Summary
Undersøgelser af cellevægsbiomekanik er afgørende for at forstå plantevækst og morfogenese. Følgende protokol foreslås at undersøge tynde primære cellevægge i det indre væv i unge planteorganer ved hjælp af atomkraftmikroskopi.
Abstract
De mekaniske egenskaber ved de primære cellevægge bestemmer retningen og hastigheden af plantecellevækst og derfor plantens fremtidige størrelse og form. Mange sofistikerede teknikker er blevet udviklet til at måle disse egenskaber; atomkraftmikroskopi (AFM) er dog fortsat den mest bekvemme til at studere cellevægselasticitet på celleniveau. En af de vigtigste begrænsninger ved denne teknik har været, at kun overfladiske eller isolerede levende celler kan studeres. Her præsenteres brugen af atomkraftmikroskopi til at undersøge de mekaniske egenskaber af primære cellevægge, der tilhører de indre væv i en plantekrop. Denne protokol beskriver målinger af det tilsyneladende Youngs modul af cellevægge i rødder, men metoden kan også anvendes på andre planteorganer. Målingerne udføres på vibratomafledte sektioner af plantemateriale i en flydende celle, hvilket gør det muligt (i) at undgå brug af plasmolyserende opløsninger eller prøveimprægnering med voks eller harpiks, (ii) gøre eksperimenterne hurtige og (iii) forhindre dehydrering af prøven. Både antiklinale og periklinale cellevægge kan studeres, afhængigt af hvordan prøven blev sektioneret. Forskelle i de mekaniske egenskaber af forskellige væv kan undersøges i et enkelt afsnit. Protokollen beskriver principperne for studieplanlægning, problemer med prøveforberedelse og målinger samt metoden til valg af kraftdeformationskurve for at undgå topografiens indflydelse på de opnåede værdier af elastisk modul. Metoden er ikke begrænset af prøvestørrelse, men er følsom over for cellestørrelse (dvs. celler med et stort lumen er vanskelige at undersøge).
Introduction
De mekaniske egenskaber ved plantecellevæggen bestemmer cellens form og dens evne til at vokse. For eksempel er pollenrørets voksende spids blødere end de ikke-voksende dele af det samme rør1. Primordiadannelsen på Arabidopsis meristem indledes med et lokalt fald i cellevægsstivhed på stedet for det fremtidige primordium 2,3. Cellevæggene i Arabidopsis hypocotyl, som er parallelle med hovedvækstaksen og vokser hurtigere, er blødere end dem, der er vinkelret på denne akse og vokser langsommere 4,5. I majsroten blev overgangen af celler fra division til forlængelse ledsaget af et fald i elastiske moduler i alle væv i roden. Moduli forblev lav i forlængelseszonen og steg i den sene forlængelseszone6.
På trods af tilgængeligheden af forskellige metoder sammenlignes de store arrays af biokemiske og genetiske oplysninger om cellevægsbiologi, der opnås årligt, sjældent med cellevæggenes mekaniske egenskaber. For eksempel har mutanter på cellevægsrelaterede gener ofte ændret vækst og udvikling 4,7,8, men beskrives sjældent med hensyn til biomekanik. En af grundene til dette er vanskeligheden ved at foretage målinger på cellulære og subcellulære niveauer. Atomkraftmikroskopi (AFM) er i øjeblikket den primære tilgang til sådanne analyser9.
I de senere år er der udført adskillige AFM-baserede undersøgelser af plantecellevægsbiomekanik. De mekaniske egenskaber af cellevægge i det ydre væv af Arabidopsis 2,3,4,5,10,11 og løg 12 samt af dyrkede celler 13,14,15 er blevet undersøgt. Imidlertid kan de overfladiske celler i en plante have cellevægge, hvis mekaniske egenskaber adskiller sig fra de indre væv6. Derudover er planteceller under tryk af turgor, hvilket gør dem stivere. For at slippe af med indflydelsen fra turgortryk skal forskere bruge plasmolyserende opløsninger 2,3,4,5,10,11 eller nedbryde de opnåede værdier i turgor- og cellevægsbidrag 12. Den første tilgang fører til prøvedehydrering og ændrer tykkelsen og egenskaberne af cellevæggen16, mens den anden tilgang kræver yderligere målinger og kompliceret matematik og kun gælder for celler med relativt enkel form12. Cellevægsegenskaberne af indre væv kan evalueres på kryosektioner17 eller sektioner af plantemateriale imprægneret med harpiks8. Begge metoder involverer imidlertid dehydrering og / eller imprægnering af prøver, hvilket uundgåeligt fører til ændringer i egenskaber. Egenskaberne af isolerede eller dyrkede celler er vanskelige at forholde sig til hele plantens fysiologi. Både dyrkning og isolering af planteceller kan påvirke de mekaniske egenskaber af deres cellevægge.
