Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Ex Vivo Organoïde model van Adenovirus-Cre gemedieerde gendeleties in muizen urotheelcellen

Published: May 5, 2022 doi: 10.3791/63855
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 2, 1,2
1Department of Urology, Roswell Park Comprehensive Cancer Center, 2Department of Pharmacology and Therapeutics, Roswell Park Comprehensive Cancer Center

Summary

Dit protocol beschrijft het proces van het genereren en karakteriseren van muis urotheliale organoïden die deleties in genen van belang herbergen. De methoden omvatten het oogsten van muizenurotheelcellen, ex vivo transductie met adenovirus dat Cre-expressie drijft met een CMV-promotor, en zowel in vitro als in vivo karakterisering.

Abstract

Blaaskanker is een onderbelicht gebied, met name in genetisch gemanipuleerde muismodellen (GEMM's). Inteelt GEMM's met weefselspecifieke Cre- en loxP-sites zijn de gouden standaard voor voorwaardelijke of induceerbare gentargeting. Om snellere en efficiëntere experimentele modellen te bieden, wordt een ex vivo organoïde kweeksysteem ontwikkeld met behulp van adenovirus Cre en normale urotheelcellen die meerdere loxP-allelen van de tumoronderdrukkers Trp53, Pten en Rb1 dragen. Normale urotheelcellen zijn enzymatisch gescheiden van vier blazen van triple floxed muizen (Trp53f/f: Ptenf/f: Rb1f/f). De urotheelcellen worden ex vivo getransduceerd met adenovirus-Cre aangedreven door een CMV promotor (Ad5CMVCre). De getransduceerde blaasorganoïden worden gekweekt, vermeerderd en gekarakteriseerd in vitro en in vivo. PCR wordt gebruikt om gendeleties in Trp53, Pten en Rb1 te bevestigen. Immunofluorescentie (IF) kleuring van organoïden toont positieve expressie van urotheliale afstamming markers (CK5 en p63). De organoïden worden subcutaan geïnjecteerd in gastheermuizen voor tumorexpansie en seriële passages. De immunohistochemie (IHC) van xenografts vertoont positieve expressie van CK7, CK5 en p63 en negatieve expressie van CK8 en Uroplakine 3. Samenvattend is adenovirus-gemedieerde gendeletie uit muizenurotheelcellen die zijn gemanipuleerd met loxP-sites een efficiënte methode om snel het tumorigene potentieel van gedefinieerde genetische veranderingen te testen.

Introduction

Blaaskanker is de vierde meest voorkomende kanker bij mannen en treft jaarlijks meer dan 80.000 mensen in de Verenigde Staten1. Platina-gebaseerde chemotherapie is al meer dan drie decennia de standaardzorg voor patiënten met gevorderde blaaskanker. Het landschap van de behandeling van blaaskanker is revolutionair veranderd door de recente goedkeuring door de Food and Drug Administration (FDA) van immunotherapie (anti-PD-1 en anti-PD-L1 immuuncheckpointremmers), erdafitinib (een fibroblastgroeifactorreceptorremmer) en enfortumab vedotin (een antilichaam-geneesmiddelconjugaat)2,3,4. Er zijn echter geen klinisch goedgekeurde biomarkers beschikbaar voor het voorspellen van de reacties op chemotherapie of immunotherapie. Er is een kritieke behoefte om informatieve preklinische modellen te genereren die het begrip van de mechanismen die de progressie van blaaskanker stimuleren kunnen verbeteren en voorspellende biomarkers voor verschillende behandelingsmodaliteiten kunnen ontwikkelen.

