Summary
I denne protokollen ble ny bypasstransplantasjon av grisevin utført gjennom et lite snitt i venstre brystvegg uten kardiopulmonal bypass. Det ble gjort en postoperativ patologistudie som viste intimal fortykkelse.
Abstract
Venøs graftsykdom (VGD) er den viktigste årsaken til koronar bypassgraft (CABG) svikt. Store dyremodeller av CABG-VGD er nødvendig for undersøkelse av sykdomsmekanismer og utvikling av terapeutiske strategier.
For å utføre operasjonen går vi inn i hjertekammeret gjennom det tredje interkostalrommet og dissekerer forsiktig den indre brystvenen og senker den i vanlig saltvann. Høyre hovedkoronararterie behandles deretter for iskemi. Målbeholderen er innskåret, en shuntplugg er plassert, og den distale enden av graftvenen er anastomosert. Den stigende aorta er delvis blokkert, og den proksimale enden av graftvenen anastomoseres etter perforasjon. Vena graft kontrolleres for patency, og proksimale høyre koronararterie ligeres.
CABG-kirurgi utføres i minigriser for å høste venstre indre brystvein for bruk som vaskulær graft. Serumbiokjemiske tester brukes til å evaluere dyrets fysiologiske status etter operasjonen. Ultralydundersøkelse viser at den proksimale, midtre og distale enden av transplantatkaret er uhindret. I den kirurgiske modellen observeres turbulent blodstrøm i transplantatet ved histologisk undersøkelse etter CABG-operasjonen, og venøs graftstenose assosiert med intimal hyperplasi observeres i transplantatet. Studien her gir detaljerte kirurgiske prosedyrer for etablering av en repeterbar CABG-indusert VGD-modell.
Introduction
Selv om dødeligheten av koronar hjertesykdom har gått betydelig ned de siste årene, utvikler halvparten av middelaldrende voksne i USA iskemiske hjerterelaterte symptomer hvert år, og en tredjedel av eldre voksne dør av koronar hjertesykdom1. Koronar bypasstransplantasjon (CABG) er en effektiv kirurgisk modalitet for å forbedre myokardiskemi, og enda viktigere, det er en uerstattelig kirurgisk modalitet for behandling av multivessel koronararteriesykdom2. Over tid utvikler imidlertid vaskulære transplantater betennelse, intimal hyperplasi og progressiv aterosklerose, som er kjent for å føre til venetransplantatsvikt eller venetransplantatsykdom (VGD)3. Hos pasienter etter CABG, hvis restenose oppstår, kan bare det syke blodkaret erstattes i noen tilfeller2. Eldre pasienter og ekstra komorbiditeter gjør redoing koronar bypass poding ganske utfordrende. Forsinkelse eller kontroll av de patologiske problemene forbundet med podede blodkar er et presserende problem som skal løses. Store dyremodeller av CABG-VGD er nødvendig for undersøkelse av sykdomsmekanismer og utvikling av terapeutiske strategier. Forskere har vellykket etablert VGD-modeller for dyr i små og store dyr som mus4, rotter5, kaniner6 og griser7. Sammenlignet med små dyr har store dyr som griser anatomiske strukturer og fysiologiske egenskaper som ligner på mennesker og har lengre levetid 8,9. Dermed er store dyr mer egnet for å utforske langsiktige patologiske forandringer i venøs graftsykdom og for preklinisk testing av legemidler eller enheter. Vi og vårt samarbeidsteam har med hell brukt kirurgiske teknikker for å etablere en svinehjertesviktmodell og beskrevet de hjertepatologiske endringene i denne modellen10.
CABG-kirurgi har blitt standardisert i klinisk praksis, men når den brukes til etablering av VGD-dyremodeller, er forskjellene mellom arter, anskaffelse av dyreutstyr og fasiliteter, dyrekirurgiske operasjoner og dyrefôring og sykepleie store utfordringer for forskere. Som i klinisk praksis inkluderer tilnærmingene for CABG-kirurgi som brukes til å etablere VGD-dyremodeller midtlinjesternotomi11 og venstre lateral torakotomi12. Midtlinjesternotomi er mer vanlig brukt13,14. Denne tilnærmingen har imidlertid høy risiko for både mennesker og dyr. I studien rapportert av Thankam et al., døde to av de seks grisene som ble brukt til modellering under operasjon15. Høy modelldødelighet øker studiekostnadene og påvirker nøyaktigheten av resultatene. En studie viste tidligere at et venstre brystveggsnitt var mulig for å etablere CABG-indusert VGD hos gris11. Her tar denne studien sikte på å beskrive en trinnvis protokoll for å etablere en reproduserbar kirurgi for en CABG-indusert VGD-modell hos minigriser og å evaluere fenotypen til denne modellen. Den eksperimentelle protokollen ble utformet i fellesskap av hjertekirurgi- og anestesiteamene. Den kirurgiske tilnærmingen for venstre tredje interkostalrom ble bestemt i henhold til til andre minipiger i laboratoriet før kirurgi, og anestesimetoden ble utført i henhold til metoden som ble brukt i sentrum16. Blodbiokjemiske tester, ultralydundersøkelse og histologiundersøkelse ble utført for å evaluere dyremodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Prosedyrene for pleie og bruk av forsøksdyr ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute. Alle forsøkene ble utført i samsvar med Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (8th Ed., 2011, National Research Council, USA). Den kirurgiske prosedyren er vist i figur 1.