Den metode, der præsenteres her, supplerer de ovennævnte tilgange. Ved hjælp af det kan de primære cellevægge i ethvert væv og på ethvert stadium af planteudvikling undersøges. Sektionering og AFM-observationer blev udført i væske, som undgår prøvedehydrering. Problemet med turgor blev løst, da cellerne skæres. Protokollen beskriver arbejdet med majs- og rugrødder, men enhver anden prøve kan undersøges, om den er egnet til vibratomsektionering.
De her beskrevne AFM-undersøgelser blev udført ved hjælp af kraftvolumenteknikken. Forskellige instrumenter bruger forskellige navne til denne metode. Det grundlæggende princip er imidlertid det samme; Et kraftvolumenkort over prøven opnås ved en sinusformet eller trekantet bevægelse af udkragningen (eller prøven) for at opnå en bestemt belastningskraft ved hvert analyseret punkt, mens cantileverafbøjningen registreres18. Resultatet kombinerer et topografisk billede af overfladen og rækken af kraftafstandskurver. Hver kurve bruges til at beregne deformation, stivhed, Youngs modul, vedhæftning og energiafledning på et bestemt punkt. Lignende data kan opnås ved punkt-for-punkt kraftspektroskopi efter scanning i kontakttilstand19, selvom det er mere tidskrævende.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Prøveforberedelse til AFM-målinger
- Plantemateriale: Steriliser frøene af majs (Zea mays L.) og rug (Secale cereale L.) med en 0,35% NaOCl-opløsning i 10 min., vask 3x med destilleret vand, og dyrk derefter hydroponisk i mørke ved 27 °C i henholdsvis 4 dage og 2 dage. Primære rødder blev brugt til eksperimentet.
- Fremstilling af opløsninger og prøve til vibratom sektionering
- Forbered agaroseopløsning til rodindlejring ved at opløse 3% (w / w) lavsmeltepunktsagarose i vand ved hjælp af en mikrobølgeovn.
BEMÆRK: Alle eksperimenter blev udført i vand. Hvis der kræves buffer eller anden type medium til undersøgelsen, er det bedre at bruge det samme medium til agarosepræparat under sektionering og i den flydende celle i AFM for at undgå at beskadige prøven. - Hæld et 4 mm lag smeltet 3% agarose på bunden af petriskålen (diameter = 35 mm), og lad det køle lidt af for at forhindre termisk skade på prøven.
- Placer tre eller fire små stykker (ca. 5 mm lange) af det studerede planteorgan vandret på agarose.
BEMÆRK: Prøver skal være halvt nedsænket, men ikke nedsænket i agaroselaget. Hvis prøven ikke er nedsænket, kan den bryde ud af agarosen under vibratom sektionering. Hvis prøven synker til bunden, vil den være for tæt på kanten af sektionen og blive ubelejlig for yderligere trin. - Når en tynd, halvfast film vises oven på det første lag agarose (30-60 s), hæld forsigtigt et andet lag ovenpå.
BEMÆRK: Det nederste lag af agarose bør ikke størkne fuldstændigt. Ellers kan de to lag adskilles fra hinanden under det videre arbejde. - Når agarosen er fuldstændig størknet, skal du skære blokken, der indeholder prøven, ud. Form blokken til en sekskantet afkortet pyramide for at sikre dens stabilitet under yderligere sektionering (figur 1A).
BEMÆRK: Prøven kan orienteres lodret eller vandret inden for denne blok afhængigt af den krævede sektionstype. Når du forbereder blokken, skal du forlade 2-3 mm agarose omkring prøven. I dette tilfælde bevares prøvesektionen af laget på 3% agarose, hvilket vil lette dets yderligere immobilisering (figur 1B).
- Forbered agaroseopløsning til rodindlejring ved at opløse 3% (w / w) lavsmeltepunktsagarose i vand ved hjælp af en mikrobølgeovn.
- Sektionering af prøven med vibratomet
- Lim blokken til vibratomstadiet med cyanoacrylatklæbemiddel. Placer scenen i vibratomet, så et af pyramidehjørnerne vender mod vibratomets blad. Hæld vand i vibratombadet.
- Indstil sektionsparametrene (sektionstykkelse, bladhastighed og vibrationsfrekvens), og skær prøven.