Een belangrijk obstakel in blaastranslationele onderzoeken is het gebrek aan preklinische modellen die de pathogenese en behandelingsresponsen van menselijke blaaskanker samenvatten 5,6. Er zijn meerdere preklinische modellen ontwikkeld, waaronder in vitro 2D-modellen (cellijnen of voorwaardelijk geherprogrammeerde cellen), in vitro 3D-modellen (organoïden, 3D-printen) en in vivo modellen (xenograft, kankerverwekkende, genetisch gemanipuleerde modellen en patiënt-afgeleide xenograft)2,6. Genetisch gemanipuleerde muismodellen (GEMM's) zijn nuttig voor vele toepassingen in de blaaskankerbiologie, waaronder analyses van tumorfenotypen, mechanistisch onderzoek van kandidaatgenen en/of signaalroutes, en de preklinische evaluatie van therapeutische responsen 6,7. GEMM's kunnen site-specifieke recombinases (Cre-loxP) gebruiken om genetische deleties in een of meer tumorsuppressorgenen te controleren. Het proces van het genereren van gewenste GEMM's met meerdere gendeleties is tijdrovend, arbeidsintensief en duur5. Het algemene doel van deze methode is het ontwikkelen van een snelle en efficiënte methode van ex vivo Cre-toediening voor het vaststellen van blaas triple knockout (TKO) modellen van normale muis urotheelcellen met triple floxed allelen (Trp53, Pten en Rb1)8. Het grote voordeel van de ex vivo methode is de snelle workflow (1-2 weken in plaats van jaren muizenfok). Dit artikel beschrijft het protocol voor het oogsten van normale urotheelcellen met gevlokte allelen, ex vivo adenovirustransductie, organoïde culturen en in vitro en in vivo karakterisering bij immunocompetente C57 BL/6J muizen. Deze methode kan verder worden gebruikt om klinisch relevante blaaskankerorganoïden te genereren in immunocompetente muizen die een combinatie van gevlokte allelen herbergen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dierprocedures werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) in het Roswell Park Comprehensive Cancer Center, Buffalo, NY (1395M, Biosafety 180501 en 180502).
OPMERKING: Voer stap 1-3 op dezelfde dag uit.

1. Dissectie van de muizenblaas

  1. Voorbereiding voor dissectie
    1. Bereid alle steriele instrumenten voor, waaronder scharen, tangen, steriele DPBS in 35 mm kweekschalen, 70% ethanol, steriel gaas en schone papieren handdoeken. Reinig alle oppervlakken van het dissectiegebied. Genereer mannelijke triple floxed muizen Trp53f/f: Ptenf/f: Rb1f/f (4 muizen, 10 weken oud), zoals eerder beschreven in dr. Goodrich's lab 8.
  2. Euthanasie en incisie
    1. Euthanaseer de muizen door CO 2-verstikking met een stroomsnelheid van 2,0 l / min, gevolgd door cervicale dislocatie. Reinig het dissectiegebied met 70% ethanol en dek af met een schone papieren handdoek.
    2. Plaats de muis op gaas in het dissectiegebied. Spuit 70% ethanol op de buik van de muis en gebruik een steriele dissectieschaar om een onderste buikincisie te maken die de blaas blootlegt.
  3. De blaas ontleden
    1. Gebruik een tang om de blaas vast te pakken en trek voorzichtig omhoog zodat bilaterale ureterovesicale juncties worden geïdentificeerd. Gebruik een schaar om de blaasfundus te verwijderen volgens de grenslijn tussen de twee urineleideropeningen.
    2. Breng de blaas over in een steriele schaal met 2 ml DPBS. Verwijder vet- en bindweefsel en doe de blaas in een nieuwe schaal met steriele 2 ml DPBS. Haal op dit moment het adenovirus uit -80 °C opslag en bewaar het op ijs.