1. Preoperativ forberedelse av dyr
- Del tilfeldig 10 3 måneder gamle hannminigriser som veier 30-35 kg inn i narregruppen (n = 5) og VGD-gruppen (n = 5).
- Evaluer de preoperative og postoperative helsemessige forholdene til grisene ved hjelp av kroppsmasseindeksen (BMI). Beregn BMI som følger:
BMI = kroppsvekt (kg)/(kroppslengde [cm] × kroppslengde [cm])
MERK: Kroppslengden måles fra grisens nese til bunnen av halen. - Fast dyrene i 12 timer før operasjonen for å unngå aspirasjon etter anestesi. Forbered anestesiapparater og kirurgiske instrumenter, inkludert en anestesimaskin, gass, bedøvelsesmidler, en anestesirørledning, et spesielt laryngoskop og kirurgiske instrumenter, en ribbeholder, suturer, en skjoldbruskretraktor, kirurgisk tang, etc. Steriliser alle instrumenter som skal brukes i operasjonen.
2. Klargjøre dyrene for kirurgi
- Vei dyrene og beregne bedøvelsesdosen. Administrer intramuskulært anestesiblandingen som består av 2 mg/kg av 1:1 tiletamin og zolazepam, 0,2 mg/kg diazepam og 0,02 mg/kg atropin17. Bruk fentanyl (50 mg/kg) til intraoperativ smertelindring30.
- Sørg for at et riktig bedøvelsesplan oppnås og sett inn et inneliggende venekateter (20G) i den marginale ørevenen for å etablere øretilgang. Overfør grisen til operasjonsbordet og legg den i den bakre posisjonen. Immobiliser lemmer med bandasjer og løft hodet med et sterilt drap.
MERK: Anestesitilstanden ble overvåket ved sentral fiksering av øyeeplet, miose, tap av pupillrefleks og tap av smerterefleks. Hjertefrekvens og blodtrykk ble opprettholdt på et lavere nivå enn baseline. Kirurgen bør overvåke HR, BP og andre parametere under lammelse og øke anestesidosen hvis HR øker > 20 % over baseline. - Eksponer epiglottis og glottis ved hjelp av et veterinært laryngoskop. Utfør trakeal intubasjon med et 7,0-7,5Fr rør og koble det til anestesipustekretsen.
MERK: Respiratoren brukes til kontinuerlig overtrykksventilasjon med tidalvolum 280 ml, inspiratorisk/ekspiratorisk forhold 1:2, respirasjonsfrekvens 20 ganger/min og positivt endeekspiratorisk trykk (5 cm H2O). - Injiser vekuroniumbromid intravenøst (0,1 mg/kg) for å slappe av i musklene under de kirurgiske prosedyrene, og bruk 2 % isofluran for å opprettholde anestesi med en respirasjonsfrekvens på 16-20 slag/minutt og et tidalvolum på 10 ml/kg.
MERK: Vekuronium gis for å sikre tilstrekkelig anestesidybde hos lammede dyr, spesielt siden dosen av induksjonslegemiddel og isofluran er i den nedre enden av anbefalt. - Bruk veterinærsalve på grisens øyne for å forhindre tørrhet under anestesi. Bruk elektriske tepper for å holde grisens kroppstemperatur på 38 °C ± 5 °C.
- Bruk et elektrokardiogram for å overvåke hjertefrekvens, oksygennivå i blodet og kroppstemperatur.
3. Kirurgiske prosedyrer
- Barber venstre brystvegg og påfør tre alternerende runder med 0,7% jod og 75% alkohol for aseptisk å forberede operasjonsområdet opp til venstre mandibulær vinkel, ned til navlestrengen, til venstre til bakre aksillære linje og rett til aksillærfronten. Plasser en steril kirurgisk drapering rundt operasjonsområdet.
- Lag et 7-10 cm tverrsnitt med en elektrisk kniv i det tredje venstre interkostalrommet og skill det subkutane vevet lag for lag (figur 2A). Fjern et 5-6 cm segment av den tredje ribben med bensaks og eksponer den indre brystvenen med en retractor etter å ha eksponert det tredje ribbe-sternalleddet (figur 2B).
- Finn den indre brystvenen sammen med venstre indre brystarterie på venstre side av brystbenet. Utfør en stump disseksjon av den indre brystvenen med vaskulære tang.
- Utfør hemostase ved elektrokoagulering av grenene til venstre indre brystvein med en elektrisk kniv. Hvis hemostase er ufullstendig, bruk bomullstrådligering for hemostase. Ligat og merk de to endene av venen mens den høstes (figur 2C).
- Forbered heparin normal saltoppløsning ved å tilsette 2 ml heparinnatriumoppløsning og 98 ml normal saltvann. Etter å ha fjernet venen, injiser heparin vanlig saltvann i venen for forbehandling (figur 2D). Deretter legger du venen i vanlig saltvann og oppbevarer den for sikkerhetskopiering.
- Gjør et lignende snitt som beskrevet ovenfor og fjern den indre brystvenen i skamgruppen. Åpne perikardiet, og lukk deretter brystveggen i skamgruppen. Bruk den indre brystvenen i skamgruppen for patologisk kontroll uten bypasstransplantasjon av koronararterien.