BEMÆRK: Brug sektionstykkelserne mellem 200 og 400 μm. Et afsnit, der er for tyndt, kan introducere fejl i vurderingen af mekaniske egenskaber, mens et afsnit, der er for tykt, er tilbøjeligt til brud. En bladhastighed på 1,3 mm·s-1 og en svingningsfrekvens på 90 Hz blev anvendt til rug- og majsrødder. - Brug en fin børste til at flytte sektionen fra vandbadet til et glasglas, og læg en dråbe vand på sektionen for at forhindre, at den tørrer ud. Kontroller sektionens kvalitet under et lysmikroskop.
BEMÆRK: Skrå sektioner kan ikke bruges til at måle elasticitetsmodulet. Cellevægge skal være vinkelret på sektionsplanet, ellers kan de bøje eller spænde under AFM-spidsen.
- Immobilisering af sektionen til AFM-målinger (figur 1B)
- Hæld et lag smeltet 1% (w/w) agarose (~1 ml) på bunden af petriskålhætten ved hjælp af en pipette.
BEMÆRK: Sørg for, at siderne på petriskålhætten ikke forhindrer spidsen i at nærme sig prøven. Agaroselaget skal være 1 mm tykt og skal dække hele bunden af hætten. - Når 1% agarose er størknet, skal du fjerne overskydende vand fra sektionen ved at bringe filterpapir til kanten.
BEMÆRK: Rør ikke plantesektionen med papiret for at undgå skader og fuldstændig tørring af prøven. - Overfør forsigtigt sektionen fra diaset til midten af petriskålhætten ved hjælp af en børste. Brug en 20 μL pipette til forsigtigt at tilføje 1% agarose omkring sektionen (figur 1B).
BEMÆRK: 1% agarose bør ikke komme på selve prøven. Det bør kun dække kanterne af det 3% agaroselag, der bevarer planteprøven. 1% agarose skal danne små knolls på kanterne af dette 3% agaroselag. Store knolls kan forhindre cantileveren i at nærme sig prøven. - Hæld vandet eller anden opløsning, der skal bruges til AFM, i petriskålhætten med den immobiliserede sektion.
- Hæld et lag smeltet 1% (w/w) agarose (~1 ml) på bunden af petriskålhætten ved hjælp af en pipette.
2. Forberedelse og kalibrering af AFM
BEMÆRK: AFM's kraftvolumenmetode genererer et rumligt opløst array af kraftafstandskurver opnået på hvert punkt i det undersøgte område. Få alle parametre til kraftvolumentilstand (cantilever stivhed, IOS osv.) i kontakttilstand. Lignende procedurer for instrumenter fra andre fabrikanter er tidligere beskrevet10,20.
- Vælg den relevante type udkragning.
BEMÆRK: Cantileverstivheden skal være sammenlignelig med prøvestivheden21. En cantilever, der er meget stivere end prøven, vil ikke afbøje meget, mens en cantilever, der er for blød, ikke deformerer prøven nok. En typisk resonansfrekvens skal være tilstrækkelig til at svinge cantileveren i væsken (dvs. være mindst et par titalls kHz). Kontaktfladen skal være lille i forhold til cellevæggens størrelse, da prøven, der undersøges i Youngs modulberegninger, antages at være et uendeligt halvt rum. Følgende udkragninger blev anvendt til rug- og majsrødder: skarpe udkragninger med en typisk resonansfrekvens på 60 kHz, en gennemsnitlig fjederkonstant på 1,5 N·m-1 og en spidsradius på 10 nm eller sfæriske udkragninger med en typisk resonansfrekvens på 75 kHz, en gennemsnitlig fjederkonstant på 2,8 N·m-1 og en spidsradius på 150 nm. - Tænd for AFM-enheden og den tilhørende software (Materialetabel). Monter udkragningen på spidsholderen til væskecellen. Placer en dråbe væske på spidsen for at undgå, at der dannes luftbobler på spidsen, mens den nedsænkes i væsken.
BEMÆRK: I tilfælde af bobledannelse kan væsken fjernes med en præcisionsserviet, og derefter kan en ny dråbe placeres. - Monter tipholderen på scanningshovedet.
- Anbring en hård prøve (frisk glasglas) i en petriskålhætte. Hæld væsken i den, og sørg for, at den dækker diaset. Placer scanningshovedet på scenen, og hæv prøven, så væsken dækker udkragningen.
- Vælg fanen Hoveder i rullemenuen Funktioner . Sørg for, at scanningshovedet til væskecellen er valgt.
- Klik på knappen Sigter for at åbne vinduet Lasersigte. Klik på kamera knappen for at åbne vinduet Optisk mikroskop . Placer laseren ved spidsen af udkragningen ved hjælp af skruerne på AFM-hovedet og vinduet Optisk mikroskop til orientering.
- Vælg Semicontact-tilstand i rullemenuen i programmets hovedvindue.
