Summary
يصف البروتوكول الحالي تحريض التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي في نموذج فأر باستخدام بروتين سكري قليل التغصن المايلين ومراقبة عملية المرض باستخدام نظام تسجيل سريري. يتم تحليل الأعراض التجريبية المرتبطة بالتهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي باستخدام تحليل التصوير المقطعي المحوسب الدقيق لعظم الفخذ واختبار المجال المفتوح لتقييم عملية المرض بشكل شامل.
Abstract
التصلب المتعدد (MS) هو مرض مناعي ذاتي نموذجي يصيب الجهاز العصبي المركزي (CNS) ويتميز بالتسلل الالتهابي وإزالة الميالين وتلف المحور العصبي. في الوقت الحالي، لا توجد تدابير لعلاج مرض التصلب العصبي المتعدد تماما، ولكن تتوفر علاجات متعددة معدلة للمرض (DMT) للسيطرة على تطور المرض والتخفيف من حدته. هناك أوجه تشابه كبيرة بين السمات المرضية للجهاز العصبي المركزي لمرضى التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي (EAE) ومرضى التصلب العصبي المتعدد. تم استخدام EAE على نطاق واسع كنموذج تمثيلي لتحديد فعالية أدوية التصلب المتعدد واستكشاف تطوير علاجات جديدة لمرض التصلب العصبي المتعدد. الحث النشط ل EAE في الفئران له تأثير مستقر وقابل للتكرار وهو مناسب بشكل خاص لدراسة آثار الأدوية أو الجينات على التهاب الأعصاب المناعي الذاتي. تتم مشاركة طريقة تحصين الفئران C57BL / 6J ببروتين سكري قليل التغصن المايلين (MOG35-55) والتقييم اليومي لأعراض المرض باستخدام نظام التسجيل السريري بشكل أساسي. نظرا للمسببات المعقدة لمرض التصلب العصبي المتعدد مع المظاهر السريرية المتنوعة ، فإن نظام التسجيل السريري الحالي لا يمكن أن يفي بتقييم علاج المرض. لتجنب أوجه القصور في تدخل واحد ، يتم إنشاء مؤشرات جديدة لتقييم EAE بناء على المظاهر السريرية للمزاج الشبيه بالقلق وهشاشة العظام لدى مرضى التصلب العصبي المتعدد لتوفير تقييم أكثر شمولا لعلاج مرض التصلب العصبي المتعدد.
Introduction
أمراض المناعة الذاتية هي مجموعة من الاضطرابات التي تسببها الاستجابة المناعية للجهاز المناعي لمستضدات خاصة به مما يؤدي إلى تلف الأنسجة أو اختلال وظيفي1. التصلب المتعدد (MS) هو مرض مناعي ذاتي مزمن من اعتلال الأعصاب في الجهاز العصبي المركزي (CNS) ، ويتميز بالتسلل الالتهابي ، وإزالة الميالين ، والتنكس العصبيالمحوري 2,3. في الوقت الحاضر، أثر مرض التصلب العصبي المتعدد على ما يصل إلى 2.5 مليون شخص في جميع أنحاء العالم، معظمهم من الشباب ومتوسطي العمر الذين تتراوح أعمارهم بين 20 و 40 عاما، والذين غالبا ما يكونون العمود الفقري لأسرهم ومجتمعهم. وقد تسبب هذا في تأثير كبير وضرر للأسر والمجتمع 2,4.
مرض التصلب العصبي المتعدد هو مرض متعدد العوامل مع مظاهر سريرية متنوعة ومعقدة. بالإضافة إلى الاضطرابات العصبية الكلاسيكية التي تتميز بالتسلل الالتهابي وإزالة الميالين ، غالبا ما يظهر مرض التصلب العصبي المتعدد ضعف البصر وخلل الحركة في الأطراف والاضطرابات المعرفية والعاطفية5،6،7. إذا لم يحصل مرضى التصلب العصبي المتعدد على العلاج المناسب والصحيح ، فسيعيش نصفهم على كراسي متحركة بعد 20 عاما ، وسيعاني نصفهم تقريبا من أعراض الاكتئاب والقلق ، مما يؤدي إلى مستويات أعلى بكثير من التفكير في الانتحار من عامة السكان 8,9.
على الرغم من فترة البحث الطويلة ، لا تزال مسببات مرض التصلب العصبي المتعدد بعيدة المنال ، ولم يتم بعد توضيح التسبب في مرض التصلب العصبي المتعدد. سمحت النماذج الحيوانية لمرض التصلب العصبي المتعدد بالعمل كأدوات اختبار لاستكشاف تطور المرض والأساليب العلاجية الجديدة ، على الرغم من الاختلافات الكبيرة بين القوارض وأجهزة المناعة البشرية ، مع مشاركة بعض المبادئ الأساسية في نفس الوقت. يعد التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي (EAE) حاليا النموذج الحيواني المثالي لدراسة مرض التصلب العصبي المتعدد ، والذي يستخدم مناعة المستضد الذاتي من بروتينات المايلين للحث على المناعة الذاتية لمكونات الجهاز العصبي المركزي في الفئران الحساسة ، مع إضافة مساعد فرويند الكامل (CFA) وسم السعال الديكي (PTX) لتعزيز الاستجابة المناعية الخلطية. اعتمادا على الخلفية الجينية والمستضدات المناعية ، يتم الحصول على عمليات مرضية مختلفة ، بما في ذلك الحادة أو الانتكاسية أو المزمنة ، لتقليد الأشكال السريرية المختلفة لمرض التصلب العصبي المتعدد10،11،12. تأتي المستمنات ذات الصلة المستخدمة بشكل شائع في بناء نماذج EAE من بروتينات الجهاز العصبي المركزي الذاتية ، مثل بروتين المايلين الأساسي (MBP) أو بروتين البروتين البروتيني (PLP) أو البروتين السكري قليل التغصن المياليني (MOG). تطور فئران SJL / L المحصنة ضد MBP أو PLP مسارا للانتكاس والتحويل ، ويؤدي MOG إلى تحفيز EAE التدريجي المزمن في C57BL / 6 الفئران11،12،13.