- Gjør et ~ 7 cm snitt med en elektrisk kniv på perikardiet for å eksponere høyre koronararterie. Suspender perikardiet og sy på huden på ipsilateral side med 1-0 kirurgiske suturer (figur 2E). Separer høyre koronarstamme fra det omkringliggende vevet (figur 2E).
- Omgå blokkeringsbåndet under den proksimale enden av den isolerte høyre koronararterien nær aorta med en trådkrok og behandle myokard med tre sykluser på 2 min iskemi og 5 min reperfusjon ved å stramme og slappe av blokkeringsbåndet (figur 2F). Overvåk hjertets elektriske aktivitet med elektrokardiogrammonitoren under iskemi/reperfusjonsforkondisjonering (figur 2G).
MERK: Når høyre koronararterie er blokkert, viser elektrokardiogrammet økt hjertefrekvens og ST-segmenthøyde. - Stram båndet for å blokkere riktig koronar blodstrøm. Klipp epikardiet som dekker blodkarene. Utsett koronarveggen, og kutt i lengderetningen med spissen av et kirurgisk blad mot midten av blodkarets fremre vegg.
- Etter å ha kuttet lumen, forstørre snittet med saks og legg en koronar shunt. Sett den ene enden av shunten med en spole inn i den distale koronararterien gjennom tåren. Shunt blodet i koronararteriene inn i den hule koronar shunten for å sikre et klart operativt felt (figur 2H).
- Utfør en ende-til-side kontinuerlig sutur mellom den indre brystvenen og høyre koronarstamme med 7-0 polypropylen sutur (figur 2I). I midten av den stigende aorta, okkluder den venstre anterolaterale veggen av den stigende aorta med en semi-okklusjonsklemme.
- Bruk et kirurgisk blad for å lage et lite snitt i aortaveggen der adventitia har blitt kuttet, sett hodeenden av glideakselen i hodeenden av slaget inn i aortahulen gjennom dette snittet, kontrakt glideakselen utover, og den sirkulære kniven over den kutter av et stykke av arterieveggen. Vevsblokken som kuttes ut av stansen er ca. 3 mm i diameter (figur 2J).
- Trekk ut shunt. Utfør en ende-til-side kontinuerlig sutur mellom den indre brystvenen og aortaveggen med 6-0 polypropylen sutur (figur 2K). Åpne semi-okklusjonsklemmen.
- Registrer bypassstrømmen til høyre koronararteriestamme proksimalt til anastomosestedet ved hjelp av ultralyd. Overvåk hjertets elektriske aktivitet ved hjelp av elektrokardiogrammet (figur 2L).
- Indwell et midlertidig dreneringsrør (Fr: 16) inn i brysthulen for å la blodet og væskene renne av. Sy perikardsnittet med en 1-0 bomullstråd og lukk brystet lag for lag (fra innsiden til utsiden: Pleura lag, muskellag, subkutant vevslag, hudlag) mens du plasserer penicillin (ca. 0,5 g) pulver på hvert lag. Fjern dreneringsrøret etter å ha sydd hudsnittet med en 1-0 bomullstråd.
4. Behandling etter operasjonen
- Fjern endotrakealrøret etter at dyrene kom tilbake til spontan pust. Anestesiologen bør vurdere dyrets vitalitet (f.eks. respirasjonsfrekvens, hjertefrekvens, oksygenmetning osv.) og fjerne EKG etter at dyrene våkner og går tilbake til spontan aktivitet. Send dyrene tilbake til fôringsrommet og legg narredyrene i en annen merd i avlsrommet. Hold dyrene varme med et elektrisk teppe. Observer dyrene hver time etter operasjonen (minst 4 ganger).
- Fôr dyret dagen etter operasjonen. Tilsett aspirin (200 mg) 2x daglig i 7 dager til dyrefoder for å forhindre postoperativ trombose og redusere sårsmerter.
MERK: Unngå å mate dyr på operasjonsdagen for å forhindre aspirasjon. - Administrer dyret med en intramuskulær injeksjon av penicillin 1x daglig i 7 påfølgende dager for å forhindre postoperativ infeksjon (14.000 enheter per kg).
5. Ultralyd undersøkelse
- Etter CABG-kirurgi, bruk en steril ultralydsondehylse for å pakke den høyfrekvente lineære array-sonden. Plasser sonden på overflaten av venetransplantatet.
- Vis omrisset av transplantatet i todimensjonal ultralydmodus, og skift deretter til fargedopplermodus for å oppdage blodstrømmen i transplantatet.
6. Venøs transplantatvevssamling
- Samle 10 ml blodprøve fra venøs krets av ørevenen for biokjemisk testing. (Tabell 1). Sentrifuger blodprøven ved 1000 x g i 5 minutter og utfør biokjemiske tester med en automatisk biokjemisk analysator.
- Bedøv dyret som beskrevet tidligere. Ved bekreftelse av anestesidybde, injiser 10% kaliumklorid 0,5 ml / kg kroppsvekt fra ørets marginale vene eller forbenvenen. Deretter gjør du et 10 cm median sternalt snitt med en elektrisk kniv for å høste venetransplantatet 30 dager etter operasjonen. Fest kroppsposisjonen som i trinn 2.2., og etter sterilisering og plassering av et drap, gjør du et median brystbensnitt for å dele brystbenet. Under separasjonen, unngå de viktigste blodkarene og hjertet, og skille de podede blodkarene lag for lag.