- Åbn fanen Resonans , og vælg den type cantilever, der bruges, i menuen Probes . Klik på knappen Auto for at bestemme resonansfrekvensen.
BEMÆRK: Hvis den udkragning, der bruges, ikke er angivet, skal du åbne Tools > Probe Passport. Opret en ny fil, indtast cantilever-parametrene, og gem den. Vælg det derefter i rullemenuen Sonder . - Vælg kontakttilstand i rullemenuen i programmets hovedvindue.
- Klik på knappen N_Force Cal for at åbne cantilever kalibreringsvindue. Vælg den udkragning, der bruges, og klik på knappen Sweep og derefter på Spect Meas-knappen for at bestemme cantileverfjederkonstanten ved hjælp af termisk tune-proceduren. Luk vinduet.
- Indstil SetPoint til 1 nA. Åbn fanen Tilgang , og klik på landingsknappen for at nærme dig prøven.
- Åbn fanen Scanning . Indstil scanningshastigheden til 0,5 Hz. Klik på knappen Område , og indstil scanningsstørrelsen til 10 μm x 10 μm og scanningspunktet til 256 x 256. Klik på knappen Kør , og scan ca. 20 linjer for at kontrollere, at der ikke er forurening på glasset. Klik på Stands knappen for at afslutte scanningen uden at miste data.
- Åbn fanen Kurver . Indstil parametre for tilbagetrækning og tilgang til henholdsvis 500 nm og -100 nm.
- Vælg den sidste scanning i rullemenuen Vælg ramme for at observere overfladen.
- Find et rent område på glasset, og angiv det punkt, hvor kraftdeformationskurven skal tages, og klik på knappen Kør for at få kurven. Optag tre til fem kraftkurver forskellige steder på scanningen.
- Klik på knappen Data for at åbne analysevinduet, og vælg rammen med kraftdeformationskurven.
- Klik på knappen Par markører og angiv den lineære del af tilbagetrækningskurven for at beregne forholdet mellem DFL-signalet og forskydningen, som er den inverse optiske følsomhed (IOS, nA nm-1) eller afbøjningsfølsomhed.
- Gentag trin 2.17 for alle registrerede kurver, og skriv alle beregnede værdier af DFL-signal/forskydningsforholdet ned. De skal være de samme.
- Luk analysevinduet, klik på fanen Tilgang og derefter knappen Fjern for at trække sonden tilbage fra prøven.
3. Dataindsamling
- Før prøven under AFM-udkragningen ved hjælp af det optiske mikroskop. Klik på fanen Tilgang og derefter på landingsknappen for at nærme dig prøven i kontakttilstand med et SetPoint på 1 nA.
- Klik på fanen Scanning og derefter på knappen Område . Vælg områdestørrelsen på 70 μm x 70 μm, der skal scannes.
- Klik på knappen Flyt sonde , og kontroller hele scanningsområdet ved at flytte scanneren over den. Baseret på graden af scannerfremspring finder du det højeste punkt.
- Åbn fanen Tilgang , og klik derefter på knappen Fjern for at trække prøven tilbage. Brug det højeste punkt som mål til at klikke på landingsknappen for at nærme dig prøven igen. Kontroller derefter overfladen igen ved at klikke på knappen Flyt sonde og flytte scanneren over den. Ingen af punkterne i området bør kræve, at scanneren hæves helt.
BEMÆRK: Ideelt set bør scannerens z-område overstige prøvens højdeforskel. Det er dog acceptabelt, hvis nogle punkter på scanningsområdet er under scannerens kapacitet. Samtidig bør der ikke være mange sådanne punkter. Store områder, som scanneren ikke kan nå, kan forårsage scanningsabort. - Indstil scanningshastigheden til 0,5 Hz. Indstil scanningsstørrelsen til 70 μm x 70 μm, og scanningspunktet til 64 x 64. Klik på knappen Kør , og scan for at kontrollere overfladen af prøven og dens mulige forurening med agarose.
BEMÆRK: Hvis prøven har celler med et stort lumen, kan scanningsområdets størrelse reduceres, eller det skal flyttes, så der er flere cellevægge på scanningen. - Klik på knappen Til øverst i hovedvinduet for at slukke for feedback-loopet.
- Vælg HDPlus-tilstand (kraft-lydstyrkemetode) i rullemenuen i programmets hovedvindue. Et ekstra vindue (HD-vindue) vises.
- Indstil SetPoint til 0,1 nA i programmets hovedvindue.
- Under fanen Hovednavn i HD-vinduet skal du indstille scanningsparametrene (amplitude og hyppighed af sinusformet udkragningsbevægelse), der passer til den undersøgte prøve.