الغرض الرئيسي من العلاج المعدل للمرض (DMT) هو تقليل أعراض المرض وتحسين الوظيفة6. يتم استخدام العديد من الأدوية سريريا للتخفيف من مرض التصلب العصبي المتعدد ، ولكن لم يتم استخدام أي دواء حتى الآن لعلاجه تماما ، مما يكشف عن ضرورة العلاج التآزري. تعد الفئران C57BL / 6 حاليا الأكثر استخداما لبناء الفئران المعدلة وراثيا ، وفي هذا العمل ، تم استخدام نموذج EAE الناجم عن MOG35-55 في الفئران C57BL / 6J بمقياس من 5 نقاط لمراقبة تطور المرض. تعاني نماذج EAE أيضا من حالات مزاجية تشبه القلق وفقدان العظام ، والآفات المزيلة للميالين المعروفة على نطاق واسع. هنا ، يتم أيضا وصف طريقة تقييم أعراض EAE من وجهات نظر متعددة باستخدام اختبار المجال المفتوح وتحليل التصوير المقطعي المحوسب الدقيق (Micro-CT).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وافقت لجنة رعاية الحيوان بجامعة تونغجي على العمل الحالي ، وتم اتباع جميع إرشادات رعاية الحيوان. تم استخدام ذكور أو إناث الفئران C57BL / 6J بين 8-12 أسبوعا من العمر للتجارب. تم التأكد من أن العمر والجنس متماثلان في المجموعات التجريبية. خلاف ذلك ، تأثرت القابلية للمرض. تم إيواء الفئران في بيئة محددة خالية من مسببات الأمراض مع تناوب دورات الضوء والظلام لمدة 12 ساعة في ظل ظروف ثابتة (درجة حرارة الغرفة 23 ± 1 درجة مئوية ، الرطوبة 50٪ ± 10٪) ، مع حرية الوصول إلى طعام وماء الفئران.
1. إعداد مستحلب MOG35-55
- أضف المتفطرة السلية المجففة بالتجميد المعطلة بالحرارة (MTB ، H37Ra) لإكمال مساعد فرويند (يحتوي نفسه على 1 مجم / مل من MTB المعطل بالحرارة ، H37Ra) ، مما يؤدي إلى تركيز MTB النهائي بمقدار 5 مجم / مل (انظر جدول المواد).
ملاحظة: يجب إكمال العملية بأكملها في خزانة السلامة الأحيائية ؛ لا تفتح الهواء الذي ينفخ. - قم بإذابة الببتيد MOG35-55 المجفف بالتجميد (انظر جدول المواد) بمحلول ملحي معقم مبرد مسبقا بالفوسفات (PBS) (بدون أيونات الكالسيوم والمغنيسيوم ، درجة الحموضة 7.4) لتحضير محلول المستضد بتركيز 2 مجم / مل.
- خذ أنبوب طرد مركزي دقيق نظيف سعة 2 مل وأضف كرة فولاذية معقمة مقاس 5 مم (انظر جدول المواد) إلى كل أنبوب.
- أضف 500 ميكرولتر من مساعد فرويند الكامل الذي يحتوي على 5 مجم / مل من MTB و 500 ميكرولتر من محلول مستضد MOG35-55 إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق أعلاه الذي يحتوي على كرة فولاذية واحدة.
- تذبذب الأنبوب أعلاه على TissueLyser (انظر جدول المواد) لمدة 10 دقائق ، تبرد على الثلج لمدة 10 دقائق ، وكرر أربع مرات لخلطه جيدا وأخيرا تشكيل محلول لزج أبيض.
ملاحظة: الاستحلاب الجيد هو خطوة أساسية في تحضير مستحلب MOG35-55 ، لذلك يلزم الخلط الشامل. تم ضبط TissueLyser على سرعة 28 هرتز.
2. إعداد سم السعال الديكي (PTX)
- قم بإعداد PTX مع ddH2O بتركيز 100 ميكروغرام / مل وتخزينه في 4 درجات مئوية.
- قم بتخفيف محلول مخزون PTX 50 مرة باستخدام 1x PBS المعقم (بدون أيونات الكالسيوم والمغنيسيوم ، درجة الحموضة 7.4) لعمل محلول 200 نانوغرام / 100 ميكرولتر للاستخدام.
3. إنشاء نموذج حيواني EAE
- قم ببناء نموذج EAE باستخدام الفئران C57BL / 6J البالغة من العمر 8-12 أسبوعا. تأكد من تأقلم الفئران بشكل كاف مع بيئة التغذية قبل التحصين.
- قم بالطرد المركزي لمستحلب MOG35-55 المحضر (الخطوة 1) عند 4 درجات مئوية لمدة 2-3 ثوان عن طريق الضغط على زر النبض الخاص بالجهاز (انظر جدول المواد) لترسيب جميع المستحلبات في قاع الأنبوب.
ملاحظة: يمكن تخزين مستحلب MOG35-55 عند - 20 درجة مئوية لعدة أيام. لتجنب فشل الدواء ، يوصى باستخدامه في أسرع وقت ممكن. - قم بتوصيل إبرة 22 جم ببرميل حقنة سعة 1 مل ، واستنشاق مستحلب MOG 35-55 ، ونقل مستحلب MOG35-55 إلى برميل حقنة جديد سعة 1 مل. قم بتأمين الاتصال بين برميل حقنة سعة 1 مل وإبرة 26 جم مع فيلم مانع للتسرب (انظر جدول المواد).
ملاحظة: تجنب فقاعات الهواء عند تحميل مستحلب MOG35-55 في براميل حقنة سعة 1 مل. - امسح وتطهير موقع الحقن بنسبة 70٪ إيثانول.
- حقن مستحلب MOG35-55 تحت الجلد على كل جانب من العمود الفقري الظهري للفئران ، 100 ميكرولتر على كل جانب. مراقبة التكوين التلقائي للكتل منتفخة تحت جلد ظهر الفئران بعد اكتمال عملية الحقن.
ملاحظة: تأكد من أن المجربين ذوي الخبرة يقومون بعملية التحصين وأن الحقن يتم بلطف وببطء لتقليل الضغط على الفئران. - حقن الفئران المذكورة أعلاه داخل الصفاق مع 100 ميكرولتر من PTX (الخطوة 2).
ملاحظة: يوم التحصين هو اليوم 0. تأكد أيضا من إمكانية تحديد الفئران بدقة للتقييم اليومي اللاحق ، مثل استخدام علامة ملونة على ذيل الفئران. - حقن نفس الجرعة من PTX في اليوم 2 بعد التحصين.
- تحضير مجموعة من الفئران غير المحصنة كفئران من النوع البري (WT).
4. المراقبة السريرية للفئران
- سجل وزن جسم الفئران EAE و WT يوميا.
ملاحظة: ترتبط شدة EAE بشكل إيجابي بفقدان وزن الفئران ، لذا فإن وزن الجسم هو أيضا مؤشر مراقبة مهم جدا. - مراقبة حالة الفئران من 0-21 يوما بعد التحصين باستخدام نظام التسجيل 0-5 المدرج في الجدول 1.
ملاحظة: يتم احتساب الأعراض بينهما على أنها زائد أو ناقص 0.5 نقطة.
5. اختبار المجال المفتوح
ملاحظة: التجارب المختارة لهذه الخطوة هي فئران EAE في فترات البداية المبكرة والذروة والمغفرة. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام الفئران WT كعنصر تحكم. تجدر الإشارة إلى أنه تم اختبار جميع الفئران للسلوك الشبيه بالقلق قبل النمذجة لاستبعاد الفئران التي تعاني من اضطرابات القلق لنمذجة EAE. بالإضافة إلى ذلك ، تم استبعاد الفئران EAE في فترات الذروة ومغفرة مع العجز الحركي الكامل من الاختبار.
