину вверх дном и продолжайте затвердевание в течение дополнительных 25 минут.
- После инкубации добавьте 2,5 мл CCM в каждую лунку и поместите пластину в инкубатор для органоидной культуры.
4. Культивирование и пассаж органоидов
- Меняйте среду каждые 3-4 дня. Выполняйте культивирование органоидов, пассирование и замораживание, как сообщалось в Lee et al.9. Выполняют встраивание органоидов с помощью геля для обработки образцов, как описано в Fujii et al.10.
- Удалите среду и добавьте 1 мл диспазы в каждую лунку. Аккуратно разбейте купол и хорошо перемешайте с наконечником пипетки P1000.
- Поместите пластину в инкубатор с температурой 37 °C с 5% CO2 в течение 30 мин. Затем соберите все клетки в центрифужную трубку объемом 15 мл и промыть скважину 4 мл 10% FBS, очищенного от древесного угля, в DPBS. Если органоидные клетки выглядят как большие кластеры, выполните шаг 2.2.6. и этап 2.2.7. чтобы получить диссоциированные клетки.
- Центрифугируйте трубку при 200 х г в течение 5 мин. Удалите супернатант и промыть клетки 1 мл СКК.
- Повторно суспендируйте клетки в 70% матричном экстракте и выполните шаги 3.4.-3.6. для культивирования. Альтернативно, криоконсервировать клетки путем повторного использования в 90% FBS, очищенном от древесного угля, и 10% DMSO, дополненном 10 мкМ свежего Y-27632.
5. Имплантация органоидных клеток в подкожную мышь C57BL/6J
- Подготовка к имплантации
- Приготовьте 25 г 1,5 в иглах, шприц 1 мл, диспазу 1 мг/мл, экстракт матрицы, 10% FBS, очищенный от древесного угля, в DPBS с 10 мкМ свежего Y-27632 и 15 мл центрифужной трубки.
- Коллекция органоидных клеток
- После достижения стабильной культуры в течение не менее 5 проходов, соберите расширенные органоидные клетки для инъекции in vivo . Выполните шаги 4.2.-4.4. и повторное суспендирование клеток в 1 мл СКК.
- Подсчет клеток и подкожные инъекции
- Подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра. После центрифугирования при 200 х г в течение 5 мин повторно суспендируют 2 х 106 клеток в 100 мкл 50% матричного экстракта в DPBS. Поместите суспензию на лед и отнесите ее в кабинет биобезопасности в процедурном кабинете для животных.
- Обезболить двух самцов мышей C57BL/6J (10 недель) 4% изофлурана и 1 л/мин O2 течь в течение примерно 4 мин в камере. После того, как мыши потеряли свой правый рефлекс и их дыхание стало глубже и медленнее, переведите мышей в недыхающую цепь с 2% изофлурана и потоком 1 л / мин O2 . Нанесите ветеринарную мазь для защиты глаз животных от травматического повреждения.
- Побрейте одну область вокруг места инъекции на правом фланге мыши и используйте 70% этанола для очищения, а затем используйте иглу 25 г для непосредственного введения 100-мкл клеточной суспензии в правый бок под анестезией.
- После инъекции снимите ингаляционную анестезию и поместите мышей в клетку под тепловую лампу до полного восстановления и мобилизации. Верните мышей для размещения и контролируйте образование опухоли.
6. Сбор опухолей и размножение in vivo
- Следуйте подготовительному этапу 2.1.1. Усыпляйте мышей асфиксиейCO2 с использованием скорости потока 2,0 л / мин с последующим вывихом шейки матки после образования опухоли диаметром ~ 2,0 см (почти 2-3 недели). Переместите мышей в чистую область рассечения, распылите 70% этанола на область опухоли флакона мыши и используйте стерильные ножницы для рассечения и щипцы, чтобы сделать разрез для отделения опухоли.
- Вымойте опухоль в 60-миллиметровой посуде с 5 мл DPBS и используйте ножницы для удаления соединительной ткани. Вырежьте один кусочек свежей опухоли и утопите его 4% параформальдегидом в DPBS на 48 ч и отправьте на встраивание парафина и секционирование для гистологического анализа.