BEMÆRK: Hver type prøve og cantilever kræver valg af scanningsparametre. Nogle indledende eksperimenter er nødvendige. Til majs- eller rugrødder blev skarpe og sfæriske cantilevers anvendt ved en amplitude på 400 nm og en frekvens på 300 Hz. - Åbn fanen Lyde i HD-vinduet, og indtast resonansfrekvensen for cantileveren.
- Åbn fanen Quant i HD-vinduet, og indtast IOS, cantilever Stivhed og spidsradius og vinkel. Vælg kontaktmodellen, som skal bruges til beregninger afhængigt af spidsgeometrien.
BEMÆRK: DMT-modellen tager højde for den vedhæftningskraft, der findes mellem sonden og prøven, og bruges mest i mekanobiologi21. - Åbn fanen Scan i HD-vinduet, og vælg de signaler, der skal optages. Vælg den retning, hvor signalet er optaget. Marker afkrydsningsfeltet Tving lydstyrke for at få en oversigt over alle kraftkurver.
BEMÆRK: Optag elasticitetsmodulsignalet i både fremadgående og bagudgående retninger. Det vil give flere point at beregne. - Klik på knappen Fra øverst i hovedprogramvinduet for at tænde feedback-loopet.
- Klik på PhaseCorr-knappen i HD-hovedvinduet for at korrigere følsomheden af det optiske system.
- Fanen vs Tid i hovedvinduet i HD præsenterer funktionen af DFL-signalet vs . tid i realtid; Vælg de dele af denne funktion, der skal bruges til bestemmelse af basisniveau, og som passer til kontaktmodellen til yderligere beregninger.
- Indstil scanningspunktværdien til 256 x 256 i programmets hovedvindue. Indstil scanningshastigheden til 0.2 Hz, og klik på knappen Kør for at scanne prøven.
- Når scanningen stopper, skal du klikke på knappen Til øverst i hovedvinduet for at slukke for feedback-sløjfen.
- Vælg kontakttilstand i rullemenuen, åbn fanen Tilgang , og klik på knappen Fjern for at trække eksemplet tilbage.
- Klik på knappen Data for at åbne analysesoftwaren og gemme output.
- I slutningen af måledagen skal du fjerne cantilever tipholderen fra hovedet og skylle den forsigtigt med ultrarent vand flere gange. Fjern vandet hver gang med en præcisionsserviet.
4. Dataevaluering og efterbehandling
BEMÆRK: Stol ikke på elastiske modulværdier, der beregnes automatisk. Da overfladen varierer meget i højden, skal mange artefaktkurver udvises.
- Åbn den gemte fil i analysesoftwaren.
- Vælg HDForceVolume-rammen .
- Hold Ctrl-tasten nede, og vælg en visuel ramme, der er opnået i samme scanningsretning. Klik på knappen Indlæs eksternt kort for at se, hvor cellevæggene er placeret.
BEMÆRK: Ethvert signalkort kan bruges som en visuel ramme, men brug af DFL-signalkortet (forskellige instrumenter kan henvise til det som et afbøjningssignal eller fejlsignal) kan være den nemmeste måde. - Kontroller InvOptSens (IOS) og cantilever Stivhedsværdier under fanen Hoved .
- Åbn fanen Yderligere , og kontroller tipparametrene og kontaktmodellen.
- Klik på forskellige punkter på cellevæggene på den visuelle ramme, og vælg kun de kurver, der er godt beskrevet af modellen. Se Repræsentative resultater for at få flere oplysninger.
- Skriv de opnåede værdier ned.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Typiske elastiske modul- og DFL-kort samt kraftkurver opnået på rug- og majsrødder ved den beskrevne metode er vist i figur 2. Figur 2A viser elastisk modul og DFL-kort opnået på den tværgående sektion af rugens primære rod. De hvide områder på modulkortet (figur 2A til venstre) svarer til en fejlagtig overvurdering af Youngs modul på grund af, at scanneren nåede sin grænse i z-retningen. Dette billede er ikke praktisk at bruge som et eksternt kort til et yderligere udvalg af tilfredsstillende kraftkurver. DFL-signalkortet (afbøjnings-/fejlkort), der vises til højre (figur 2A), er bedre egnet til dette formål.
Modulkortene over tværgående og langsgående sektioner af majsroden er vist i figur 2B,C. Scanneren, der er blevet fuldt udvidet, mens den forsøgte at nå bunden af prøven, kan resultere i fejlagtige målinger og endda afbrudte scanninger (øverste del af figur 2C). Nogle gange, efter at have fået en god scanning i kontakttilstand, trækker instrumentet pludselig scanneren helt sammen og alarmerer, at den har nået den maksimale z-retningsgrænse, når den skifter til kraftvolumentilstand. Det betyder, at prøven ikke blev immobiliseret korrekt og flød op. Der skal udarbejdes en ny prøve.