- قم بإعداد غرفة تفاعل المجال المفتوح 40 × 40 × 40 سم3 ونظام تحليل فيديو نشاط الحركة (المجال المفتوح) (انظر جدول المواد).
ملاحظة: يتم تثبيت الكاميرا في وضع يغطي الصندوق بالكامل ، وتكون غرفة التفاعل مضاءة بالتساوي ، ويجب أن تكون غرفة الاختبار منطقة هادئة. - ضع فئران الاختبار في غرفة الاختبار للتعود 1 ساعة قبل بدء التجربة.
- رش المنطقة بأكملها بنسبة 70٪ من الإيثانول وامسحها بمنشفة ورقية نظيفة للتأكد من نظافة غرفة التفاعل قبل بدء الاختبار.
- قم بإزالة كل فأر على حدة من قفصه وضعه في نفس الزاوية من الساحة قبل البدء في الاستكشاف.
ملاحظة: ينقسم الجزء السفلي من الصندوق إلى 16 شبكة ، منها منطقة الشبكات الأربعة الوسطى هي المنطقة المركزية والمنطقة المحيطة بها هي المنطقة الطرفية. - انقر فوق الزر Start Capture في شريط القائمة بنظام تحليل الفيديو ، وسجل الوقت ، وابدأ التصوير.
- حافظ على الهدوء في غرفة الاختبار.
- دع الماوس يتحرك بحرية لمدة 5 دقائق أثناء عملية التسجيل.
- أوقف نظام الاستحواذ واحفظ الفيديو.
- أخرج الماوس من الساحة ، وأعده إلى القفص ، وانتقل إلى الماوس التالي.
ملاحظة: نظف منطقة الاختبار بنسبة 70٪ من الإيثانول بين الأشواط لإزالة الروائح والمواد الأخرى. - تحليل النتائج باستخدام نظام تحليل الفيديو.
6. تحليل النمط الظاهري للعظام
- القتل الرحيم للفئران EAE و WT عن طريق خلع عنق الرحم في اليوم 21.
ملاحظة: يجب أن يكون الأفراد الذين يقومون بعمليات خلع عنق الرحم مدربين تدريبا جيدا لتقليل الألم الذي يتحملونه أثناء موت الحيوان. - اجعل الماوس مسطحا في صينية تشريح وقم بإصلاح الأطراف.
- امسك جلد الطرف الخلفي للفأر بالملقط وافتح جلد الفأر والأنسجة العضلية بالمقص.
- افصل عظم الفخذ عن عظم الساق والورك بعناية بالمقص.
- قم بإزالة العضلات الملتصقة بعظم الفخذ بالمقص وضع عظم الفخذ في 70٪ إيثانول في درجة حرارة الغرفة.
- امسح عظم الفخذ البعيد باستخدام نظام التصوير المقطعي المحوسب الدقيق (انظر جدول المواد) بحجم فوكسل متناحي الخواص يبلغ 10 ميكرومتر ، مع ذروة جهد أنبوب الأشعة السينية 70 كيلو فولت وشدة الأشعة السينية 0.114 مللي أمبير.
ملاحظة: يسمح مرشح 3D Gaussian بتقليل التشويش لصور عتبة 2D. - تحليل 100 شريحة تم مسحها ضوئيا من عمود الفخذ الأوسط لقياس معلمات عظم الفخذ ، بما في ذلك حجم العظام وحجم الأنسجة وكثافة المعادن في العظام والفصل التربيقي والرقم التربيقي وكثافة التوصيل التربيقي وسمك التربيق والقشرة.
ملاحظة: بدءا من الطرف القريب من صفيحة نمو عظم الفخذ البعيد في الفئران ، تم العثور على أقسام خالية تماما من هياكل غطاء المشاش واستمرت في تمديد 100 شريحة نحو عظم الفخذ القريب ، والتي تم تحديدها يدويا في عدة فوكسل بعيدا عن السطح القشري الداخلي لتحديد الترابيق المشاش. - إنشاء إعادة البناء 3D عن طريق تكديس صور عتبة 2D من المناطق الكنتورية في نظام micro-CT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بعد تحصين الفئران ، يتم تسجيل وزن جسم الفئران يوميا ، ويتم تقييم أعراضها السريرية وفقا للبروتوكول الموضح أعلاه (الخطوة 4). في الفئران C57BL / 6J المحصنة بببتيد MOG ، لأن موقع الآفة يقتصر بشكل أساسي على الحبل الشوكي ، ينتشر التسبب في فئران EAE من نهاية الذيل إلى الرأس. في بداية المرض ، تظهر فئران EAE ضعفا وتدليا في الذيل ، يليه ضعف في الأطراف الخلفية ، وحركة غير منسقة ، وشلل. مع تفاقم المرض ، يتطور تدريجيا إلى ضعف الأطراف الأمامية ، والشلل ، وفي الحالات الشديدة ، يسبب صعوبة في تحريك الفئران وحتى بالقرب من الموت. كما هو موضح في الشكل 1A ، يصور مخطط حالة الفئران بدرجات مختلفة من أمراض EAE صورة مثالية لمجموعة من الفئران تتغير من أعراض EAE عديمة الأعراض إلى أعراض EAE عالية الدرجات (الدرجة 4). كما ذكر سابقا أن وزن جسم فئران EAE مرتبط بالأعراض السريرية. بالمقارنة مع الفئران WT ، قد يبدأ فقدان الوزن في فئران EAE في الأيام القليلة الأولى بعد التحصين ، في حين أن الأعراض السريرية لفئران EAE تبدأ عادة في اليوم 6-9 بعد التحصين وستصل إلى ذروتها في اليوم 14-16. بعد ذلك ، تتعافى أعراض فئران EAE جزئيا بشكل عام ، وفي الوقت نفسه ، سيتم تخفيف فقدان وزن الفئران (الشكل 1B ، C). وبالتالي ، عادة ما يتم تقسيم مسار بداية EAE إلى فترات مبكرة ، وذروة ، ومغفرة ، والتنبؤ بهذه النقاط الزمنية مهم في تقييم معلمات النتائج. بشكل عام ، لتحليل إنتاج الخلايا المناعية والسيتوكينات في موقع آفات EAE ، يمكن عزل الخلايا المناعية في الدماغ والحبل الشوكي لفئران EAE في ذروة المرض ومعالجتها بشكل أكبر ، والتي يمكن تحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي14,15. أنسجة الحبل الشوكي في بداية الذروة هي أيضا الأنسب لإعداد تلطيخ الهيماتوكسيلين ويوزين (H&E) وتلطيخ Luxol الأزرق السريع لمزيد من التحقيق في تسلل الخلايا الالتهابية وإزالة الميالين من الحبل الشوكي14,16. لمراقبة التغيرات في الجهاز المناعي في أوقات بداية مختلفة من EAE ، الطحال والغدد الليمفاوية في بداية مبكرة هي أيضا خيارات أساسية17،18. بالإضافة إلى ذلك ، تستخدم الخلايا من الطحال أو الغدد الليمفاوية لفئران EAE المحصنة ضد MOG بشكل شائع لبناء نماذج النقل ، والتي يتم نقلها إلى الفئران المتلقية بعد إعادة تحفيز MOG في المختبر للحث على التحصين السلبي لفئران EAE18.