- Обработайте другую половину свежей опухоли для диссоциации клеток. Вкратце измельчите свежую опухоль на 1 мм3 кусочка для диссоциации в 60-миллиметровой посуде с 5 мл CCM(-). Затем, выполнив шаги 2.2.4.-2.2.8., вводите диссоциированные клетки новым мышам C57BL/6J для прохождения in vivo после шага 5.3. или хранить в качестве органоидной культуры in vitro после этапов 3.4.-3.6., или заморозить непосредственно в жидком азоте с использованием 90% очищенного древесного угля FBS и 10% DMSO с 10 мкМ свежего Y-27632.
- При необходимости восстановите замороженные клетки, быстро разморозив их на водяной бане с температурой 37 °C и промыв с помощью CCM(-). После этого повторно суспендируют их в 100 мкл 50% матричного экстракта в DPBS для прямой инъекции мышам для образования опухоли in vivo . Используйте не менее 2 х 106 размороженных клеток для одной инъекции in vivo .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рабочий процесс опосредованных аденовирусом кре делеций генов в уротелиальных клетках мышей показан на рисунке 1А. Сопроводительное видео демонстрирует, как уротелиальные клетки диссоциируются с глазным дном мочевого пузыря и как тройные флоксированные клетки трансдуцируются ex vivo с Ad5CMVCre. Рисунок 1А показал, что минимальные подслизистое вещество и мышечные клетки были разъединены после переваривания ферментов. Чтобы подтвердить эффективность доставки аденовируса-Cre, диссоциированные уротелиальные клетки у трехслоксированных мышей с мембранно-таргетным tdTomato/мембранно-локализованным улучшенным зеленым флуоресцентным белком (мТ/мГ) трансдуцировали аденовирусом Cre. Зеленый флуоресцентный белок (GFP) был обнаружен почти в 100% клеток, что указывает на высокую эффективность трансдукции аденовируса (рисунок 1B).
Стабильные органоиды TKO были установлены в соответствии со стандартными органоидными протоколами (in vitro с более чем 5 проходами; Рисунок 2А). H&E и иммунофлуоресценция (IF) органоидных срезов in vitro (рисунок 2A) продемонстрировали морфологию высокодифференцированной уротелиальной карциномы с положительной экспрессией маркеров уротелиальной линии CK5 и p6311. ПЦР-анализ выявил рекомбинированные аллели в органоидах TKO, тогда как некомбинированные флокированные аллели были обнаружены только в уротелиальных клетках, не обработанных аденовирусом (рисунок 2B). В общей сложности 2 х 106 первичных органоидов ex vivo были введены в C57BL / 6J для первоначального образования подкожной (SQ) опухоли через 8 недель. Затем опухоль SQ (проход 1) собирали и проходили у мышей. В целом, 2-3 недели были необходимы для формирования опухоли SQ размером 2 см (проходы 2-5) (рисунок 2C). Иммуногистохимия (IHC) ксенотрансплантата TKO in vivo показала положительную экспрессию CK7 (пятнистый), CK5 и p63 и отрицательную экспрессию CK8 и Uroplakin 3 (рисунок 2D). Чтобы обнаружить контаминацию клеток мезенхимы, опухоли TKO окрашивали на виментин. Пятно H &E показало опухоль слева и капсулу справа, разграниченную желтой линией. Положительный виментин был обнаружен только в опухолевой капсуле или строме (рисунок 2Е).