Agaroseforureningen kan også være en grund til at forberede en ny prøve (figur 2D,E). Agarosetilstedeværelsen kan kontrolleres, mens den første scanning opnås i kontakttilstand (trin 3.5). Ideelt set bør cellevæggene og nogle cellebunde være synlige på sådanne scanninger (figur 2D); I tilfælde af unøjagtig immobilisering kan overfladen dog være dækket af agarose (figur 2E), som maskerer prøvetopografien.
Figur 2F viser fire forskellige kraftkurver registreret på forskellige punkter i den samme cellevæg. Kurven registreret i punkt 1 viser ingen basislinje. Det betyder, at der ikke var nogen adskillelse af udkragningsspidsen fra cellevæggen. Modulet beregnet ud fra denne kurve blev overvurderet. Kurven registreret ved punkt 3 viser en skulder på den nærliggende del. Denne artefakt kan indikere, at cellevæggen blev bøjet. Begge kurver registreret i punkt 1 og 3 bør udvises. Punkt 2 og 4 viser tilfredsstillende kraftkurver med lignende værdier af moduli. Følgende kriterier kan anvendes til at skelne mellem korrekte kurver: i) basisniveauet skal være tydeligt på både tilnærmelsesvis og tilbagetrækning af dele af kurven; ii) der bør ikke være uregelmæssigheder såsom skuldre eller fejl (fremstår som konstante kraftværdier og et pludseligt fald i kraftværdier midt på skråningen) iii) den valgte model skal passe godt til kurven. For alle valgte kurver skal de maksimale anvendte kraftværdier være ens. En maksimal anvendt kraft, der er betydeligt højere eller lavere end den forventede værdi, kan også bruges som et kriterium for kurveudvisning. Brug af neurale netværk til at kassere kurver af dårlig kvalitet19 kan fremskynde behandlingen af resultater.
Figur 1: Kritiske trin i prøveforberedelsen . (A) Rodfragment indlejret i en blok af agarose og monteret på vibratomstadiet. (B) Prøvesektion anbragt oven på et lag på 1% agarose og immobiliseret med yderligere agarose i en petriskålhætte. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Typiske AFM-billeder og målinger på primære rødder . (A) Elasticitetsmodul og DFL-kort over en tværgående del af rugroden. Fuldt registrerede (B) og afbrudte (C) kort over elasticitetsmodulet opnået på langsgående og tværgående sektioner af majsrod. 3D-visning af rene (D) og agarosedækkede (E) sektioner af majsrødder. (F) Et DFL-kort over et tværsnit af majsrod. Punkt 1-4 på cellevæggen viser de positioner, hvor kraftkurverne i højre side af billedet blev optaget. Den røde linje er til at nærme sig, den blå linje er til tilbagetrækning, og den sorte linje viser kontaktmekanikkens modelpasning. Kurverne registreret i punkt 1 og 3 har artefakter og kan ikke bruges til beregninger. Rugrødder blev undersøgt med skarpe spidser, og majsrødder blev undersøgt med sfæriske spidser. Forkortelser: Rhiz = rhizodermis, Exo = exodermis, OC = ydre cortex, IC = indre cortex, End = endodermis, Per = pericycle og VP = vaskulær parenchyma. Skalabjælker = 10 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De mekaniske egenskaber ved de primære cellevægge bestemmer retningen og hastigheden af plantecellevækst og dermed plantens fremtidige størrelse og form. Den AFM-baserede metode, der præsenteres her, supplerer eksisterende teknikker, der bruges til at studere egenskaberne af plantecellevægge. Det gør det muligt at undersøge elasticiteten af cellevægge, der tilhører plantens indre væv. Ved hjælp af den præsenterede metode blev de mekaniske egenskaber af cellevægge i forskellige væv af den voksende majsrod kortlagt, og en matematisk model blev konstrueret baseret på disse egenskaber6. Den simulerede rod reagerede på anvendelsen af tryk, der efterlignede turgor ved ændringer i lineær størrelse. Disse ændringer var i samme område og i modsat retning som dem, der blev udstillet af en frisk udskåret rod i plasmolyzing medium6.