2. Dissociatie van urotheelcellen

  1. Voorbereiding voor celdissociatie
    1. Bereid alle steriele instrumenten voor, inclusief tang, chirurgische scalpels (een mes van maat 10 met handvat), steriele DPBS in kweekschalen van 35 mm, compleet kweekmedium zonder houtskoolgestripte FBS gedefinieerd als CCM(-), collagenase/hyaluronidasemengsel, recombinant enzym voor trypsinevervanger, 10% houtskoolgestripte FBS in DPBS met 10 μM vers Y-27632, een steriele celzeef van 100 μm en een centrifugebuis van 15 ml.
      OPMERKING: Het volledige kweekmedium (CCM) bestaat uit borstepitheelcelgroeimedium aangevuld met de verstrekte groeifactoren en 5% houtskool-gestripte FBS, 1% L-glutaminevervanger, 100 μg / ml primocine en 10 μM vers Y-27632.
  2. Gehakt en vertering van de blaas
    1. Breng de blaas over en was deze opnieuw met 2 ml steriele DPBS in een schaal van 35 mm in een bioveiligheidskast.
    2. Verzamel blaasdoekjes van vier muizen in een schaal met 1 ml CCM(-) en hak elke blaas in vier gelijke stukken met een chirurgisch mes. Gebruik een tang om de blaas uit te vouwen om het urotheeloppervlak bloot te stellen aan het medium.
    3. Breng de blaasstukken en het medium over in een centrifugebuis van 15 ml. Was de schaal met 2 ml CCM(-) 2x en verzamel deze in een centrifugebuis tot een totaal volume van 5 ml.
    4. Voeg het collagenase/hyaluronidasemengsel toe tot een eindconcentratie van 300 E/ml collagenase en 100 E/ml hyaluronidase en plaats de buis horizontaal in een 37 °C orbitale broedschudder gedurende 30 minuten bij 200 tpm.
    5. Voeg na weefselvertering een gelijk volume (5 ml) van 10% houtskool-gestripte FBS in DPBS toe aan de buis en centrifugeer de buis gedurende 5 minuten bij 200 x g .
    6. Verwijder het supernatant en gooi het weg. Voeg 2 ml trypsinevervanger toe aan de celkorrel en meng goed. Plaats de buis in een celincubator bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 4 min.
    7. Pipetteer na incubatie 10x op en neer met een standaard P1000-tip. Voeg 5 ml 10% houtskoolgestripte FBS toe in DPBS.
    8. Zeef de gedisassocieerde cellen door een steriele celzeef van 100 μm. Verzamel de celsuspensie en centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 minuten.
  3. Cellen tellen en resuspending
    1. Verwijder het supernatant en gooi het weg. Resuspend de celkorrel met 1 ml CCM.
    2. Tel het aantal cellen met behulp van een hemocytometer en plaats slechts 0,5 x 106 cellen in een put van een 24-putplaat met 0,5 ml verse CCM. Haal op dit moment de matrixextracten van Engelbreth-Holm-Swarm muizensarcoomcellen (zie Tabel met materialen) uit -20 °C opslag en ontdooi op ijs. Verwarm een 6-well plaat voor in een celincubator van 37 °C.
      OPMERKING: De resterende cellen kunnen worden gecentrifugeerd en ingevroren als celpellets voor niet-virustransductiecontrole.

3. Adenovirale transductie en plating organoïden

LET OP: Wees voorzichtig bij het verwerken van adenovirus. Laboratoriumpersoneel moet bioveiligheidsniveau 2-praktijken volgen en adenovirus desinfecteren met 10% bleekmiddel.

  1. Voeg 2 μL adenovirus (Ad5CMVCre; 1 x 107 PFU/μL) toe aan de 24-well plaat. Meng goed met de gedisassocieerde urotheelcellen.
  2. Om de transductie-efficiëntie te verbeteren, voert u spinoculatie uit door de 24-wells plaat gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur op 300 x g te centrifugeren. Plaats de 24-well plaat in een celincubator bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 1 uur.
  3. Breng cellen en medium uit de put over in een buis van 15 ml en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 200 x g . Verwijder en gooi het supernatant weg, voeg 50 μL CCM toe en meng goed met de cellen aan de onderkant.
  4. Voeg 140 μL matrixextract toe en meng voorzichtig goed om luchtbellen te voorkomen. Voeg de oplossing snel toe aan de voorverwarmde 6-putplaat bij 50 μL/koepel om koepels voor organoïden te creëren.
  5. Breng de plaat voorzichtig over in een incubator van 37 °C met 5% CO2 en laat de koepels gedurende 5 minuten stollen. Draai de 6-putplaat ondersteboven en ga nog eens 25 minuten door met stollen.
  6. Voeg na incubatie 2,5 ml CCM toe aan elke put en plaats de plaat in een incubator voor organoïdekweek.