Рисунок 1: Аденовирус-cre опосредованные делеции генов в уротелиальных клетках мыши с участками loxP . (A) Рабочий процесс генерации органоидов TKO с помощью аденовируса ex vivo Ad5CMVCre. Кратковременное 30-минутное переваривание фермента было достаточным для диссоциации уротелиальных клеток от нижележащей подслизистой и мышечной проприи. Диссоциированные уротелиальные клетки трансдуцировали Ad5CMVCre для органоидов TKO и впоследствии вводили мышам C57BL/6J. (B) Тройные флокированные уротелиальные клетки с mT/mG (конститутивная трансгенная экспрессия красного флуоресцентного белка, который превращается в зеленый флуоресцентный белок после рекомбинации Cre) трансдуцировали Ad5CMVCre. Почти 100% клеток были положительными на GFP, что указывает на высокоэффективную трансдукцию и рекомбинацию Cre. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Характеристика органоидов TKO через ex vivo аденовирус-Cre рекомбиназу. (A) Диссоциированные Trp53f/f: Ptenf/f: Rb1f/f уротелиальные клетки трансдуцировали аденовирусом (Ad5CMVCre) для генерации органоидов TKO (яркое поле). Органоиды TKO были встроены в гель для обработки образцов и окрашены для H & E и иммунофлуоресценции. (B) Геномную ДНК экстрагировали из тройных уротелиальных клеток (полоса 2) и органоидов TKO (полоса 4) и амплировали с помощью ПЦР для обнаружения флокированных аллелей или рекомбинированных аллелей Cre Trp53, Rb1 и Pten. Полосы ПЦР окрашивали бромидом этидия. Полоса 1 и полоса 3 были отрицательными и положительными рекомбинированными элементами управления. (C) Грубая опухоль TKO SQ (проход 4) была показана на 17-й день после инъекции SQ. (D) Участки опухолевой ткани из ксенотрансплантатов TKO SQ были окрашены H&E, IF (CK5, CK8) или IHC (CK7, p63, Upk3). Сокращения: CK5 = Цитокератин 5; CK20 = Цитокератин 20; CK8 = Цитокератин 8; CK7 = цитокератин 7; Upk3 = Уроплакин III. (E) Участки опухолевой ткани из ксенотрансплантатов TKO SQ были окрашены H&E и IF (виментином). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
GEMM были золотыми стандартами для моделирования рака, инициированного из нормальных клеток, что позволяет тщательно тестировать последствия потенциальных онкогенных возмущений (активация онкогенов и / или потеря супрессоров опухоли). Здесь предоставляется быстрый и эффективный протокол для генерации органоидов рака мочевого пузыря посредством редактирования генов ex vivo нормальных уротелиальных клеток мыши, несущих флоксированные аллели в генах, представляющих интерес. Окрашивание H&E и IHC демонстрирует, что органоиды TKO демонстрируют гистологию, соответствующую высокосортному уротелиальному уротелию, с плоской дифференцировкой и базально-подобным подтипом как в качестве органоидов in vitro , так и в качестве ксенотрансплантатов in vivo . Органоиды TKO могут быть использованы in vitro для изучения эффектов потери Trp53, Rb1 и Pten , скрининга лекарств и молекулярной оценки сигнальных путей. Быстрое образование опухоли у мышей C57BL/6J позволит проводить исследования in vivo , предназначенные для оценки ответов на лечение системной терапией, такой как химиотерапия или иммунотерапия.
Уротелий состоит из слоя базальных клеток (положительных для CK5 и p63), 1-2 слоев промежуточных клеток (Uroplakins и p63 положительных) и зонтичных клеток (Uroplakins, CK8 и CK20 positive)6. Критическим этапом метода является ограниченное время (30 мин) диссоциации тканей вместо длительного (4 часа) переваривания фермента, что позволяет минимально загрязнять неуротелиальные клетки подслизистой оболочки (рисунок 1А). Более длительное время диссоциации может увеличить процент стромальных клеток, таких как эндотелиальные клетки и клетки фибробластов. Стадия трансдукции аденовируса ex vivo очень эффективна. После трансдукции Cre ex vivo аденовируса GFP визуализировали почти в 100% уротелиальных клеток с репортерными аллелями mT/mG (рисунок 1B).