Prøveforberedelsen er afgørende for denne protokol. Tørring af prøven bør undgås under hele tilberedningen. Korrekt placering af plantematerialet, der skal sektioneres, er et vigtigt spørgsmål; Cellevæggene skal være orienteret strengt vinkelret på det fremtidige scanningsplan. Ellers opnås utilfredsstillende kraftdeformationskurver, fordi cellevæggen er blevet bøjet eller spændt. Den agarose-indlejrede sektion skal være tæt fastgjort med yderligere agarose (figur 2B). Sidstnævnte bør ikke komme på prøven, ellers måles agaroseegenskaberne. Den vigtigste del af denne protokol er at filtrere de resulterende kraftkurver. Selv undersøgelse af modelobjekter, såsom AFM-kalibreringsgitre, kan resultere i en betydelig andel af fejlagtige kraftdeformationskurve22. Direkte brug af de beregnede modulværdier uden at analysere de underliggende kraftdeformationskurver kan føre til forkerte konklusioner (figur 2F).
Teknikken er ikke begrænset af lokaliseringen af cellen eller størrelsen af planteorganer. Objekter, der er for små, er dog vanskelige at skære, orientere og immobilisere. Celler med et stort lumen er vanskelige at arbejde med, da der er stor sandsynlighed for scanningsafbrydelse (figur 2C).
Med alle fordelene ved at bruge ikke-faste plantesektioner forberedt med et vibratom er der mindst to afgørende spørgsmål: muligheden for at udvikle en stressreaktion efter skæring af plantemateriale og muligheden for delvis opløselighed af materiale fra de skårne cellevægge. Begge kan føre til ændringer i sammensætningen og egenskaberne af cellevægge. Tilstedeværelsen af øjeblikkelig stressrespons på snittet blev testet på Arabidopsis apices10. Der blev ikke rapporteret nogen signifikant effekt på de observerede egenskaber. Eksperimenter blev udført for at teste ændringer i egenskaberne af skårne cellevægge under deres inkubation i vand19. Der var ingen stabil tendens i Youngs tilsyneladende modulværdier målt på den samme væg af majsrod i mindst en halv times periode19. Det er dog bedre at holde forsøgstiden så kort som muligt og kontrollere hver prøve for sådanne ændringer under inkubation af prøven i vand.
AFM er en kraftfuld teknik til at studere plantecellevægge. Det er imidlertid indlysende, at beregninger af elasticitetsmodul, stivhed og vedhæftning er baseret på flere antagelser, der ikke opfyldes af plantecellevægge. Alle modeller af kontaktmekanik, der anvendes af AFM, betragter den undersøgte prøve som et uendeligt halvt rum af isotropt materiale, hvilket ikke gælder for plantecellevægge. Samtidig antages det, at indenterens geometri og egenskaber måles nøjagtigt og konstant over udkragningslevetiden, hvilket også kan være fejlagtigt. Derudover udviser plantecellevægge kompleks mekanisk adfærd, der involverer elastiske, viskoelastiske og plastiske komponenter, og normalt kan kun en af disse måles i et enkelt eksperiment. Ikke desto mindre korrelerer de data, der er opnået ved hjælp af AFM-baserede metoder, pålideligt med plantecellevæksten og den mekaniske ydeevne i forskellige organer og arter 3,4,5,6. Alt dette betyder, at både selve teknikken og forståelsen af de data, der er opnået med den, kan forbedres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi vil gerne anerkende Dr. Dmitry Suslov (Sankt Petersborg State University, Sankt Petersborg, Rusland) og Prof. Mira Ponomareva (Tatar Scientific Research Institute of Agriculture, FRC KazSC RAS, Kazan, Rusland) for at levere henholdsvis majs og rugfrø. Den præsenterede metode blev udviklet inden for rammerne af det russiske videnskabsfondsprojekt nr. 18-14-00168 tildelt LK. Den del af arbejdet (opnåelse af de præsenterede resultater) blev udført af AP med økonomisk støtte fra regeringsopgaven til FRC Kazan Scientific Center of RAS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose, low melting point | Helicon | B-5000-0.1 | for sample fixation |
| Brush | - | - | for section moving |
| Cantilevers | NanoTools, Germany | NT_B150_v0020-5 | Model: Biosphere B150-FM |
| Cantilevers | NT-MDT, Russia | FMG01/50 | Model: FMG01 |
| Cyanoacrylate adhesive | - | - | for vibratomy |
| Glass slides | Heinz Herenz | 1042000 | for vibratomy and AFM calibration |
| ImageAnalysis P9 Software | NT-MDT, Russia | - | for data analysis |
| Leica DM1000 epifluorescence microscope | Leica Biosystems, Germany | 11591301 | for section check |
| NaOCl | - | - | for seed sterilization |
| Nova PX 3.4.1 Software | NT-MDT, Russia | - | for experiments conducting |
| NTEGRA Prima microscope with HD controller | NT-MDT, Russia | - | for AFM and data acquisition |
| Petri dish 35 mm | Thermo Fisher Scientific | 153066 | for sample fixation |
| Tip pipette 1000 µL | Thermo Fisher Scientific | 4642092 | - |
| Tip pipette 2-20 µL | Thermo Fisher Scientific | 4642062 | - |
| Ultrapure water | - | - | - |
| Vibratome Leica VT 1000S | Leica Biosystems, Germany | 1404723512 | for sample sectioning |
References
- Zerzour, R., Kroeger, J., Geitmann, A. Polar growth in pollen tubes is associated with spatially confined dynamic changes in cell mechanical properties. Developmental Biology. 334 (2), 437-446 (2009).
- Braybrook, S. A., Peaucelle, A. Mechano-chemical aspects of organ formation in Arabidopsis thaliana: the relationship between auxin and pectin. Plos One. 8 (3), 57813 (2013).
- Milani, P., et al. In vivo analysis of local wall stiffness at the shoot apical meristem in Arabidopsis using atomic force microscopy. Plant Journal. 67 (6), 1116-1123 (2011).
- Daher, F. B., et al. Anisotropic growth is achieved through the additive mechanical effect of material anisotropy and elastic asymmetry. Elife. 7, 38161 (2018).
- Peaucelle, A., Wightman, R., Hofte, H. The control of growth symmetry breaking in the Arabidopsis hypocotyl. Current Biology. 25 (13), 1746-1752 (2015).
- Petrova, A., Gorshkova, T., Kozlova, L. Gradients of cell wall nano-mechanical properties along and across elongating primary roots of maize. Journal of Experimental Botany. 72 (5), 1764-1781 (2021).
- Chiniquy, D., et al. Three novel rice genes closely related to the Arabidopsis IRX9, IRX9L, and IRX14 genes and their roles in xylan biosynthesis. Frontiers in Plant Science. 4, 83 (2013).
- Majda, M., et al. Mechanochemical polarization of contiguous cell walls shapes plant pavement cells. Developmental Cell. 43 (3), 290-304 (2017).
- Bidhendi, A. J., Geitmann, A. Methods to quantify primary plant cell wall mechanics. Journal of Experimental Botany. 70 (14), 3615-3648 (2019).
- Peaucelle, A. AFM-based Mapping of the elastic properties of cell walls: at tissue, cellular, and subcellular resolutions. Journal of Visualized Experiments. (89), e51317 (2014).
- Peaucelle, A., et al. Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis. Current Biology. 21 (20), 1720-1726 (2011).
- Beauzamy, L., Derr, J., Boudaoud, A. Quantifying hydrostatic pressure in plant cells by using indentation with an atomic force microscope. Biophysical Journal. 108 (10), 2448-2456 (2015).
- Radotic, K., et al. Atomic force microscopy stiffness tomography on living Arabidopsis thaliana cells reveals the mechanical properties of surface and deep cell-wall layers during growth. Biophysical Journal. 103 (3), 386-394 (2012).
- Yakubov, G. E., et al. Mapping nano-scale mechanical heterogeneity of primary plant cell walls. Journal of Experimental Botany. 67 (9), 2799-2816 (2016).
- Zdunek, A., Kurenda, A. Determination of the elastic properties of tomato fruit cells with an atomic force microscope. Sensors. 13 (9), 12175-12191 (2013).
- Evered, C., Majevadia, B., Thompson, D. S. Cell wall water content has a direct effect on extensibility in growing hypocotyls of sunflower (Helianthus annuus L). Journal of Experimental Botany. 58 (12), 3361-3371 (2007).
- Torode, T. A., et al. Branched pectic galactan in phloem-sieve-element cell walls: implications for cell mechanics. Plant Physiology. 176 (2), 1547-1558 (2018).
- Garcia, R. Nanomechanical mapping of soft materials with the atomic force microscope: methods, theory and applications. Chemical Society Reviews. 49 (16), 5850-5884 (2020).
- Kozlova, L., Petrova, A., Ananchenko, B., Gorshkova, T. Assessment of primary cell wall nanomechanical properties in internal cells of non-fixed maize roots. Plants-Basel. 8 (6), 172 (2019).
- Bovio, S., Long, Y. C., Moneger, F. Use of atomic force microscopy to measure mechanical properties and turgor pressure of plant cells and plant tissues. Journal of Visualized Experiments. (149), e59674 (2019).
- Krieg, M., et al.
- Braunsmann, C., Schaffer, T. E. Note: Artificial neural networks for the automated analysis of force map data in atomic force microscopy. Review of Scientific Instruments. 85 (5), 056104 (2014).