4. Organoïde kweken en passeren

  1. Vervang het medium elke 3-4 dagen. Voer organoïde kweken, passeren en bevriezen uit zoals gerapporteerd in Lee et al.9. Voer inbedding van organoïden uit met behulp van monsterverwerkingsgel zoals beschreven in Fujii et al.10.
  2. Verwijder het medium en voeg 1 ml dispase toe aan elke put. Breek de koepel voorzichtig en meng goed met een P1000 pipetpunt.
  3. Plaats de plaat gedurende 30 minuten in een incubator van 37 °C met 5% CO2 . Verzamel vervolgens alle cellen in een centrifugebuis van 15 ml en was de put met 4 ml 10% houtskool-gestripte FBS in DPBS. Als de organoïde cellen als grote clusters worden weergegeven, voert u stap 2.2.6 uit. en stap 2.2.7. om gedisassocieerde cellen te krijgen.
  4. Centrifugeer de buis gedurende 5 minuten bij 200 x g . Verwijder het supernatant en was de cellen met 1 ml CCM.
  5. Resuspend de cellen in 70% matrixextract en volg stap 3.4.-3.6. om te kweken. Als alternatief kunt u de cellen cryopreserveren door resuspendatie in 90% houtskool-gestripte FBS en 10% DMSO aangevuld met 10 μM verse Y-27632.

5. Organoïde cellen implantatie in C57BL / 6J muis subcutaan

  1. Voorbereiding voor implantatie
    1. Bereid 25G 1.5 in naalden, een spuit van 1 ml, 1 mg /ml dispase, matrixextract, 10% houtskool-gestripte FBS in DPBS met 10 μM verse Y-27632 en een centrifugebuis van 15 ml.
  2. Verzameling organoïde cellen
    1. Na het bereiken van een stabiele cultuur gedurende ten minste 5 passages, verzamelt u de geëxpandeerde organoïde cellen voor in vivo injectie. Volg stappen 4.2.-4.4. en resuspend cellen in 1 ml CCM.
  3. Cellen tellen en subcutane injectie
    1. Tel het aantal cellen met behulp van een hemocytometer. Na centrifugeren bij 200 x g gedurende 5 minuten, resuspend 2 x 106 cellen in 100 μL 50% matrixextract in DPBS. Plaats de suspensie op ijs en neem deze mee in een bioveiligheidskast in een dierenverplegingsruimte.
    2. Anesthetiseer twee mannelijke C57BL/6J muizen (10 weken oud) met 4% isofluraan en 1 L/min O2 flow gedurende ongeveer 4 min in een kamer. Zodra de muizen hun rechtzettingsreflex hebben verloren en hun ademhalingspatroon dieper en langzamer is geworden, brengen de muizen over naar een niet-rebreathing circuit met 2% isofluraan en 1 L / min O2-stroom . Breng dierenartszalf aan om de ogen van de dieren te beschermen tegen traumatisch letsel.
    3. Scheer een gebied rond de injectieplaats op de rechterflank van de muis en gebruik 70% ethanol om te reinigen, en gebruik vervolgens een naald van 25 G om de 100 μL celsuspensie onder anesthesie rechtstreeks in de rechterflank te injecteren.
    4. Verwijder na injectie de inhalatie-anesthesie en plaats de muizen in een kooi onder een warmtelamp totdat ze volledig zijn hersteld en gemobiliseerd. Breng de muizen terug voor huisvesting en controleer de tumorvorming.