- Kutt raskt av de store blodkarene som forbinder hjertet, plasser hjertet og den stigende aorta på isflis, og fjern graftvaskulær bro, den tilkoblede aorta og høyre koronararterie. Skyll alle prøvene med vanlig saltvann ved 4 °C.
- Ta hele graftbeholderen på ca 3-4 cm i størrelse, del den i 4-5 like deler, og overfør til kryopreserveringsrør. Sett rørene raskt i flytende nitrogen for å flashfryse og flytte til en -80 ° C ultra-lav temperatur fryser for lagring.
- For analyse, skyll transplantatet med iskald 0,9% saltvann og fest det i 4% paraformaldehydoppløsning. Oppretthold et forhold mellom vevsblokkstørrelse og fiksativ løsning på 1:10 og fikser vevet i mer enn 12 timer.
- Flekk seksjonene i 50 ml vandig oppløsning av hematoksylin i 3 minutter. Skill seksjonene ved å vaske med 50 ml 0,5% saltsyreetanol og 50 ml 0,2% ammoniakkvann i 10 s hver.
- Skyll med rennende vann i 1 time og rengjør deretter i destillert vann ved å bløtlegge i 3 minutter. Dehydrer i 70% og 90% etanol i 10 minutter hver. Plasser i 50 ml 0,5% alkohol eosinfarging løsning i 2-3 minutter.
- Dehydrer de fargede seksjonene med ren etanol i 10 minutter og suge deretter i ren xylen i 10 minutter for å gjøre prøvene gjennomsiktige. Drypp de gjennomsiktige seksjonene med nøytral lim og deksel med deksel. Observer patologiske seksjoner under et lysmikroskop ved 40x forstørrelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
BMI og serum biokjemiske indekser
BMI mellom simulerings- og VGD-gruppene var ikke signifikant forskjellig (simulering vs. VGD, 22,05 kg/cm 2 ± 0,46 kg/cm 2 vs. 21,14 kg/cm 2 ± 0,39 kg/cm 2, p = 0,46). De biokjemiske resultatene i serum er listet opp i tabell 1. Statistisk signifikante endringer mellom gruppene ble funnet i fire biokjemiske indekser, inkludert aspartataminotransferase (ASAT, simulering vs. VGD, 25,25 IE/L ± 1,88 IE/L vs. 31,5 IE/L ± 2,58 IE/L), serumbilirubin (simulering vs. VGD, 2,5 μmol/L ± 0,47 μmol/L vs. 4,5 μmol/L ± 0,14 μmol/L), totalbilirubin (narrevilt vs. VGD, 0,025 μmol/L ± 0,14 μmol/L vs. 0,92 μmol/L ± 0,33 μmol/L), og kreatinin (humbug vs. VGD, 92,75 μmol/L ± 4,15 μmol/L vs. 141,75 μmol/L ± 12,65 μmol/L).
Ultralydundersøkelse
Alle dyrene i narre- (n = 5) og VGD-gruppene (n = 5) overlevde. De kirurgiske prosedyrene for CABG er vist i figur 1. Gjennomsnittlig operasjonstid var 105 min ± 25 min (spredning: 90-160 min), og gjennomsnittlig intraoperativt blødningsvolum var 85 ml ± 35 ml (område: 50-200 ml). Påvirkningen av driftstiden er hovedsakelig overgangen av operatørens ferdigheter fra menneske til gris og har ingen spesiell betydning. Gjennomsnittlig varighet fra etter snittanastomose til trakeal ekstubasjon var 17 min ± 5 min (spredning: 15-30 min). Ultralydundersøkelse viste at blodforsyningen til den podede karen hadde delvis regurgitasjon sammenliknet med normal koronararterie, og total blodstrømsretning var stort sett normal (figur 3). Pneumothorax, tamponade, infeksjon eller andre alvorlige komplikasjoner ble ikke observert postoperativt. Det ble ikke funnet noen signifikant forskjell i vekt eller BMI mellom narre- og VGD-gruppene, 1 måned postoperativt.
Ultralydundersøkelse ble utført på proksimale enden (figur 3A,B), vaskulær hulrom (figur 3C,D) og distale ende (figur 3E,F) av transplantatkaret. Den retrograde strømmen ble observert ved de proksimale og distale endene av transplantatkaret; Det ble imidlertid ikke observert ekstravasasjon av blod.
Patologiske endringer i venene
Hvert venetransplantat ble jevnt fordelt i tre segmenter etter lengde, og ett snitt ble valgt fra hvert segment for evaluering og klassifisert etter modifisert Proudilit-klassifikasjon for koronarstenose18. Gjennomsnittsverdier fra de tre delene ble benyttet som resultat for okklusjonsgrad. Den spesifikke klassifiseringen var som følger: grad I = 0-punkt, normal uten restenose; grad II = 1-punkts, mild stenose <30%; grad III = 2 poeng, stenose mellom 30% og 50%; grad IV = 3 poeng, alvorlig stenose mellom 50% og 90%; klasse V = 4 poeng, subtotal okklusjon >90%; og grad VI = 5 poeng, total okklusjon, uten blodtilførsel til venetransplantatet. Den modifiserte Proudilit-klassifikasjonen for koronarstenose ble tatt i bruk for å vurdere de kvantifiserte resultatene. Resultatet for simuleringsgruppen var 0,00 ± 0,00, noe som indikerer ingen vaskulær okklusjon, mens resultatet for CABG-gruppen var 3,12 ± 1,22. Forskjellen var derfor signifikant mellom de to gruppene (p < 0,05, tabell 2).