Существуют ограничения для метода ex vivo. Во-первых, диссоциированные клетки не отбираются предварительно перед трансдукцией аденовируса. Например, клетки не дифференцируются для уротелиальных клеток против неуротелиальных клеток или просветных клеток против базальных клеток. Сортировка клеток с помощью EpCAM и/или CD49f может быть использована для сортировки чистых эпителиальных клеток и/или стволовых клеток перед трансдукцией ex vivo 12,13. Во-вторых, аденовирус, стимулирующий экспрессию Cre с промотором ЦМВ, используемым в этом протоколе, нацелен на широкий спектр типов клеток после диссоциации тканей (уротелиальный против неуротелиальных, базальных и просветных клеток). Это неспецифическое нацеливание может привести к смещению отбора, вызывающему чрезмерный рост клеток с наибольшим онкогенным потенциалом. Векторы аденовируса, специфичные для типа клеток, использовались местно как при раке легких, так и при раке мочевого пузыря GEMM 14,15,16,17. Будущие исследования с использованием ex vivo клеточного тип-специфического аденовируса (аденовирус с промотором CK8 или промотором CK5) могут решить вопросы о происхождении клеток происхождения о том, являются ли органоиды TKO производными из базальных или просветных клеток18. CK20 или Upk2 промотор-специфический аденовирус (недоступен для наших знаний) также может быть разработан для трансдукции зонтичных клеток в уротелии. Тем не менее, необходимы будущие исследования для изучения эффективности и специфичности этих промотор-специфических аденовирусов для инфекции мочевого пузыря ex vivo. Может наблюдаться расхождение в эффективности аденовируса-Cre между трансдукцией in vivo и ex vivo из-за среды хозяина18. В-третьих, метод ex vivo ограничен отсутствием опухолевой среды, что может повлиять на опухолевый генез in vivo и гистоморфологию. Несмотря на эти ограничения, основным преимуществом метода ex vivo является быстрый рабочий процесс (1-2 недели вместо лет разведения мышей). Второе преимущество подхода ex vivo заключается в том, что аденовирус-Cre (Ad5CMVCre) коммерчески доступен, прост и почти на 100% эффективен для вирусной трансдукции и рекомбинации Cre (рисунок 1B).. Напротив, альтернативные методы ex vivo, использующие редактирование CRISPR или лентивирусную трансдукцию, требуют дальнейшего выбора клонов из-за менее эффективного геномного редактирования 5,13,19,20.
Таким образом, описанный аденовирусный подход ex vivo удобен, быстр и эффективен в создании моделей рака мочевого пузыря, использующих любую комбинацию генов, представляющих интерес (флоксированные аллели), связанных с раком мочевого пузыря человека. Эти модели могут быть объединены с клеточным тип-специфическим аденовирусом и сортировкой клеток для устранения влияния клетки происхождения на фенотип рака мочевого пузыря и для оценки ответов на лечение иммунотерапией в условиях определенных генетических мутаций.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта исследовательская работа была частично поддержана грантами NIH, K08CA252161 (Q.L.), R01CA234162 и R01 CA207757 (D.W.G.), P30CA016056 (NCI Cancer Center Core Support Grant), Roswell Park Alliance Foundation и Friends of Urology Foundation. Благодарим Марису Бласк и Милу Пахомову за корректуру рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 μm sterile cell strainer | Corning | 431752 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 25G 1.5 inches needle | EXELINT International | 26406 | |
| Adenovirus (Ad5CMVCre High Titer, 1E11 pfu/ml) | UI Viral Vector Core | VVC-U of Iowa-5-HT | |
| C57 BL/6J | Jackson Lab | 000664 | |
| Charcoal-stripped FBS | Gibco | A3382101 | |
| Collagenase/hyaluronidase | Stemcell Technologies | 07912 | |
| Dispase | Stemcell Technologies | 07913 | |
| DPBS, 1x | Corning | 21-031-CV | |
| L-glutamine substitute (GlutaMAX) | Gibco | 35-050-061 | |
| Mammary Epithelial Cell Growth medium | Lonza | CC-3150 | |
| Matrix extracts from Engelbreth–Holm–Swarm mouse sarcomas (Matrigel) | Corning | CB-40234 | |
| Monoclonal mouse anti-CK20 | DAKO | M7019 | IF 1:100 |
| Monoclonal mouse anti-CK7 | Santa Cruz Biotechnology | SC-23876 | IHC 1:50 |
| Monoclonal mouse anti-p63 | Abcam | ab735 | IHC 1:100, IF 1:50 |
| Monoclonal mouse anti-Upk3 | Fitzgerald | 10R-U103A | IHC 1:50 |
| Monoclonal mouse anti-Vimentin | Santa Cruz Biotechnology | SC-6260 | IF 1:100 |
| Monoclonal rat anti-CK8 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-I-s | IF 1:100 |
| HERAcell vios 160i CO2 incubator | Thermo Fisher | 51033557 | |
| Polyclonal chicken anti-CK5 | Biolegend | 905901 | IF 1:500 |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| Recombinant enzyme of trypsin substitute (TrypLE Express Enzyme) | Thermo Fisher | 12605036 | |
| Signature benchtop shaking incubator Model 1575 | VWR | 35962-091 | |
| Specimen Processing Gel (HistoGel) | Thermo Fisher | HG-4000-012 | |
| Surgical blade size 10 | Integra Miltex | 4-110 | |
| Sorvall Legend RT | Thermo Fisher | 75004377 | |
| Sorvall T1 centrifuge | Thermo Fisher | 75002383 | |
| Y-27632 | Selleckchem | S1049 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A.