مرض التصلب العصبي المتعدد هو آفة مزيل للميالين ناتجة عن التهاب المناعة الذاتية في الجهاز العصبي المركزي تتميز بإزالة الميالين الالتهابية وفقدان الخلايا العصبية 2,3. عادة ما يكون هذا المرض مصحوبا بأمراض نفسية مصاحبة ، مثل الاضطرابات العاطفية ، والتي يكون اضطراب القلق شائعا جدا لدى مرضى التصلب العصبي المتعدد ، حيث يعاني ما يصل إلى 30٪ من مرضى التصلب المتعدد من القلق 9,19. اضطراب القلق هو شذوذ يتميز بالتوتر العاطفي المفرط والقلق. غالبا ما يستخدم اختبار المجال المفتوح لتحليل سلوكيات القلق في القوارض20,21. بمساعدة تحليل سلوكيات الاستكشاف لفئران EAE في اختبارات المجال المفتوح خلال فترات البداية المبكرة والذروة والمغفرة ، وجد أن فئران EAE لديها أيضا سلوكيات تشبه القلق مماثلة لتلك الخاصة بمرضى التصلب العصبي المتعدد (الشكل 2 أ). في اختبار الحقل المفتوح ، تميل القوارض القلقة إلى تقليل النشاط وزيادة السلوك النمطي ، بما في ذلك تفضيل الاقتراب من الزوايا ، والتحيز نحو المجال المحيطي ، وعدم الرغبة في استكشاف المنطقة المركزية. بالمقارنة مع الفئران WT ، كان لدى فئران EAE مسافة مشي ووقت حركة أقل بكثير في جميع الفترات الثلاث للمرض ، حتى في بداية المرض المبكرة عندما لم تكن فئران EAE تعاني بعد من ضعف حركي (الشكل 2B ، C). بالإضافة إلى ذلك ، تمر فئران EAE بمسافة أقل بكثير وتبقى في المنطقة المركزية أقل من الفئران العادية ، وحتى تتحرك فقط في المنطقة الطرفية ، مما يظهر مزاجا واضحا يشبه القلق (الشكل 2D ، E). لا تزال فئران EAE تظهر مزاجا قويا يشبه القلق عندما تكون البداية خفيفة ، أي التنسيق الحركي. تشير بعض الدراسات إلى أن هذا قد يعزى إلى التهاب عصبي خفيف ، مما يؤثر بشكل أكبر على إفراز الناقل العصبي22,23. يمكن أن تساعد الاختبارات الميدانية المفتوحة التي تراقب محفزات المزاج الشبيهة بالقلق في فئران EAE الباحثين على فهم وعلاج الأمراض النفسية المصاحبة لمرض التصلب العصبي المتعدد.
مع تقدم المرض ، يظهر مرض التصلب العصبي المتعدد بشكل أساسي في النهاية على أنه خلل الحركة. وقد وجدت الدراسات أن مرضى التصلب العصبي المتعدد لديهم قابلية أعلى للإصابة بهشاشة العظام والكسور ، ويرجع ذلك أساسا إلى فقدان كتلة العظام ، وأن شدة خلل الحركة ترتبط ارتباطا وثيقا بكثافة عظام المريض24,25. يمكن ملاحظة ظاهرة مماثلة عن طريق تحليل Micro-CT بمساعدة نموذج EAE الحيواني (الشكل 3A ، H). من بيانات التحليل التربيقي لعظم الفخذ في الفئران ، خضعت فئران EAE لانخفاض كبير في كثافة المعادن في العظام (BMD) مقارنة بالفئران WT ، وهو مؤشر مهم للاستجابة لقوة العظام وأساس مهم لتشخيص هشاشة العظام (الشكل 3 ب). أظهر المزيد من التحليل أن فقدان العظام التربيقي حدث بشكل ملحوظ في فئران EAE مقارنة بفئران WT السليمة وكان مصحوبا بانخفاض في كثافة الاتصال التربيقي والأرقام التربيقية وسمك التربيق. هذه كلها خصائص انخفاض كتلة العظام ، مما يشير إلى أن EAE يسبب أيضا فقدان العظام التربيقية في عظم الفخذ للفئران (الشكل 3C-F). في الوقت نفسه ، تغير التشكل الهيكلي للترابيق العظمي ، وزاد تباعد الترابيق بشكل كبير. كلما زاد التباعد ، زادت هشاشة العظام (الشكل 3G). وهذا يتفق مع فكرة أن مرضى التصلب العصبي المتعدد عرضة لهشاشة العظام. في العظام القشرية لعظم الفخذ ، كان سمك العظم القشري في نموذج EAE أقل بكثير من سمك الفئران الطبيعية (الشكل 3I). في مرض التصلب العصبي المتعدد ، يرتبط انخفاض الحركة وزيادة ضمور العضلات ارتباطا وثيقا بهشاشة العظام والكسر وزيادة ارتشاف العظام بسبب انخفاض القوى الميكانيكية ، مما يقلل تدريجيا من سلامة العظام ، مما يزيد من خطر الإصابة بهشاشة العظام والكسر26. يمكن لتحليل Micro-CT لعظم الفخذ في فئران EAE مراقبة صحة العظام بشكل جيد ، والتدخل مفيد في السيطرة على حالة EAE.