6. Tumorverzameling en in vivo voortplanting

  1. Volg de voorbereiding Stap 2.1.1. Euthanasie muizen door CO 2-verstikking met behulp van een stroomsnelheid van 2,0 l / min gevolgd door cervicale dislocatie nadat een tumor met een diameter van ~ 2,0 cm (bijna 2-3 weken) is gevormd. Breng de muizen over naar een schoon dissectiegebied, spuit 70% ethanol op het tumorgebied van de muisflank en gebruik steriele dissectieschaar en tang om een incisie te maken om de tumor te scheiden.
  2. Was de tumor in een schaal van 60 mm met 5 ml DPBS en gebruik een schaar om het bindweefsel te verwijderen. Snijd een stuk van de verse tumor en zink het met 4% paraformaldehyde in DPBS gedurende 48 uur en stuur voor paraffine-inbedding en sectie voor histologische analyse.
  3. Verwerk de andere helft van de verse tumor voor celdisassociatie. Hak de verse tumor kort in 1 mm3 stukjes voor dissociatie in een schaal van 60 mm met 5 ml CCM(-). Injecteer vervolgens, na het volgen van stap 2.2.4.-2.2.8., de gedisassocieerde cellen in nieuwe C57BL/6J-muizen voor in vivo passaging na stap 5.3. of bewaren als in vitro organoïde cultuur volgens stappen 3.4.-3.6., of direct invriezen in vloeibare stikstof met behulp van 90% houtskool-gestripte FBS en 10% DMSO met 10 μM vers Y-27632.
  4. Herstel indien nodig de bevroren cellen door ze snel te ontdooien in een waterbad van 37 °C en te wassen met CCM(-). Resuspend ze hierna in 100 μL 50% matrixextract in DPBS voor directe injectie in muizen voor in vivo tumorvorming. Gebruik ten minste 2 x 106 ontdooide cellen voor één in vivo injectie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De workflow van adenovirus-Cre gemedieerde gendeleties in muizenurotheelcellen is weergegeven in figuur 1A. De bijbehorende video laat zien hoe de urotheelcellen worden losgekoppeld van de fundus van de blaas en hoe de triple floxed cellen ex vivo worden getransduceerd met Ad5CMVCre. Figuur 1A toonde aan dat minimale submucosa en spiercellen werden gedisassocieerd na enzymvertering. Om de efficiëntie van adenovirus-Cre-toediening te bevestigen, werden gedisassocieerde urotheelcellen van triple floxed muizen met membraangerichte tdTomato / membraangelokaliseerd verbeterd groen fluorescerend eiwit (mT / mG) getransduceerd met adenovirus Cre. Groen fluorescerend eiwit (GFP) werd gedetecteerd in bijna 100% van de cellen, wat wijst op een hoge efficiëntie van adenovirustransductie (figuur 1B).

De stabiele TKO-organoïden werden vastgesteld volgens standaard organoïdeprotocollen (in vitro met meer dan 5 passages; Figuur 2A). H&E en immunofluorescentie (IF) van in vitro organoïde secties (figuur 2A) toonden een morfologie van hooggradig urotheliaal carcinoom met positieve expressie van urotheliale afstammingsmarkers CK5 en p6311. PCR-analyse onthulde gerecombineerde allelen in de TKO-organoïden, terwijl niet-gerecombineerde floxed allelen alleen werden gedetecteerd in urotheelcellen onbehandeld met adenovirus (figuur 2B). Een totaal van 2 x 106 primaire ex vivo organoïden werden geïnjecteerd in C57BL/6J voor initiële subcutane (SQ) tumorvorming in 8 weken. Vervolgens werd SQ-tumor (passage 1) verzameld en gepasseerd bij muizen. Over het algemeen waren 2-3 weken nodig om een 2 cm SQ-tumor te vormen (passages 2-5) (figuur 2C). De immunohistochemie (IHC) van TKO in vivo xenograft vertoonde positieve expressie van CK7 (fragmentarisch), CK5 en p63 en negatieve expressie van CK8 en Uroplakine 3 (figuur 2D). Om besmetting van mesenchymcellen te detecteren, werden de TKO-tumoren gekleurd voor vimentine. H&E-vlek toonde de tumor aan de linkerkant en de capsule aan de rechterkant afgebakend door de gele lijn. Positieve vimentine werd alleen gedetecteerd in het tumorkapsel of stroma (figuur 2E).