Under mikroskopet, i sham-gruppen, virket tunica intima, tunica media og venøs vegg av venøs graft normal. I VGD-gruppen ble tunica intima og tunica medium av venøse transplantater betydelig fortykket 30 dager etter CABG-operasjonen. Tunica intima ble tvetydig avgrenset fra tunikamediene. Det elastiske laget av tunika media forsvant (figur 4). Venetransplantatets lumen var fylt med hyperplastisk vev (figur 4). Ingen signifikant endring i kardiameter ble observert.
Figur 1: Oversikt over prosedyren. (A-C) Før operasjonen: Vei minigrisene, kontroller ytelsen til hjertestarteren og ventilatoren, og koble til ventilasjonsrøret. (VG Nett) Anestesi: Administrer en intramuskulær injeksjon av anestesi til minigrisene, fest minigrisen på operasjonsbordet, blottlegg luftveiene fullt ut for trakeal intubasjon, koble ventilatoren og bruk inhalasjonsbedøvelse for å opprettholde anestesi. (VG Nett) Under operasjon: Utfør en preoperativ ultralydundersøkelse av hjertefunksjonen hos minigrisene og fullstendig koronar bypasstransplantasjon gjennom et venstre brystveggsnitt. (J-L) Etter operasjonen: Anastomose sårene og vær oppmerksom på postoperativ pleie og fôring av minigrisene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Det kirurgiske inngrepet. (A) Klipp brystveggen, (B) isoler den indre brystvenen, (C) fjern den indre brystvenen, (D) utfør heparinprekondisjonering, (E) suspendere perikardiet, (F) utføre myokardiskemireperfusjon, (G) overvåke EKG-endringene, (H) blokkere koronar blodstrøm, (I) anastomose den proksimale enden av transplantatkaret, (J ) distalt koronar anastomosested, (K) anastomoser distalt for koronararteriene, (L) fullstendig bypasstransplantasjon i koronararterien. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Ultralydundersøkelse. Etter fullføring av koronar bypasstransplantasjon, vurderes blodstrømningspatensen til det podede karet ved hjelp av ultralyd. (A,C,E) Normale koronar blodstrømsbilder. Kontinuerlige blodstrømningssignaler ses ved (B) proksimale, (D) midtre og (F) distale ender av de podede karene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4 Histologisk analyse. (A) Normalt patologisk avsnitt i indre mammarvene viste klart karhierarki og ingen lumenstenose. (B,C) Patologien i vena mammary interna 30 dager etter koronartransplantasjonen viste at intima i karet var fortykket i varierende grad, og lumen var tydelig innsnevret. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Indikatorer | Humbug-gruppe (n=5) | Graftgruppe (n=5) |
| ALAT (IE/L) | 46 ±5.11 | 47.75±7.88 |
| ASAT (IE/L) | 25.25 ±1.88 | 31,5±2,58* |
| Totalt protein (IE/L) | 63.12 ±.138 | 60.17±1.91 |
| Albumin (IE/L) | 32.25 ±0.77 | 23.77±5.61 |
| Globulin (g/L) | 30.87 ±.136 | 36.4±6.03 |
| Serumbilirubin (μmol/L) | 2,5 ±0,47 | 4,5±0,14* |
| Totalt bilirubin (μmol/L) | 0,025 ±0,14 | 0,92±0,33* |
| Alkalisk fosfatase (IE/L) | 103 ±19.3 | 104±16.04 |
| Glukosamin (mmol/L) | 4,44 ±0,36 | 5,96±0,42 |
| Urea Nitrogen (mmol / L) | 2,46 ±0,17 | 2,89±0,65 |
| Serumkreatinin μmol/L | 92,75 ±4,15 | 141,75±12,65* |
| Totalt kolesterol (mmol / L) | 2,37 ±0,12 | 2.16±0.06 |
| Triglyserid (mmol/L) | 0,48 ±0,10 | 0,25±0,05 |
| Høy tetthet lipoprotein mmol / L | 1,05 ±0,07 | 1.03±0.07 |
| Lipoprotein med svært lav tetthet (mmol/l) | 1,43 ±0,06 | 1.29±0.04 |
| Laktat dehydrogenase (mmol / L) | 384,75 ±26,8 | 478,25±49,58* |
Tabell 1. Serumbiokjemiske indikatorer. Statistisk analyse programvare ble brukt til analyse. Data ble uttrykt som gjennomsnitt ± standardfeil (n = 5). Sammenligninger av måledata ble analysert med Student t-test. En p-verdi mindre enn 0,05 indikerte statistisk signifikans. * p < 0,05, CABG vs humbug.
| Proudilit klassifisering | ||||||
| S. Nr. av utvalg | Score umiddelbart etter CABG-kirurgi | Score 30 dager etter CABG-kirurgi | ||||
| 1 | 0, 0, 0 | 2, 2, 2 | ||||
| 2 | 0, 0, 0 | 1, 2, 2 | ||||
| 3 | 0, 0, 0 | 2, 3, 2 | ||||
| 4 | 0, 0, 0 | 3, 2, 2 | ||||
| 5 | 0, 0, 0 | 2, 1, 2 | ||||
Tabell 2. Statistiske resultater av transplantatets okklusjonsgrader umiddelbart etter kirurgi og 30 dager postoperativt. Den modifiserte Proudilit klassifikasjonsskalaen ble brukt for vaskulær okklusjonsgrad: grad I = 0-punkt, normal uten restenose; grad II = 1-punkts, mild stenose <30%; grad III = 2 poeng, stenose mellom 30% og 50%; grad IV = 3 poeng, alvorlig stenose mellom 50% og 90%; klasse V = 4 poeng, subtotal okklusjon >90%; og grad VI = 5 poeng, total okklusjon, uten blodtilførsel til venetransplantatet. Dataene inkluderer resultater fra fem venetransplantater jevnt fordelt på tre seksjoner etter lengde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne studien beskrev vi i detalj protokollen for dyrevalg, instrumentforberedelse, kirurgiske prosedyrer og postoperativ evaluering ved utvikling av en CABG-indusert VGD-modell. Vi utførte ultralydundersøkelse av venetransplantatet før og etter CABG-kirurgi og histologisk undersøkelse av transplantatet 30 dager etter operasjonen. Blodstrømmen i vena indre mammary var normal før CABG-operasjonen, mens retrograd flow ble observert i transplantatet i vena interna mammary. Sammenlignet med skamoperasjonsgruppen ble lever- og nyrefunksjonen til dyrene i operasjonsgruppen skadet til en viss grad. Tatt i betraktning forekomsten av koronar transplantatsykdom, resulterte svekkelsen av myokardial kontraktilitet i utilstrekkelig perfusjon av perifert vev. Venetransplantatet viste intimal hyperplasi og karremodellering 30 dager etter CABG-operasjonen (figur 4). Fibrotiske forandringer rundt blodkarene er assosiert med sårheling, fibroblastproliferasjon skjer tidlig i sårheling på dag 1 til dag 3 19, produksjonen av aktivt type I kollagen og fibronektin skjer på dag 4 til dag 6, og cytoplasmatisk α-SM aktinfirfilaggregering skjer på dag 7 til dag 1419. Stressfibre innebærer dannelsen av myofibroblaster, som sammenfaller med sårkontraksjon20. Det er uklart om perivaskulær fibrose påvirker operasjonsutfallet.
Her valgte vi ut minigriser for å etablere modellen for venetransplantatsykdom. Mens små dyr som rotter har blitt brukt til å studere de patologiske mekanismene i VGD21, er griser like i størrelse, anatomi og fysiologi som mennesker og er derfor mer egnet for å studere patogenesen av menneskelig hjertesykdom eller som et verktøy for enhetsutvikling22. Indre mammary vener er også ofte selektert som grafts klinisk. Kliniske studier fra to uavhengige grupper fant at internt mammarvenetransplantat har karakteristisk høy forekomst av venetransplantatlesjoner, og de samme patologiske forandringene ble observert i vår studie (figur 4)23,24. Som i klinisk praksis er valg av en passende kirurgisk tilnærming i dyrekirurgi avgjørende for operasjonens suksess; Her viste vi til Hocums venstre torakotomi11. Vi fant at venstre torakotomi tydelig kunne eksponere operasjonsfeltet, anatomien rundt snittet var lett å identifisere og blødningsmengden var lav. I tillegg, sammenlignet med median torakotomi, krever lateral torakotomi ikke saging av brystbenet, slik at kirurgisk stress kan reduseres.
Anestesi er avgjørende for suksessen til en kirurgisk modell. I denne studien ble protokollen modifisert fra Kotani og medarbeidere, med kombinasjonen ketamin og diazepam brukt som anestesiinduksjon og isofluran inhalasjon som vedlikeholdsanestesi25. I tillegg viste en forskergruppe at intravenøse medikamenter også var egnet for vedlikeholdsanestesi26. Endotrakeal intubasjon hos gris kan være vanskelig for et dyr kirurgisk team. Sammenlignet med menneskets luftveier, gjør luftrørsanatomien til griser eksponering av glottis vanskelig27. Her, for bedre å eksponere glottis, presset vi ned grisens overkjeve for å avsløre grisens glottis (figur 1D). På den annen side vil bruk av direkte laryngoskopi eller fiberoptisk bronkoskopi bidra til å visualisere glottis i endotrakeal intubasjon28.
Den patologiske tilstanden til venøs graftsykdom er hovedsakelig delt inn i tre faser: 1) akutt stadium (innen 1 måned) trombose; 2) subakutt stadium (1-12 måneder) intimal hyperplasi; 3) senstadium (mer enn 12 måneder) dannelse av aterosklerose, som er en årsak til graftstenose og okklusjon29. De fleste endringene i den akutte fasen av VGD er relatert til operasjonelle faktorer, og aterosklerose dannet i sen fase er irreversibel. Studien av subakutt endometrisk fortykkelse er svært viktig for patogenesen, behandlingen og forebyggingen av VGD. Det er også kritisk at de valgte transplantatkarene er forskjellige fra de vertikale karene i den store saphenøse venen. Den indre brystvenen bærer vanligvis mindre hydrostatisk trykk, og de patologiske endringene er raskere etter transplantasjonen enn for den store saphenøse venen. I vår modell så man typisk intimahyperplasi som okkluderer lumen i den podede kar ved den histologiske undersøkelsen 30 dager etter operasjonen, og de samme patologiske forandringene er observert i andre kliniske studier23,24. Modelleringsresultatene for å velge den indre brystvenen hos minigriser er stabile i fenotype, modelleringstiden er kort, og graden av reduksjon av de patologiske endringene i VGD er høy, noe som bidrar til utviklingen av oppfølgingsforskning.
Modellen har også noen begrensninger. Noen fine operasjoner i modelleringsprosessen for store dyr, intraoperativ overvåking av vitale tegn fra dyr og postoperativ gjenopplivning krever alle viss praktisk erfaring, noe som krever profesjonelle kirurger og anestesiologer for å veilede opplæringen og redusere dyrs utilsiktede dødelighet sterkt. Store dyreoperasjoner krever spesifikke forsøkssteder, faglig bemanning og tilstrekkelig økonomisk støtte, noe som kan være en tyngre byrde for mindre institutter.
Avslutningsvis, under veiledning av fagfolk, kan velutstyrte laboratorier videre studere de patologiske endringene i VGD ved å etablere denne minigris VGD-modellen, som er av stor betydning for behandlingen av VGD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.
Acknowledgments
Forfatterne takker Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute for teknisk støtte, dyrepleie og prøveinnsamling. De takker også Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd, for teknisk støtte i ultralydundersøkelsen. Dette arbeidet ble støttet av Guangdong Science and Technology Program, Kina, og Jinan University Central Universities Basic Scientific Research Business Expenses Project (2017A020215076, 2008A08003 og 21621409).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aortic Punch | Medtronic Inc. , America | 3.0mm, 3.5mm, 4.0mm | Used for proximal coronary bridge anastomosis |
| Automatic biochemical analyzer | IDEXX Laboratories, Inc. America | Catalyst One | |
| Cardiac coronary artery bypass grafting instrument kit | LANDANGER, France | ||
| Cardiogram monitor | Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co, Ltd | MEC-1000 | |
| Coronary Shunt | AXIUS | OF-1500, OF-2500, OF-3000 | The product temporarily blocks the coronary artery during arteriotomy to reduce the amount of bleeding in the surgical field and provide blood flow to the distal end during anastomosis. The Axius shunt plug is not an implant and should be removed prior to completion of the anastomosis. |
| Defibrillator | MEDIANA | Mediana D500 | |
| Diazepam | Nanguo pharmaceutical Co. LTD, Guangdong, China | H37023039 | Narcotic inducer |
| Disposable manual electric knife | Covidien, America | E2516H | |
| Electric negative pressure suction machine | Shanghai Baojia Medical Instrument Co, Ltd | YX932D | |
| Esmolol | Guangzhou Wanzheng Pharmaceutical Co. LTD | H20055990 | Emergency drugs |
| Ice machine | Local suppliers, Guangzhou, China | ||
| Lidocaine | Chengdu First Pharmaceutical Co. LTD | H51021662 | Emergency drugs |
| Luxtec headlight system | Luxtec, America | AX-1375-BIF | Used for lighting fine parts during operation |
| Medical operation magnifier (glasses) | Germany Lista co, LTD | SuperVu Galilean 3.5× | Used for fine site operation during operation |
| Multi-function high-frequency electrotome | Shanghai Hutong Electronics Co, Ltd | GD350-B | |
| Nitrogen canister | Local suppliers, Guangzhou, China | ||
| Nonabsorbable surgical suture (polypropylene suture) | Johnson & Johnson, America | 6-0, 7-0 | Used to suture blood vessels. |
| Nonabsorbable suture (cotton thread) | Covidien, America | 1-0 | Used for skin and muscle tissue tugging |
| Open heart surgery instrument kit | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., LTD | ||
| Propofol injection | Xi 'an Libang Pharmaceutical Co. LTD | H19990282 | Anesthetic sedative |
| Refrigerator | Local suppliers, Guangzhou, China | ||
| Respiratory anesthesia machine for animal | Shenzhen Reward Life Technology Co, Ltd, China | R620-S1 | |
| Semi-occlusion clamp | Xinhua Surgical Instrument Co., Ltd. | ZL1701RB | Temporarily cut off the aortic flow |
| vecuronium bromide | Richter, Hungary | JX20090127 | Muscle relaxant |
| Veterinary ultrasound system | Royal Philips, Netherlands | CX50 | |
| Zoletil | Virbac, France | Zoletil 50 | Animal narcotic |
References
- Lloyd-Jones, D., et al. Executive summary: Heart disease and stroke statistics--2010 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 121 (7), 948-954 (2010).
- Taggart, D. P. Contemporary coronary artery bypass grafting. Frontiers of Medicine. 8, 395-398 (2014).
- Wolny, R., Mintz, G. S., Pregowski, J., Witkowski, A. Mechanisms, prevention and treatment of saphenous vein graft disease. The American Journal of Cardiology. 154, 41-47 (2021).
- Schachner, T., Laufer, G., Bonatti, J. In vivo (animal) models of vein graft disease. European Journal of Cardio-thoracic Surgery: Official Journal of the European Association for Cardio-thoracic Surgery. 30 (3), 451-463 (2006).
- Suggs, W. D., et al. Antisense oligonucleotides to c-fos and c-jun inhibit intimal thickening in a rat vein graft model. Surgery. 126 (2), 443-449 (1999).
- Jiang, Z., et al. A novel vein graft model: Adaptation to differential flow environments. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 286 (1), H240-H245 (2004).
- O'Brien, J. E., et al. Early injury to the media after saphenous vein grafting. The Annals of Thoracic Surgery. 65 (5), 1273-1278 (1998).
- Zou, Y., et al. Mouse model of venous bypass graft arteriosclerosis. The American Journal of Pathology. 153 (4), 1301-1310 (1998).
- Klyachkin, M. L., et al. Postoperative reduction of high serum cholesterol concentrations and experimental vein bypass grafts. Effect on the development of intimal hyperplasia and abnormal vasomotor function. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 108 (3), 556-566 (1994).
- Tan, W., et al. A porcine model of heart failure with preserved ejection fraction induced by chronic pressure overload characterized by cardiac fibrosis and remodeling. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 677727 (2021).
- Hocum Stone,, L, L., et al. Magnetic resonance imaging assessment of cardiac function in a swine model of hibernating myocardium 3 months following bypass surgery. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 153 (3), 582-590 (2017).
- Gedik, N., et al. Proteomics/phosphoproteomics of left ventricular biopsies from patients with surgical coronary revascularization and pigs with coronary occlusion/reperfusion: Remote ischemic preconditioning. Scientific Reports. 7 (1), 7629 (2017).
- Tsirikos Karapanos,, N,, et al. The impact of competitive flow on distal coronary flow and on graft flow during coronary artery bypass surgery. Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 12 (6), 993-997 (2011).
- Meng, X., et al. Competitive flow arising from varying degrees of coronary artery stenosis affects the blood flow and the production of nitric oxide and endothelin in the internal mammary artery graft. European Journal of Cardio-thoracic Surgery: Official Journal of the. 43 (5), 1022-1027 (2013).
- Thankam, F. G., et al. Association of hypoxia and mitochondrial damage associated molecular patterns in the pathogenesis of vein graft failure: A pilot study. Translational Research: The Journal of Laboratory and Clinical. , 38-52 (2021).
- Li, X., et al. A surgical model of heart failure with preserved ejection fraction in Tibetan minipigs. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 180 (180), 63526 (2022).
- Rueda, A. lcalá, I,, et al. A live porcine model for surgical training in tracheostomy, neck dissection, and total laryngectomy. European Archives of Oto-Rhino-Laryngology: Official Journal of the European Federation of Oto-Rhino-Laryngological Societies (EUFOS): Affiliated with the German Society for Oto-Rhino-Laryngology - Head and Neck Surgery. 278 (8), 3081-3090 (2021).
- Proudfit, W. L.
- Clark, R. A. Regulation of fibroplasia in cutaneous wound repair. TheAmerican Journal of the Medical Sciences. 306 (1), 42-48 (1993).
- Darby, I., Skalli, O., Gabbiani, G. Alpha-smooth muscle actin is transiently expressed by myofibroblasts during experimental wound healing. Laboratory Investigation. 63 (1), 21-29 (1990).
- Sterpetti, A. V., et al. Formation of myointimal hyperplasia and cytokine production in experimental vein grafts. Surgery. 123 (4), 461-469 (1998).
- Shannon, A. H., et al. Porcine model of infrarenal abdominal aortic aneurysm. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 153 (153), (2019).
- Langille, B. L., O'Donnell, F. Reductions in arterial diameter produced by chronic decreases in blood flow are endothelium-dependent. Science. 231 (4736), 405-407 (1986).
- Zwolak, R. M., Adams, M. C., Clowes, A. W. Kinetics of vein graft hyperplasia: Association with tangential stress. Journal of Vascular Surgery. 5 (1), 126-136 (1987).
- Kotani, K., et al. A subacute hypoxic model using a pig. Surgery Today. 35 (11), 951-954 (2005).
- Liu, D., et al. Comparison of ketamine-pentobarbital anesthesia and fentanyl-pentobarbital anesthesia for open-heart surgery in minipigs. Lab Animal. 38 (7), 234-240 (2009).
- Geovanini, G. R., Pinna, F. R., Prado, F. A., Tamaki, W. T., Marques, E. Standardization of anesthesia in swine for experimental cardiovascular surgeries. Revista Brasileira de Anestesiologia. 58 (4), 363-370 (2008).
- Alhomary, M., Ramadan, E., Curran, E., Walsh, S. R. Videolaryngoscopy vs. fibreoptic bronchoscopy for awake tracheal intubation: A systematic review and meta-analysis. Anaesthesia. 73 (9), 1151-1161 (2018).
- Parang, P., Arora, R. Coronary vein graft disease: Pathogenesis and prevention. Canadian Journal of Cardiology. 25 (2), e57-e62 (2009).
- Egan, T. D., et al. Fentanyl pharmacokinetics in hemorrhagic shock: a porcine model. Anesthesiology. 91 (1), 156-166 (1999).