الشكل 1: مراقبة الأعراض السريرية ل EAE. (أ) الصورة المثالية للفئران بدرجات مختلفة من علم أمراض EAE. ب: تغير الوزن في فئران WT و EAE. (ج) النتيجة السريرية في الفئران WT و EAE. يتم إعطاء البيانات كمتوسط ± SEM (n = 5) ، *** p < 0.001 مقابل الفئران WT ، اختبار ANOVA ثنائي الاتجاه. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: السلوك الشبيه بالقلق لفئران EAE في اختبار المجال المفتوح. (أ) مخططات المسار التمثيلية لاختبار المجال المفتوح. مسافة السفر (B) ، ومدة النشاط (C) ، ومسافة السفر في المركز (D) ، والوقت الذي يقضيه في المركز (E) لفئران WT وفئران EAE في فترات البداية المبكرة والذروة والمغفرة. البيانات هي متوسط ± SEM (n = 3) ، * p < 0.05 ، ** p < 0.01 ، ***p < 0.001 مقابل الفئران WT ، اختبار t للطالب. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: تحليل التصوير المقطعي المحوسب الدقيق لصحة العظام في فئران EAE. (أ) صور 3D تمثيلية للبنية التربيقية الفخذية (قضبان مقياس ، 100 ميكرومتر). تم تحديد كثافة المعادن في العظام (B) ، ونسبة حجم العظام / حجم الأنسجة (C) ، وكثافة التوصيل (D) ، والأرقام (E) ، والسمك (F) ، والفصل (G) للتربيق الفخذي عن طريق تحليل Micro-CT. (ح) صور 3D تمثيلية للعظام القشرية (قضبان مقياس ، 100 ميكرومتر). (ط) سمك القشرية التي تم الحصول عليها من بيانات التصوير المقطعي المحوسب الدقيق. البيانات هي متوسط ± SEM (n = 3) ، * p < 0.05 ، ** p < 0.01 ، ***p < 0.001 مقابل الفئران WT ، اختبار t للطالب. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
| نقاط | علامة سريرية | ||
| 0 | لا توجد علامات سريرية | ||
| 0.5 | ضعف الذيل ، سقوط الجزء الأمامي من الذيل | ||
| 1 | ذيل مشلول تماما | ||
| 2 | شلل خفيف في الأطراف الخلفية (ضعف كل من الأطراف الخلفية أو الشلل من جانب واحد ، والمشي غير المنسق ، والاستجابة للقرصة) | ||
| 3 | شلل كامل في الأطراف الخلفية ، والأطراف الخلفية تسحب وتمشي ، والأطراف الخلفية لا تستجيب للقرصة | ||
| 4 | شلل الأطراف الخلفية وضعف الأطراف الأمامية | ||
| 5 | الاقتراب من الموت أو الموت | ||
الجدول 1: نظام التسجيل السريري.
| مستضد | وتر | نوعي | تطبيق | الحد | ||
| بل.بي.بي | SJL/J34 | EAE الانتكاس والتحويل | دراسة الأحداث الخلوية والجزيئية التي ينطوي عليها الانتكاس السريري | يقتصر على استجابات محددة للخلايا التائية ؛ تعد دراسة جينات ومسارات معينة في سلالة SJL / J أمرا صعبا | ||
| إم بي بي | SJL/J35 | الشلل الانتكاسي المتبع في المتلقين الجزئي أو الكلي بعد الشفاء من الشلل الحاد | دراسة التهاب الأعصاب وتنشيط الجهاز المناعي | يقتصر على استجابات محددة للخلايا التائية ؛ تعد دراسة جينات ومسارات معينة في سلالة SJL / J أمرا صعبا | ||
| موج35-55 | C57BL / 631 | EAE التقدمية الأولية ؛ EAE التدريجي المزمن | دراسة آليات الضرر المحوري ؛ دراسة آليات المرض الجزيئي في النماذج المعدلة وراثيا والضربة القاضية | دراسات إزالة الميالين الأولية وتجديد المايلين ذات قيمة محدودة | ||
| تجانس الحبل الشوكي | بيوزي ABH36 | EAE الانتكاس والتحويل | دراسة تجديد المايلين والعلاج الوقائي العصبي لمرض التصلب العصبي المتعدد | غير تقدمي سريريا ، مع تراكم العجز العصبي بمرور الوقت ؛ يقتصر على استجابات CD4 الخاصة بالخلايا التائية | ||
| فيروس التهاب الدماغ والنخاع الفأر ثيلر | سلالات متعددة من الفئران شديدة الحساسية ، بما في ذلك SJL / J ، SWR ، PL /J 12،31 | النماذج الفيروسية لإزالة الميالين الالتهابية | دراسة إصابة المحور العصبي وإزالة الميالين الناجم عن الالتهاب | لم يتم تحديد أي عدوى فيروسية خاصة بمرض التصلب العصبي المتعدد. من الصعب تقييم تجديد الميالين ، ويحدث إزالة الميالين وتجديد المايلين في وقت واحد | ||
| كوبريزون | تستخدم على نطاق واسع في الفئران C57BL / 6 ، في حين أن السلالات الأخرى ، مثل سلالة CD1 ، أقل عرضة للتلف الناجم عن النحاسكوبريزون 37,38 | نموذج سام لإزالة الميالين وإعادة الميالين | دراسة إزالة الميالين المستقلة عن الخلايا التائية ، وخاصة تجديد المايلين وعمليات إصلاح المايلين الأساسية | يحدث تجديد المايلين التلقائي الكبير بعد توقف الإصابة السامة. إزالة الميالين خاصة بمنطقة الدماغ وغير مفيدة لدراسة إزالة الميالين في الحبل الشوكي | ||
| ليسوليسيثين | SJL / J12 ، C57BL / 639 ، إلخ. | نموذج سام لإزالة الميالين وإعادة الميالين | دراسة إزالة الميالين المستقلة عن الخلايا التائية ، وخاصة تجديد المايلين وعمليات إصلاح المايلين الأساسية | عدم وجود استجابة مناعية لوحظ أثناء مرض التصلب العصبي المتعدد | ||
| بروميد الإيثيديوم | C57BL / 640 ، إلخ. | نموذج سام لإزالة الميالين وإعادة الميالين | دراسة الآفات البؤرية المزيلة للميالين والتنبؤ بحركية إزالة الميالين وتجديد المايلين | بروميد الإيثيديوم يدمر جميع الخلايا المحتوية على النواة. ارتباط محدود مع مرض التصلب العصبي المتعدد | ||
الجدول 2: نماذج الماوس المختلفة من مرض التصلب العصبي المتعدد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
مرض التصلب العصبي المتعدد هو مرض التهابي مزيل للميالين في الجهاز العصبي المركزي وهو أحد أكثر الاضطرابات العصبية شيوعا التي تسبب إعاقة مزمنة لدى الشباب ، مما يفرض عبئا كبيرا على العائلات والمجتمع 3,4. لطالما تم تصنيف مرض التصلب العصبي المتعدد على أنه مرض مناعي ذاتي خاص بالخلايا التائية ، مما يحفز جهاز المناعة الذاتية على تآكل الجهاز العصبي المركزي ببطء ، والذي سيشمل أنظمة متعددة في جميع أنحاء الجسم27. تشمل الأعراض السريرية النموذجية ضعف البصر ، والاضطرابات الحركية ، والاضطرابات المعرفية والعاطفية ، وما إلى ذلك 6,7. مرض التصلب العصبي المتعدد هو مرض مدمر سوف يتفاقم تدريجيا إذا لم يتم علاجه بشكل صحيح ، مما يؤدي إلى العمى الشديد والشلل28. لم يتم بعد فهم التسبب في مرض التصلب العصبي المتعدد بشكل كامل ، حيث أن مظاهره السريرية وتطوره المرضي غير متجانسة ، وبالتالي فإن النماذج الحيوانية ضرورية للبحث والتطوير في علاج مرض التصلب العصبي المتعدد.