Figure 1
Figuur 1: Adenovirus-Cre gemedieerde gendeleties in muizenurotheelcellen met loxP-plaatsen . (A) De workflow van TKO organoïde generatie via ex vivo adenovirus Ad5CMVCre. Een korte enzymvertering van 30 minuten was voldoende om urotheelcellen los te koppelen van de onderliggende submucosa en muscularis propria. De gedisassocieerde urotheelcellen werden getransduceerd met Ad5CMVCre voor TKO-organoïden en vervolgens geïnjecteerd in C57BL/6J-muizen. (B) Triple floxed urotheelcellen met mT/mG (constitutieve transgenexpressie van rood fluorescerend eiwit dat na Cre-recombinatie wordt omgezet in groen fluorescerend eiwit) werden getransduceerd met Ad5CMVCre. Bijna 100% van de cellen was GFP-positief, wat wijst op zeer efficiënte transductie en Cre-recombinatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Karakterisering van TKO-organoïden via ex vivo adenovirus-Cre-recombinase. (A) De gedisassocieerde Trp53f/f: Ptenf/f: Rb1f/f urotheelcellen werden getransduceerd met adenovirus (Ad5CMVCre) om TKO-organoïden (helder veld) te genereren. De TKO-organoïden werden ingebed met monsterverwerkingsgel en gekleurd voor H & E en immunofluorescentie. (B) Genomisch DNA werd geëxtraheerd uit triple floxed urotheelcellen (lane 2) en TKO organoïden (lane 4) en versterkt door PCR om floxed allelen of Cre gerecombineerde allelen van de Trp53, Rb1 en Pten te detecteren. PCR-banden werden gekleurd met ethidiumbromide. Rijstrook 1 en rijstrook 3 waren negatieve en positieve recombineerde controles. (C) Een grove TKO SQ-tumor (passage 4) werd getoond op dag 17 na SQ-injectie. (D) Tumorweefselsecties van de TKO SQ xenografts werden gekleurd met H & E, IF (CK5, CK8) of IHC (CK7, p63, Upk3). Afkortingen: CK5 = Cytokeratin 5; CK20 = Cytokeratine 20; CK8 = Cytokeratine 8; CK7 = Cytokeratine 7; Upk3 = Uroplakine III. (E) Tumorweefselsecties van de TKO SQ xenografts werden gekleurd met H & E en IF (vimentine). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

GEMM's zijn de gouden standaard voor kankermodellering geïnitieerd vanuit normale cellen, waardoor de gevolgen van potentiële oncogene verstoringen (oncogenactivering en / of verlies van tumoronderdrukkers) rigoureus kunnen worden getest. Hier wordt een snel en efficiënt protocol aangeboden om blaaskankerorganoïden te genereren via ex vivo genbewerking van normale muis-urotheelcellen die gevlokte allelen dragen in genen van belang. H&E- en IHC-kleuring tonen aan dat TKO-organoïden histologie vertonen die consistent is met hoogwaardig urotheel urotheel, met plaveiseldifferentiatie en een basaalachtig subtype, zowel als in vitro organoïden als als in vivo xenografts. De TKO-organoïden kunnen in vitro worden gebruikt voor het bestuderen van de effecten van Trp53-, Rb1 - en Pten-verlies , geneesmiddelenscreening en de moleculaire beoordeling van signaalroutes. Snelle tumorvorming in C57BL/6J-muizen zal in vivo studies mogelijk maken die zijn ontworpen om behandelingsreacties op systemische therapieën zoals chemotherapie of immunotherapie te evalueren.

Het urotheel bestaat uit een laag basale cellen (positief voor CK5 en p63), 1-2 lagen tussenliggende cellen (Uroplakinen en p63 positief) en paraplucellen (Uroplakinen, CK8 en CK20 positief)6. Een cruciale stap in de methode is de beperkte tijd (30 min) van weefseldisassociatie in plaats van een langdurige (4 uur) enzymvertering, die minimale besmetting van niet-urotheliale submucosacellen mogelijk maakt (figuur 1A). Een langere disassociatietijd kan het percentage stromale cellen verhogen, zoals endotheelcellen en fibroblastcellen. De ex vivo transductiestap van adenovirus is zeer effectief. Na ex vivo adenovirus Cre transductie werd GFP gevisualiseerd in bijna 100% van de urotheelcellen met mT/mG reporter allelen (figuur 1B).