- Zhu, S., et al. Preclinical models for bladder cancer research. Hematology/Oncology Clinics of North America. 35 (3), 613-632 (2021).
- DeGraff, D. J., et al. Current preclinical models for the advancement of translational bladder cancer research. Molecular Cancer Therapeutics. 12 (2), 121-130 (2013).
- Andreev-Drakhlin, A. Y., et al. The evolving treatment landscape of advanced urothelial carcinoma. Current Opinion in Oncology. 33 (3), 221-230 (2021).
- Mullenders, J., et al. Mouse and human urothelial cancer organoids: A tool for bladder cancer research. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4567-4574 (2019).
- Kobayashi, T., Owczarek, T. B., McKiernan, J. M., Abate-Shen, C. Modelling bladder cancer in mice: opportunities and challenges. Nature Reviews. Cancer. 15 (1), 42-54 (2015).
- Kersten, K., de Visser, K. E., van Miltenburg, M. H., Jonkers, J. Genetically engineered mouse models in oncology research and cancer medicine. EMBO Molecular Medicine. 9 (2), 137-153 (2017).
- Ku, S. Y., et al. Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance. Science. 355 (6320), 78-83 (2017).
- Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
- Fujii, E., et al. A simple method for histopathological evaluation of organoids. Journal of Toxicologic Pathology. 31 (1), 81-85 (2018).
- Georgas, K. M., et al. An illustrated anatomical ontology of the developing mouse lower urogenital tract. Development. 142 (10), 1893-1908 (2015).
- Santos, C. P., et al. Urothelial organoids originating from Cd49f(high) mouse stem cells display Notch-dependent differentiation capacity. Nature Communication. 10 (1), 4407 (2019).
- Wang, L., et al. A genetically defined disease model reveals that urothelial cells can initiate divergent bladder cancer phenotypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 563-572 (2020).
- Yang, D., et al. Intertumoral heterogeneity in SCLC is influenced by the cell type of origin. Cancer Discovery. 8 (10), 1316-1331 (2018).
- Sutherland, K. D., et al. Cell of origin of small cell lung cancer: inactivation of Trp53 and Rb1 in distinct cell types of adult mouse lung. Cancer Cell. 19 (6), 754-764 (2011).
- Bottger, F., et al. Tumor heterogeneity underlies differential cisplatin sensitivity in mouse models of small-cell lung cancer. Cell Reports. 27 (11), 3345-3358 (2019).
- Puzio-Kuter, A. M., et al. Inactivation of p53 and Pten promotes invasive bladder cancer. Genes & Development. 23 (6), 675-680 (2009).
- Park, S., et al. Novel mouse models of bladder cancer identify a prognostic signature associated with risk of disease progression. Cancer Research. 81 (20), 5161-5175 (2021).
- Hawley, S. P., Wills, M. K., Jones, N. Adenovirus-mediated genetic removal of signaling molecules in cultured primary mouse embryonic fibroblasts. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (43), e2160 (2010).
- Feng, W., et al. Rapid interrogation of cancer cell of origin through CRISPR editing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (32), 2110344118 (2021).