النموذج الحيواني الأكثر دراسة لمرض التصلب العصبي المتعدد هو EAE ، والذي يحتوي بشكل أساسي على طريقتين للنمذجة: التحصين النشط والتحصين السلبي29. يتم اعتماد الأول على نطاق واسع بسبب بساطته ، ونقص تشعيع الماوس ، ووقت الدورة القصير. يحفز نموذج المناعة النشطة EAE استجابات المناعة الذاتية في الجهاز العصبي المركزي عن طريق تحصين القوارض بمستضدات المايلين الذاتية أو الببتيدات اللاحقة ، والتي تظهر عادة على شكل ضعف في الذيل وشلل الأطراف13. على وجه التحديد ، يتميز نموذج EAE الناجم عن MOG 35-55 في الفئران C57BL / 6J بدورات مغفرة وانتكاس متناوبة ، مصحوبة بالتهاب الجهاز العصبي المركزي ، وإزالة الميالين ، وإصابة محورية ، مما يجعل MOG35-55 الناجم عن EAE النموذج المفضل 11,12. يمكن تحفيز EAE بشكل جيد في الفئران الحساسة عن طريق الحقن تحت الجلد من الببتيد MOG 35-55 ، مستحلب مع CFA المناعي المخصب مع MTB ، وإعطاء حقن داخل الصفاق من PTX مع حاجز الدم في الدماغ تعطيل التأثير في الأيام0-2 30. يتمثل التحدي الأكبر لنموذج EAE في انخفاض معدل الإصابة بأعراض ضعيفة ، والعديد من العوامل المؤثرة حاسمة في مسار التجربة. (1) سيؤثر عمر الفئران وبيئتها على قابلية EAE. لذلك ، يجب اختيار الفئران من نفس العمر قبل التجربة. يجب وزن الفئران وتجميعها عشوائيا قبل تخصيص القفص ، ويجب أن يظل وزن كل مجموعة قريبا. تأكد أيضا من أن الظروف البيئية بين التجارب المستقلة قابلة للمقارنة. (2) تركيز PTX: يتمثل الدور الرئيسي ل PTX في زيادة نفاذية الحاجز الدموي الدماغي ، والذي يسمح للخلايا التائية المسببة للأمراض بدخول الجهاز العصبي المركزي لإفراز السيتوكينات ذات الصلة وتعزيز الاستجابة الالتهابية ، مما يؤدي في النهاية إلى التحلل المائي لبروتينات المايلين الملفوفة في الطبقة الخارجية من المحاور العصبية. تأخر ظهور المرض في فئران EAE مع انخفاض تركيز إدارة PTX ، وستضعف شدة المرض إذا انخفض PTX بأكثر من 60٪. (3) حل مستضد MOG 35-55: لتجنب التجمد والذوبان ، يوصى بشراء مستضد MOG35-55 المجفف بالتجميد في عبوات منفصلة ، 4 مجم / أنبوب ، لتجنب التجميد والذوبان. أيضا ، يتم استخدام PTX للذوبان بدلا من الماء المعقم لأنه من الأفضل الاستحلاب باستخدام CFA باستخدام PTX. (4) يجب استحلاب مستضد MOG35-55 و CFA بشكل كاف عن طريق التذبذب لتشكيل هيكل ماء في الزيت ، ولا تنتشر قطرات المستحلب على سطح الماء لفترة طويلة ، مما يشير إلى استحلاب جيد. (5) تم استخدام الحقن من نقطتين لنمذجة EAE للماوس. يفضل أن يكون موقع الحقن فوق الخصر وتحت الرقبة ، بالقرب من العمود الفقري ، لتجنب لعق الفئران وعض الجلد ، مما يؤدي إلى انسكاب مستحلب MOG35-55.
ومع ذلك ، فإن نموذج EAE الناجم عن مستضد MOG35-55 لا يزال لديه بعض القيود. كنموذج اعتلال دماغي التهابي للإصابة المحورية الأولية بوساطة خلايا CD4 T ، فإن الآفة الرئيسية هي تنكس محوري هائل مع إزالة الميالين الثانوية وإزالة الميالين الأولية الأقل ، والتي تختلف عن أمراض MS31،32،33. يعكس نموذج EAE الناجم عن MOG35-55 بشكل أساسي الاستجابة المناعية التي تحركها خلايا CD4 T ، في حين أن الخلايا المناعية الأخرى مثل خلايا CD8 T و B ليس لديها شعور قوي بالمشاركة في هذا النموذج31. عامل مقيد آخر هو أن EAE الناجم عن MOG35-55 لديه تحيز معين تجاه المكون المناعي للفيزيولوجيا المرضية لمرض التصلب العصبي المتعدد ، ويمكن اعتبار النماذج الحيوانية الأخرى عند النظر في الدراسات التي تركز على أمراض الجهاز العصبي المركزي ، مثل دراسة عمليات إزالة الميالين وتجديد المايلين34،35،36،37،38،39،40 ، كما هو موضح في الجدول 2 .
EAE هو مؤشر فعال في تقليد خصائص المناعة الذاتية لمرض التصلب العصبي المتعدد ، وكذلك آلية الالتهاب وإزالة الميالين12 ، مما يجعل العديد من العلماء حريصين على دراسة آلياته المناعية ، متجاهلين الأعراض السريرية الأخرى لمرض التصلب العصبي المتعدد. أظهرت الدراسات أن القلق المرتبط بمرض التصلب العصبي المتعدد يعزى إلى العمليات الفيزيولوجية المرضية مثل عدم التنظيم المناعي والتهاب الدماغ22 ، 23,41. مشاكل الصحة العقلية ، مثل القلق ، شائعة بشكل خاص لدى الأشخاص المصابين بمرض التصلب العصبي المتعدد ، ويمكن أن يعيق اضطراب القلق أداء المهام اليومية الأساسية ويؤثر بشكل كبير على نوعية الحياة42,43. قد تتنبأ التغيرات في القدرة الحركية لفئران EAE بالتغيرات في العمليات العصبية. في تجارب المجال المفتوح ، حدثت سلوكيات شبيهة بالقلق في فئران EAE ، بما في ذلك انخفاض في السلوكيات الاستكشافية التي بدأت في بداية مبكرة للمرض (بشكل أساسي ، موضوعات الاختبار ذات الدرجات السريرية <0.5 والقدرة الحركية تقريبا جيدة مثل الفئران العادية) ، مما يشير إلى أن ظهور السلوكيات الشبيهة بالقلق يسبق الضعف الحركي. بالإضافة إلى ذلك ، لم تحسن الفئران EAE في فترة مغفرة السلوك الشبيه بالقلق مع زيادة القدرة الحركية. قد يكون ظهور الاستجابة الالتهابية مسؤولا عن الضعف العقلي في فئران EAE من خلال النشاط العصبي ، مما يؤدي إلى تغيرات في الحالة المزاجية ، ويتداخل تنظيم مستويات السيتوكين الالتهابية مع وظيفة متشابك المخطط قبل ظهور ضعف الحركة23,41. ومع ذلك ، يتطلب اختبار المجال المفتوح الانتباه إلى حقيقة أن غرفة الاختبار يجب أن تكون منطقة هادئة ، وتحتاج فئران الاختبار إلى التأقلم مع الغرفة لمدة 1 ساعة مقدما لتجنب الضغط المفرط الناجم عن البيئة الجديدة. مطلوب تنظيف إضافي بالإيثانول بين الاختبارات لإزالة الروائح والمواد الأخرى التي خلفها موضوع الاختبار الأخير. يتمثل القيد الرئيسي لاختبار المجال المفتوح في التداخل الناجم عن الخلل الحركي في فئران EAE ، ويعتمد اختبار تقييم السلوك الشبيه بقلق القوارض على المسافة والوقت ونطاق نشاط القوارض في غرفة التفاعل ، ولا يمكن استبعاد تأثير الخلل الحركي على السلوك الشبيه بالقلق. لذلك ، تحتاج الدراسات المستقبلية إلى أخذ الضعف الحركي في الاعتبار.
غالبا ما تستخدم الطرق التقليدية لتحليل الدراسات المتعلقة بأنسجة العظام الفحص المجهري لقسم العظم ثنائي الأبعاد ، والذي يمكن أن يواجه صعوبات أكبر في تحليل التشكل الهيكلي ، وتوزيع الكثافة ، وتوزيع الاتجاه ، وخصائص أخرى بسبب تأثير المستويات ثنائية الأبعاد وعدم تجانس العينات البيولوجية. أكدت العديد من الدراسات دقة وفعالية نظام Micro-CT لوصف مورفولوجيا العظام ، وأكدت العديد من الدراسات44،45،46 نتائج الكشف عن البنية المجهرية. يسمح التصوير ثلاثي الأبعاد لأنسجة العظام بواسطة Micro-CT بنتائج أكثر سهولة ودقة لقياس الأنسجة العظمية. تم تحقيق مسح الحيوانات الصغيرة والعينات دون إعدام الحيوان أو إتلاف عينة الأنسجة ، مما يسمح بمعلومات مفصلة عن البنية المكانية ثلاثية الأبعاد داخل الأنسجة44. أظهرت الدراسات أن مرضى التصلب العصبي المتعدد عرضة لفقدان كتلة العظام وهشاشة العظام24,25 ؛ من خلال مسح وتصوير عظم الفخذ لفئران EAE باستخدام نظام Micro-CT ، يمكن ملاحظة تدهور واضح في البنية الدقيقة للعظام وانخفاض قوة العظام في عظم الفخذ لفئران EAE مقارنة بالفئران WT التي أصيبت بهشاشة العظام. يعد تحليل التصوير المقطعي المحوسب الدقيق بسيطا نسبيا وغير مكلف نسبيا ، ويمكن استخدام التصوير الحي Micro-CT لمراقبة صحة العظام في المستقبل عند إعطاء العلاج لفئران EAE. ومع ذلك ، فإن العيب هو عدم وجود علامات دوران العظام التي يتم تقييمها من خلال عينات الدم أو قياس الأنسجة العظمية لمراقبة التغيرات الأساسية في التوازن الأيضي للعظام في الفئران EAE47. يمكن النظر في تنظيم بانيات العظم والخلايا الآكلة للعظم في الدراسة في المستقبل.
مرض التصلب العصبي المتعدد هو مرض متعدد الأعراض ، والهدف الوحيد من إدارة المرض هو تقليل أعراض المرض. في البروتوكول المذكور أعلاه ، يمكن محاكاة الأعراض السريرية لمرض التصلب العصبي المتعدد من خلال بناء نموذج EAE المستحث MOG35-55 . أظهرت فئران EAE أعراضا سريرية لخلل وظيفي حركي وسلوك يشبه القلق وهشاشة العظام. يمكن لنظام التسجيل المكون من 5 نقاط ، واختبار المجال المفتوح ، وتحليل Micro-CT الموصوف في هذا البروتوكول مراقبة الأعراض المرضية لفئران EAE من وجهات نظر متعددة وتوفير مخطط مرجعي لعلاج EAE. في غياب الأدوية الفعالة المعدلة للمرض ، يمكن أن يوفر مزيج محتمل من العلاج التآزري أفضل فرصة لتخفيف الأعراض وتحسين الوظيفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
يقر المؤلفون بالدعم المقدم من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (32070768 ، 31871404 ، 31900658 ، 32270754) ومختبر الدولة الرئيسي لأبحاث الأدوية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe(with 26 G needle) | Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd | 60017031 | |
| 2 mL microcentrifuge tube | HAIKELASI | KY-LXG2A | |
| 22 G needle | Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd | 60017208 | |
| Complete Freund’s Adjuvant | Sigma | F5881 | Stored at 4 °C, 1 mg of heat-inactivated MTB (H37Ra) per mL |
| Conditioned place preference system | Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd | Animal behavior | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10009218 | Stored at RT |
| Locomotion activity (open field) video analysis system | Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd | DigBehv-002 | Animal behavior |
| MOG35-55 peptide | Gill Biochemical Co., Ltd | GLS-Y-M-03590 | Stored at -20 °C |
| Mycobacterium tuberculosis H37Ra | BD | 231141 | Stored at 4 °C |
| Open field reaction chamber | Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd | Animal behavior | |
| Pertussis toxin | Calbiochem | 516560 | Stored at 4 °C |
| Phosphate Buffered Saline | Made in our laboratory | ||
| Scissor | Shanghai Medical Instrument (group) Co., Ltd | J21010 | |
| Sealing film | Heathrow Scientific | HS 234526B | |
| Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002447 | |
| Steel ball | QIAGEN | 69975 | |
| TissueLyser II | QIAGEN | 85300 | |
| Tweezer | Shanghai Medical Instrument (group) Co., Ltd | JD1060 | |
| μCT 35 desktop microCT scanner | Scanco Medical AG, Bassersdorf, Switzerland |
References
- Zhernakova, A., Withoff, S., Wijmenga, C. Clinical implications of shared genetics and pathogenesis in autoimmune diseases. Nature Reviews Endocrinology. 9 (11), 646-659 (2013).
- Filippi, M., et al.
- Dobson, R., Giovannoni, G. Multiple sclerosis - a review. Europen Journal of Neurology. 26 (1), 27-40 (2019).
- Rietberg, M. B., Veerbeek, J. M., Gosselink, R., Kwakkel, G., van Wegen, E. E. Respiratory muscle training for multiple sclerosis. Cochrane Database of Systematic Reviews. 12 (12), (2017).
- O'Brien, K., Gran, B., Rostami, A. T-cell based immunotherapy in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Immunotherapy. 2 (1), 99-115 (2010).
- Feinstein, A., Freeman, J., Lo, A. C. Treatment of progressive multiple sclerosis: what works, what does not, and what is needed. Lancet Neurology. 14 (2), 194-207 (2015).
- Li, H., Lian, G., Wang, G., Yin, Q., Su, Z. A review of possible therapies for multiple sclerosis. Molecular and Cellular Biochemistry. 476 (9), 3261-3270 (2021).
- Lewis, V. M., et al. depression and suicide ideation in people with multiple sclerosis. Journal of Affective Disorders. 208, 662-669 (2017).
- Boeschoten, R. E., et al. Prevalence of depression and anxiety in Multiple Sclerosis: A systematic review and meta-analysis. Journal of the Neurological Sciences. 372, 331-341 (2017).
- Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O'Brien, K., Gran, B. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS). British Journal of Pharmacology. 164, 1079-1106 (2011).
- Glatigny, S., Bettelli, E. Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) as Animal Models of Multiple Sclerosis (MS). Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 8 (11), 028977 (2018).
- Procaccini, C., De Rosa, V., Pucino, V., Formisano, L., Matarese, G.
- Mix, E., Meyer-Rienecker, H., Hartung, H. P., Zettl, U. K. Animal models of multiple sclerosis-potentials and limitations. Progress in Neurobiology. 92 (3), 386-404 (2010).
- DiToro, D., et al. Insulin-like growth factors are key regulators of T helper 17 regulatory T cell balance in autoimmunity. Immunity. 52 (4), 650-667 (2020).
- Jain, R., et al. Interleukin-23-induced transcription factor Blimp-1 promotes pathogenicity of T helper 17 cells. Immunity. 44 (1), 131-142 (2016).
- Du, C., et al. Kappa opioid receptor activation alleviates experimental autoimmune encephalomyelitis and promotes oligodendrocyte-mediated remyelination. Nature Communications. 7, 11120 (2016).
- Yang, C., et al. Betaine Ameliorates Experimental Autoimmune Encephalomyelitis by Inhibiting Dendritic Cell-Derived IL-6 Production and Th17 Differentiation. The Journal of Immunology. 200 (4), 1316-1324 (2018).
- McGinley, A. M., et al. Interleukin-17A serves a priming role in autoimmunity by recruiting IL-1β-producing myeloid cells that promote pathogenic T cells. Immunity. 52 (2), 342-356 (2020).
- Kocovski, P., et al. Differential anxiety-like responses in NOD/ShiLtJ and C57BL/6J mice following experimental autoimmune encephalomyelitis induction and oral gavage. Laboratory Animals. 52 (5), 470-478 (2018).
- Seibenhener, M. L., Wooten, M. C. Use of the Open Field Maze to measure locomotor and anxiety-like behavior in mice. Journal of Visualized Experiments. (96), e52434 (2015).
- Walsh, R. N., Cummins, R. A. The Open-Field Test: a critical review. Psychological Bulletin. 83 (3), 482-504 (1976).
- Tauil, C. B., et al. Depression and anxiety disorders in patients with multiple sclerosis: association with neurodegeneration and neurofilaments. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 54 (3), 10428 (2021).
- Gentile, A., et al. Interaction between interleukin-1beta and type-1 cannabinoid receptor is involved in anxiety-like behavior in experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Neuroinflammation. 13, 231 (2016).
- Hearn, A. P., Silber, E.
- Gibson, J. C., Summers, G. D.
- Ye, S., Wu, R., Wu, J.
- Zamvil, S. S., et al. Lupus-prone' mice are susceptible to organ-specific autoimmune disease, experimental allergic encephalomyelitis. Pathobiology. 62 (3), 113-119 (1994).
- Oh, J., Vidal-Jordana, A., Montalban, X.
- Smith, P.
- Aharoni, R., Globerman, R., Eilam, R., Brenner, O., Arnon, R. Titration of myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG)-Induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model. Journal of Neuroscience Methods. 351, 108999 (2021).
- Lassmann, H., Bradl, M. Multiple sclerosis: experimental models and reality. Acta Neuropathological. 133 (2), 223-244 (2017).
- Goverman, J., Perchellet, A., Huseby, E. S. The role of CD8(+) T cells in multiple sclerosis and its animal models. Current Drug Targets. Inflammation and Allergy. 4 (2), 239-245 (2005).
- Schultz, V., et al. Acutely damaged axons are remyelinated in multiple sclerosis and experimental models of demyelination. Glia. 65 (8), 1350-1360 (2017).
- McRae, B. L., et al. Induction of active and adoptive relapsing experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) using an encephalitogenic epitope of proteolipid protein. Journal of Neuroimmunology. 38 (3), 229-240 (1992).
- Zamvil, S., et al. T-cell clones specific for myelin basic protein induce chronic relapsing paralysis and demyelination. Nature. 317 (6035), 355-358 (1985).
- Jackson, S. J., Lee, J., Nikodemova, M., Fabry, Z., Duncan, I. D. Quantification of myelin and axon pathology during relapsing progressive experimental autoimmune encephalomyelitis in the Biozzi ABH mouse. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 68 (6), 616-625 (2009).
- Gudi, V., Gingele, S., Skripuletz, T., Stangel, M. Glial response during cuprizone-induced de- and remyelination in the CNS: lessons learned. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 73 (2014).
- Yu, Q., et al.
- Dehghan, S., Aref, E., Raoufy, M. R., Javan, M. An optimized animal model of lysolecithin induced demyelination in optic nerve; more feasible, more reproducible, promising for studying the progressive forms of multiple sclerosis. Journal of Neuroscience Methods. 352, 109088 (2021).
- Kuypers, N. J., James, K. T., Enzmann, G. U., Magnuson, D. S., Whittemore, S. R. Functional consequences of ethidium bromide demyelination of the mouse ventral spinal cord. Experimental Neurology. 247, 615-622 (2013).
- Haji, N., et al. TNF-alpha-mediated anxiety in a mouse model of multiple sclerosis. Experimental Neurology. 237, 296-303 (2012).
- Butler, E., Matcham, F., Chalder, T. A systematic review of anxiety amongst people with Multiple Sclerosis. Multiple Sclerosis and Related Disorders. 10, 145-168 (2016).
- Peres, D. S., et al. TRPA1 involvement in depression- and anxiety-like behaviors in a progressive multiple sclerosis model in mice. Brain Research Bulletin. 175, 1-15 (2021).
- Bouxsein, M. L., et al. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. Journal of Bone and Mineral Research. 25 (7), 1468-1486 (2010).
- Chappard, D., Retailleau-Gaborit, N., Legrand, E., Baslé, M. F., Audran, M. Comparison insight bone measurements by histomorphometry and microCT. Journal of Bone and Mineral Research. 20 (7), 1177-1184 (2005).
- Akhter, M. P., Lappe, J. M., Davies, K. M., Recker, R. R. Transmenopausal changes in the trabecular bone structure. Bone. 41 (1), 111-116 (2007).
- Wei, H., et al. Identification of Fibroblast Activation Protein as an Osteogenic Suppressor and Anti-osteoporosis Drug Target. Cell Reports. 33 (2), 108252 (2020).