Er zijn beperkingen aan de ex vivo methode. Ten eerste worden de gedisassocieerde cellen niet vooraf geselecteerd vóór adenovirustransductie. Cellen zijn bijvoorbeeld niet gedifferentieerd voor urotheelcellen versus niet-urotheelcellen, of luminale cellen versus basale cellen. Celsortering met EpCAM en/of CD49f kan worden gebruikt om zuivere epitheelcellen en/of stamcellen te sorteren vóór ex vivo transductie12,13. Ten tweede richt het adenovirus dat Cre-expressie met CMV-promotor aandrijft dat in dit protocol wordt gebruikt, zich op een breed scala aan celtypen na weefseldisassociatie (urotheliale versus niet-urotheliale, basale versus luminale cellen). Deze niet-specifieke targeting kan leiden tot een selectiebias die overgroei van cellen met het meest oncogene potentieel veroorzaakt. Celtypespecifieke adenovirusvectoren zijn topisch gebruikt bij zowel longkanker als blaaskanker GEMMs 14,15,16,17. Toekomstige studies met ex vivo celtypespecifiek adenovirus (adenovirus met een CK8-promotor of een CK5-promotor) kunnen betrekking hebben op vragen over de vraag of de TKO-organoïden zijn afgeleid van basale of luminale cellen18. CK20 of Upk2 promotor-specifiek adenovirus (niet beschikbaar voor onze kennis) kan ook worden ontworpen om paraplucellen in het urotheel te transduceren. Toekomstige studies zijn echter nodig om de efficiëntie en specificiteit van deze promotorspecifieke adenovirussen voor ex vivo blaasontsteking te onderzoeken. Er kan een discrepantie zijn in adenovirus-Cre-efficiëntie tussen in vivo en ex vivo transductie als gevolg van de gastheeromgeving18. Ten derde wordt de ex vivo methode beperkt door het ontbreken van tumoromgeving, wat van invloed kan zijn op de in vivo tumorigenese en histomorfologie. Ondanks deze beperkingen is een groot voordeel van de ex vivo methode de snelle workflow (1-2 weken in plaats van jaren muizenfok). Het tweede voordeel van de ex vivo benadering is dat adenovirus-Cre (Ad5CMVCre) commercieel verkrijgbaar, eenvoudig en bijna 100% efficiënt is voor virale transductie en Cre-recombinatie (figuur 1B). Alternatieve ex vivo-methoden met CRISPR-bewerking of lentivirale transductie vereisen daarentegen verdere kloonselectie vanwege minder efficiënte genomische bewerking 5,13,19,20.

Samenvattend is de beschreven ex vivo adenovirusbenadering handig, snel en efficiënt bij het genereren van blaaskankermodellen met behulp van elke combinatie van interessante genen (gevlokte allelen) gerelateerd aan menselijke blaaskanker. Deze modellen kunnen worden gecombineerd met celtypespecifiek adenovirus en celsortering om de impact van de cel van oorsprong op het fenotype van blaaskanker aan te pakken en om behandelingsresponsen op immunotherapieën te evalueren in een setting van gedefinieerde genetische mutaties.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit onderzoekswerk werd gedeeltelijk ondersteund door NIH Grants, K08CA252161 (Q.L.), R01CA234162 en R01 CA207757 (D.W.G.), P30CA016056 (NCI Cancer Center Core Support Grant), de Roswell Park Alliance Foundation en de Friends of Urology Foundation. Wij danken Marisa Blask en Mila Pakhomova voor het proeflezen van het manuscript.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 μm sterile cell strainer Corning 431752
1 mL syringe BD 309659
25G 1.5 inches needle EXELINT International 26406
Adenovirus (Ad5CMVCre High Titer, 1E11 pfu/ml) UI Viral Vector Core VVC-U of Iowa-5-HT
C57 BL/6J Jackson Lab 000664
Charcoal-stripped FBS Gibco A3382101
Collagenase/hyaluronidase Stemcell Technologies 07912
Dispase Stemcell Technologies 07913
DPBS, 1x Corning 21-031-CV
L-glutamine substitute (GlutaMAX) Gibco 35-050-061
Mammary Epithelial Cell Growth medium Lonza CC-3150
Matrix extracts from Engelbreth–Holm–Swarm mouse sarcomas (Matrigel) Corning CB-40234
Monoclonal mouse anti-CK20 DAKO M7019 IF 1:100
Monoclonal mouse anti-CK7 Santa Cruz Biotechnology SC-23876 IHC 1:50
Monoclonal mouse anti-p63 Abcam ab735 IHC 1:100, IF 1:50
Monoclonal mouse anti-Upk3 Fitzgerald 10R-U103A IHC 1:50
Monoclonal mouse anti-Vimentin Santa Cruz Biotechnology SC-6260 IF 1:100
Monoclonal rat anti-CK8 Developmental Studies Hybridoma Bank TROMA-I-s IF 1:100
HERAcell vios 160i CO2 incubator Thermo Fisher 51033557
Polyclonal chicken anti-CK5 Biolegend 905901 IF 1:500
Primocin InvivoGen ant-pm-1
Recombinant enzyme of trypsin substitute (TrypLE Express Enzyme) Thermo Fisher 12605036
Signature benchtop shaking incubator Model 1575 VWR 35962-091
Specimen Processing Gel (HistoGel) Thermo Fisher HG-4000-012
Surgical blade size 10 Integra Miltex 4-110
Sorvall Legend RT Thermo Fisher 75004377
Sorvall T1 centrifuge Thermo Fisher 75002383
Y-27632 Selleckchem S1049

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. Cancer statistics, 2021. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (1), 7-33 (2021).
  2. Zhu, S., et al. Preclinical models for bladder cancer research. Hematology/Oncology Clinics of North America. 35 (3), 613-632 (2021).
  3. DeGraff, D. J., et al. Current preclinical models for the advancement of translational bladder cancer research. Molecular Cancer Therapeutics. 12 (2), 121-130 (2013).
  4. Andreev-Drakhlin, A. Y., et al. The evolving treatment landscape of advanced urothelial carcinoma. Current Opinion in Oncology. 33 (3), 221-230 (2021).
  5. Mullenders, J., et al. Mouse and human urothelial cancer organoids: A tool for bladder cancer research. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4567-4574 (2019).
  6. Kobayashi, T., Owczarek, T. B., McKiernan, J. M., Abate-Shen, C. Modelling bladder cancer in mice: opportunities and challenges. Nature Reviews. Cancer. 15 (1), 42-54 (2015).
  7. Kersten, K., de Visser, K. E., van Miltenburg, M. H., Jonkers, J. Genetically engineered mouse models in oncology research and cancer medicine. EMBO Molecular Medicine. 9 (2), 137-153 (2017).
  8. Ku, S. Y., et al. Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance. Science. 355 (6320), 78-83 (2017).
  9. Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
  10. Fujii, E., et al. A simple method for histopathological evaluation of organoids. Journal of Toxicologic Pathology. 31 (1), 81-85 (2018).
  11. Georgas, K. M., et al. An illustrated anatomical ontology of the developing mouse lower urogenital tract. Development. 142 (10), 1893-1908 (2015).
  12. Santos, C. P., et al. Urothelial organoids originating from Cd49f(high) mouse stem cells display Notch-dependent differentiation capacity. Nature Communication. 10 (1), 4407 (2019).
  13. Wang, L., et al. A genetically defined disease model reveals that urothelial cells can initiate divergent bladder cancer phenotypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 563-572 (2020).
  14. Yang, D., et al. Intertumoral heterogeneity in SCLC is influenced by the cell type of origin. Cancer Discovery. 8 (10), 1316-1331 (2018).
  15. Sutherland, K. D., et al. Cell of origin of small cell lung cancer: inactivation of Trp53 and Rb1 in distinct cell types of adult mouse lung. Cancer Cell. 19 (6), 754-764 (2011).
  16. Bottger, F., et al. Tumor heterogeneity underlies differential cisplatin sensitivity in mouse models of small-cell lung cancer. Cell Reports. 27 (11), 3345-3358 (2019).
  17. Puzio-Kuter, A. M., et al. Inactivation of p53 and Pten promotes invasive bladder cancer. Genes & Development. 23 (6), 675-680 (2009).
  18. Park, S., et al. Novel mouse models of bladder cancer identify a prognostic signature associated with risk of disease progression. Cancer Research. 81 (20), 5161-5175 (2021).
  19. Hawley, S. P., Wills, M. K., Jones, N. Adenovirus-mediated genetic removal of signaling molecules in cultured primary mouse embryonic fibroblasts. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (43), e2160 (2010).
  20. Feng, W., et al. Rapid interrogation of cancer cell of origin through CRISPR editing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (32), 2110344118 (2021).

Tags

Kankeronderzoek Nummer 183
<em>Ex Vivo</em> Organoïde model van Adenovirus-Cre gemedieerde gendeleties in muizen urotheelcellen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xu, D., Wang, L., Wieczorek, K.,… More

Xu, D., Wang, L., Wieczorek, K., Wang, Y., Zhang, X., Goodrich, D. W., Li, Q. Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells. J. Vis. Exp. (183), e63855, doi:10.3791/63855 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter